Анализ влияния малых доз ионизирующей радиации на протонную проницаемость и активность H+-атфазы плазмалеммы клеток высшего растения

Шибарова, Анна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ влияния малых доз ионизирующей радиации на протонную проницаемость и активность H+-атфазы плазмалеммы клеток высшего растения
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Анализ влияния малых доз ионизирующей радиации на протонную проницаемость и активность H+-атфазы плазмалеммы клеток высшего растения"

На правах рукописи

С0Г

Шибарова Анна Николаевна

АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА

ПРОТОННУЮ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И АКТИВНОСТЬ НГ-АТФАЗЫ ПЛАЗМАЛЕММЫ КЛЕТОК ВЫСШЕГО РАСТЕНИЯ (CUCURBITA PEPO)

03.00.12 - Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 2006

Работа выполнена на кафедре биофизики Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Пятыгин Сергей Станиславович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Лобов Виктор Павлович кандидат биологических наук, доцент Дятлова Ксения Дмитриевна

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и

биофизики Каз.НЦ РАН

Защита состоится «2Ь> ШХЖСсР 2006 г. в ¿6 часов на заседании диссертационного совета К 212.166.06 Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского (603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23).

e-mail: dec@bio.unn.ru fax: (8312) 34-50-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского.

Автореферат разослан «¿£»> \ЛМХЛ 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, я

кандидат биологических наук, доцент ^ ^ ^ '^лександРова

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

ЛФК - активные формы кислорода, БМ — биомембраны, ДЦКД — дицикпогексилкарбодии-мид, КЦХФГ - карбонилцианид-т-хлорфенилгидразон, МДА - малоновый диальдегид, ПМ - плазматические мембраны, ПОЛ — перекисное окисление липидов, РАО — радиоадаптивный ответ, ЭМД - эффекты малых доз, 9-АА - 9-аминоакридин, 1+., - интенсивность флуоресценции.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее изучаемых вопросов в радиационной биологии является природа структурно-функциональных изменений, которые происходят в мембране под действием ионизирующего излучения. Результаты исследований, полученные в последние годы, весьма определенно свидетельствуют о том, что облучение в малых дозах вызывает многочисленные структурные перестройки в клеточных мембранах, сохраняющиеся длительное время после облучения и приводящие к изменению функциональной активности клеток (Бурлакова, 1994; Кузин, 1995; Виг1акоуа, 2000; Кудряшов, 2004). В структурно-метаболической теории А. М. Кузина (1986), а также в концепции «мембранного механизма биологического действия малых доз» Л. X. Эйдуса (2001) приводятся доказательства, что первичной мишенью действия радиации в малых дозах является не ДНК, а именно клеточные мембраны, и в этом состоит принципиальное отличие эффектов, вызываемых облучением в малых дозах по сравнению с большими. Следует отметить, что эксперименты по изучению действия ионизирующей радиации в малых дозах до сих пор в основном провозились на объектах животного происхождения. Практически отсутствуют работы в этом направлении, выполненные на растительных объектах, которым обычно отводится роль «переносчиков» радионуклидов по пищевым цепям. Между тем радионуклиды, поступая в растения из почвы и накапливаясь в их тканях, оказывают влияние излучением в малых дозах на многие процессы, которые происходят непосредственно в растительном организме.

Ионизирующая радиация в легальных и сублетальных дозах вызывает увеличение в мембране окислительных процессов, в частности усиление процессов перекисного окисления липидов, в результате которого происходит окислительная деградация мембранных структур (Кудряшов, 2004). Специфика нарушения окислительно-восстановительного равновесия при действии малых доз ионизирующей радиации пока не представляется однозначной.

Важнейшим показателем, от которого зависит нормальное функционирование клетки, является состояние барьера ионной проницаемости плазмалеммы Изменение проницаемости

мембраны тесно связано с её структурным состоянием (Владимиров, 2002). На настоящий момент недостаточно изученными остаются молекулярные механизмы биологического действия радиации в малых дозах на проницаемость мембраны и системы активного транспорта ионов в клетках высших растений. Известно, что на роль такой транспортной системы в растительных клетках претендует протонный насос, представленный Н*-АТФазой (Palmgren, 1991; Morsomme, Boutry, 2000). Большинство клеток растений характеризуется низкой проницаемостью для протона по сравнению с другими катионами, что определяет в значительной мере эффективность работы протонной АТФазы и поддержание рН-стата на оптимальном уровне (Воробьев, 1988; Опритов и др., 1991).

В этой связи вполне правомерно ожидать, что под действием ионизирующей радиации в малой дозе в плазматической мембране (ПМ) растительной клетки будут активироваться окислительные процессы, которые неизбежно отразятся на структурно-функциональном состоянии мембраны.

Исходя из этого, было проведено исследование влияния ионизирующей радиации при облучении малыми дозами на структурное состояние плазматических мембран, связанное с ним изменение барьера протонной проницаемости и активность ключевой транспортной системы плазматических мембран ЬГ-АТФазы в везикулах ПМ клеток высшего растения.

Цель н задачи исследования. Цель работы состояла в изучении изменения ряда основных структурно-функциональных показателей плазматических мембран клеток высшего растения (Cucurbitaреро) в результате воздействия малых доз ионизирующей радиации.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Анализ нарушения Непроницаемости везикул плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации.

2. Регистрация изменения содержания продуктов перекисного окисления липидов в результат« радиационного воздействия.

3. Анализ действия низкодозового ионизирующего излучения на гидролитическую активность Н^-АТФазы плазматических мембран.

4. Определение характера изменений кинетических параметров работы фермента в норме и при облучении.

5. Изучение модифицирующего влияния ионов Ca2* на гидролитическую активность Н+-АТФазы в условиях воздействия ионизирующей радиации.

Все исследования проводились на изолированной фракции везикул плазматических мембран, что позволило разделить изучение пассивного транспорта ионов Н+ и функционирование системы активного переноса протона через мембрану, и исключить при этом эффекты действия малых доз радиации немембранной природы.

Основные положения, выносимые на «щиту:

Под действием ионизирующей радиации в малой дозе (0,5 мГр/час) происходит активация процессов липопероксидации ПМ в первые минуты облучения.

^ Значительные изменения в структуре ПМ в связи с активацией ПОЛ в результате низкодозового облучения приводят к возрастанию протонной проницаемости ПМ, и увеличению входящего потока ионов Н+ в клетку.

^ Закисление цитозоля в результате «протонной вспышки», а также изменения в структуре ПМ приводят к увеличению гидролитической активности Н*-АТФазы — ключевой транспортной системы ПМ растительной клетки.

Выявленный феномен стимуляции активности Н+-АТФазьх может быть связан как с изменением конформации фермента под действием облучения, так и нарушением регуляторного контроля за его работой.

^ В результате воздействия ионизирующей радиации в малой дозе происходит активация протонной сигнальной системы, вследствие чего можно ожидать изменение функционального статуса растительной клетки в целом.

Научная новизна. Впервые: обнаружено, что в условиях воздействия малых доз ионизирующей радиации происходит быстрое и значительной изменение протонной проницаемости плазматических мембран клеток высшего растения. Показано, что даже незначительная по величине доза облучения вызывает резкое возрастание Непроводимости мембраны. Уже в первые минуты облучения происходит быстрая потеря протонного градиента везикул, а при последующих сроках облучения скорость пассивного транспорта ионов Н* замедляется.

Получены новые данные, согласно которым в результате воздействия ионизирующего излучения происходит активация процессов липопероксидации в ПМ растительных клеток, о чем свидетельствует повышение содержания продуктов ПОЛ - МДА и оснований Шиффа. Изменения в структуре плазмалеммы, в результате активации процессов ПОЛ происходят в первые минуты при облучении малыми дозами и могут лежать в основе нарушения проницаемости мембраны для протона.

Впервые исследован характер изменения активности транспортной системы ПМ растительных клеток ЬГ-АТФазы в условиях низкодозового ионизирующего излучения. Выявлен феномен активирующего действия малых доз ионизирующего излучения на работу фермента. Показано, что модулирующее влияние малых доз ионизирующего излучения на Н+-АТФазу мембранных везикул проявляется в том, что ее гидролитическая активность возрастает. Прирост активности зависит от времени облучения.

Установлено, что в результате воздействия ионизирующей радиации происходит изменение кинетических и регуляторных свойств Н+-АТФазы. Показано возрастание регулятор-

ного эффекта ионов кальция в отношении данной ферментной системы под действием малых доз ионизирующего излучения. Изменение кинетических параметров работы фермента: скорости распада фермент-субстратного комплекса и сродства фермента к субстрату может свидетельствовать о том, что в результате воздействия радиации в малой дозе произошли структурные перестройки активного центра Н+-АТФазы.

На основании полученных данных сделан вывод об активации протонной сигнальной системы в растительной клетке в результате воздействия ионизирующей радиации в малой дозе.

Сформулировано и обосновано положение о высокой чувствительности структурного состояния, а также систем пассивного и активного транспорта ПМ клеток высшего растения к низкодозовым радиационным воздействиям.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты изучения структурно-функциональных изменений ПМ при действии малых доз ионизирующей радиации имеют важное значение для понимания различия в особенностях воздействия малых и больших доз ионизирующего излучения. Они вносят вклад в расшифровку мембранного механизма действия малых доз ионизирующей радиации. В условиях повышения уровня радиоактивного загрязнения природных экосистем все живые организмы подвергаются дополнительному воздействию малых доз ионизирующего излучения, поэтому очень важным представляется выяснение процессов, происходящих при этом в растительной клетке.

Наблюдаемый феномен активации работы фермента Н+-АТФазы, а также нарушение Непроницаемости и активация процессов липопероксидации в условиях воздействия малых доз ионизирующей радиации, свидетельствует о необходимости с осторожностью относиться к применению метода радиационной стимуляции в сельском хозяйстве. Любое вмешательство в тонко отрегулированную систему поддержания окислительно-восстановительного равновесия, а также в процессы пассивного и активного транспорта ионов через мембрану, может иметь весьма существенные функциональные последствия для растительной клетки и растения в целом. Основные результаты работы могут быть включены в соответствующие разделы спецкурсов и лекций общего курса радиобиологии и физиологии растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены иа VI и IX Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2001, 2004), III сессии школы-семинара «Экологическая и промышленная безопасность» (Саров, 2003), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), П1 международной междисциплинарной конференции «НБИТТ-21» (Петрозаводск, 2004).

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения (2 главы), заключения, выводов и списка литературы (196 работ, в том числе 64 иностранных). Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков и 3 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исходным растительным материалом для данных исследований служили 10-12-дневные проростки тыквы Cucurbita pepo L. сорта Мозолеевская. Проростки тыквы выращивали 5 дней при температуре 30-32°С в темноте и 5-7 дней при температуре 21-23°С при освещении люминесцентными лампами. Выращивание проростков тыквы осуществляли на гидропонной основе из керамзита. Полив производили 50%-ной средой Хоглэнда-Арнона. (Гродзинский, 1973).

Фракцию, обогащенную ПМ (-70%), выделяли из стеблей проростков тыквы по методике Леонарда-Ходжеса (Leonard, Hodges, 1973) с последующей очисткой в градиенте плотности сахарозы (34 и 45%). Концентрацию белка в выделенной фракции ПМ определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951) с учетом поправки на сахарозу (Gerhardt, Beevers, 1969). Изучение ориентации везикул полученной фракции ПМ проводили, измеряя АТФазную активность в присутствии аламетицина (Тихая и др., 1984). Везикулы ПМ были полностью инвертированы за счет внесения в среду ресуспендирования неионного детергента Brij 58 в концентрации 0,02% (Johansson et al., 1995). Степень чистоты полученной мембранной фракции оценивали также с помощью ингибиторного анализа.

