Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование реконструированных в присутствии детергена моноксигеназных систем, содержащих цитохромы Р4501А2 и Р4502В4

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование реконструированных в присутствии детергена моноксигеназных систем, содержащих цитохромы Р4501А2 и Р4502В4"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕГШЯ МВДЩИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ.БИОЛОГИЧЕСКОМ И ВДЩ4НСКОЙ Х1СГ.ГЛ

На правах рукописи УДК 577.15.-018.1.-35

СЕВРЮКОВА Ирина Федоровна

РАЕНИТЕШЮЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЕКОЙСТРУИРОВАЕпЫХ; В ПРЙСУТСТВ®* ДЕТЕРГЕНА ИОНООКСйГЕНАЗНЫХ СИСТЕМ, СОДЕЕВДОС - ' ЦИТОХРОШ Р4501А2 И Р4502В4

03.-00.04 - Биологическая гикая-

¿БТОгИ&ЙРДУ

дГССб-ЗТВЦН^

на соисханзге учоной сгелош ¿ггзддагса биохэгических- наук

Работа Е'гхижна с бшлэгагссксй а мэ&щккз

3cc.sk екте?'й«йй кздяциаских наук

Научнкл руковэдат&вь: дггтор бясшзтических взук. Г.И.Батагизеа

Офашальшо оппоненты:

- доктор биологичесзж наук УЕаров В.В.

- доктор кедиюнских наук Хащшзв З.М.

Ведущая организация - Московский государственный ушшеисгт им. М.В.Ломоносова. *

Защита диссертация состоится "_" _1992 г.

на заседании специализированного ученого совета Д.001.10.( Института биологической и медицинской химии РАШ по адресу:. 119832, Москва, ул. Погодинская, 10. , . '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Циститу! биологической и медицинской химии РАМН.

Автореферат разослан "_" _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Павлихина Л.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ни одна из ферментаых систем -не мекает в настоящее время большего внимания исследователей, оксигеназные комплексы, содержащие цитохром Р-450 (Archakov ,, Bachraanova G.I. 1990, Coon et al-, 1992). Цитохром Р-450 i объектом интенсивных исследований по двум причинам. Этот лент, с одной стороны, представляет интерес для ^ментальных исследований в области биологического катализа, а эугсй - изучение катализируемых цитохрсмоа Р-450 реакций Зхсдимо для исследований в различных областях биологии и шины. Около 250000 синтетических соединений являютбя знцкальвккя субстратам, ингибиторами кгя индукторами эхроча Р-450 (Guengerioh, 1992). В эту группу входят эрственные средства, прокандерогены, антиоксиданты, зничесоте растворители, красители, пестнцады, спирты, зхавдие, и ароматизирующие средства. Токсичность этих пилений монет Сыть увеличена или уменьшена в результате слительных реакций, катализируемых цитохромом Р-450. акозлена также -ванная роль цнтохрома Р-450 в метаболизме кологически ванных эндогенных соединений: стероидов, зсиршх лот, простаясидоз, ¡жирорастворимых витаминов я алкалоидов.

. В настоящее время больное внимание удзггется изучению екулярной организации и ' лриншпов йункционирования соксигеназннх систем печени, содержащих различные изоформы охромз Р-450. Все многообразие изоформ цнтохрома Р-450 делено на семейства (Nebei-t et al-, 1989), даа из которых дсгзвляют особый интерес. Это семейства цгтогромов Р-450, ударуешх полицяклическими ароматическими углеводородами - IA вЕобарбиталом - 2В. семейство цитохромэв P450IA ответственно

за активацта химических соединений и превращает их в токсические продукты, а семейсзЕО цитохромов' Р4502В, наоборот, направляет метаболизм химических веществ в стороду образования неактивных продуктов и детоксккацяи (Ioannides, îarke, 1990). Цитэхромы Р-450, принадлекащю к этим семействам, различаются по механизму индукции, субстратной специфичности, по иммунологическим и физико-химическим свойствам. Наиболее известными представителями этих семейств яшяатся цитохромы P450IA2 и 2В4 кроликов, индуцируемые соответственно З-метилхолантреном и фенобарбиталом. Сравнительный аналкз первичных последовательностей этих изоформ цитохрома Р-450 выявил очень низкую степень гоыолопт мэзду шаги, отличия в профилях гидрофобности, структуре и организации мембранных доменов.

Для изучения принципов функционирования мшфосоыакьных юнооксигеназных састек, роли и свойств отдельных компонентов эффективно используется метод реконструкции. {.{икросомальвые монооксигеназныо системы печени могут быть реконструированы в растворе из изолированных цитохрома Р-450 и îiADPH-флавопротеина в присутствии фосфсашидов или детергентов (bu, West, 1978, Bosterling, Trudell, 1982). Функционирование цитохрома Р4502В4 хорошо изучено как в протеолипосомальных системах, тек и в реконструированных системах с детергентом (Dean, Gray, 1962, Wagner, Gray, 1S©). Более того,- удалось реконструировать монооксигеназную систему, состоящую из мономеров цитохрома Р4502В4 и НАВННШ в присутствии ноионного детергента эмульгена 913 (Bachmanova et al-,1986). Представитель другого семейства -цитохром P450IA2 - в реконструированных системах с детергентом использовался гораздо реже. Поэтому представляло интерес изучение поведения данной нзоформы цитохрома Р-450 в реконструированной системе с эмульгевш 913 и сравнение свойств этой системы с

2

[алогичной, содержащей цитохром Р4502В4.

