Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноксигеназная система растительных микросомальных мембран

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моноксигеназная система растительных микросомальных мембран"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ГРУЗИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ РАСТЕНИИ ИМ. С.В.ДУРГЛШЙДЗЕ

На иравзх руколгиси

УЖ 581.12

Хатисвшвилк Гаа Алфезович

МОНООКСИГЕНДЗНАЯ СИСТЕМА РАСТИТЕЛЬНЫХ ЮИРОССТШЬШХ НЕМБРАН

03.СЮ.04 - Биохимия

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тбилиси - 1991

Работе вшголнена в Институте б^химии растерий им. с.В.Дурми-пшдзе Ал Республики Грузия.

Научный руководитель - кандидат биологичскит. наук Гор-азнаки Иарлен Шалвович

Официальные оппоненты: чл.-к&р. АН Республики Грузик,

доктор биологических наук, профессор Угрехелвдзя Дэви Шалвович доктор биологических наук, профессор Прувдзе Гурам Николаевич

Ведущая оргнизация - Кафедра биохимии Тбилисского Государственного университета им. И.Дкавапишили

Защита состоится 12 апреля 1991 года в ¿¿'часов на заседании специализированного совета К 007.04.01 по присуждению ученое степени'кандидата биологичских наук в Институте биохимии растений им. С.В.Дурмишидзв по ыресу: 380059 Тбилиси, Аллея Давида Агмашеяебела,-10-ый км.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Оио-гимии растений им. С.В.Дурмитидзе.

Автореферат разослан 12 марта 1991 г.

.Ученый секретарь саоциализитчэЕанясго совета кандидат Зислогачсккх наук

Ы.Б.Бевдаашсгеилк

.3 —

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность- проблема. Растения могут эффективно утилг.зиро-ватъ и трансформировать многие ксенобиотики, источниками котсрих -являются промышленные химические отходы я применяемое в зельскс.?; хозяйстве гербицида, пестициды л другие химикаты.

После попадания в растительную клетку, как известно, часть молекул чужеродных соединений коныягирует с эндогенными вещества- ■ ми, а часть подвергается окислительной деградации. Некоторые ксенобиотики при этом превращаются в субстраты внутриклеточного метаболизма ш разлагается до конечных продуктов биологического окисления и том самым полностью обезвреживаются. Однако, в ходе био-трансфсрмации некоторых ксенобиогеков, в частности, ароматических "окинов, генерируются метаболиты; которые для хивотных я человека лзляются более токсичяыки, чей исходные ксенобиотики.;

Как видно из Екшепзлоквнного, усваивая ксекобкотаки, растения выполняют ваанув роль "зеленого £кльтра" меяду окрузкакцпЯ средо.Ч и чэловс-ко.-.:. Поэтому изучение вопросов, касандася возможных путей превращения ксенобиотиков в растительных организмах и фу:паиониро-вания участвугох в.тх метаболизме ферментных систем, является весьма актуалыкм.

■ Ключевую роль в отжслительксм катаболизме ксенобиотиков играет цитохрсм Р-45С-содоркацая монооксигеназная ферментная система. Очевидно, что выявление особенностей функционирования упомянутой фэрнентнсЗ системы в растениях имеет больаое значение для решения ряда задач современной ксеиобиохимии.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выявление некоторых особенностей функционирования цитохрсм р-450-седгркызах монооксигеназнш: систем б растительных объектах у. изучение регуляции цп ■ эхром р~450-з движимого гидроксилирования кеонс—

Оиотиков внутриклеточными метаболцчесними процессами. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация растительных цктохром р-45а-содержащлх мокэ-оксигеназ и изучение возможности их индукции • путем выращивания растений на икдукторэ.

2. Изучение гидроксилирущей способности растительных микро-

сом.

3. Исследование возможности переключения цитохром Р-450-1;- ■ даркацей моноскзигоназы с биосинтетическсго на детоксикацаоншЕ путь.

4. Установление характера взаимного в-лияния процессов пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) и гидрсксилирования ксенобиотиков.

Научная новизне работы. Впервые показаны количественные изме-нэния содержании цитохрома Р-450 при выращивании растений на ксенобиотиках; изучен процесс свободного окисления ИАПРН в растительных кикросомах а выявлено функционирование редокс-цикла НАЗРН при дефиците кислороде; установлено, что реакции НАВРН-зазисимого гидрсксилирования разные ксенобиотиков носят конкурентный характер; показана корреляция мевду физико-химическими свойствами ксенобиотиков и кинетическими параметрами процессов их окисления; доказана ьозмжностъ переключения цитохрома Р-450 с биосинтетической фукк-к я детоксккационаус.

Практическая ценность работы. Сведения о факторах, ялиящах на функционирование цптохром р-450-содеркащей монооксигеназпой система в растениях, могут найти применение, в ксенобисхимических исследованиях. Методы, сценки монсоксигеназкой активности растительных объектов мст^ т быть использованы для рекомендации растений в каЛстве очистителей • Зкссфэры от некоторых химических вьгрязни-телей, в ососбнкости гидрофобных соединений ароматической природа.