Облучение изолированных везикул плазматических мембран производили стандартным источником ß-излучения (90Sr-9"Y) с активностью 90 кБк. Облучение микросомальной фракции ПМ осуществляли в круглой кювете при толщине слоя жидкости 1 мм и воздушной прослойке 1см, при температуре 4° С. Применяли однократное облучение с экспозициями от 5 до 60 мин, мощность поглощенной дозы облучения при этом составила 0,5 мГр/час.

О пассивной проницаемости везикул, имеющих внутри щелочную среду (pH 8,0), судили по сдвигу в них pH, возникающем при внесении фракции в более кислую среду (pH 5,5). Величину градиента pH измеряли флуориметрически с использова.ию.м зонда 9-АА при длине волны возбуждения и флуоресценции соответственно 408 и 456 нм (Deamer, et al, 1972). Регистрировали динамику изменения интенсивности флуоресценции (1ф,,) в виде записи кинетических кривых. Относительный уровень содержания оснований Шиффа оценивали по их собственной флуоресценции при длине волны возбуждения 360 нм и испускания 430 нм

(Fletcher, 1973). Количество образующегося МДА определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой в кислой среде (Орехович, 1977).

Степень чистоты полученной мембранной фракции оценивали с помощью ингибитор-ного анализа. АТФазная активность подавлялась примерно на 60% NajVOi (специфическим ингибитором Н+-АТФазы ИМ) и практически не уменьшалась под влиянием NaN3 (специфический ингибитор митохондриальной АТФазы) и NaNCh (специфический ингибитор АТФазы тонопласта).

АТФазную активность ПМ определяли по количеству неорганического фосфата, отщепляемого в ходе реакции от АТФ. Количество неорганического фосфата определяли спек-трофотометрически по методу Лоури-Лопец (Болдырев, 1977). Определяли зависимость АТФазной активности ПМ от концентрации ионов Са2+ в среде инкубации. Концентрацию Саг+ в среде рассчитывали с помощью программы CHELATOR (Schoenmakers et al., 1992).

Опыты проводили в 5-7-кратных повторностях. Результаты экспериментов обрабатывали при помощи методов вариационной статистики (Лакин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение Непроницаемости н содержания продуктов перекнсного окисления липидов в везикулах плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации.

Модификация Н*-проницаемости везикул плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации. Важнейшим показателем, от которого зависит нормальное функционирование клетки, является состояние барьера ионной проницаемости плазмалеммы. Для изучения эффекта ионизирующей радиации в малой дозе на Непроницаемость регистрировали в виде записи типичных кривых изменения 1фЛ 9-АА. Как видно из рисунка 1, внесение в среду (рН 5,5) необлученной фракции ПМ (рН 8,0) сопровождается быстрым увеличением 1фл 9-АА, обусловленным поступлением зонда в везикулы. По завершении процесса накопления зонда в везикулах 1ф„ становится стабильной и дальнейшего изменения ее уровня не наблюдается. Добавление протонофора КЦХФГ индуцирует тушение 1фл, что указывает на наличие ДрН на мембране везикул и его последующую диссипацию.

По-другому протекает динамика изменения 1фл при добавлении в среду (рН 5,5) фракции облученных везикул (рН 8,0). Связанное с аккумуляцией зонда первоначальное возгорание флуоресценции сменяется медленно релаксирующей (в течение нескольких минут) фа-

зой тушения, свидетельствующей о смещении рН в везикулах в кислую область в результате входа в них Н+.

пм

пм 1

А КЦХФГ

ЛрН 1

Рис. 1. Типичные кривые изменения интенсивности флуоресценции (1фл) зонда 9-АА при внесении в среду необлученной (А) и облученной фракций ПМ (Б - 5 мин, В - 10 мин, Г — 20 мин)

А - амплтуда, х - время фазы релаксация

Фаза тушения заканчивается установлением более низкого стационарного уровня 1фл вследствие выравнивания концентраций протона в среде и в везикулах, о чем свидетельствует отсутствие реакции на последующее добавление КЦХФГ. Появление фазы тушения является доказательством резко возросшей пассивной Непроницаемости везикул, подвергнутых действию радиации. Количественный анализ показывает достоверные отличия в скоростных и амплитудных параметрах фазы тушения у везикул, получивших разные временные дозы облучения.

Из таблицы 1 следует, что в наибольшей степени барьер пассивной протонной проницаемости мембраны везикул оказывается нарушенным при 20 и 40-минутном облучении. Для

них характерна минимальная амплитуда фазы тушения и величина сдвига рН вследствие значительной потери градиента по сравнению с исходным (ДрН = 2,5 ед).

Таблица 1.

Параметры фазы тушения возникающей при сдвиге исходного ДрН (2,5 ед.) в микросомяльной фракции ЛМ, при разных экспозициях облучения ионизирующей радиацией в малой дозе (по 4 опытам)

Время облучения, мин Время релаксации (т), мин Амплитуда (А), в ед. ДрН Скорость: ДрН/т

5 2,4 ± 0,6 1,29 ±0,16 0,59 ±0,13

10 8,4 ± 0,3 1,95 ± 0,43 0,23 ± 0,08

20 6,2 ± 0,8 0,62 ± 0,07 0,10 ±0,03

40 6,4 ± 0,5 0,64 ± 0,30 0,10 ±0,02

Различия достоверны для всех попарно сравниваемых вариантов облучения р < 0,05.

Следует отметить, что в норме ПМ растительных клеток обладает весьма низкой проницаемостью для протона, что является необходимым фактором для поддержания внутриклеточного рН, от которого зависит функциональный статус многих метаболических процессов, протекающих в растительной клетке. Увеличение протонной проницаемости ПМ, в результате действия малых доз ионизирующей радиации может иметь весьма существенные последствия для метаболизма растительной клетки в целом.

Существует большое количество экспериментальных данных, полученных на необлу-ченных клетках, которые свидетельствуют о тесной связи ионной проницаемости и ионного транспорта со структурным состоянием клеточной мембраны. Исходя из полученных данных, можно предположить, что наблюдаемое при облучении мембранных везикул малыми дозами ионизирующей радиации значительное нарушение проницаемости плазматической мембраны для протона, вероятно, является следствием структурных перестроек в мембране, вызванных облучением. Ионизирующие излучения вызывают повреждение липидной структуры ПМ и нарушение ей барьерных функций. Этот процесс может быть обусловлен способностью фосфолипкдов формировать мицеллярные и гексагональные фазы, обладающие высокой проницаемостью. Мицеллярные и гексагональные структуры способны формировать сквозные поры в мембране, доступные для диффузии воды и ионов. Диффузия катионов может быть обусловлена их прохождением через динамические мицеллярные поры, стенки которых образованы полярными группами фосфолипидов (Антонов, 1982).

В качестве возможного механизма нарушения проницаемости, вызванного облучением, многие авторы рассматривают активацию перекисного окисления липидов мембран, которое непрерывно протекает в условиях физиологической нормы (Мирзоев и др., 2002; Пирутин и др., 2002; Заводник и др, 2003).

Для определения интенсивности процессов ПОЛ везикул ПМ в условиях воздействия ионизирующего излучения измеряли количество образующегося малонового диальдегида (МДА) и оснований Шиффа при разных временных экспозициях.

Содержание малонового диальдегида в везикулах плазматических мембран в норме и при облучении. Данные, представленные на рис. 2, свидетельствуют о нелинейном характере изменения количества МДА. Как видно из представленных данных при действии ионизирующей радиации в течение 5 минут на фракцию везикул ПМ, наблюдается значительное увеличение содержания МДА. Т. к. МДА является вторичным продуктом ПОЛ, можно заключить, что усиление окислительных процессов в мембране наступает фактически сразу же при действии даже небольших доз ионизирующей радиации. Дальнейшее снижение уровня МДА при облучении можно рассматривать как результат активации репарационных процессов и утилизации образовавшихся продуктов ПОЛ.

1 г а 4 5

Время облучения

Рис. 2. Динамика изменения содержания малонового диальдегида (МДА) микросомальной фракции ПМ при различных экспозициях облучения ионизирующей радиацией в малой дозе

1 - необлучснные везикулы (контроль);

2 - везикулы, облученные 5 мин; 3-10 мин; 4-20 мин: 5-40 мин

Определение содержания оснований Шиффа в микросомачыит ф/хзщнп ПМ при облучении. На рис. 3 приведены данные по содержанию оснований Шиффа в микросомальной фракции ПМ до облучения и при различных сроках облучения. Пояснение содержания оснований Шиффа и МДА носит схожий характер. Количество оснований Шиффа резко возрастает уже после пяти минут облучения, достигая максимума на 10 минуте, а на 20-й, и 40-й

минутах - снижается до уровня, который остается достоверно выше контрольного. Также и содержание МДА при 40-минутной экспозиции достоверно не отличается от контроля

Можно предположить, что при действии низкоинтенсивного ионизирующего облучения изменение в содержании продуктов ПОЛ в микросомальной фракции ПМ растений носит репарационный характер и происходит дальнейший распад (утилизация) этих соединений на фоне продолжающегося действия радиации.

Таким образом, нарушение барьера проницаемости ПМ для протона в первую очередь, может быть связано со структурными перестройками липидного бислоя, вызванными усилением окислительных процессов под действием облучения.

Несмотря на то, что первичные продукты ПОЛ образуются в большем количестве по сравнению со вторичными (Владимиров, 2002), являются высокореакционными и обладают малым временем жизни, они в меньшей степени дестабилизируют мембрану. Скорее всего, роль увеличения ионной проницаемости наряду с более поздними вторичными продуктами ПОЛ принадлежит также гидроперекисям, которые способны образовывать гидрофильные поры в мембране за счет выталкивания гидроперекисных группировок на поверхность. В то же время в более поздних работах по изучению мембранного механизма повреждающего действия радиации эффект УФ-радиации на мембрану наряду с гидроперекисями и с вторичными продуктами ПОЛ связывают также с появлением видоизмененных аминокислот и белков (Пирутин, 2002).

Рис. 3. Относительный уровень оснований Шиффа в микросомальной фракции ПМ при разных экспозициях облучения ионизирующей радиацией в малой дозе

1 - необлучснные везикулы (контроль); .

2 - везикулы, облученные 5 мин; 3-10 мин; 4-20 мин; 5-40 мин

Поскольку спектр действия ПОЛ затрагивает мембранные белки (Владимиров, 2002), то есть основания полагать, что в нарушении барьера проницаемости везикул при облучении наряду с липидами участвуют белковые компоненты мембран. По существующим представ-

2 3 4

Время облучания

лениям белковые комплексы, по-видимому, играют важную роль в механизме протонной проводимости мембран (Кеугег е1 а!., 2003). Трансмебранный перенос Н* может происходить через вН-группы белковых цепей в каналах и белков-переносчиков, локализованных у различных поверхностей мембраны, которые функционируют как доноры и акцепторы протонов (Мнацканян и др., 2002). Изменение конформации белковых транслокаторов в результате их взаимодействия с продуктами ПОЛ будет неизбежно сказываться на состоянии барьера протонной проницаемости плазмалеммы.

Увеличение пассивной проницаемости ПМ, происходящее в первые минуты облучения может быть рассмотрено в качестве пускового механизма в проявлении лучевого поражения при действии облучений в малых дозах.