Цель н задачи исследования. Целью настоякего исследовашя ялась реконструкция микросомальной монооксигеназной системы чени в растворе из очищенных изолированных иабрн-фп и цитохрома 501А2 в присутствии эмульгена 913 и сравнительное исследование конструированных монооксигеназных систем, содерзсалщх цитохромы 501А2 и 2В4.

Были поставлены следующие задачи исследование

Изучить влияние эмульгена 913 на 0-деэтилазную активность :тохрома Р4501А2 в гидроперекись кумила- и тшхрн-зависимых :стемах.

Определить молекулярные массы цитохрома Р4501&2 в присутствии, .зличшх концентраций эмульгена 913.

Исследовать связывание цитохрома . Р4501А2 с этоксирезоруфином, цитохрошм Ъ5 и НАШ1-Ш.

Определить кинетические параметры дитионит- и НАБРН-зависимого ссгановлевия цитохрома Р4501А2.

Провести сравнительный анализ исследованных параметров двух конструированных в присутствии эмульгена 913 монооксигеназных стем, содержала цитохромы Р4501А2 и 2В4.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований впервые конструированы в присутствии эмульгена 913 монооксигеназные стемы, содержащие цитохром Р4501А2 и Ш)РН-ФП. Изучено влияние улъгена 913 на гидроксилазкун активность цитохрома Р4501А2 и о агрегатное состояние; Иоыерены константы, диссоциации мплексов этого гемспротеина с субстратом 7-эгоксирезоруфином, пгя-ФП и цктохроком ь5. Исследованы процессы датионит- и ЕРЕ-завлсимого восстановления цитохрома Р4501А2.

Впервые црздсрявята попытка провзсти сравнительный анализ

реконструированных монооксигеназных систем, содергэдпс цитохро Р4501А2 и 2В4. Показало,' что' максимальной активностью клпрн-завксимых'гндрсксилазных и рсдуктазкых реакциях облада. пента- и гексакеры этих гемопротеинов. Мономеры цитохро, Р4501А2, образущсеся при концентрации эмулъгена 913 в I большей, тем моээмеры 2В4, были неактивны в ншив-зашсшл гидроксилазной реакции. Дзе изоформы цитохрома Р-450 отличали! но сродству к субстратам и редокс-партнерам. Выявлен таю© р; отличий кинетических параметров реакций дитконит-ШШРЯ-зависшого восстановления цитохромов Р4501А2 и 2В4.

Апробация двссертавди состоялась на сошестной научнс конференции лабораторий физико-химических методов анализа микросомального окисления, использования вычислительной техники биохимии Института биологической и' медицинской. химии РАМЬ кафедры биохимии МВФ и БНШГ экологии, токсикологии и метаболизм лекарственных препаратов РГМУ им. Н.И.Пирогова. Результат исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Цитохро Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), на 7-о Международной конференции "Цитохро!,! Р-450: Биохимия и Биофизика (Москва, 1991) и на 9-ом Международном "симпозиуме по микросомам окислению лекарств (Иерусалим, 1992). '

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатны работ.

Объем и структура работы. Диссертация излоаена на 12' страницах, включая 18 рисунков и 10 таблиц, и состоит и: введения, обзора литературы, описания использованных материалов 1 методов, результатов и обсуждения собственных исследований заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включакщеи 169 ссылок.

4

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выделения фракции, макросом печзпи использовали беспородных кроликов-самцов весом 1-1,5 кг, получавших фенобарбитал или 3-метилхолантрен. С цельи индукции нужной изофорш цитохрсма Р-450 животных поили в течение 7 дней 0,1% раствором ФБ или в течение 3 дней вводили знутрябрюшинно масляный раствор МХ из расчета 25 кг/кг веса. Зз сутки перед забоем кроликов лишали пищи. Выделение фракции шпсроссм проводили, как описано ранее (Карузина, Арчаков, 1977).

Нитохром P450IA2 выделяли по методу Альтермана (I9S0), ЦКТОХрам Р4502В4 - ПО методу br.aí et al., (1980), 1ШТ0хр0.м Ъ5 - по методу Spata я Strittsatter 0 971). а UADPS—цптохрои Р-450 редуктазу - по методу Dignara и Strobel (1975). Препараты шсскоочященных белков были любезно предоставлены прзпгрзтзвнсй группой лаборатория знзимологии и йЕЖзргетояя при ка.фздрз Ozommt ШР РГ7.Г/ пм.Н.И.Парогова.

Кнкубэпню флаво- и гешпротеннов с эмульгеиом 913 проводила следуя®»: образом. К 5 таолям каждого белка добавляли такую алдквот у 2% детергента, чтобы при последующем разведении получалась требуемая концентрация эмульгёна 913. После тф&тковрсменнай инкубации в -течение 5-IQ иин при комнатной те.'чпзратурз объем смза: доводили до конечной концентрации белка 5 ГГ--.Ч и соответствующей концентрации детергента (от 0,1 до 8 г/л) 100 К-фзсфахнш буфзром рН 7,5 и оставляет на 24 часа при 4°С.