Работа выполнена по плановой теме, утвержденной Президиумом АН Республики Грузия (Госрегистрационный Ji 01822028697).

. АпроС-зция работа. Материалы диссертации доложены и представлены 'на Республиканских конференциях молодых ученых по .биохимии биополимеров и биотехнологии, Тбилиси, 1935, 1987; ш Республиканской научной конференции по вопросам физиологии и биохимии, T6hjùioh, 1937; г? Всесоюзной конференции "Цитохром р-450 и охрана окрукающей среды", Новосибирск, 1987; i Республиканской молодекной конференции по охране окружагаей-среды, Тбилиси, 1989; vi Межуниверситетской конференции "Биологические мембрана в нсрмо и патологии", Тбилиси, 1939; V Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 19S9.

Публикации. По данным диссертации опубликовано 11 работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из вЕедекия, литературного обзора, экспериментальной части, - обсузсдегая результатов и еыводов.- Работа изложена на 312 страницах машинописного текста и содеркит 11 таблиц, 18 рисунков и список цитируемой литературы, состоящий из 1Э5 работ(из них 307 иностранных публикаций).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Объектами исследования служили проростки однолетних растений: СОИ (Glycine hispida), гороха (Pissum sativum), райграса (Lolium .nultiflorun italicun), а также листья многолетных - ореха (lugians regia), тополя (Fopulus gracilis Crosah), биршины обыкновенной (bigustnai migare L. ) И ЕВЫ (Salix alba). Проростки выращивались в термостата (25-28°С) на гвдропочвв. С целью изучения индукции растительных мокооксигеказ проростки выращивались на растЕорах исследуемых векеств с концентрацией lraíí. В опытах применялись как

- в -

.этиолированные, так и выращенные на свету растения.

Микросомальную фракцию получали из корней или листьев растений методом дифференциального центрифугирования. (Карузина, Арча-ков, 1977]. Средой выделения служил 1/15и кн^ро^-иазнро« буфер рН-7.4. В случае■выделения мшфосом из листьев к буферу добавляли ш 1 шМ диэтилдитиокарбамат-ма, дитиотрейтол, ЭДТА, а также 0.1* пе-якБшшлпироллидон (м.м. 25-30000). Суммарные фосфолипида-экстрагировали из семян сои метанолом [ОртнЕр, Рейхель, 1939].

Концентрации цитохромов bB, Рт450 и р-420 определяли спектро-фотометрическим методом [Ошига, Sato, 1964]. Белок определяли по Лоури [Lowry et al., 1951) или Брэдфорду • [Bradíord. 1974].'

Полярографическим тюкм устанавливали окислительную способность исследуемых объектов, а также определяли некоторые кинетические параметры окислительных процессов.' Исследования проводились в ячейках открытого "типа (объем 1,3,4 или 5 мл),* снабжении* мембранными (силар. купрофан или тефлон) кислородными электродами [Брискер .и др., 1S34], на биооноргометрах "Дигоыи" и "Лиахви" (рйзработка СКВ Ш АН Республики Грузия). Этим же методом контро-•лировали отсутствие в полученных микросомальных фракциях митохон-дриального белка с помощью специфических субстратов и ингибиторов цитохромоксидазного дыхания.

N-Деметилазнуг активность фракций оценивали по количеству генерированного формальдегида (ФА) [Naan, 1953*3, ПОЛ - ,по выделении малснового диальдегида (ЦДА) {Стальная, Гсвшбили, 1977]. Актив-похь.¿-гидроксилазы транс-коричвой кислоты определяли спектральные методом (на 263 нм),.а также применением радиоактивно меченного препарата. Изменение концентрации КАБРН при окислительных процессах оценивали сгоктрофотсматричеоки, измеряя поглощение на 330 ей Канаьва и iy., 1935]. -

- ? -

• . 4-"с-коричнув кислоту синтезировали по схеме:

■ Толуол ■ ■ Хлористый_ . Ввнзаль- коричная

бенвидиден • дегид кислота

[Агрвномов, Шаберов, 1971; Цряниишпсов, 1952 s Вейганд-Хигельтаг,

1968]. ' '

. В ■ исследованиях применялись центрифуги hfw-340 (Польша ), К-23 и К-24, ультрацентряфугн vao-601 и UP-65 (ГДР), спектрофотометры СФ-26(СССР) и Speool (ГДР), 'Двухлучевые дифференциальные спектрофотометр! Speoord CV-VIS и Bteeord М-40 (ГДР), сцштиляционные счетчики Б1г-20 (вранция) и 1£В (Швеция) (о эффективностью 95jS).