При анализе участия различных сигнальных систем в защитных реакциях растительных клеток на действие повреждающих агентов было выявлено, что одна из наиболее ранних и экспериментально доказанных реакций клетки — это обратимое изменение концентрации протонов в цитозоле. Существует понятие о «протонной вспышке», которая начинается практически сразу при действии повреждающего фактора и может продолжаться в течение десятков минут (Тарчевский, 2001). Т. е. резкое возрастание протонной проницаемости в первые минуты после облучения может свидетельствовать об активации в мембране растительной клетки протонной сигнальной системы, в рамках которой естественно ожидать изменения функционирования протонного насоса представленного НГ-АТФазой, который обеспечивает поддержание 1Г-градиента на плазмалемме. Кроме того, зарегистрированное увеличение интенсивности процессов липопероксидации может также оказывать существенное воздействие на работу Н+-ДТФазы, которая являясь интегральным белком, зависима от липидного окружения в мембране.

Действие малых доз ионизирующего излучения на функционирование Н*-АТФазы плазматических мембран клеток высших растений. Протонный насос представленный Н+-АТФазой, осуществляет активный транспорт протонов через плазматическую мембрану, создавая таким образом метаболическую компоненту мембранного потенциала растительных клеток. Формируемый Н*-АТФазой трансмембранный электрохимический градиент протонов играет важную роль в осуществлении вторичного активного транспорта веществ, регуляции осмотических свойств клетки и внутриклеточного рН.

И вменение гидраттической активности II' -А ТФазы. Для изучения влияния малых доз ионизирующей радиации на работу Н*-АТФазы измеряли ей гидролитическую активность при разных временных экспозициях облучения. Модулирующее влияние малых доз ионизирующего излучения на Н+-АТФазу мембранных везикул проявлялось в том, что ее гидролитическая активность возрастала (Рис 4). Прирост активности зависел от времени облучения и

при 30 мин экспозиции достигал 50%. При дальнейшем увеличении времени облучения до 50 мин активность фермента оставалась неизменной. Это позволяет предположить, что гидролитическая активность фермента стабилизировалась на новом стационарном уровне, переход на который в условиях воздействия малой дозы радиации зависел от длительности облучения. Полученные данные подтверждают мнение многих исследователей о высокой чувствительности ферментов активного транспорта ионов к радиационному воздействию даже в малых дозах (Рыскулова, 1986; Дворецкий, Егорова, 1990; Мирзоев и др., 2002).

Повышение гидролитической активности фермента, вероятно, явилось следствием возросшей Непроницаемости везикул ПМ. Как и ожидалось, для поддержания существующего градиента протона активность Н+-АТФазы ПМ возросла, но до определенного предела. В качестве одной из вероятных причин феномена стимулирующего влияния излучения в малых дозах на активность Н^-АТФазы, можно назвать изменение внутриклеточного рН в результате увеличения проницаемости ПМ для Н*.

Время облучения, мин

Рис. 4. Зависимость изменения гидролитической активности Н+-АТФазы в результате воздействия малых доз ионизирующей радиации от времени облучения 1-облученные мембраны; 2-контроль

Кроме того, активность фермента находится под контролем со стороны мембраны, которая претерпела структурные изменения в результате радиационного воздействия. Можно сделать предположение, что изменение активности фермента в ранние сроки облучения, с одной стороны вызвано необходимостью поддержания ионного гомеостаза, нарушенного в результате повышения пассивного транспорта протона, с другой стороны может быть связано с изменением липидного окружения фермента, как впрочем, и повреждением структуры самого фермента в результате действия ионизирующей радиации даже в небольшой дозе.

Так как спектр действия ионизирующей радиации затрагивает не только липидные, но и белковые компоненты мембраны, то естественно предположить, что облучение везикул ПМ

в малой дозе привело также к изменению конфигурации активного центра ЬГ-АТФазы, которое может сопровождаться изменением сродства субстрата к (Мй2*-АТФ) - связывающему цешру фермента и соответствующим повышением гидролитической активности фермента. (Рыскулова, 1986). Исследования, проведенные на тенях эритроцитов, показали, что изменение активности фермента Са^-АТФазы, которое происходит при действии ионизирующей радиации в малой дозе (4-10"3 Гр), является результатом конформацнонных перестроек молекулы фермента. Облучение даже в малой дозе вызывало модификацию структуры активного центра фермента Са2*-АТФазы, что сопровождалось измененнем сродства фермента к субстрату и скорости распада фермент-субстратного комплекса (Древаль, Зима, 2000). Представленные данные дают основания предполагать, что действие ионизирующей радиации в малой дозе на Н+-АТФазу также может вызывать информационные изменения в молекуле фермента, сопровождающиеся изменением скорости ферментативной реакции и сродства фермента к субстрату, поэтому представлялось важным изучить кинетические характеристики работы ЬГ-АТФазы в условиях её повышенной активности в результате облучения.

Кинетические параметры работы фермента в норме и при облучении. Установлено, что в кооперативной системе белок-липидного матрикса мембран радиационно-индуцированные нарушения структуры мембраны приводят к изменению свойств интегральных белков. Н^-АТФаза, являясь интегральным белком плазматических мембран, достаточно чувствительна к нарушениям их структуры. Изменение активности Нт-АТФазы при действии ионизирующей радиации в малой дозе может быть связано с вызываемыми радиацией перестройками самой белковой молекулы фермента.

Рис. 5. Кинетические кривые изменения скорости гидролиза АТФ КГ-АТФазой ПМ от концентрации субстрата, при действии ионизирующей радиации

1 - везикулы ПМ, подвергнутые облучению в течение 30 мин;

2 - необлученные везикулы ПМ

Само по себе определение активности фермента по нарастанию содержания неорганического фосфата недостаточно информативно, поскольку не раскрывает механизм наблю-

даемого изменения. Для понимания механизмов изменения активности Н+-АТФазы при облучении, определяли кинетические характеристики фермента: константу Михаэлиса (ДГ„) и максимальную скорость ферментативной реакции (Кто»). Анализ кинетических кривых зависимости скорости гидролиза АТФ от ее концентрации показал, что для везикул, подвергнутых предварительному облучению в течение 30 мин, максимальная скорость процесса гидролиза АТФ была в 1,5 раза выше по сравнению с контролем (Рис. 5).

Рис. 6. Определение константы Михаэлиса. Зависимость скорости гидролиза АТФ Н*-АТФазой ПМ от концентрации субстрата, при действии ионизирующей радиации в обратных координатах

1 - везикулы ПМ. подвергнутые облу чению в течение 30 мин;

2 - нсоблученные везикулы ПМ

Величина Кт процесса при этом также изменилась, но не существенно. Для везикул, подвергнутых облучению, она составила 0,83 мМ, для необлученных везикул - 0,52 мМ (Рис. 6). Полученные данные позволяет заключить, что облучение плазматических мембран в малой дозе, вероятно, вызывает структурные изменения активного центра Н+-АТФазы, сопровождающиеся увеличением скорости распада фермент-субстратного комплекса, но не приводит к значительному изменению сродства фермента к субстрату.

М/кУнфнцнруюгцее влияние ионов С а2 * на гидролитическую активность Н*-АТФазы. В качестве одной из вероятных причин феномена стимулирующего влияния излучения в малых дозах на активность Н'-АТФазы, можно предположить нарушение регуляторного контроля за её работой. Повреждение регуляторных механизмов, являющихся более хрупкими, чем контролируемая ими функция, нередко происходит под влиянием малых доз неблагоприятного фактора, которые недостаточны для повреждения функционального аппарата (Александров, 1985)

Для исследования этого вопроса были проведены эксперименты, в которых в качестве регулятора активности Н*-АТФазы использовались ионы Са2~. Известно, что ионы Са2+ являются эффективными регуляторами работы Н*-АТФазы (Lino, 1998; De Nisi, 1999; Qiu, Su, 1998). По имеющимся данным, увеличение концентрации Са2" (кальциевый сигнал) в цито-золе растительных клеток при возбуждении под влиянием раздражающих стимулов приводит к заметному угнетению как гидролитической, так и транспортной активности Н*-АТФазы плазматической мембраны.

Концентрация ионов См1*, М

Рис. 7. Зависимость гидролитической активности Н'-АТФазы от концентрации ионов Са2+ в растворе

1 - мембраны после облучения в течение 30 мин;

2 - необлученные мембраны

Сравнительное исследование регуляторного эффекта Са2* на активность Н*-АТФазы мембранных везикул, необлученных и подвергнутых воздействию малой дозы ионизирующего излучения, проводилось с использованием экспозиции 30 мин.

Концентрацию Са2* в среде изменяли от 10"7 М (соответствует концентрации Са2* в цн-тозоле покоящихся растительных клеток) до 10"4 М (концентрация ионов Са2* при возбуждении). Показано, что предварительное облучение везикул плазматических мембран малой дозой радиации приводит к увеличению ингибирующего эффекта Са2* на гидролитическую активность Н*-АТФазы в 1,5-2 раза (Рис.7). Полученные данные позволяют предположить, что эффективность кальциевого сигнала в растительных клетках под влиянием малых доз радиации, по-видимому, резко возрастает.

Изменение модифицирующего влияния ионов кальция на гидролитическую активность Н*-АТФазы плазматических мембран, на наш взгляд можно объяснить как с позиции вызванного облучением нарушения регуляторного контроля за активностью фермента, так и изменением конформации самого фермента в результате воздействия малых доз ионизирующего излучения. В последнем случае можно предположить, что ионы Са2*, конкурируя с

ионами М82- при связывании с молекулой АТФ, могут более эффективно снижать активность фермента, конфигурация активного центра которого изменена в условиях воздействия малых доз радиации.

Для выявления природы изменения регуляторного влияния ионов Са2+ на активность Н~-АТФазы были проведены исследования с использованием неспецифического ингибитора мембраносвязанной Оа2 - зависимой протеинкиназы, т.к. одним из предполагаемых механизмов ингибирующего воздействия ионов кальция является Са2'-стимулируемое фосфори-лирование фермента.

Рис. 8. Гидролитическая активность Н^-АТФазы плазматических мембран необлученных везикул <1,2,3,4 ), и везикул подвергнутых облучению (1*,2*,3*,4*) 1,1 * - в присутствии ионов Саг+ в концентрации 10"? М 2.2* - в присутствии ионов С;Г* в концентрации 10"7 М

и ингибитора протеинкиназы - Н7 5, 3* - в присутствии ионов Са2т в концентрации 10 1М 4. 4* - в присутствии ионов Cií в концентрации 10 4 М, и ингибитора протеинкиназы - Н7

Как видно из рис. 8 добавление в реакционную среду ингибитора протеинкиназы — Н7 в большей степени снимает угнетающее действие ионов Caí+ на гидролитическую активность Н -АТФазы у необлученных везикул, чем у везикул, подвергнутых воздействию ионизирующей радиации в малой дозе. Если для необлученных мембран основным механизмом регуляторного эффекта ионов Са2* in vivo может быть именно Са2*-стимулируемое фосфори-лирование фермента (т.е. активация мембраносвязанной Са2+-зависимой протеинкиназы при увеличении концентрации ионов кальция в цитозоле растительной клетки вероятно вызывает фосфорилирование Н"-АТФазы, что сопровождается снижением ее активности), то в условиях воздействия ионизирующего излучения вероятно подключаются ранее не задействованные, более эффективные механизмы ингибирующего влияния ионов Са2+ на работу фермента. На основании представленных данных можно заключить, что в условиях воздействия на

Н'-АТФазу ионизирующей радиации в малой дозе происходит нарушение регуляторных связей данного фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, под действием ионизирующей радиации в малой дозе плазматическая мембрана растительных клеток претерпевает значительные структурно-функциональные перестройки. Ионизирующие излучения вызывают окислительное повреждение липидной структуры ПМ и нарушение её барьерных функций.