Все спектрсЗатомзтрпческке измераки проводили на спектрофотометр? Hwlétt Ps.ckarl 845U (СПИ). Содержание белка о^-одпга по методу et al., (1951), используя в . качестве

стандарта бычий сывороточный альбумин.

Содержание • цзтохромов -Р-450' и- Ъ5 определяли по дифференциальной стеме, используя коэффициент молярной экстнвкции 91 мМ см . дел АА„а.г30 С0-Еосстановленного комплекса цитохрома Р-450 2 165 мМ~ см* для ААли.ща восстановленной формы цитохрома Ь5 (Omura, Sato, 1964).

Содержание NiDPH-ФП определяли по абсолютному спектру поглощения в диапазоне 300-600 нм, используя коэффициент молярной зкстинкции 21,4 мМ см" для Две (Dignam, Strobel, 1977).

Активность ЫАЕ?н-цзтохром с редуктазы определяли по методу Phillips, Iiongdon (1962).

Определение прочносвязанного детергента проводили по методу Garewal (1973).

Регистрации спзктров связывания ци-тохромов P450IA2 и Р4502В4 с NABPE-ФП, цитохроиом Ъ5, 7-этоксирезоруфином и бензфетамкЕом проводили по дифференциальной схеме в диапазоне 350-550 ем при 30°С. I мкМ раствор цитохромов Р-450 с различным содержанием эмульгена 913 титравали равными объемами соответствующих буферных растворов NiíPH-Ш, цитохрома Ъ5 и 7-этоксирезоруфина до конечной концентрации 2-3 мкМ, а в случае бензфзгамина - до 2 ¡¿У. Спектральные константы диссоциации (Kd) еомшксов цитохронов P450IA2 и 2В4 с лигандаш рассчитывали по уравнению Эдн-Хсфсти по программе "spec кв /к4", разработанной в назей лаборатории.

Скорость реакции N-деметшшрования бэязфетамша определяли по накоплению формальдегида (Nash, 1953).

Скорость реакции 0-де этапирования 7-дтоксирэзоруфяна определяли по методу Prough и Buroke (I&78) на флусршетре Baird. (Англия).

Кинетику дизионит— и NAKPH-занЕсзмого восстановления цитохромов P450IÍ2 и Р4502В4 исследовали при помощи метода

б

остановленного потока в термостатируемой кювете при 30°С и длинах волн 450 и 490 нм с использованием специального устройства к спектрофотометру Hewlett Packard 845IA. Анаэробиоз создавали добавлением 50 мМ D-глзокозы, 90 ед/мл глюкозоксздазы и 2500 ед/мл каталазы. Реэкцию начинали смешиванием раствора цитохрома Р-450 с раствором восстановителя (hadph, датионит натрнн) или nadph-ФП. Описание кинетических кривых уравнением реанцин первого порядка и уравнением суммы двух экспонент осуществляли по модифицированной программе KINFIT (Davydov et al., 1985).

Молекулярные массы исследуемых белков при различных концентрациях эмульгена 913 определяли методом гельфшгьтрации на колонке (1,6 х 100 см) с сефакрилом S-40Q (диапазон фракционирования 20-8000 кДа). Элюцию проводили со скоростью 0,7 млЛмн при комнатной температуре. На колонку наносили 0,5 мл 5 икМ растворов гемо- или флавопротеина или их смеси. Регистрацию проводили на детекторе хроматографичвоной станции Waters 991 ("Hillipore", США) с использованием проточной шветы. Абсолютные спектры цитохромов и редукгазн записывали в диапазонах 200-420 и 200-470 нм соответственно. Хрсматографическиа данше обрабатывали на компьютере по специальной программе "Waters 991". В качестве маркеров использовали следующие белки: пентамер и мономер igM (900 я 180 кДа соответственно), тиреогдобулин (S60 кДа), ферритин (450 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (45 кДа), химотршсиноген (25 кДа).'

Измерение светорассеяния проводили на лззерном нефелометре "ЛАНБИ-ОЗ" (НИК "Мобэль", Россия). Мощность излучения лазера - 3 мВт, длина волны - 0,8 мкм.

Принятые сокращения: 7-ЭР - 7-этоксгрезоруфин, 7-ЗРОД - О-^еэталирование 7-этоксирезсруфана, БФ - бензфетамин, ПЖ ' -гидроперекись куотла, РР - реворуфян, ФА - фзрыальдегзд.

7

СС20ВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Влияние эмульгйга 913 на гидроксилазнув активность систем, состоящих из очезшшх изолированных н.ш?н-ФП и цитохромов

P450IA2 и Р4502В4

При сравнительном изучении реконструирующего действия различных детергеетов на скорость окисления iîabph в системе, содержащей NADPH-SI и цитохром Р4502В4, было установлено, чт-о наибольшим эффектом обладал неионшй детергент эмульгэн 913 в концентрации 0,05 г/л (Канаэва и соавт., 1985). Мзномзрная моноокскгеназная система была реконструирована путем длительной инкубации 5 мкЫ растворов ЯШ>Н-ФП и цитохрема Р4502Б4 с эмульгеном 913 при его концентрации 0,25 г/л (Скоц&ля.с и соавт., 1987). Реконструкцию монооксигеназной системы, содержащую цитохром P450IA2, проводили аналогичным образом.