Статистическую обработку данных и определение кинетики ферментативных реакций осуществляла методой наименьших квадратов //

[Гордон, Форд, 1976; Корниш-Боуден. 1983; Крупянко, 19871 на ПЗВМ с применением специальных программ, разработанных автором.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Идентификация цитохромных компонентов и их индукция Спектральными методами обнаружены компоненты монооксигеказной систеад - цитохромы ьв и Р-450 в микроеомальной фрахшга из корней проростков сои, горохе и райграса.- Подтверждаются литературные данные о том, что' количество и активность цитохрома р-450.в растениях во многом зависят от возраста и условия выращивания проростков, в частности, от режима освещения [Hendry et al., 1986]. Максимальный уровень цитохрома Р-450 наблюдается в равней стадии развития проростков, в возрасте от 3-4 до 7-8 дней, à затем наступает постоянная в необратимая инактивация гемопротеяда. В растениях, выращенных в этиолированных условиях, концентрация цитохрома Р-450 выше. Следует откэтить. что в этих образцах, как правило, наблюдается более высокг - монооксигенезну активность >«икросом, чем при

выращивании ргстений на свету.

Наибольшее количество цитохрсмов ъ5 и р-450 (соответственно 0.91 и 0.30 нЫ на мг белка) обнаруживается в микросоках из корней сои, когда возраст этиолированных проростков достигает 4-5 дней (рис.1). В этих образцах содержание цитохрома Р-420 минимальное. В микросомах из корней"проростков гороха и райграса концентрация фермента достигает соответственно - 0.13 и 0.09 нЫ на мг белка.

Установлена возможность иццукцил монооксигеназных систем некоторыми эндогенными (коричная кислота (КК)) и экзогенными (диме-тиланилин (ДМА), бенз(а)пирен (Ш)) субстратами цитохрома Р-450. При выращивании сои на гидропочве, содержащей 10"ЭМ КК, концентрации цитохромов Р-450 и ьв в микросомах становятся максимальными после 72 часов преинкубации и их содержание увеличивается в 1.3-1.4 раза. Более интенсивная индукция ксенобиотиками наблюдалась в микросомах из корней райграса, гдо после 72' часов выращивания на 30~3 к растворе гидрохлорида ДМА фонд цитохрома Р-450 по сравнению с контрольными растениями увеличивается приблизительно в Е * -

0.04 !

0.02

Я.нм

Рис.1 Дифференциальные спектры поглощения восстановленной дитио-еитом (—.....) и дитаонит * СО (-) микросомальной фракции из косней 5-дневннх этиолированных проростков сои.

3 раза (табл. 1). В этой же таблица даптся результаты индуктбм после выращиваний,, райграса на БП, где изменение количества гд го-хрома Р-450 почти не наблюдается. При увьличешга време;:л Енраажьз-ния на ксенобиотике до дв чассов содержание иитохрс.ма р-450 прекращает расти. .Его уровень фактически не меняется и поел- перенесения рьстенгй на обычную гидропочву, .йния карткна каолю^ае-ся по отношению к. цитохрому Р-4Г0. количество которого неизменно уьг.";;-чивается так в контрольных, так и в индуцированных варианта:-:, причем максимальный прирост этой формы гемопрЬтеида характерен для растений, которые преинкуСироьалтсь на ЯП.

Кз этой же таблицы видно, что при увеличении времени воздействия ксенобяолисов In vivo растения стремятся сохранять определенный пул цитохрока v-450. Известно, что цитохром Р-tbO,. катализируя реакции гидрйкеялирования ксенобиотиков, претерпевает инактивацию и переходит б ферму р-420 [Арчаков, 1?3YJ. Видано, накопление в растигелышх макросом ах цитохрока р-420 во время индукции является результатом конверсии отработанного при дотоксикиии ксенобиотиков цитохрома Р-450. Разницу в количествах кндуцкрован-ного цитотрома P-4Z3 под влиянием"ЕП и Д1А мокно объяснить образо-

Табл.1 Содержание цитохромов Р-450 и Р-420 (в нМ/мг белка) в микросомах из корней этиолированных проростков райграса после индукции ксекобиотичами.

Объект Преинкубация 72 часов Прзинкубация 96 часов 3 дней после преинкубации

цит. Р-420 ЦИТ. Р-450 цит. Р-420 цит. Р-450 цит. Р-420 цит. Р-450

Контроль 0.03 0.07 0.12 0.08 0.35 0.G7

Выращ. на ДМА 0.07 0.23 .0.30 0.22 0.43 0.21

Выращ. ня БП 0.23 С.07 ' 0.37 0.03' 0.51 G.00

Банком более активных продуктов при окислении первого. 00 их образовании свидетельствует сравнение степеней стимулирующего воздействия продуктов окисления БП и' ЛМА на накопление МДЛ при ПОЛ: в присутствии МАВРН и БП инициация ПОЛ увеличивается на порядок (табл.2). Такого родя влияние свойственно образованным при гидрок-силировании ЕП реакционноспособным радикалам кислорода [Еуегкоувк! ег а!.. 198'/ -

Табл.2 Влияние НАЯРН, ДМА и БП на процесс ПОЛ в микросомах

Варианты опытов Выход МЛА, нЫ '(ыин.мг белка)

Контроль 15.Э 5 1.1 .