Анализируя изменение пассивного транспорта протона через мембрану, можно говорить об увеличении протонной проницаемости ПМ, происходящей в первые минуты после облучения. Наиболее быстрая потеря градиента протона везикул происходит после 5-ти минутного облучения, а при последующих сроках облучения скорость пассивного транспорта ионов Н* замедляется. В наибольшей степени барьер пассивной протонной проницаемости мембраны везикул оказывается нарушенным при 20-ти и 40-минутном облучении, вследствие значительной потери градиента И+ по сравнению с исходным.

Изменение пассивной проницаемости ПМ, происходящее в первые минуты облучения может быть рассмотрено в качестве пускового механизма в проявлении лучевого поражения при действии облучений в малых дозах. В первую очередь, нарушение барьера проницаемости ПМ для протона может быть связано со структурными перестройками липидного бислоя, вызванными усилением окислительных процессов под действием облучения.

Зарегистрированное увеличение содержания продуктов ПОЛ, таких как МДА и основания Шиффа свидетельствуют об активации в мембране процессов липопероксидации в результате радиационного воздействия. Значительное увеличение содержания продуктов ПОЛ при небольшой временной экспозиции облучения свидетельствует о быстром нарушенин окислительно-восстановительного баланса плазмалеммы в условиях повреждающего действия ионизирующей радиации и подтверждает предположение о более высокой чувствительности окислительных процессов к действию низкодозового облучения, чем механизмов репарации, систем антиоксидантной защиты.

Вызванное облучением увеличение Непроницаемости везикул ПМ в результате активации процессов ПОЛ приводит к модификации работы протонного насоса, представленного Н*-АТФазой, который обеспечивает поддержание Н*-градиента на плазмалемме. Кроме того, зарегистрированное увеличение интенсивности процессов липопероксидации также оказывает существенное воздействие на работу Н*-АТФазы, которая являясь интегральным белком, зависит от липидного окружения в мембране.

Результаты исследования работы фермента в условиях воздействиях облучения свидетельствуют о высокой чувствительности Н+-АТФазы, как ключевого фермента плазматических мембран растительной клетки, к воздействию радиации даже в небольшой дозе. Показано, что действие излучения приводит к существенному росту гидролитической активности ЬГ-АТФазы, причем прирост активности имеет немонотонный характер и зависит от времени облучения.

Изучение кинетики ферментативной реакции показало, что облучение плазматических мембран в малой дозе, вероятно, вызывает структурные изменения активного центра Н+-АТФазы, сопровождающиеся увеличением скорости распада фермент-субстратного комплекса, но не приводит к значительному изменению сродства фермента к субстрату.

В качестве одной из вероятных причин феномена стимулирующего влияния, излучения в малых дозах на активность Н'-АТФазы, является нарушение регуляторного контроля за её работой. Предварительное облучение везикул плазматических мембран малой дозой радиации приводит к увеличению ингибирующего эффекта Саг+ на гидролитическую активность Н*-АТФазы. В условиях воздействия ионизирующего излучения вероятно подключаются ранее не задействованные, дополнительные механизмы ингибирующего влияния ионов Са2* на работу фермента.

Таким образом, суммируя полученные данные, схема событий развивающихся в условиях воздействия низкодозового ионизирующего излучения на плазмалемме растительной клетке представляется нам следующей (Рис. 9). Плазматическая мембрана является весьма чувствительной мишенью действия ионизирующего излучения в малой дозе. В результате такого воздействия происходят изменения как в липидной, так и в белковой компоненте мембраны. Вызванная облучением активация ПОЛ приводит к нарушению протонной проницаемости ПМ, а также изменению вязкости и состава фосфолипидов. Увеличение пассивного транспорта протонов вызывает активацию протонного насоса, представленного Н*-АТФазой. Кроме того, активность данной ферментной системы зависит от вязкости и состава липидного окружения. Непосредственное действие ионизирующей радиации на белковую молекулу фермента способно приводить к изменению конформации активного центра фермента, что также неизбежно скажется на его чувствительности к регуляторным факторам и как следствие приведет к изменению активности Н+-АТФазы.

В результате изучения событий, происходящих под действием облучения в малой дозе можно говорить об активации протонной сигнальной системы, которая является одной из ранних реакций растительных клеток на внешние раздражающие стимулы (Тарчевский, 2002). В рамках активации протонной сигнальной можно ожидать изменения метаболизма растительной клетки в целом.

Рис. 9. Предполагаемая схема событий в плазматической мембране, индуцированных действием ионизирующей радиации в малой дозе

выводы

Воздействие ионизирующей радиации в малой дозе на везикулы ПМ клеток растения приводит к значительному увеличению их протонной проницаемости и диссипации трансмембранного градиента протона. Увеличение протонной проницаемости коррелирует с повышением уровня липопероксидации в ПМ и может быть следствием окислительного нарушения мембранной структуры, вызванного низкодозовой радиацией

Ионизирующая радиация в малой дозе оказывает стимулирующее влияние на активность Н+-АТФазы, играющей роль протонного насоса. При этом увеличивается скорость распада фермент-субстратного комплекса и нарушается регуляторный контроль за работой фермента (на примере ингибирующего эффекта ионов Са2+). Сродство фермента к субстрату в этих условиях изменяется незначительно. Полученные данные свидетельствуют о том, что механизм влияния ионизирующей радиации в малой дозе на клетки растения включает в качестве важного начального звена активацию протонной сигнальной системы, которая осуществляется при участии систем пассивного (проницаемость) и активного (Н+-АТФаза) транспорта протонов через ПМ. Предложена схема структурно-функциональных изменений в ПМ клеток растений, вызванных влиянием ионизирующей радиации в малой дозе, которые приводят к активации протонной сигнальной системы.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воденеев В.А., Мокрова (Шибарова) А.Н. Обоснование возможности участия 1Г-АТФазы плазматических мембран в формировании фазы деполяризации потенциала действия в клетках высшего растения // Тез. докл. шестой нижегородской сессии мол. ученых. Н. Новгород, 2001. С. 152.

2. Орлова О.В., Шибарова А.Н., Пятыгин С.С. Действие малых доз ионизирующей радиации на гидролитическую активность Н*-АТФазы плазматических мембран клеток высшего растения (Cucurbita pepo) // Материалы III сессии школы-семинара «Экологическая и промышленная безопасность». Саров, 2003. С. 263-265.

3. Шибарова А.Н., Орлова О.В., Воденеев В.А., Опритов В.А., Пятыгин С.С. Влияние ионов Са2> на гидролитическую активность Н'-АТФазы плазматических мембран клеток высшего растеши (Cucurbita pepo L.) при воздействии малых доз ионизирующей радиации //Тез. докл. III съезда биофизиков России. Воронеж, 2004. С.737-738.

4. Шибарова А.Н. Регуляторные аспекты функциональной активности Н*-АТФазы плазматических мембран клеток высшего растения (Cucurbita pepo L) в условиях воздействия малых доз ионизирующей радиации // Тез. докл. девятой нижегородской сессии мол. ученых. Н. Новгород, 2004. С. 243-244.

5. Шибарова А.Н. Действие ионизирующего излучения в малой дозе на кинетические параметры работы Н^-АТФазы плазматических мембран клеток высшего растения (Cucurbita pepo)// Тез. докл. III международной междисциплинарной конференции «НБИТТ-21». Петрозаводск, 2004. С. 37.

6. Шибарова А.Н., Орлова О.В., Лобкаева Е.П. Влияние импульсного магнитного поля на некоторые биофизические показатели семян тыквы (Cucurbita pepo L.) // Вестник ННГУ. Сер. Биология, Вьт.1(7), 2004. С. 111-116.

7. Калинин В.А., Глазкова H.A., Шибарова А.Н. Модификация Непроницаемости везикул плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации // Вестник ННГУ. Сер. Биология, 2005 (в печати).

Подписано в печать 23.05.2006. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Зак. 851. Тир. 100.

Типография Нижегородского госуниверситета. Лиц. ПД № 18-0099 от 04.05.2001. 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шибарова, Анна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологические эффекты облучения организмов в сублетальных дозах.

1.2. Радиочувствительность мембран.

1.2.1. Гиперрадиочувствительность биомембран при действии малых доз ионизирующей радиации.

1.2.2. Мембранный механизм индукции радиоадаптивного ответа.

1.2.3. Биомембраны в осуществлении «эффекта свидетеля».

1.2.4. Неспецифическая реакция биомембран на облучение в малой дозе.

1.3. Радиационные нарушения структурного состояния биомембран.

1.3.1. Радиационно-индуцированные изменения состояния липидных компонентов.

1.3.2. Изменения белков биомембран в условиях воздействия ионизирующей радиации в малых дозах.

1.4. Функциональные особенности биомембран их изменение при воздействии ионизирующих излучений в малой дозе.

1.4.1. Влияние низкодозового ионизирующего излучения на состояние барьера ионной проницаемости биомембран.

1.4.2. Активность мембраносвязанных ферментов при действии малых доз ионизирующей радиации.

1.5. Ключевой фермент плазматических мембран клеток высших растений - Н+-АТФаза

1.5.1. Молекулярная структура и свойства Н+-АТФазы плазматических мембран клеток высших растений.

1.5.2. Функциональная роль Н+-АТФазы плазматических мембран клеток высших растений.

1.5.3. Регуляция работы Н+-АТФазы плазматических мембран клеток высших растений.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методы исследования.

• 2.2.1. Выделение фракции, обогащенной плазматическими мембранами, методом дифференциального ультрацентрифугирования.

2.2.2. Определение гидролитической активности Н+-АТФазы по методу Лоури - Лопец.

2.2.3. Определение белка в пробе по методу Лоури.

2.2.4. Оценка степени чистоты полученной микросомальной ь фракции плазматических мембран.

2.2.5. Оценка градиента рН в везикулярной фракции плазматических мембран с помощью 9-аминоакридина.

2.2.6. Определение содержания малонового диальдегида в микросомальной фракции плазматических мембран.

2.2.7. Регистрация интенсивности флуоресценции оснований Шиффа в микросомальной фракции плазматических мембран.

2.2.8. Обработка фракции изолированных плазматических мембран ионизирующим излучением.

2.2.9. Статистическая обработка результатов.

• ГЛАВА 3. ИЗМЕНЕНИЕ НЕПРОНИЦАЕМОСТИ И СОДЕРЖАНИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ВЕЗИКУЛАХ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ.

3.1. Модификация Непроницаемости везикул плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации.

3.2. Регистрация изменения продуктов перекисного окисления липидов в л результате радиационного воздействия.

3.2.1. Содержание малонового диальдегида в везикулах плазматических мембран в норме и при облучении.

3.2.2. Определение содержания оснований Шиффа в микросомальной фракции плазматических мембран в норме и при облучении.

ГЛАВА 4. ДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ Н+-АТФАЗЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

4.1. Изменение гидролитической активности Н+-АТФазы при облучении.

4.2. Кинетические параметры работы фермента в норме и при облучении.