Было проввдвео сравнение гидрокешшных активностей систем, содержащих 5 мкМ растворы ШЭРН-СП, цкгохромов P450IA2 ш 2В4 и различные концентраций эмульгена 9X3. Результаты предстаздевн на рис. I. В отсутствие детергента наблюдались очень низкие скорости О-деэтилированая 7-Э? Е н-деметилировавия БФ, т.е. обе системы были практически неактивны. При добавлении эмульгена 913 отмечалось резкое увеличение скоростей обеих реакций, когорыг достигали максимум при концентрации детергента 0,1 г/л. Дальнейшее увеличение содержания эмульгена 913 сопровождалось сникэниеы активностей обета систем. При концентрации эмульгена 913 8 г/л 7-ЭРОД активность составляла Юй от максимальной, а скорость N-деыеталарования БФ - 3«.

Оказалось, таз падение гидрокаиазшх активностей при высоких концентрациях детергента нельзя объяснить ЕЕяктиЕацнзй

8

>ис. I. Зависимость скоростей О-деэтялирования 7-этоксирезоруфина [ N-деметилирования бэнзфетамина от концентрации эмульгена 913 в

реконструированных системах, [нкубацаонная смесь объемом 0,5 мл содержала 100 мМ К-фосфатный ¡уфер рН 7,в, по I мкМ NAEPH-ФП, цитохрома Р450Ш или 2В4, 2 мкМ '-ЭР или 2 мМ БФ, 100 мкМ NADPH и соответствупцие концентрации мульгена 913. Температура 30 С._

P450IA2. сиота/ил .10 жаюпк uxt с/тпапт

»мульгея Й1Э. г/я

о.о 1 i.o г г.о о с

ol-i-1-li--'-1-8-Г

ис. 2. Зависимость содержания цитохрома P450IA2 и активности

ííadph—цитохром с редуктазы от концентрации эмульгена 913 -Содеслание цитогрома P450IA2. Инкубационная смесь объемом 2 мл одержала 100 Ш К-фосф.буфер рН 7.6 и 0,17 мкМ цитохром P450IA2. -н.шрб-цитохром с редуктазная активность. Инкубационная смесь бъемом 2 мл содержала 300-мМ К-фосфатный буфер рН 7.7, 50 мкМ итохрсм с, 100 мкМ hadph и 0,005 мкМ ШЛХРН-ФШ Температура 30°С.

переносчиков. Как показано на рис. 2, при увеличении концентрации эмульгена 913 до 8 г/л содержание' цитохрома P450IA2 падало всего на 252, а цигохром с редуктазная активность флавопротеина в данном диапазоне практически не изменялась; Инактивации цитохрома Р4502В4 не наблюдалось при увеличении концентрации эмульгена 913 до 0,8 г/л (Панаева и соавт., 1935). Оба гемопротеина сохранят свою активность в шунтированной ГПК-зависимой системе.

2. Влияние эмульгена 913 на агрегатное состояние цитохромов P450IA2 И Р4502В4

Олигомеры цитохрома Р-450 и NADPH-® практически неактивны в NADPH—зависимых реакциях (Dean, Gray, 1982, Kominami et al, 1984, Бачманова и соавт., 1988), поэтому 'реконструирующий эффект детергентов связывают с их дезагрегирующим действием и участием в образовании смешанных комплексов гемо- и флавопротеина. Влияние эмульгена 913 на агрегатное состояние NADPH-ФП и цитохрома Р4502В4 было изучено ранее (Канаева И соавт., 1985, Kanaeva et al, 1987). Для сравнения реконструирующего действия эмульгена 913 было проведено определение молекулярных масс исходных препаратов цитохрома P450IA2 и в присутствии различных концентраций детергента (табл.1). Гельхроматографические исследования выявили два принципиальных отличия между изоформами цитохрома Р-450. Во-первых, значительно отличались молекулярные массы олигомеров гемопротеинов в отсутствие детергента: агрегаты цитохрома P450IA2 были значительнее крупнее и полиморфнее. Кроме того, цитохром Р4502В4 легче подвергался дезагрегирующему действию детергента, о чем свидетельствовала практически полная мономеризация этого гемопротеина при концентрации эмульгена 913 (0,25 г/л). В то же время, даже при концентрации детергента 8 г/л мономеризовалось

Ю

ТАБЛИЦА I. Влияние эмульгена 913 на агрегатное состояние цитохромов Р4501А2 и Р4502В4 '

Эмульген птп Р4501А2 Р4502В4

г/л Мол.вес кДа Число субъединиц % Мол.вес Число кДа субъединиц

0 2500±100 500±20 45 9 35 65 500-700 10-14

0,05 не определялось 270 5-6

0,1 2500±10и 300+20 45 5-6 5 95 не определялось

0,25 2500±100 270+20 45 5 5 95 65 I

8 2500±100 62±5 45 I 30 60-70 не определялось

только 60-70% цитохрома Р4501А2, что говорит о меньшем сродстве этого белка к эмульгену 913. Различная склонность к самоагрегации цитохромов Р4501А2 и 2В4 (0иёп§егз.с11, НоНайау, 1979) кокет определяться различным строением мембранных доменов этих белков и поверхностной топографией данных белковых молекул в целом.