♦ КАВРН 30.9 I 0.6

- ЛМА 20.1 - 3.2

♦ КАБРН + ДМ> 46.7 т 1.7

» БП' 46.4 ♦ 4.3

- КАБРН + БП 142.2 ♦ Р.?

Как уже отмечалось, при увеличении времени выращивания тенденция к накоплению 1Штохрома Р-420 наблюдается и в контрольных вариантах, только в метшей степени по сравнению с индуцированными растениями. Вероятно, это связана с конверсией цитохргта Р-450 при возрастании его пероксидззной нктишостк [НепАг^ а1., 1986], которая, как известно, ув^лич.-гряетпя при росте растений [Минаева, Сэдвакяссва, 1981].

Исследование цитохром Р-450-зэе;;симой монооксигеназной активности

Монооксигеназную активность рз^тительных ыпкрог.сял м-гхно сце-1г,*7ь по интенсивности реакцга КАБРН-зависимого окисления суЗстра-тэл гидроксилированкя. Кв рис.2 приводится типичная полярогрвмма

г 11

1.7ЦМ IIADPH З.ОЦЫ ДМА

1.7ЦМ NADPH

J 1 уин

Q(oa)

Рис.2 Подпрограмма окисления NADPH и ДМА в мтсросомах из корней сои. Состав инкубационной среда (1мл): 1/15М кнгр0«-нагнр04- буфер рН-7.4; 0.8 мг/мл микросомального белка. Q(o2) - исходное дыхание. Скорость потребления кислорода - s Ю-7 м/(мин.мг белка).

IJADPH-зависимого окисления Шк - субстрата. цитохрома р-450. Процесс потребления кислорода почти полностью ингибируатся СО, и'в меньшей степени, другими специфическими ингибиторами цитохрома Р-450 - кетирзпоном и SKF-525A. Эти данные указывают на функционирование в растительных микросомах монооксигеказной систо-.з», терма-нальним компонентом которой является цитохрбм Р-450.

Растительные микросомы для осуществления моноэксигеназкух реакций могут использовать и NADH. При одновременной добаЕ::е oCo;:z никотинамядных коферментов максимальная скоррсть окисления ДУА наблюдается при количественном соотношении NADPH:NADH 4:1, как и в микросомах печени кроликов во время окисления нафталина {Метелица, 1982]. СО полностью ингибирует процесс, что свидетельствует со участии в нем цитохрома F-450. Вероятно, при использованиях соот-отношениях никотинамядных коферментов устанавливается оптимальное согласование двух - 1UDPH- и NADH-зависимых микросок.альных редокс-цепей для обеспечения электронами гиАроксилирущей" системы.

По скорости потребления кислорода при СО-чувствительном "АиРК-зэвисимом окислении ДМА оценивали такае моноокскгеназку-о активность разных органел нефотосинтезпруквдй (корни) и фстосинтезк-руидеЯ (листья; тканей растений. В корнях бся монооксигвназная активность локализован?» во фракции макросом и только незначитель чая часть проявляется в митохондриях (до 5£-ов) и супегн^такге микро-сомзльнс.й фракции (до 10-15>-об). Б ¡«ккросомах из устьев сои наибольшая часть активности сохраняется, в . листьях ке многолетных растений наблюдается иная.картина: здесь основными носителями данной зкгиьнооти деляются в равной степени фракция хлороплэотов и югевдель, тогде кяк в микросомах она почти полностью утеряна <табл,3>. Сращэняв активностей органел листьев разного Еозрэста •показало, что при их старении общая монооксигеназная способность снижается. Следует отметить, что КАЬРН-зг.висимая 'активность 1.05.10^ гупернвтанта не снижается с увеличением центробежного ускорения до 1.5Л03£. Этот результат позволяет считать, что в этой-- клеточной фракции суаествует раса^оримая форма цитохром р-450-зависикой монооксигенззы. Не исключена также возможность п&-

Тьол.З ЛМА-окислительная способчость клеточнмх {ракций листьев

Скорость потребления хислорода, хО^МАмин.мг белка)

Рьстенге

5.10э6 осадок

ивт-г^н

И

♦ДМА

осадок

¡»А1!?й

«аЬГ ъ -ДМА

1.05.10=2 осадок

."АЕГН

!ка"рн

г +ДМА

1.05.1с*е суперкатант

КАОРН

ЯАПРН

♦ДМА

С-оя -Орех Иьа

Тополь

г>»зк.чип'э

тг 31

22 /с.

122 £8 24 14

50

23 19 34 12

29

6Ь 16 <!\5

<8.5 , <8.Ь

I С -

I .<8.0

чб.С-

-.Ь.Ь

14 34

43

34

13 чр

рехода микросомального фпрмента в растворимую фазу при получении микросомальной фрагоии. Нэ животных объектах, например, сбнэрутггю 'увеличение данной 'активности при перехода в растворимое ■ осто.чкчо .цитохрома Р-450 вследствие дезагрегации его тетрпкерных структур до димеров ГВинер к др., 1387].