4.3. Модифицирующее влияние ионов Са на гидролитическую активность Н+-АТФазы в условиях воздействия ионизирующей радиации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ влияния малых доз ионизирующей радиации на протонную проницаемость и активность H+-атфазы плазмалеммы клеток высшего растения"

Актуальность проблемы. Одним из наиболее изучаемых вопросов в радиационной биологии является природа структурно-функциональных изменений, которые происходят в мембране под действием ионизирующего излучения. Результаты исследований, полученные в последние годы, весьма определенно свидетельствуют о том, что облучение в малых дозах вызывает многочисленные структурные перестройки в клеточных мембранах, сохраняющиеся длительное время после облучения и приводящие к изменению функциональной активности клеток (Бурлакова, 1994; Кузин, 1995; Burlakova, 2000; Кудряшов, 2004). В структурно-метаболической теории А. М. Кузина (1986), а также в концепции «мембранного механизма биологического действия малых доз» JI. X. Эйдуса (2001) приводятся доказательства, что первичной мишенью действия радиации в малых дозах является не ДНК, а именно клеточные мембраны, и в этом состоит принципиальное отличие эффектов, вызываемых облучением в малых дозах по сравнению с большими. Следует отметить, что эксперименты по изучению действия ионизирующей радиации в малых дозах до сих пор в основном проводились на объектах животного происхождения. Практически отсутствуют работы в этом направлении, выполненные на растительных объектах, которым обычно отводится роль «переносчиков» радионуклидов по пищевым цепям. Между тем радионуклиды, поступая в растения из почвы и накапливаясь в их тканях, оказывают влияние излучением в малых дозах на многие процессы, которые происходят непосредственно в растительном организме.

Ионизирующая радиация в летальных и сублетальных дозах вызывает увеличение в мембране окислительных процессов, в частности усиление процессов перекисного окисления липидов, в результате которого происходит окислительная деградация мембранных структур (Кудряшов, 2004). Специфика нарушения окислительно-восстановительного равновесия при действии малых доз ионизирующей радиации пока не представляется однозначной.

Важнейшим показателем, от которого зависит нормальное функционирование клетки, является состояние барьера ионной проницаемости плазмалеммы. Изменение проницаемости мембраны тесно связано с её структурным состоянием (Владимиров, 2002). На настоящий момент недостаточно изученными остаются молекулярные механизмы биологического действия радиации в малых дозах на проницаемость мембраны и системы активного транспорта ионов в клетках высших растений. Известно, что на роль такой транспортной системы в растительных клетках претендует протонный насос, представленный Н+-АТФазой (Palmgren, 1991; Morsomme, Boutry, 2000). Большинство клеток растений характеризуется низкой проницаемостью для протона по сравнению с другими катионами, что определяет в значительной мере эффективность работы протонной АТФазы и поддержание рН-стата на оптимальном уровне (Воробьев, 1988; Опритовидр., 1991).

Исходя из этого, было проведено исследование влияния ионизирующей радиации при облучении малыми дозами на структурное состояние плазматических мембран, связанное с ней изменение барьера протонной проницаемости и активность ключевой транспортной системы плазматических мембран Н+-АТФазы в везикулах ПМ клеток высшего растения.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении изменения ряда основных структурно-функциональных показателей плазматических мембран клеток высшего растения (Cucurblta реро) в результате воздействия малых доз ионизирующей радиации.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

2. Регистрация изменения содержания продуктов перекисного окисления липидов в результате радиационного воздействия.

3. Анализ действия низкодозового ионизирующего излучения на гидролитическую активность Н+-АТФазы плазматических мембран.

4. Определение характера изменений кинетических параметров работы фермента в норме и при облучении.

2*1"

5. Изучение модифицирующего влияния ионов Са на гидролитическую активность Н+-АТФазы в условиях воздействия ионизирующей радиации.

Все исследования проводились на изолированной фракции везикул плазматических мембран, что позволило разделить изучение активного и пассивного транспорта протона и исключить эффекты действия малых доз радиации немембранной природы.

Основные положения, выносимые на защиту.

S Под действием ионизирующей радиации в малой дозе (0,5 мГр/час) происходит активация процессов липопероксидации ПМ в первые минуты облучения.

S Значительные изменения в структуре ПМ в результате низкодозового облучения приводят к возрастанию протонной проницаемости ПМ, и увеличению входящего потока ионов Н+ в клетку. •S Закисление цитозоля в результате «протонной вспышки», а также изменения в структуре ПМ приводят к увеличению гидролитической активности Н+-АТФазы - ключевой транспортной системы ПМ растительной клетки.

S Выявленный феномен стимуляции активности Н+-АТФазы может быть связан как с изменением конформации фермента под действием облучения, так и нарушением регуляторного контроля за его работой. •S В результате воздействия ионизирующей радиации в малой дозе происходит активация протонной сигнальной системы, в результате чего можно ожидать изменение функционального статуса растительной клетки в целом.

Научная новизна. Впервые обнаружено, что в условиях воздействия малых доз ионизирующей радиации происходит быстрое и значительное изменение протонной проницаемости плазматических мембран клеток высшего растения. Показано, что даже незначительная по величине доза облучения вызывает резкое возрастание Непроводимости мембраны. Уже в первые минуты облучения происходит быстрая потеря протонного градиента везикул, а при последующих сроках облучения скорость пассивного транспорта ионов 1-Г замедляется.

Впервые исследован характер изменения активности транспортной системы ПМ растительных клеток Н+-АТФазы в условиях низкодозового ионизирующего излучения. Выявлен феномен активирующего действия малых доз ионизирующего излучения на работу фермента. Показано, что модулирующее влияние малых доз ионизирующего излучения на Н+-АТФазу мембранных везикул проявляется в том, что ее гидролитическая активность возрастает. Прирост активности зависит от времени облучения.

Установлено, что в результате воздействия ионизирующей радиации происходит изменение кинетических и регуляторных свойств Н+-АТФазы. Показано возрастание регуляторного эффекта ионов кальция в отношении данной ферментной системы под действием малых доз ионизирующего излучения. Изменение кинетических параметров работы фермента: скорости распада фермент-субстратного комплекса и сродства фермента к субстрату может свидетельствовать о том, что в результате воздействия радиации в малой дозе произошли структурные перестройки активного центра Н+-АТФазы.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты изучения структурно-функциональных изменений ПМ при действии малых доз ионизирующей радиации имеют важное значение для понимания различия в особенностях воздействия малых и больших доз ионизирующего излучения. Они вносят вклад в расшифровку мембранного механизма действия малых доз ионизирующей радиации. В условиях повышения уровня радиоактивного загрязнения природных экосистем все живые организмы подвергаются дополнительному воздействию малых доз ионизирующего излучения, поэтому очень важным представляется выяснение процессов происходящих при этом в растительной клетке.

Наблюдаемый феномен активации работы фермента Н+-АТФазы, а также нарушение Непроницаемости и активация процессов липопероксидации в условиях воздействия малых доз ионизирующей радиации, свидетельствует о необходимости с осторожностью относиться к применению метода радиационной стимуляции в сельском хозяйстве. Любое вмешательство в тонко отрегулированную систему поддержания окислительно-восстановительного равновесия, а также процессы пассивного и активного транспорта ионов через мембрану, может иметь весьма существенные функциональные последствия для растительной клетки и растения в целом. Основные результаты работы могут быть включены в соответствующие разделы спецкурсов и лекций общего курса радиобиологии и физиологии растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на VI и IX Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2001, 2004), III сессии школы-семинара «Экологическая и промышленная безопасность» (Саров, 2003), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), III междисциплинарной конференции «НБИТТ-21» (Петрозаводск, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шибарова, Анна Николаевна

выводы

1. Воздействие ионизирующей радиации в малой дозе на везикулы ПМ клеток растения приводит к значительному увеличению их протонной проницаемости и диссипации трансмембранного градиента протона. Увеличение протонной проницаемости коррелирует с повышением уровня липопероксидации в ПМ и может быть следствием окислительного нарушения мембранной структуры, вызванного низкодозовой радиацией

2. Ионизирующая радиация в малой дозе оказывает стимулирующее влияние на активность Н+-АТФазы, играющей роль протонного насоса. При этом увеличивается скорость распада фермент-субстратного комплекса и нарушается регуляторный контроль за работой фермента (на примере ингибирующего эффекта ионов Са ). Сродство фермента к субстрату в этих условиях изменяется незначительно.

3. Полученные данные свидетельствуют о том, что механизм влияния ионизирующей радиации в малой дозе на клетки растения включает в качестве важного начального звена активацию протонной сигнальной системы, которая осуществляется при участии систем пассивного (проницаемость) и активного (Н+-АТФаза) транспорта протонов через ПМ. Предложена схема структурно-функциональных изменений в ПМ клеток растений, вызванных влиянием ионизирующей радиации в малой дозе, которые приводят к активации протонной сигнальной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализируя изменение пассивного транспорта протона через мембрану, можно говорить об увеличении протонной проницаемости ПМ, происходящей в первые минуты после облучения. Наиболее быстрая потеря градиента протона везикул происходит после 5-ти минутного облучения, а при последующих сроках облучения скорость пассивного транспорта ионов Н+ замедляется. В наибольшей степени барьер пассивной протонной проницаемости мембраны везикул оказывается нарушенным при 20 и 40-минутном облучении, вследствие значительной потери градиента Н+ по сравнению с исходным.

В норме ПМ растительных клеток обладает весьма низкой проницаемостью для протона, что является необходимым фактором для поддержания внутриклеточного рН, от которого зависит функциональный статус многих метаболических процессов, протекающих в растительной клетке. Увеличение протонной проницаемости ПМ, в результате действия малых доз ионизирующей радиации может иметь весьма существенные последствия для метаболизма растительной клетки в целом. Изменение пассивной проницаемости ПМ, происходящее в первые минуты облучения может быть рассмотрено в качестве пускового механизма в проявлении лучевого поражения при действии облучений в малых дозах. В первую очередь, нарушение барьера проницаемости ПМ для протона может быть связано со структурными перестройками липидного бислоя, вызванными усилением окислительных процессов под действием облучения.

Зарегистрированное увеличение содержания продуктов ПОЛ, таких как МДА и основания Шиффа свидетельствуют об активации в мембране процессов липопероксидации в результате радиационного воздействия. Значительное увеличение содержания продуктов ПОЛ при небольшой временной экспозиции облучения свидетельствует о быстром нарушении окислительно-восстановительного баланса плазмалеммы в условиях повреждающего действия ионизирующей радиации и подтверждает предположение о более высокой чувствительности окислительных процессов к действию низкодозового облучения, чем механизмов репарации, систем антиоксидантной защиты.

Вызванное облучением увеличение Непроницаемости везикул ПМ в результате активации процессов ПОЛ приводит к модификации работы протонного насоса, представленного Н+-АТФазой, который обеспечивает поддержание Н+-градиента на плазмалемме. Кроме того, зарегистрированное увеличение интенсивности процессов липопероксидации также оказывает существенное воздействие на работу Н+-АТФазы, которая являясь интегральным белком зависима от липидного окружения в мембране.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шибарова, Анна Николаевна, Нижний Новгород

1. Абуталыбов М. Г., Али-Заде В. М., Ганиев В. М. Значение кальция в регуляции электрогенеза растительных клеток//Докл. АН СССР, 1982. Т. 265, № 4. С. 1020 1022.

2. Александров В. Я. Реактивность клеток и белки. Л.: Наука, 1985. 318 с.

3. Антонов В. Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М.: Наука, 1982. 150 с.

4. Антонов В. Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран // Соросовский образовательный журнал, 1998. № 10 С. 10-17.

5. Бак 3., Александер П. Основы радиобиологии. М.: И. Л., 1963. 500 с.