В реконструированных системах, обладающих максимальной гидроксилазной активностью, оба гемопротеина были представлены пента- и гексамерами. Цитохром Р4502В4 в этих условиях находился в соствЕе зквимолярных комплексов с 1ШЗРН-ФП. Однозначного вывода

11

Рис. 3. Зависимость светорассеяния растворов цитохромов P450I12 к

Р4502В4 и НАБРН-Ш от концентрации эмульгена 913 Смесь объемом 0,5 мл содержала 100 мМTí-фосфатный буфер рН 7,6, 5 мкМ цитохром P450IA2, 2В4 или NADPH-ФП и соответствующие концентрации эмульгена 913. Температура-30 С.

об образовании аналогичных комплексов цитохрома P450IA2 с nabph-ФП на основании гельхроматографических исследований сделать не удалось. При совместном нанесении белки элзоировались в тех ае фракциях, что и при раздельном нанесении, и имели очень близкие времена выхода.

Различное влияние эмульгена 913 на агрегатное состояние цитохромов P450IA2 и 2В4 хорош видно на рис. 3, где представлены данные об изменении светорасеяния растворов гемопротекнсв в зависимости от концентрации эмульгена 913. Светорассеяние растворов цитохрома Р4502В4 быстро снижалось при увеличении концентрации детергента до 0,05 г/л, что говорит о быстром уменьшении размеров этого бежа, а при содержании • эмульгена 913 свыше 0,2 г/л светорассеяние было сравнимо с аналогичной величиной для контрольного буфера. Агрегаты цитохрома P45QIA2 рассеивали свет в 4 раза интенсивнее агрегатов 2В4. Резке:

12

падение светорассеяния наблюдалось при увеличении содержания эмульгена 913 до'О,Г г/л, а затем практически не изменялось.

Для простоты изложения экспериментального материала в дальнейшем агрегатное состояние цитохромов Р4501А2 и 2В4 в реконструированных системах в отсутствие детергента обозначается как олигомеры, а при концентрациях смульгена 913 0,1 и 8 г/л и 0,05 и 0,25 г/л соответственно - как генсамзры и мономеры.

3. Влияние эмульгена 913 на процесс комплексообрззования цитохромов Р4501А2 и 2В4 с субстратами, цитохромом Ь5 и НАЛРН-ФП

Причиной падения гидроксилазнсй активности з реконструированных системах при высоких концентрациях детергента монет быть изменение сродства цитохрома Р-450 к субстратам и к его редокс-партнерам - цитохрому ь5 и наирн-ФП, о чем мокно судить по изменению констант диссоциации комплексов гемонротеинов с этими лигандами.

Результаты исследований спектров связывания цитохрома Р4501А2 с 7-ЭР и Р4502В4 с БФ представлены в табл. 2 и на рис. 4. Обе изофорш в различных агрегатных состояниях обладали способностью связывать свои субстраты. Значение Кй комплексов цитохрома Р4501А2 с 7-ЗР было на три порядка ниже аналогичного значения для комплексов цитохрома Р4502В4 с БФ, т.е. цктохром Р4501А2 имеел гораздо большее' сродство к своему субстрату. Спектральные константы связывания возрастали в ряду олигомеры > гексамеры > мономеры, что могло быть связано с конкуренцией молекул субстрата и детергента зз места связывания нз гемопротеине.

Результаты. спектральных исследований взаимодействия цитохромов Р4501А2 и 2В4 с цитохромом Ъ5 представлены на рис.5 и

13

Рис. 4. Спектры связывания цитогрома Р4501А2 с ,7-этоксирезоруфином (А) и цитохрома Р4502В4 с бензфзтаминсм (Б) А- Смесь объемом 1,5 мл содержала I мкМ цитохром Р4501А2, 2 мкМ 7-ЭР, 100 мМ К-фосфатшй. буфер рН 7,6 (I); + 0,1 г/л эмульгена 913 (2); +8 г/л эмульгена 913 (3). Температура 30°С. Б- Смесь объемом 1,5 мл содержала I мкМ цитохром Р4502В4, 2 мМ БФ, 100 мМ К-босф.лбуфер рН 7,5 (I); + 0,25 г/л эмульгена 913 (2). Температура 30°С.

ТАБЛИЦА 2. Параметры спектров связывания цатохрома Р4501А2 с 7-этоксирезоруфином и Р4502В4 с бензфетамином

Олигомеры

Пента- гексамеры

Мономэры

1А2 2В4 1А2 2В4 1А2 . 2В4

421 423 421 не опред. 421 421

333 383 383 383 - 385

37 47 35 ЗЕ 41

К1,мкМ 0,40 300 0,47 _ 11 — 0,75 600

И

в табл.3. Оба гемопротеина в различных агрегатных состояниях были способны связываться с этим лигандом. Значения Ка комплексов цитохромов Р450ГА2 и 2В4 с цитохромом Ъ5 имели один порядок и снижались при добавлении в раствор эмульгена 913. Т.е. присутствие детергента в системе облегчало образование комплексов цитохромов Р-450 и Ь5. Меньшее значение Ка для цитохрома Р4502В4 говорило о его большем сродстве к цитохрому Ъ5. Т.к. основная роль во взаимодействии цитохромов Р-450 и Ъ5 принадлежит электростатическим силам (ТатЬигии et а1, 1986, ТгтЬигапа, Зйгепктап, 1937), то снижение значений К а. комплексов цитохромов Р4501А2 и 2В4 с цитохромом Ь5 при увеличении концентрации эмульгена 913 можно объяснить, в частности, дезагрегирующим действием детергента на олигомеры гемопротеинов. Диссоциация крупных олигомеров цитохромов Р-450 и Ъ5 облегчала процесс их комплексообразования.