.' Изучение изменений активностей МЕГН-зависимого окисления после индукции показало, что в результате преинкубации растений на ксёнобиотик-содержащей среде ферментная система с более высокой интенсивностью окисляет не только ксенобиотик-индуктор, но и чуке-родгше соединения другой химической природы. Это указывает на меньшую специфичность растительных мснооксигензз по срзвне::ию с аналогичной ферментной системой уевотного происхождения.

Свободное окисление иавгк в растительных микросом.т-: Как известно, микросомы животных з условиях отсутствия ксенобиотика интенсивно осуществляют окисление ;;ш>н.'Лто т.н. сб."годное (несоггряженное с-гидрохсилирсвением) окисление никотинаадсного кофермокта [Жуков, Арчаков, 1935]. В растительных микросомгх. ол:;з-ружено наличие нескольких оксидазных' путей свободного '¡кксл-.'гил КАБРН, так как, блокируя н'а 9С№ окисление ДШ, СО всего на 4С? выключает МАБРН-окисляпцую активность. Окисление же ча'орн другая неспецифетескими редокс-слстемзмк полностью подавляется блокэтсрэ-МУ; эн- (п-хлормеркурий бензозт) и ферро- (ксн, НаН3) группировок. Можно считать, что попадание в реакционную среду субстрата гидрок-силировшшя является сигналом, предопределяющим использование ИАБРН преимущественно цитохром Р-450-завнсимой редокс-цепью. Следует также подчеркнуть, что чем выше валовая монооксигеназнйл активность, тем больше ИАВРН расходуется при окислении субстратен гидроксилирования. .

Процесс свобод юго окисления №4СРН в микросомальной -фракции

Рис.3 Кинетика свободного окисления .iiadph в микросомах и?, корней сои. Состав инкубационной среды (1ыл): 1/15М кн2ро4- иа2нро, - буфер рн=7.4; 0.7 мг/мл микросомального белка. Q(o2) - исходное дыхание. Скорость потребления кислорода - в 1С-'м ог/(мик.мг белка).

из корней сои подчиняется уравнению Кихаэлисэ-Ментен (рис.3). При последовательном внесении ь инкубационную среду возрастающих количеств касрн, наступает период'насыщения, после чего наблюдается понижение кинетической кривой, которая в конечном счете принимэат классический вид кривой ингибирования продуктом. Однако, дальнейший анализ показал, что окисленная форма кофермента не ингиб/рует окисление' его восстановленной формы, т.е. не является конкретной причин;.:? Енгпб-.грования. Эту функцию должен выполнять вещество-акцептор, переносящий редуцирующие эквиваленты на окисляемый субстрат. Процесс лимитируется концентрацией молекулярного кислорода и соответствующего субстрата. Схематически '¿то мокко представить следующим обрзсэм:

ilADPS - А* — liADP* ♦ АК (1)

♦ 0Р ♦ н*

АЛ ♦ РН---:-► А* + SOH -» Н2С (2),

- г.киептор; ¿н - восстановленная акцептор; sh - субстрат гкд-рск::плйрсвяаия5 '

- -И -

Акцепторами б этих процессах могут служить вещества, ггодойыо липидам или хинонам, а ферментами, обусловливающими такого рода перехода - дегидрогеназы типа Н.Ф.1.1.1.24 и редуктазы т:.гггз Н.Ф.1.S.SS 2. Перемещение равновесия в процессе (1) в правую сторону должно предопределяться реакцией (2).

В пользу таких соображений свидетельствуют и результаты, полученные. в ■ условиях недостатка кислорода' в реакционной среде (рис.4). Оказалось, что в это время происходит обратный перекос редуцирующих ¿квЕБалентсв на окисленный ксфермент. Добавление в момент наступления гипоксии NADP" или NAD*, смещая равновесие реакции (1) в сторону образования NAEPR, еще более усиливает указанный эффект. Описанный процесс полностью подавляется ¿локаторами электронно-транспортной цепи - фэрпициакидсм калия и вдтохроюм с, а такте ингибиторами цитохрома р-450 - кетирапоно» и СО, Это указывает на участие вышеупомянутых компонентов редо?с-п-пк в рассматриваемых реакциях. % %

Гис.4 Динамика свободного окисления NADPH микросомами из корней сои при дефиците кислорода. Состав инкубационной среда (3;/л): 1/1ЕМ кн2ро4-магнро, буфер рН=7.4; 2.0 мг/мл микросомзльного белка; 6пa NAPPH; 3mJf MVP'. -

Кинетика НАРРН-зависимого гидроксилировэния ксенобиотиков Б ыикросомзльной фракции из корней сои и райграса установлены некоторые кинетические параметры КАПРН-Еависимого окисления веществ разных химических типов, которые считаются субстратами цито-хрома Р-4501 Ш1А, КК, анилин (АН), БП, п-нитроанизол (п-Н&), еми-ношфин (АЛ). Превращение" всех этих веществ на 80-90$ подавляется • монооксидом углерода.