6. Балалаева И. В., Половинкина Е. О. Развитие окислительного стресса хло-ропластов растений при действии стрессирующих факторов различной природы // Докл. девятой нижегородской сессии мол. ученых. Н. Новгород, 2004, С. 202-203.

7. Барабой В. А., Брехман И. И., Голотин В. Г., Кудряшов Ю. Б. перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992, 149 с.

8. Белов А. Д., Киршин В. А. Радиобиология. М.: Колос, 1981. 255 с.

9. Ю.Болдырев А. А. Современное состояние проблемы транспортных АТФаз //

10. Транспортные аденозинтрифосфатазы. М.: Изд. Моск. Ун-та, 1977. С 5 -10.

11. Болдырев А. А. Биологические мембраны и транспорт ионов: Учеб. пособие, М.: Высш. школа, 1985. 208 с.

12. Бондарчук И. А. Гипотеза о механизме индукции адаптивного ответа при облучении клеток млекопитающих в малых дозах // Радиац. биология. Радиоэкология, 2002. Т. 42, № 1. С. 36-43.

13. Бурлакова Е. Б. Действие ионизирующей радиации на регуляторную функцию биомембран // Информ. Бюл. Науч. Совета по радиобиологии, 1979. № 22. С. 3 -6.

14. Бурлакова Е. Б. Действие сверхмалых доз // Вестник РАН, 1994. Т. 64 С. 425 -431.

15. Бурлакова Е. Б. Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов низкой интенсивности // Росс. хим. Журнал, 1999. Т. 43, № 5. С. 3-11.

16. Бурлакова Е. Б., Кондратов А. А., Мальцева Е. Л. Сверхслабые воздействия химических соединений и физических факторов на биологические системы // Биофизика, 2004. Т. 49, вып. 3. С. 551 564.

17. Бурлакова Е. Б., Михайлов В. Ф., Мазурик В. К. Система окислительно-восстановительного гомеостаза при радиационно-индуцируемой нестабильности генома // Радиац. биология. Радиоэкология, 2001. Т. 41, № 5. С. 489 499.

18. Бурлакова Е. Б., Храпова Н. Г. Перекисное окисление липидов и природа антиоксидантов // Успехи химии, 1985. Т. 54, вып. 9. С. 1540 1558.

19. Веселов А. П., Курганова Л. Н., Лихачева А. В., Сушкова У. А. Возможное ре-гуляторное влияние перекисного окисления липидов на активность Н+-АТФазы плаз-малеммы в условиях стресса // Физиология растений, 2002. Т. 49, № 3. С. 385 389.

20. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: МГУ, 1972. 50 с.

21. Владимиров Ю. А. Нарушение барьерных свойств внутренней и наружной мембраны митохондрий: некроз и апоптоз // Биологические мембраны, 2002. Т. 19, № 5. С. 356 377.

22. Воробьев Л. Н. Регулирование ионного транспорта: теоретические и практические аспекты минерального питания растений // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. М.: ВИНИТИ, 1988. Т. 5. 80 с.

23. Выскребенцова Э. И., Синюхин А. М. Влияние ионов калия на генерацию и проведение потенциалов действия в проводящих пучках стебля тыквы (Cucurbita реро L.) // Физиология Растений, 1967. Т.14, №5. С. 823 833.

24. Гераськин С. А. Концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки // Радиац. биология. Радиоэкология, 1995. Т. 35, № 5. С. 571 -578.

25. Грейб Р. Действие малых доз ионизирующего излучения. Эффект Петко // Ядерная энциклопедия М.: Благ. Фонд Ярошинский, 1996. С.387 394.

26. Гродзинский Д. Э. Радиобиология. Биологическое действие ионизирующих излучений. М.: Атомиздат, 1966. 232 с.

27. Гродзинский А. М., Гродзинский Д. М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев: Наукова думка, 1973. 592 с.

28. Гунар И. И., Паничкин Л. А. Водно-ионные потоки и передача возбуждения у растений // Известия ТСХА, 1969. №4. С. 3 -13.

29. Гуща Н. И., Перковская Г. Ю., Дмитриев А. П., Гродзинский Д. М. Влияние хронического облучения на адаптивный потенциал растений // Радиац. биология. Радиоэкология, 2002. Т. 42, № 2. С. 155 158.

30. Дворецкий А. И., Егорова Е. Г. Действие рентгеновского облучения в малой дозе на ключевые ферменты систем активного транспорта ионов в клетке // Радиобиология, 1990 Т. 30, вып. 5 С. 688 689.

31. Дворецкий А. И., Зайцева И. А., Егорова Е. Г. Действие однократного и хронического облучения в малых дозах на транспорт К1" в срезах мозга // Радиац. биология. Радиоэкология, 2002. Т. 42, № 5. С. 492 497.

32. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989. 274 с.

33. Древаль В. И., Зима Г. В. Влияние ионизирующего излучения на Са2+-АТФазу плазматических мембран эритроцитов // Радиац. биология. Радиоэкология, 2000. Т. 40, № 1. С. 28-31.

34. Егоров В. В. Аналогия биологического действия сверхмалых химических и физических доз // Радиац. биология. Радиоэкология, 2003. Т. 43, № 3. С. 261 264.

35. Заводник Л. Б., Кравчук Р. И., Арцукевич А. Н., Чумаченко С. С., Шейбак В. М., Овчинников В. А., Буко В. У. Динамика изменений в печени крыс после однократного воздействия у-излучения // Радиац. биология. Радиоэкология, 2003. Т. 43, № 6. С. 618-624.

36. Иванов А.С., Путвинский А.В., Антонов В.Ф., Владимиров Ю.А, Увеличение протонной проницаемости липосом при перекисном фотоокислении липидов // Биофизика, 1997. Т. 22, вып. 4. С. 621 624.

37. Калинин В. А., Опритов В. А., Швец И. М. Активный электрогенный транспорт Н+ в везикулах плазматических мембран клеток флоэмы борщевика // Биофизика, 1982. Т. 27, вып. 6. С. 58 61.

38. Калинин В. А., Опритов В. А. Протонно-калиевый обмен при генерации АТФ-зависимого градиента рН в везикулах плазматических мембран клеток высших растений // Биофизика, 1985. Т. 30, вып. 1. С. 76 78.

39. Калинин В. А., Опритов В. А. Роль Дф и АрН в протонзависимом транспорте сахарозы в везикулах плазматических мембран флоэмы растений // Физиология растений, 1989. Т. 36, № 5. С. 901 909.

40. Кларксон Д. Транспорт ионов и структура растительной клетки / Пер. с англ. под ред. Вахмистрова Д. Б. М.: Мир, 1978. 368 с.

41. Коломийцева И. К. Радиационная биохимия мембранных липидов. М.: Наука, 1989. 181 с.

42. Коломийцева И. К. Немонотонность зависимости доза-эффект в области малых доз ионизирующей радиации // Радиац. биол. Радиоэкология, 2003, Т. 43, №2, С. 179-181.

43. Конев С. В. Структурная лабильность биологических мембран и регулятор-ные процессы. М.: Наука и техника, 1987. 240 с.

44. Кудряшов Ю. Б. Лучевое поражение критических систем // Лучевое поражение. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1987. С. 5 72.

45. Кудряшов Ю. Б. Основные принципы в радиобиологии // Радиац. биол. Радиоэкология, 2001, Т. 41, №5, С. 531 -547.

46. Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М.: ФИЗМАЛИТ, 2004. 448с.

47. Кузин А. М. Действие ионизирующего излучения на клеточные мембраны. М.: Атомиздат, 1973. 112 с.

48. Кузин А. М. Структурно-метаболическая теория в радиобиологии. М.: Наука, 1986.283 с.

49. Кузин А. М. Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. М.: Наука, 1995. 158 с.

50. Кузин А. М., Березина Н. М. Атомная энергия в сельском хозяйстве. М.: Атомиздат, 1965.

51. Кузин А. М., Вагабова М. Э., Примак-Миролюбов В. Н. О роли естественного фона ионизирующих излучений в начальных стадиях развития растений // Радиобиология, 1977. Т. 17 С. 37-40.

52. Кузин А. М., Медведев Б. И., Сложенкина Л. В. Молекулярные механизмы радиационного изменения регуляторных свойств биомембран // Информ. Бюл. Науч. Совета по радиобиологии, 1979. № 22. С. 6 9.

53. Курганова Л. Н., Веселов А. П., Гончарова Т. А. Синицына Ю. В. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система защиты в хлоропластах гороха при тепловом шоке // Физиология растений, 1997. Т. 44. С. 725 730.

54. Курганова Л. Н., Веселов А. П., Синицына Ю. В., Еликова В. А. Продукты пе-рекисного окисления как возможные посредники между воздействием повышенной температуры и развитием стресс-реакции у растений // Физиология растений, 1999. Т. 46. С. 218-222.

55. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1973. 343 с.

56. Ларская И. А., Заботин А. И. Исследование изменения активности протонной помпы плазмалеммы при низкотемпературном закаливании проростков пшеницы // Вестник Башкирского ун-та. 2001 № 2 С 88 92.

57. Левицкий Д. О. Кальций и биологические мембраны. М.: Высш. школа, 1990. 124 с.

58. Лось Л. А. Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов // Соросовский образовательный журнал, 2001. Т. 7, № 9 (70) С. 14-22.

59. Мазурик В. К. Роль регуляторных сетей ответа клеток на повреждения в формировании радиационных эффектов // Радиац. биология. Радиоэкология, 2005. Т. 45, № 1. С. 26-45.

60. Мазурик В. К., Михайлов В. Ф. О некоторых молекулярных механизмах основных радиобиологических последствий действия ионизирующих излучений на организм млекопитающих// Радиац. биология. Радиоэкология, 1999. Т. 39, № 1. С. 91 -98.

61. Медведев С. С., Батов А. Ю., Мошков А. В., Маркова И. В. Роль ионных каналов в трансдукции ауксинового сигнала // Физиология растений, 1999. Т. 46, № 5 С. 711 -717.

62. Медведев С. С., Маркова И. В. Роль ионов Са2+ при передаче сигналов в клетках растений // Вестник ННГУ им. Н.И. Лобачевского. Сер. Биол. Материалы выезд. сессии ОФР РАН по пробл. биоэлектрогенеза и адаптации. Н.Новгород: ННГУ, 2001. С. 20-25.

63. Мнацаканян Н., Захарян Э., Баграмян К., Трчунян А. Дитиол-сульфидные переходы в мембранных транспортных белках у Escherichia coli II Биологические мембраны, 2002. Т. 19, № 2. С. 183 -192.

64. Нахильницкая 3. Н., Герасимова Г. Г. Некоторые итоги изучения механизма нарушения транспорта ионов калия в облученных эритроцитах // Действие ионизирующего излучения на клеточные мембраны, 1973. С. 84 90.

65. Опритов В. А., Калинин В. А., Пятыгин С. С., Орлова О. В., Абрамова Н. Н. Увеличение потенциалчувствительности АТФазной активности плазмалеммы при холодовом закаливании проростков пшеницы // Физиология растений, 1999. Т. 46, № 1. С. 153- 158.

66. Опритов В. А., Пятыгин С. С. Уровни мембранных потенциалов клеток стебля тыквы при изменении температуры среды // Ферменты, ионы и биоэлектрогенез у растений. Горький, 1984. С. 51.

67. Опритов В. А., Пятыгин С. С. Анализ сопряжения работы электрогенного ионного насоса возбудимой мембраны с генерацией потенциала действия у высших растений // Изв. АН СССР, сер. биол. 1989. № 5. С. 739- 744.