Цитохром Р4501А2 во всех трех агрегатных состояниях был способен связываться и с НАКРН-® (рис.6, табл.4). При концентрации детергента 0,1 г/л наблюдалось сникение значений Ка комплексов гемо- и флзвопротеияа почти в два раза, что говорило об увеличении их сродства. Однако, дальнейше'е повышение содержания эмульгена 913 до 8 г/л приводило к увеличению константы диссоциации в 3 раза, т.е. взаимодействие мономеров цитохрома Р4501А2 и флавопротеина в этих условиях было затруднено. Причиной ухудшения взаимодействия цитохрома Р4501А2 и 1Ш)РН-ФП при высокой концентрации эмульгена 913 могла быть конкуренция молекул детергента и редуктазы за места связывания на ч цятохроме Р-450.

Олигомеры цитохрома Р4502В4 также были способны связываться с олигомерами ШЯРН-ФП. Значение М комплексов агрегатов цитохрома Р4502В4 и ФП было в 4 раза вние соответствунцего

Рис. о. Спектры связывания цитохромов P450IA2 (А) и 2В4 (Б) с цитохромом ь5

А- Смесь объемом 1,5 мл содержала I мкМ цитохром P450IA2, 2,4 мкй цитохром Ь5, 100 мМ К-фосфатный буфер рН 7,6 (I); + 0,1 г/л эмульгена 913 (2); + 8 г/л эмульгена 913 (3). Температура 30°С. Б- Смесь объемом 1.5 мл содержала 3 мкМ цитохром Р4502В4, 15 мкМ цитохром Ь5, 100 мМ К-фосф. буфер рН 7,5 (I); и 2 мкМ цитохром Р4502В4, 2 мкМ цитохром Ъ5, 100 мМ К-фосф., 0,25 г/л эмульгена 913 (¿roiiaJcoT.üraroT, 1985, Kanaeva et al, 1992). Температура 30 С.

ТАБЛИЦА 3. Параметры спектров связывания цитохромов P450IA2 и Р4502В4 с цитохромом Ь5

Параметры Олигомеры Лента- гексамеры Мономеры

IA2 2В4 IA2 ' 2В4 IA2 2В4

^mln'®"1 425 429 425 не опред. 423 421

380 390 391 . 393 390

¿w103 15 22 22 16 14

К&,мкМ 6,4 2,4 2,1 — " — 2,0 1,2

значения дляр щтеохрсма Р4501Л2, что говорило о его меньшем сродство к редухтазе. Т.к. мономеры гшжнш не вызывала спектральных изменений при взаимодействии с мономерами цитохрома Р4502В4 (Капаема а1, 1992), провести полное сравнение процессов комплекссобрззования двух изофэрм цятохрома Р-450 и яла?Е-£П, находящихся в различных агрегатных состояниях, не удалось.

4. Исследование кяпзтшси дитионит- и НАЕРН-занисимнх реакция восстановления цитохромов Р4501А2 -и 2В4

Данные по йсслвдоваайю дЕТПошга-зависякого восстановления цитохрома Р4501А2 представлены на рис.7 и в табл.5. Реакция восстановления .олигомеров, гексакеров и мономеров цатохрома Р4501А2 принципиально не отличались: они был: дезгфазагка, а константы скоростей реакций практически не зависела ни от присутствия субстрата, ни от содержания эмулыевз 913. Добавление 7-ЗР незначительно уввлкчззаяо дола быстра фазы, полностью загалдело от инактивации олитомзра цатохрома Р1501Д2, частичго -ге-ксамзра и не влияю на восстанозяенае мономероз. Кикетаха дашжат-зазксямого восстановления двух изсформ цетоярома Р-450 отлеталась там, что восстановлзЕке .мономеров цитохроаа Р45С2В4 6u.no монсфазным, а Р4501А2 -двухфазным. Причиной-такого явления монет быть тс, что мономеры цатохрома Р4502В4 практически полностью находятся в аизкоспановой форме (Васйтгхюта е» а1, '937), тогда как значительная часть шгесгрсма Р4Б01&2 при концентрации змульгена 913 8 г/л остается б гг.ееюгшгаозо£ фор>ле (1па1 еЪ 3.1, 19СО).

Данные по гшта-зазгажмоку зосотенслл&гзэ представлена в Тйбл.6 и 7 я на ркс.8. В отсутствие егбсита одигокеря

17

Рис. 6. Спектры связывания цитохромов Р4501А2 (А) и 2В4 (Б) с

КАОРН-ФП

А- Смесь объемом 1,5 мл содержала I мкМ цитохром Р4501А2, 2,4 мк1Л 15АВ?Н-ФП, 100 мМ К-фосфаташй буфер рН 7,6 (I); + ОД „г/л эмульгена 913 (2); +8 г/л зыульгена 913 (3). Темизратура 30 "С. Б- Смесь объемом 1,5 мл содержала 1,7 мкЫ цитохром Р4502В4, ЮО мМ К-фосф. буфер рН 7,6 и 3,5 мкМ ИАМИ-Ш (I); и 2 мкМ цитохром Р4502В4,3 мкМ ШДРЕ-ФП, 100 мМ К-фосфзттй$ буфер рН 7,6 и 0,25 Г/л змульгена 913 (2) (АгоЬакоу, 1!уагот, - 1535, Капае7а ей а1, 1992). Температура 30°С.

ТАБЛИЦА 4. Параметры спектров связывания цитохромов Р4501А2 й 2В4

с ШЛРН-ФП

Параметры Олигомеры Лента- гексамеры Мономеры

1А2 2В4 1А2 •2В4 1А2 • 2В4

417 419 415 не опред. 417 нет

\пах'ш 390 380 390 390 спектр,

АА___^10 3 6 50 8 —к— 9 измен

Кй.мкН 0,8 3,3 0,47 1.5

18

ТАБЛИЦА 5. Кинетические параметры дитионит-зэвисимого восстановления цятохромоз Р4501А2 и 2В4, находящихся в различных агрегатных состояниях в отсутствие (-) и присутствии

(+) субстратов.

Система/субстрат К<-, С к2 Уровень с" восст.,55

1А2 + 0,20±0,05 0,03±0,004 80 100 0,54 0,62

2В4 ± 0,2Б±0,05 ~ 0,02±0,005 100. 0,63

Пента- 1А2 + 0Д6±0,03 0,04±0,003 73 95 0,54 0,60

2В4 не определялось

1А2 + 0,17+0,05 0,С01±0,0005 55 66 0,45 0,64

2В4 0 0,092±0,01

Рис.?. Дитиошт-зэвисимое восстановление цатохрома Р4501А2-находящегося в различных агрегатных состояниях 4 ■ . Инкубационная смесь объемом 2 мл содержала 0,6э мкМ цитохром Р4501А2, 2 мкМ 7-ЗР, 100 мМ К-фосф. буфер (I); + 0,1 г/л змульгена 913 (2); + 8 г/л эмульгена 913 (3). Реакцию запускали добавлением 10 мМ датконпта натрия. Температура 30 С.

19

ТАБЛИЦА. 6. Кинетические параметры иаврн-заЕНСикого восстановления цитохромов. Р4501А2 я 2В4, находязщхся в шзличных агрегатных СОСТОЯНИЯХ, 2 отсутствие (-) и ПРИСУТСТВИИ (+) субстратов (инициирование Каврн)

Система/субстрат

с

к2 Уровень босст. р = за I мин, %

0,004+0,0001 3 О

+ 0,97+0,047 0,005+0,0001 12 0,14

1А2

Олигомерн ----

2в4 ±

не восстанавливались

Гекса-Пснтамэры

1А2

0,065+0,01 + 0,67+0,173 0,0013±0,001

15

2В4 ±

1,6

не определялось

О

0,60

1А2

Мономера —

0,023+0,011 + 0,37±0,082 0,001+0,0003

15

2В4

+ 1,8±0,5

О

0,38

0,037+0,01 56 О

0,033+0,01 84 0,50

4

8

цитохромов Р4501А2 и 2В4 практически не восстанавливались. Кинетика восстановления гексамеров щхтохрзыз Р4501А2 была монофэзной, а гексамзров 2В4, находившихся в составе эквимоляршх комплексов с релуктазой - двухфазной. Ре&кцкя восстановления мономеров обоих гемопротеинов имела монофаззшй характер. Кинетические параметры в отсутствие субстратов практически не зависели от способа запуска реакции (ш)рн или наяре-Ш), т.е. белки в этом случае гзаимодействовалл по прашщпу случайных соударешШ.

Добавление 7-3? ь рокснструЕропгЕпуи саотеггг гркводгаго в

Рис. 8. набрн-зависимоэ восстановление цитохрома Р4501А2, находящегося в различных агрегатных состояниях, в отсутствие (а,Б) и в присутствии (В,Г) 7-ЭР.- Инициирование лабрн (А,В) и

МАПРН-ФП (Б,Г).

А- Инкуб. смесь объемом 2 мл.'содержала по 0,65 мкм цитохрома Р4501А2 и ШИРН-ЯП, 100 мМ -К-фосф. буфер рН 7,6 (I); + 0,1 г/л эмульгена 913 (2); +8 г/л эглульгена 913 (3). Анаэробиоз создавали добавлением 50 мМ глюкозы, 90 ед/мл глюкозооксидазы и 2500 ед/мл каталазы. Реакцию запускали добавлением 1мМ каврн. . Б-Инкуб. смесь объемом 2 мл содержала 0,65 мкМ цитохрома Р4501А2, I Ш шдат, 100 мМ К-фооф. буфер рН 7,6 (I); + 0,1 г/л змульгзпз -913 (2); + 8 г/л эмульгена 913 (3). Реакцию запускали добавлением 0,65 мкМ НАШИ®.

В и Г - Условия те же, что и в А и Б соответственно, но в присутствии 2 мкМ 7-ЭР.

Кривая 4 - максим, уровень восстановления, температура 30°С.

ТАБЛИЦА 7. Кинетические параметры НАЮРН-зависимого восстановления цитохромов Р4501А2 и 2В4, находящихся в • различных агрегатных состояниях в отсутствие (-) и присутствии (+) субстратов (инициирование ЫАБРН-ФП)

к, Уровэнь восст.

Система/субстрат -I с -1 с за I мин,%

_ 0,003+0,001 1,5 0

Олигомеры 1Д2

+ 0,01±0,004 7 и

- 0,032+0,01 21 0

Панта- 1А2

Гексачеры + 0,18+0,08 30 0

-0,025+0,0114О

1А2

+ о,п±о,ое 15 о

Мономеры -----------------------------------------

0,038±0,01 не опред. 0

+ не определялось

существенному изменению кинетических параметров восстановления цитохрока Р4501А2. При инициировании процесса ш>рн кинетика восстановления цитохрома Р4501А2 была двухфазной во ес&х исследуемых системах, а при запуске реакции 1Ш>?н-Ш - вновь становилась кокофазной. Таким обрезом, субстрат увеличивал скорость взаимодействия гемо- и флавопротеина, способствуя образовании быстро восстанавливающихся смешанных комплексов. БФ не изменял характер восстановления олигомеров и генсамеров цитохрока Р4502В4, а восстановление мономеров при запуске реакции КАИРЕ также становилось двухфазная.

Таким образом, эмульген 913 в различных концентрациях оказывал сходное действие на хннзгеческие парамзтрк

£2

илврн-завискмого восстановлзния цитохрома Р4501А2 и 7-ЗР0/Т активность. Это свидетельствует о "токп что детергент влияет на ' стадию переноса 1-го электрона в монооксигеназной реакции, т.е. на процесс взаимодействия идтохрома Р4501А2 я иизш-Ш. В случае цитохрома Р4502В4 полного сходства зависимостей кинетических параметров восстановления и к-деметилазной активности от концентрации змульгена 913 не наблюдалось. По-видимому, детергент В этом случае влиял на стадии, следующие за реакцией перекоса 1-го электрона.

вывода

1. МоЕомеризацзя цитохрома Р4501Д2 по сравнению с Р4502В4 происходит- при концентрациях эмульгена 913 з 30 раз болъшкх. При переходе в мономерною форму цитохром Р4501А2 в отличаю от Р4502В4 теряет гидроксилазную активность в !Ш)РЯ-зазксиг«ых реакциях.

2. Максимальную активность в ЯАВРН-завискак гидроксилазных л редуктазных реакциях обеспечивает структура цитохрома Р-450, близкая к гэксамерной.

3. Две изоформн цитохрома Р-450 отличаются по сродству к субстратам и редокс-партверам. Сродство цитохрома Р4501А2 к 7-этоксирззоруфину на три порядка вше, чем сродство цитохрома Р45С2В4 к бензфетамину. Большим сродотЕом к цитохрому ъ5

- обладает цитохром Р450234, а к ГШЗРЯ-ФП - цитохром Р4Б01А2.

4. Показано, что отличие' кинетизси дитионит-завясимого восстановления двух изоформ цитохрома Р-450 заключалось в том, что процесс восстановления мономеров цитохрома Р-4501А2 был двухфазным, а мономеров штохрома Р4502В4 - монофазнкм-

"'5. Цитохромы Р4501А2 и 2В4 в отсутствие субстратов взаимодействовали с МРН-ФП по принципу случайных соударений. Наличие быстрой фазы в ИАШЬзазисимой реакции восстановления

цитохрома P450IA2 в . присутствии субстрата обусловлено восстановлением преформированных комплексов гемо- и флавопротеина.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО TEMS ДИССЕРТАЦИИ: I. Kanaeva I.P., Skotselyas E.D., Turkina I.P., Petrochenko E.V., Davydov D.R., Kondrashin S.K., Dzhuzenova Ch.S., Bachmanova G.I., Archakov A.I., Reduction and katalitic properties of cytochrome ^-450 Ш2 in reconstituted system containing monomeric carriers. Biochem. Biophys. Ees. Commun., 1987, v. 147, pp. 1295-12992. Канаева И.П., Севржова И.Ф., Никитюк O.B., Бачманова Г.И. Кинетические параметры NAEPH-зависимых реакций в микросомах и мономерной реконструированной системе. В тезисах 5-ой Всесоюзной конференции " Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". Ялта, 1989, с. 83.

3. Kanaeva I.P., Dedinsky I., Skotselyas E.D., Sevrukova I., Kuznetsova G., Samenkova N.P. Comparative study of peroxidase activities of monomeric and membrane-bound microsomal cytochrome P-450. Proc. 7-th International Conference "Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics". Moscow, 1991, pp. 283-290. 4- Baohmanova G.I., Sevrukova I .P., Archakov A.I. The comparative study of systems reconstituted in the absence of phospholipids and containing cytochromes P4501A2 and P4502B4. . Proc. . 9th International Symposium- on Microsomes and Drug Oxidations. Ierusalem, 1992, p. 202.

5. Kanaeva I.P., Dedinskii I., Skotselyas E.D., Krainev A.G., Guleva I.Т., Sevrukova I.P., Koen Y.M., Kuznetsova G.?., Bachnanova G.I., Archakov A.I. Comparative study oi monomeric reconstituted and meraorane microsomal monoozygenase cystems oi the rabbit liver. Arch. Biochem. Biophys., 1992, v. 297, P-

24