Графики кинетики ферментативных реакций в координатах Лайнуи-ЕСра-Бэрка (рис.5) указывают на существование конкуренции между субстратами гидроксилирования га место в активном центре фермента. По величине сродства к ферменту субстратов цитохрома р-450 можно поставить в ряд:

БП > ДОА > п-НА > КК > АН > АП Интересно, что в точно такой же ряд укладываются эти вещества по степени их гидрофобности. Под этой величиной подразумевается коэффициент распределения приведенных соединений мецду неполярным (гексан) и полярным (вода) растворителями.

Ожидалось, что между величинами Кт и степенью гидрофобности этих 'веществ будет существовать прямолинейная зависимость, так как

БП

1/{Ь]

Рис.5 Кинетика КйЛРН-зависимого окисления некоторых субстратов датохрома Р-450 в микросомах из корней сок.

г 17 -

конкуренция между ниш додана обусловливаться их чисто фиЕкчо-хь-мическими свойствами, в том числе и гидрофобностыо. Ка самом же деле оказалось, что такая зависимость- существует между бьличинсми 1/Кт и кубичэским корнем из степени гадрофобности (рис.б), т.е. гидрофобностъ вещества является одним (но не единственным), из тех основных свойств, которые, спредоляют его превращение монооксиге--нвзным механизмом. Другими подобными свойствами субстрата могут быть: природа химической связи, силы взаимодействия с липидаж и с аминокиолотныьи остатками в непосредственной близости иона железа активного центра и Др.

Эта особенность растительного цчтохрома Р-450, по-видаому, связана с его четвертичной структурой и строением активного цент ра. По данным некоторых исследователей (Куликов и др., 'Э891, ци-тохром V—ЮГ) "погружен" ь южросом&льную мембрану. Келезо активного центра расположено в глубине бэлка, и расстояние ст водкой .раза до достигает 1.4 ал. Полученные результаты позволяют сделать предположение. что в пространстве между гемом активного центра и водной фазой должен судествовать определенный компонент, служзщтй переносчиком субстрзта от водной фазы к активному-центру, а нро-дукта окисления' - в обратном направлении. Испольнить такую роль 'могут и мс-мбрэкные фосфолигода, расположенные тг.ким образом, чтобы б

3/Н

^о.б Корреляция мегту ьеличглами средств к ферменту и кубическим ссрнем степени гидрофобное™ субстратов цитохрои? Р-450.

1/kir,

направлении активного центра создавался возрастающий градиент гид-рофобности. Неполярные субстраты под влиянием такой лшшдной оболочки легко оторвутся от водной фазы и направятся з активный центр. Продукты окисления, являющиеся полярными веществами, будут вытеснены с активного центра в обратном направлении теми же силами 1-радианта. . " ■

Таким расположением фосфолидадов можно объяснить более низкую субстратную специфичность растительного. цктохрома р-450, которая проявляется в конкуренции, между субстратами, а также в зависимости величины сродства фермента к субстрату от степени гидрофобности. Чем гидрофобное будет субстрат, тем быстрее он проникнет через ли-пиды к активному центру. •

Переключение растительного цитогрома Р-450 с биосинтетичской на детоксикационную Функцию' ' В качестве модели "эндогенного" обмена выбрали"биосинтез фе-иольных соединения, в котором одним из ключевых ферментов служит 4-гидроксилаза транс-коричной кислоты (Н.^. 1.14.13.11) - моноок-сигеназа, содержащая цитохром Р-450, [йизве1, 1971]. "Экзогенный" режим функционирования'представлял процесс Ы-двметилирования ДМА, катализируемый цитохром Р-450-зависимой мснооксигеназой н-дэме-тилазой ДМА [Арчаков,1975].

Установлено, что в присутствии ДМА значительно увеличивается концентрация ЮС из-за торможения ее дальнейшего превращения (рис.7). этот результат указывает на ослабление Сиосинтетической функции, из-за переключения гемопротеида на монооксигенирование ксенобиотиков. Как видно из рис.7, при одновременном протекании этих реакций биосинтетический процесс подавляется примерно на 70-80?, а детоксикацоннкй - ограничивается лись на 25-ЗОЖ. Аналогичная картина получается-с применением радиоактивных препаратов

КК и фенилаланина (ФАЛ). В присутствии ДМА ингибировалось включение радиоактивной метки в суммарную фракцию февольных соединен;-!;!. Кинетический анализ ИАБРН-зависимого окисления КК и ДМА (рис.5) выявил более высокое сродство (в 3.5 раза) гемопротеида к ДМА по сравнению с КК.. Ир этих же данных виден конкурентный характер ин-гибирзвания 4-гидроксилазы КК диметилачилином. Наряду с ДМА,' исследовано также влияние и других экзогенных субстратов цитохромэ Р-450 на активность 4-гидроксила-ы КК. Как видно из табл.4, все применяемые ксенобиотики характеризуются ингибирунцими свойствами. Следует отметить, что эти данные также коррелируют с величинами сродства фермента к субстрату и степенью гидрофобности этих веществ.,