68. Опритов В. А., Пятыгин С. С., Воденеев В. А. Непосредственное сопряжение генерации потенциала действия в клетках высшего растения Cucurbita реро L. с работой электрогенного насоса // Физиология растений, 2002. Т. 49, № 1. С.160 -165.

69. Опритов В. А., Пятыгин С. С., Крауз В. О. Анализ роли электрической активности клеток высшего растения в развитии адаптационного синдрома при охлаждении // Физиология растений, 1993. Т. 40, вып. 4. С. 619 626.

70. Опритов В. А., Пятыгин С. С., Ретивин В. Г. Биоэлектрогенез у высших растений. М.: Наука, 1991. 216 с.

71. Опритов В. А., Ретивин В. Г. О механизме распространяющегося возбуждения у высших растений // Физиология растений, 1982. Т. 29, № 5. С. 915 924.

72. Орехович В. Н. Современные методы в биохимии. М.: Наука, 1977. С.6768.

73. Орлова О. В. АТФ-зависимый транспорт сахарозы в везикулах плазматических мембран клеток высших растений // Транспорт веществ и биоэлектрогенез у растений / Межвуз. сборник. Горький: ГГУ, 1983. С. 64 68.

74. Орлова О. В. Анализ модулирующего действия Дф на работу некоторых систем активного транспорта в плазматических мембранах клеток высших растений. Дисс. канд. биол. наук. Н. Новгород, 1999. 134 с.

75. Орлова О. В., Пятыгин С. С., Опритов В. А., Калинин В. А. Стабилизирующая роль АТФ-зависимого Н+-насоса в электрогенезе плазмалеммы клеток Cucurbita реро L. // Физиология растений, 1997. Т. 44, № 5. С. 909 914.

76. Парсонс Д. Биологические мембраны / Пер. с англ. под ред. Скулачева В. П. М.: Атомиздат, 1979. Пер. изд.: Англия, 1975. 232 с.

77. Пелевина И. И., Апещенко А. В., Антощина М. М., Готлиб В. Я., Кудряшова О. В., Семенова Л. П., Сербряный А. М. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах// Радиац. биология. Радиоэкология, 2003. Т. 43, № 2. С. 161-166.

78. Пирутин С. К., Туровецкий В. Б., Кудряшов Ю. Б. Рубин А. Б. Повреждение мембран макрофагов при действии средневолнового ультрафиолетового излучения // Радиац. биология. Радиоэкология, 2002. Т. 42, № 2. С. 147 150.

79. Пирутин С. К., Туровецкий В. Б., Пирутина О. В., Кудряшов Ю. Б. Влияние ионов кальция на УФ-индуцированное повреждение плазматических мембран пери-тонеальных макрофагов мышей // Радиац. биология. Радиоэкология, 2004. Т. 44, № 4. С. 438-441.

80. Полевой В. В., Максимов Г. Б., Синютина Н. Ф. Методы изучения мембран растительных клеток: Учеб. пособие, Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1986. 192 с.

81. Полевой В. В., Саламатова Т. С. Протонные насосы и их функциональная роль // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. М.: ВИНИТИ, 1980. Т. 4. С. 78-125.

82. Поливода Б. И., Конев В. В., Попов Г. А. Биофизические аспекты радиационного поражения биомембран. М.: Энергоатомиздат, 1990.160 с.

83. Померанцева М. Д., Рамайя Л. X. Предварительное облучение как фактор, изменяющий эффективность лучевого воздействия на организм // М.: Изд-во АН СССР, 1962. С. 91-106.

84. Прищеп С. Г., Герасимович Н. В., Буланова К. Я., Милютин А. А. Влияние малых доз ионизирующего излучения на физико-химические характеристики мембран лимфоцитов периферической крови крыс // Радиац. биология. Радиоэкология, 2000. Т. 40, №2. С. 154- 159.

85. Пятыгин С. С. Электрогенез клеток высшего растения при адаптации к охлаждению: Дисс. докт. биол. наук. Пущино: ИБК РАН, 2001. 292 с.

86. Пятыгин С. С. Электрогенез высших растений в условиях стресса // Успехи современной биологии, 2003. Т. 123, № 6. С. 552 562.

87. Пятыгин С. С. Роль плазматической мембраны в восприятии холодового воздействия на клетки растений // Биологические мембраны, 2004. Т. 21, № 5. С. 362 369.

88. Пятыгин С. С., Воденеев В. А., Опритов В. А. Сопряжение генерации потенциала действия в клетках растений с метаболизмом: современное понимание проблемы // Успехи современной биологии, 2005. Т. 125, № 5. С. 534 542.

89. Пятыгин С. С., Опритов В. А. Анализ температурной зависимости электрогенной компоненты мембранного потенциала у Cucurbita реро II Биофизика, 1987. Т. 32, № 4. С. 656 659.

90. Пятыгин С.С., Опритов В.А., Абрамова Н.Н., Воденеев В.А. Первичная биоэлектрическая реакция клеток высшего растения на комбинированное действие стресс-факторов различной природы // Физиол. растений. 1999а. Т.46, №4. С.610-617.

91. Пятыгин С. С., Опритов В. А., Половинкин А. В., Воденеев В. А. О природе генерации потенциала действия у высших растений // Докл. АН. 1999в. Т.36, №3, с. 404 407.

92. Пятыгин С. С., Опритов В. А., Худяков В. А., Гнездилов А. В. Природа температурной зависимости потенциала покоя холодочувствительного растения Cucurbits И Физиология растений, 1989. Т. 36, № 1. С. 118 -125.

93. Ретивин В. Г., Опритов В. А. Анализ электрохимических градиентов потен-циалопределяющих ионов в клетках проводящих тканей тыквы в покое и при возбуждении // Физиология растений, 1986. Т. 33, № 3. С. 447.

94. Рыскулова С. Т. Радиационная биология плазматических мембран. М.: Энергоатомиздат, 1986. 128 с.

95. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М.: Медгиз, 1960. 123 с.

96. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1972. 122 с.

97. Серебряный А. М., Зоз Н. Н. Радиационный адаптивный ответ у пшеницы. Феноменология и вероятный механизм // Радиац. биология. Радиоэкология, 2001. Т. 41, №5. С. 589-598.

98. Скулачев В. П. Кислород в живой клетке: добро и зло // Соросовский образовательный журнал, 1996. Т. 2, № 3. С. 4 -10.

99. Спитковский Д. М. Новые биофизические и биохимические аспекты механизмов действия малых доз ионизирующей радиации // Радиац. биология. Радиоэкология, 1999. Т. 39, № 1. С. 145- 155.

100. Тарусов Б. Н. Первичные процессы лучевого поражения. М.: Госатомиздат, 1962. 96 с.

101. Тарчевский И. А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: Изд. «Фэн», 2001.448 с.

102. Тарчевский И. А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002. 293 с.

103. Тимофеев-Ресовский Н. В., Савич А. В., Шальнов М. И. Введение в молекулярную радиобиологию. М.: Медицина, 1980. 320 с.

104. Тихая Н. И., Максимов Г. Б. Выделение плазмалеммы из растительных клеток // Методы изучения мембран растительных клеток / Под ред. В.В. Полевого. Л.: Изд-во ЛГУ, 1986. С. 20 29.

105. Тихая Н. И., Мишустина Н. Е., Куркова Е. Б., Вахмистров Д. Б., Самойлов С.

106. A. Оуабаин-чувствительная (Ма++К+)АТФазная активность клеточных мембран, изолированных из корней ячменя // Физиология растений, 1976. Т. 23, вып. 6. С. 1197 -1206.

107. Тихая Н. И., Стеханова Т. Н. Присуще ли апопласту корневых клеток разнообразие фосфогидролаз // Физиология растений, 1999. Т. 46, № 5. С. 728 729.

108. Ульянова Е. В., Позолотина В. Н. Изменчивость ферментных систем в це-нопопуляциях Одуванчика Лекарственного из зоны Восточно-Уральского радиоактивного следа // Радиац. биология. Радиоэкология, 2004. Т. 44, № 5. С. 579 584.

109. Фоменко Б. С., Акоев И. Г. Структурные изменения плазматических мембран под действием ионизирующей радиации // Успехи современной биологии, 1982. Т.93, Вып. 2. С.183- 195.

110. Челышева В. В., Зоринянц С. Э., Смоленская И. Н., Бабаков А. В. Регуляция Н+-насоса в плазматических мембранах растений при осмотическом стрессе: роль белков 14-3-3 //Физиология растений, 2001. Т. 48, № 3. С. 325 333.

111. Шанько А. В., Бабаков А. В. Белки 14-3-3 регулируют активность Н+-насоса плазматических мембран корней ячменя Hordeum disticum при солевом стрессе // Физиология растений, 2002. Т. 49, № 6. С. 847 853.

112. Швец И. М. Применение метода дифференциального центрифугирования для изучения активного транспорта ионов в плазматических мембранах клеток высших растений // Молекулярная биология. Киев: Наук. Думка, 1981. Вып. 28. С. 26.

113. Шишкина Л. Н., Кушнирева Е. В., Смотряева М. А. Новые подходы к оценке биологических последствий воздействия радиации в малых дозах // Радиац. биология. Радиоэкология, 2004. Т. 44, № 3. С. 289 295.

114. Шмакова Л. Н., Фадеева Т. А., Насонова Е. А., Красавин Е. А., Рзянина А.

115. B. Цитогенетические эффекты малых доз облучения в клетках млекопитающих: анализ феномена гиперчувствительности и индуцированной резистентности // Радиац. биология. Радиоэкология, 2002. Т. 42, № 3. С. 245 250.

116. Эйдус Л. X. Неспецифическая реакция клеток и радиочувствительность. М.: Атомиздат, 1977. 152 с.

117. Эйдус Л. X. Эффект малых доз радиации. Адаптивный ответ и механизм его инициации // Радиац. биология. Радиоэкология, 1994. Т. 34, № 6. С. 748 758.

118. Эйдус Л. X. О едином механизме инициации различных эффектов малых доз ионизирующих излучений // Радиац. биология. Радиоэкология, 1996. Т. 36, № 6. С. 874-881.

119. Эйдус Л. X. Лаборатория теоретических основ восстановления и защиты от излучения // Радиац. биология. Радиоэкология, 2003. Т. 43, № 1. С. 97-105.

120. Эйдус Л. X., Эйдус В. Л. Проблемы механизма радиационного и химического гормезиса // Радиац. биология. Радиоэкология, 2001. Т. 41, № 5. С. 627 630.

121. Юрина А. В., Кардашина Л. А. Предпосевное Y-облучение семян как приём повышения продуктивности огурца в теплицах // Радиобиология, 1977. Т.17, Вып. 2. С.145 -153.

122. Ярмоненко С. П., Вайнсон А. А. Радиобиология человека и животных. М.: Высш. Шк., 2004. 549 с.

123. Aitken А. 14-3-3 Protein and its possible role in coordinating multiply signaling pathways // Trends Cell Biol., 1996. V. 47. P. 49 73.

124. Backer D. A. Proton co-transport of organic solutes by plant cells II New phytol., 1978. Vol. 8, №3. P. 485-492.

125. Blatt M. R. Electrical characteristics of stomatal guard cells: the contribution of ATP dependent, «electrogenic» transport reveald by current - voltage and difference -current - voltage analysis // J. Membr. Biol., 1987. Vol. 98, № 3. P. 257 - 274.