100

50

В - превращенная КК g - образованный ФА

4

Рис.7 Взаимосвязь■реакций 4-гидроксилирования КК и к-деметилирова-ну.я ДМА. Состав инкубационной среды (Змл): 1/15И кн2ро,-на2нро« буфер рН=7.4; 2.0 мг/мл микросомального белка; 6 шМ NADPH; 1-60 пЛ ФАЛ; 2 - 60 тМ ФАЛ ♦ 18 inli ДМА; 3 - 60 rail КК; 4 - 60 irif КК + 13 пН ДМА; 5 - 18 шм ДМА. Время инкубации 1 ч. За 10056 принимали 1, 3 и С варианты опыта.

Табл.4 Влияние ксенобиотиков на активность 4-гидроксилази КК.

Ксенобиотик Активность,%

Контроль 100

дал 27.2 ? 3.5

Эпдаюрфщ 37.6 ♦ 3.5

п-НА 34.7 V 3.6

АН 47.5 ? 5.1 '

АП ' . 49.1 * 1.8

Таким образок, можно предположить, что в бвосинтетических и детоксшсационша процессах участвует одна и та в форма шгаахрома Р-450.

ПОЛ и процесс гидроксидированш ксенобиотиков Исследовано влияние ферюнтативного ЛОЛ на и-демэтиларовааке

ЛИЛ. В опытах часто обнаруживаются одинаковые воздействия стимуля-

*

торов к ингибиторов „обоих процессов.

Иная картина наблюдается при окислении ЯНА в условиях инициации ионами Ре** неферментативного ПОЛ (табл.5). В момент возвращения полярографической кривой ва коытроодгай уровень реакция гвд-роксилкровзния.ксенобиотика сильно подавлена. Ингибирование носит обратимый характер, так как внесение в инкубационпуп среду суммарных фозфолипкдов вызывает почти полную реактивацию н-деметилазвой активности. Употребление белее высоких концентраций ионов Ре*», в также увеличение интервала времени между инициацией ЛОЛ и внесением в систему лшшдов делают необратимым аффект ингибированил.

Указанный аффект можно' объяснить тем, что нефарментатнвное ПОЛ рр.зрувитеяшо. действует не липидннЯ покров актиглого центра гемопротеида, так как в этом случае атака свободными радикальными частицами происходит со стороны водной фазы. При низкой интенсив-

'Табл.5 Влияние ге*г-иницированного ПОЛ на деметилазную активность. (Дипиды•были внесены спустя 10 мин после добавления

Варианты опытов Актиеность,%

Контроль 100

+ ке*г БОцЫ1 45 ♦ 2.5

* Липида ЭО ♦ 2 «о

* ре*2 70иМ 20 ; 2.8

+ Липидк 23 ♦ 2.8

ности ПОЛ лишдный покров, разрушаясь, тем самым защищает белковую часть активного центра фермента. В случае своевременной подачи новых липидов активность фермента восстанавливается. Более высокие концентрации свободных радикалов или длительное протекание ПОЛ вызывают полное исчезновение липидного "щита", и происходит выход из строя фермента. По этой причина инактивация приобретает необратимый характер.

Некоторые аспекты регуляции гидроксилировакпя _ ксенобиотиков

Полученные результаты дают основание полагать, что интенсивность мккросомального цитсхром Р-450-зависимого гадрокешагоомния ксенобиотиков обусловливается несколькими факторами.

Основным контроллрунзим звеном является наличие восстановительных эквивалентов в виде наб(Р)н, израсходование которых при отсутствии ксенобиотика происходит самым экономным образом. В случае наличия чужеродной молекулы редуцирупдий потенциал преимущественно потребляется на гидроксилирование.

Гидроксилирование ксенобиотиков регулируется также интенсивность») цитохром Р-4Ь0-зависимыг. биосинтетических процессов. Здесь весьма вазели является■существование механизма переноса субстрата

гг -

в иитохрому Р-450, "что позволяет гемопротеиду служить универсальное "ловушкой" для неполярных веществ как эндогенного, так и экзогенного происхождения. Чем гидрофобнее ксенобиотик, ген большая часть общего фонда фермента переключается на его окисление.

' Липидные компоненты выполняют значительную роль в регуляции детоксиквционных процессов. Они способствуют окислению ксенобиотиков при интенсивном протекании ПОЛ и, кроме того,, служат для сохранения активной кояфэриаит цитохрои.а Р-г450.

/'.."... ВЫВОДЫ: - '• ..

1.. В растительных объектах идентифицированы основные компоненты кикросомальной монооксигенааной сиотемы. Показано, что содержание цитохрома Р-450 зависит от освещения при,выращивании растений, возраста и действия индукторов. Индукцию могут'вызвать как вещества, являющиеся естественными субстратами гемопротеида, так и ,ксенобиотики. *

2. Растительная монскшягеввзная система осуществляет, свободное окисление 1ШЗРН, ив случае отсутствия субстратов окисления или' гри дефиците кислорода происходит рациональный расход фонда восстановленного никотинамидаого кофермента.

3. KlDPH-завасимое гадроксилирование разных ксенобиотиков . происходит по конкурентному механизму. Установлено наличие корреляции между величинами сродства к ферменту и кубичеким корнем сте-ю- гидрофобности некоторых субстратов цнгахрока Р-450. Серывнт проявляет повышенное сродство к более гидрофобным субстратам.

4. Проникновение ксенобиотика ь клетку является регуляторным сигналом для переключения цитохрома Р-450 на его окисление, т.е. в биосвптеткческих. и двтоксакащганных процессах участвует одна и тв-. и..» форма цитсхрока Р-450:

б. Ферментативный ПОЛ и гидроксилирование ксенобиотиков протекают по взаимробусловлиЕанцему механизму. При неферментативксм ПОЛ из-за разрушения липидной оболочки цитохрсма Р-4БС1 происходит обратимая инактивация фермента, восстанавливаемая внесением фоофо лшшдов.

6. Реакции гидроксилирования ксенобиотиков в микросомах регулируются наличием NAD(P)H и интенсивностью процессов цитохром Р-450-зависимого биосинтеза и ПОЛ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ОПУБЛИКОВАННОЕ ПО ТЭМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Адамия Г.С.. Хатисашвили Г.А. Изменение фенилаланин.-амуиак-етазной активности в присутствии ксенобиотика. Респ. конф. молодых ученых по- Зиотнмии биополимеров и биотехнологии. Тез. докл., Тбилиси, 1985, 36-37.

2. Хатисашвили Г.А., Адамия Г.С., Гордезиани М.Ш., Ломидро З.П., Ерпскер В.Л. Полярогргфгсесксе исследование гидроксилируищеЯ способности растительных микросоы. .Ссооц. АН ГССР, 123, 3, G21-623.

3. Хатисашвили Г.А., Адамая Г.С. Взаимосвязь реакций п-гидрокси-яирования коричной кислоты и N-деметилирования диметил&н.!,!г.шп при их совместном протекании. TII Реет;, науч. кон1. по вопросам физиологии и биохимии. Тез. докл., Тбилиси, 1337, îvî. •

4. "Хатисашвили Г.А., Адамия Г.С. Перекисное окисление мембранкъ-* фосфолипидов в модельных системах. Респ. конф. молодых ученых. Тез. докл'., Тбилиси,■ 1387, 11. .

5. Гордезиани Ы.Ш., Дурмишидзе C.B. Хатисашвили Г.А., Адь\*ия Г. С., Ломидзе Э.П. Исследование Сиосинтетической и детоксикапи-онной способности растительного цитсхрома ?-450. ДАН СССР. 1987, 295, 6, 1491-1493.

• 6. Гордезиани Ы.Ш., Хатисашвилж Г,А,., .гдаг,.я Г .-5.. Хулешвши J5.K. Исследование некоторых да^дтрсяа ? НО растительных

макросом. Тез. докл. Всесошг:, юяп Ч»««г.гхс.ч ?—ь50 и охрана окруканцэй среды", Новосибирск» i£B?_ 5i-52;.

7. Гордезиани М.Ш., Хатисашвили Г.А, t гда-жл ГС. Ломидзе-Э.П. Возможность переключения цитохрома т-450 с "эндогенного" на "экзогенный" резким обмена. Сообщ. АН Грузинской ССР, 1987, 126. 1, 161-164. : •

8. Адамия Г.С., Хатисашвили Г.А. .Некоторые рогуляторные аспекты функциошфования растительного цитохрома Р-450. Материалы I республ. малодек. конф. по охране окружавдей среда. Тбилиси,

' .1389 , 22-23. .

9. Гордезиани М.Ш., Хатисашвили Г.А., Адамия Г.С. Цитохром Р-450-содеркацая монооксигеназная система растительных мембран. Тр. VI межуниверситетской конф. на тому': "Виологические мембраны в ноше и патологии", Тбилиси, 1989, 41-43.

10. Хатисашвили Т.к., Гордезиани М.Ш., Ломидзе З.П., Адамия Г.С. Радокс-цикл НДДОН при недостатке кислорода в бесклёточной сис-Tn-ч^й pö.-.T.-h-;'?. 7 Bcf.c.cz. конф. "Цитохроы р-450 и модофикация Ыо1\ромол^кул", Тез. докл., Ялта, 1939, 155.

11. Тогонкдзе Л.Ш., Хатисашвили Г.А., Гордезиани М.Ш., Кобахидзе U.K. NAD(Р)Н-звЕисимое фракционное окисление дикетиланилина е • листьях растений. Сообщ. АН ГССР, 1990, 140, 1, 125-1?я.

Поди