126. Blatt M. R. Ca2+ signaling and control of guard - cell volume in stomatal movements // Plant Biology, 2000. № 3. P. 196 - 204.

127. Briskin D. P. The plasma membrane H+-ATPase of higher plant cells: Biochemistry and transport function // Biochem. Biophys. Acta., 1990 Vol. 1019, № 2. P. 95 109.

128. Briskin D. P., Gawieowski M.C. Role of the plasma membrane H+-ATPase in K+ transport//Plant Physiol., 1996. Vol. 111. P. 1199- 1207.

129. Burlakova E. B. Goloschapov A. N., Zhizhina G. P. Et al. Some specific aspects of low-doses irradiation on membranes, cells and organism //Abstracts of 25 Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, 1993.

130. Bush D. R. Proton coupled sugar and amino acid transporters in plants // Ann. Rev. Physiol. Plant., 1993. Vol. 44. P. 513 542.

131. Cheeseman J. M., Pickard B. G. Electrical characteristics of cells from leaves of Lycopersicon II Can. J. Bot., 1977. Vol. 55, № 5. P. 497 510.

132. De Nisi P., DellAOrto M., Pirovano L., Zocchi G. Calcium-dependent phosphorylation regulates the plasma-membrane H+-ATPase activity of maize (Zea mays L.) roots // Planta., 1999. Vol. 209. P. 187 194.

133. Deamer D. V., Prince R. G., Crafts A. P. The response of fluorescent amines to pH-gradients across liposome membranes // Biochim. et Biophis. Acta, 1972. Vol. 274, №1. P. 323-335.

134. Desai J., Sawant P., Tappel A., Miller G. G. Lipid peroxidation as a cause of damage in irradiated biological membranes // Biochem. Biophys. Acta, 1964. Vol. 2, № 86. P. 277-289.

135. Fletcher B. L., Dillard C. J., Tappel A. L. Measurement of fluorescence lipid peroxidation products in biological systems and tissues //Anal. Biochem., 1973. Vol. 52, №1. P.1 -9.

136. Fromm J., Spanswick R, Characteristics of action potentials in Willow (Salix viminalis L.) // J. Exp. Bot., 1993. Vol.44, № 264. P. 1119-1125.

137. Gerhardt В., Beevers H. Influence of sucrose on protein determination by the Lowry procedure//Analit. Biochem., 1969. Vol. 23, № 1. P. 193 195.

138. Gisti A. M. Human cell membrane oxidative damage induced by single and fractionated doses of ionizing radiation: a fluorescence spectroscopy study // Int. J. Radiac. Biol., 1998. Vol. 74, № 5. P. 595 605.

139. Gutteridge J. M. C., Halliwell A. The measurement and mechanism of lipid peroxidation in biological systems//TIBS, 1990. Vol. 15. P. 129- 135.

140. Higinbotham N., Graves J.S., Davis R.F. Evidence for an electrogenic ion transport pump in cells of higher plants // J. Membrane Biol., 1970. Vol. 3, №3. P.210 222.

141. Hodges Т. K., Leonard R. Т., Bracker С. E., Keenan T. W. Purification of an ion-stimulated ATPase from plant roots: association with plasma membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972. № 69. P. 3307 3311.

142. Joiner M. C. Induced radioresistance an overview and historical perspective. Int. J. Radiat. Biol., 1994. Vol 65, № 1 P. 79 84

143. Jong A., Borstlap A. C. Transport of amino acids (L-valine, L-lysine, L-glutamic acid) and sucrose into plasma membrane vesicles isolated from cotyledons of developing pea seeds // J. Exp. Bot., 2000. Vol. 51, № 351. P. 1663 1670.

144. Kasamo K. Regulation of plasma-membrane H+-ATPase activity by the membrane environment // J. Plant Res., 2003. Vol. 166. P. 517 523.

145. Katou K. Distribution of electric potential and ion transport in the hypocotyls of Vigna sesquipedalis V. Electrogenic activity of the parenchyma cells in hypocotyl segments // Plant and Cell Physiol., 1978. Vol. 19, № 4. P. 523 535.

146. Keyzer J., van der Does C, Driessen A.J. The bacterial translocase: a dynamic protein channel complex// Cell Mol. Life Sci., 2003. Vol. 60, № 10. P. 2034 2052.

147. Kojima H., Katou K., Okamoto H. Homeostatic regulation of membrane potential by an electrogenic ion pump against change in the K+ concentration of the extra- and intra-organ perfusion solutions II Plant Cell Physiol., 1985. Vol. 26, № 2. P. 351 359.

148. Larsson C., Widell S., Sommarin M. Inside-out plant plasma membrane vesicles of high purity obtained by aqueus two-phase portioning // FEBS Lett., 1988. Vol. 229, № 2. P 289 -292.

149. Lemoine R., Delrot S. Proton-motive-forse sucrose uptake in sugar beet plasma membrane vesicles//FEBS lett., 1989 Vol. 249, № 1. P. 129- 133.

150. Leonard R. Т., Hodges Т. K. Characterization of plasma membrane-associated adenosine triphosphatase activity of oat roots // Plant Physiol., 1973. Vol. 52, № 1. P. 6 -12.

151. Leonard R. Т., Hotchkiss C. W. Cation-stimulated Adenosine Triphosphatase Activity and Cation Transport in Corn Roots // Plant Physiol., 1976. Vol. 58, № 3. P. 331 -335.

152. Lin W., Hanson J.B. Cell potentials, cell resistance, and proton fluxes in corn root tissue. Effects of dithioerythritol // Plant Physiol., 1976. Vol. 58. P. 276 282.

153. Lino В., Victor M., Baizabal-Aguirre, Luis E., Gonzalez de la Vara. The plasma-membrane H+-ATPase from beet root is inhibited by calcium-dependent phosphorylation // Planta., 1997. Vol. 204. P. 352 359.

154. Lowry О. H. Rosebrough N. G., Farr A. L., Randall R. G. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem., 1951. Vol. 193, № 1. P. 265 275.

155. LuckeyT. D. Hormesis with ionizing radiation. Boca Raton: CRC Press, 1980. 198 p.

156. Maathuis F.J.M., Sanders D. Plant membrane transport // Curr. Opin. Cell Biol., 1992. Vol. 4, №4. P. 661 -669.

157. Maathuis F.J.M., Sanders D. Plasma membrane transport in context making sense out of complexity // Cur. Opin. Plant Biol., 1999. Vol. 2, № 3. P. 236 - 243.

158. Michelet В., Boutry M. The plasma membrane H+-ATPase. A highly regulated enzyme with multiple physiological functions//Plant Physiol., 1995. Vol. 108, № 1. P.1 -6.

159. Miller M. V., Miller W. M. Radiation hormesis in plants. Health Phys., 1987. Vol. 52, №5 P. 607-616.

160. Morsomme P., Boutry M. The plant plasma membrane H+-ATPase: structure, function and regulation // Biochim. Biophis. Acta, 2000. Vol. 1465. P. 1 16.

161. Muir S. R., Bewell M.A., Sanders D., Allen G.J. Ligand-gated Ca2+ signaling in higher plants // J. Exp. Bot., 1997. Vol. 48. P. 589 597.

162. Ohki S. The origin of electrical potential in biological systems // Comprehensive Treatise Electrochem., 1985. Vol. 10. P. 1 -130.

163. Palecz D., Leyko W. Effect of gamma radiation on enzymatic activity and sulfhy-dryl groups of human erythrocyte membrane // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud phys. Chem. med., 1983. Vol. 44, № 3. P. 293 299.

164. Palmgren M.G. Regulation of plant plasma membrane H+-ATPase activity // Physiol. Plant., 1991. Vol. 83. P. 314 323

165. Palmgren M.G. Proton gradients and plant growth: Role of the plasma membrane H+-ATPase //Afv. Bot. Res., 1998. Vol. 28. P. 1-70.

166. Palmgren M.G., Harper J.F. Pumping with plant P-type ATPases // J. Exp. Bot., 1999. Vol. 50. P. 883-893.

167. Palmgren M.G., Sommarin M., Larsson C. Proteolytic activation of plant plasma membrane H+-ATPase by removal of a terminal segment // J. Biol. Chem., 1990. V. 265. P. 13423-13426.

168. Palmgren M.G., Sommarin M., Serrano R., Larsson C. Identification of an Autoinhibitory Domain in the C-terminal region of the plant plasma membrane H+-ATPase // J. Biol. Chem., 1991. V. 266. P. 20740 20745.

169. Petkau A. Radiation affection of model phospholipids membranes // Acta Physiol. Scand., 1980. Vol. 492. P. 81 90.

170. Pierce W. S., Hendrix D. L. Utilization of Enzime Markers to Determine the Location of Plasma Membrane from Pisum Epicotyls on Sucrose Gradients // Planta, 1979. Vol. 146, №2. P. 161 -169.

171. Planel G., Soleilhavoup I. P., Tixador R. Demonstration of a stimulating effect of natural ionizing radiation and of very low radiation doses on cell multiplication // Biol, and Env. Eff. Of low-level radiation. Vienna: IAEA, 1976. P. 127 140.

172. Portillo F. Regulation of plasma membrane H+-ATPase in fungi and plants // Biochim. Biophis. Acta, 2000. Vol. 1469. P. 31 42.

173. Qiu Q.-S., Su X.-F. The influence of extracellular-side Ca2+ on the activity of the plasma membrane H+-ATPase from wheat roots //Aust. J. Plant Physiol., 1998. Vol. 25. P. 923 928.

174. Pyatygin S. S. Opritov V. A., Khudyakov V. A. Subthreshold changes in excitable membranes of Cucurbita pepo L. stem cells during cooling-induced action-potential generation//Planta, 1992. Vol. 186, №2. P. 161.

175. Reddy A. S. N. Calcium: silver bullet in signaling // Plant science, 2001. Vol. 160. P. 381 -404.

176. Robbins К. M., Bhuvarahamurthy N., Pliska-Matyshak G., Murthy P. P. The isolation and characterization of right-side-out plasma membrane vesicles from barley aleu-rone cells // Lipids, 1999. Vol. 34, № 1. P. 75 82.

177. Schoenmakers T. J. M., VisserG. J., Flik G., TheuventA. P. R. CHELATOR: An improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions // Bio.Techniques, 1992. Vol. 12. P. 870 879.

178. Selye H. Syndrome produced by diverse nocuous agents // Nature, 1936. Vol. 138, № 3479.

179. Serrano R. Structure and function of plasma membrane ATPase // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1989. Vol. 40. P. 61 94.

180. Sze H. H+- translocating ATPases of the plasma membrane and tonoplast of plant cells // Physiol. Plant., 1984. Vol. 61. P. 683-691.

181. Sze H., Li X., Palmgren M.G. Energization of plant cell membranes by H+-pumping ATPases: regulation and biosynthesis // Plant Cell, 1999. Vol. 11, № 4. P. 677 -689.

182. Trewavas A. Le calcium, c'est la vie: calcium makes waves // Plant Physiol., 1999. Vol. 120. P. 1 -6.

183. Yonei S., Akasaka S., Kato M. Studies on the mechanism of radiation-induced structural disorganization of human erithrocite membranes // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud phys. Chem. med., 1984. Vol. 46, № 4. P. 463 471.

Информация о работе

Шибарова, Анна Николаевна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Анализ влияния малых доз ионизирующей радиации на протонную проницаемость и активность H+-атфазы плазмалеммы клеток высшего растения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Анализ влияния малых доз ионизирующей радиации на протонную проницаемость и активность H+-атфазы плазмалеммы клеток высшего растения - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы