Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Na+ - транспортирующие механизмы в плазматической мембране морской микроводоросли PLATYMONAS VIRIDIS

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Na+ - транспортирующие механизмы в плазматической мембране морской микроводоросли PLATYMONAS VIRIDIS"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

РГ6 ОД

IIa правах рукописп

. 3 ;./.■:

ПОПОВА Лариса Геннадиевна

УДК 581.133.8

Na+ - ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ МЕХАНИЗМЫ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ

PLATYMONAS VIRIDIS

Специальность 03.00Л2 — физиология растении

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

кандидат биологических наук 10. В. БАЛНОКИН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор II. II. КОРАБЛЕВА,

кандидат биологических наук II. И. ТИХАЯ

Ведущее учреждение — Институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, г. Москва.

О * ? '—

Защита состоится г. в ...... часов

на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К 053.05.14 при Московском государственном университете по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Научный руководитель:

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

О. Г. ПОЛЕССКАЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. ' Способность солеустойчивых растений осуществлять жизненный цикл при высоких концентрациях солей в среде в значительной степени реализуется за счет поддержания низкого уровня ионов в цитоплазме. Ионное гомеостатирование цитоплазмы мокно рассматривать как основную стратегию солеустойчивости, проявляющуюся на клеточном уровне [Балнокин, Строгонов, 1985; 1989]. Механизмы ионного гомеостатирования позволяют галотолерантным организмам избегать нарушений в обмене веществ, которые были охарактеризованы как токсические эффекты солей [Строгонов, 1962]. В связи с этим, исследование механизмов ионного гомеостатирования растительных организмов, обитающих в средах с высоким содержанием Na+, является одной из. актуальных задач ; фитофизиологии.

Важнейший вклад в регуляцию цитоплазматических концентраций ионов вносит плазматическая мембрана клетки.. В условиях высокой солености среды она ограничивает поступление ионов снаружи и обеспечивает их выведете из клетки за счет использования метаболической энергии.

У растителышх организмов, обитающих в средах с высоким содержанием солей , на плазматической мембране поддерживаются градиенты электрохимического потенциала Na+ большей величины, чем у растений пресного фона [Raven, 1976; Медведев, 1985]. Исходя из этого, мокно предположить, что плазмалемма клеток галотолерантных растений обладает специфическими механизмами активного транспорта Na+, которые отсутствуют в югазмалемме клеток растений пресного фона. Считается, что у высших растений-гликофитов и пресноводных водорослей Na+ выводится из цитоплазмы посредством механизма ионно-обменной диффузии, через Na+/H+ антипортер. Последний использует для этого энергию' градиента электрохимического потенциала протонов -Afijjb генерируемого Н^АТФазой плвзмалеммы [Sze, 1985].

Активный транспорт « Ка+ через плазмалемму у галотолерантных растений изучен мало. В наименьшей степени исследован вопрос о возмогших механизмах первичного активного

транснорта этого иона. Поэтому актуальной является задача идентификации и исследования свойств На+-трансгтортарущих систем в плазмалемме галотолерантных растений.

Галотолерантные микроводоросли-эукариоты, обитающие в морской воде и минерализованных водоемах являются удобной моделью для такого рода исследований.

Исследование ион-транслоцируицих систем, локализованных в плазмалемме, наиболее успешно может Сыть осуществлено на выделенных везикулах этой мембраны [Sze, 1985]. Однако в литературных источниках практически отсутствуют сведения о выделении из галотолерантных микроводорослей везикул плазмалеммы, сохраняющих барьерные свойства .по-отношеншо к ионам и функционально активных.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛВДОВАНИЯ. Целью работы было изучение Na+-транспортирующих систем плазматической мембраны морской

МИКроВОДОрОСЛИ Flatynonas viridis. В СВЯЗИ С ЭТИМ, непосредственно в задачу работы входило:

(1) Разработать метод выделения чистой фракции плазматической мембраны из клеток р. viridis, функционально активной по отношению к транспорту Н+ и Иа+;

(2) Исследовать свойства АТФазной активности препарата плазмалеммы и сравнить их с известными свойствами Н+-АТФазы плазмалеммы высших растений и пресноводных водорослей;

(3) Исследовать АТФ-зависимый транспорт Н+ и Na+ на выделенных везикулах плазмалеммы и идентифицировать системы первичного и вторичного активного транспорта ионов Na+ в плазматической мембране р. viridis.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате проведенной работы впервые предложен метод выделения высокоочшценной фракции плазматической мембраны из морской одноклеточной водоросли р. viridis, сохраняющей барьерные свойства по-отношению к ионам Н* и Na+. Выделенные везикулы плазмалеммы обладают Н*~- и Ла+-транслоцируидими активностями. Показано, что АТФазная активность плазматической мембраны р. viridis по основным характеристикам сходна с ^-АТФа'зой плазмалеммы высших растений гликофитов ■ и пресноводных водорослей. Однако', по некоторым свойствам она отличается от последней. Основные различия отнесены к функционированию двух транспортных АТФаз в

плазмалемме р. viridis- В суспензии везикул плазмалеммы впервые для галотолерантных микроводорослей продемонстрирован транспорт Н4", осуществляемый в&надат-чувствительной АТФазоЙ. Диссипация под действием ионов Na+ созданного работой этой АТФазы протонного градиента указывает на функционирование в плазмалемме р, viridis вторичной активной транспортной системы - Na+/H+ антипортера.

Впервые для галотолерантных водорослей показано, что в условиях когда Ajljj+ на мембране отсутствует, поглощение ионов Na+ везикулами осуществляется посредством первичной активной транспортной системы - электрогенной Ка+-АТФазы. Функционирование На+-АТФазы в плазмалемме р. viridis отражает адаптацию этой водоросли к условиям высокой солености среда и одновременно щелочных pH.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные результаты,, могут быть использованы для развития исследований на уровне клетки в области солеустойчивости растений, в частности, механизмов ионного гомеостатирования цитоплазмы у галотолерантных водорослей и высших растений-галофитов. Разработанный метод выделения плазмалеммы р. viridis может быть использован в исследованиях различного профиля (физиология, биохимия, биофизика, молекулярная биология растений), проводимых с использованием галотолерантных микроводорослей в качестве об'екта.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований были доложены на: Всесоюзном совещании "Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, 1991), v Меадународном молодежном симпозиуме "Регуляция метаболизма в растениях" (София, 1991), XV Международном конгрессе по биохикш (Реховот, 1991), II С'езде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1992), Международном сюлпознумэ по физиологии, биохимии и генетике содаустойчивости растений (Ташкент, 1993), VIII Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Антверпен, 1992).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано II печатных работ. ■ ,

СТРУКТУРА И. ОБ'ЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоят из введения, обзора

литературы, экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 6 таблиц, 21 рисунок; список литературы включает 178 наименований.

ОБ'ЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ,

Об'актом исследов а кия служила морская одноклеточная микроводоросль piatynonas viridisi культивируемая на стерилизованной искусственной морской воде (ЩубравыЯ, 1983).

Препараты плазматической мембраны получали из 7 л культуры, находящейся в конце логарифмической стадии роста. Дезинтеграции клеток, осуществляемой с помощью гипотонического шока, предшествовала обработка клеток протеолитическим ферментом (трипсином), которая приводила к частичной деградации гликопротеиновой клеточной оболочки. Последующий мягкий гипотонический шок вызывал образование цитоплазматической капли, выходящей через отверстие в клеточной стенке, которое появлялось в результате обработки клеток трипсином. Цитоплазматические капли осаздали центрифугированием на скорости 15000g, получая грубую, мембранную фракцию. Дальнейшее разделение мембран и очистка плазмалеммы осуществлялись центрифугированием грубой мембранной фракции в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (Balnokin et al., 1993).

При выделении плазмалеммы в качестве маркера этой мембраны использовали радиоактивный который ковалэнтно

связывали с внешними белками плазмалемг-и. Связывшшо метки с штзмаломмой осуществлялось согласно квтотшо лактопероксидазного/глвкозооксидазного иодирования клеточных поверхностей (Hubbard. Cohn, 1972), Процедуру связываний метки с плазмалеммой осуществляли после обработки iелоток трипсином, когда образовавшееся .в клеточной стенке отверстие открывало доступ компонентам реакции к плазмалок.'.э.

АТФ-пуфолазную активность препаратов (а так se другие фосфогидролазныо активности) определяли по высвобождении неорганического фосфата из соответствующего фо сфо со до pstaae го субстрата. При изучении действия ингибиторов проводили 30 ккн

предынкубацию мембранной, фракции с действующим агентом при комнатной температуре.

Содераание неорганического фосфата определяли по методу Картера и Карла (Carter, Carl, 1982) с использованием малахитового зеленого.

Активность цитохром с оксидазы , а так же антимицин А -нечувствительной НАД(Ф)Н-зависимой цитохром ' с редуктазы определяли спэктрофотометрически (Hodges, Leonard, 1974).

Хлорофилл определяли по Джеффри (Jeffreys 1972).

Содержание белка определяла по методу Симпсона и Сомма (Simpson, Somme, 1982).

Наблюдение АТФ-зависимой генерации АрН на везикулах плазм алеют, а так se Ка^-индуцируемой диссипации АрН осуществляли спектрофотометрически, регистрируя изменения оптической плотности рН-индикатора акридинового оранжевого (АО)(Sohuldiner et al., 1972) в двуволновом режима (А492_540) на спектрофотометре Hitaohi 557, Япония.

Транспорт ионов На* через везикулярную мембрану изучали тагске с помотаю регистрируя поглощение 22Na+ везикулами

плазматической мембраны; мембранный материал переносился на нитроцеллюлозные фильтры, на которых производилось определение радиоактивности (Heefner at al., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I.Получение препаратов плазматической мембраны.

В настоящей работе предлокеи метод получения Еысокоочкценной фракции плазматической мембршш из морской шпсроводорослл Platyaonas viridis. ЧаСТИЧШЙ ПрОТООЛИЗ глшсопротвиновой клеточной стешет р. viridis, осуществляв!,мй трипсином, С послэдукщм МЯГКИМ ГИПОТОНИЧвСКИМ шоком позволили дезинтегрировать клетки р. viridis таким образом, что yi:o на para пи стадиях процедуры выделения плазмалеммы ее можно было отдалить от большей части других клеточных мембран п органвлл. Последующее дифференциальное центрифугировашю и центрифугирование в ступенчатом .градиенте плотности сахарозы (Рис.1) привело к практически полному отделению плазмалеющ от осташейся части.загрязняющих мембран и органолл. О положении

плазмалеммы в градиенте судили по распределению радиоактивной метки, т.к. в данной работе был использован 1251~ в качестве искусственного маркера плазмалеммы. Радиоактивность дала один пик в градиенте, показывая, что метка связалась специфически (с поверхностными белками). Фракции градиента, в которых регистрировался максимум радиоактивности . (фракции 7-11, Рис.I), были практически свободны от загрязнения тилвкоидами и митохондриальными фрагментами. Маловероятно также, что мембраны эндоплазматического ретикулума присутствовали р этих фракциях, т.к. для фракционирования в ступенчатом градиенте был использован мембранный материал, полученный осаждением при скорости центрифугирования . 15000g, тогда как осаждение эндоплазматического ретикулума требует высокоскоростного центрифугирования (около I00000g). Регистрируемая в этих фракциях антимицин А - нечувствительная НАД(Ф)Н-цитохром с оксидоредуктазная актиы.-ш ь из свидетельствует о загрязнении исследуемых фракций мембранами эндоплазматического ретикулума, т.к.показано, что оксидоредуктазные активности ассоциированы также и с плазматической мембраной растительной клетки (Ivankina, Novak, 1931; Lundborg et a}., 1981). Во фракциях 7-1I градиента регистрируется также пирофосфатазная активность, но это не означает загрязнение фракций тонопластом, т.к. (I) в клетках р.viridis.отсутствует крупная центральная вакуоль, (2) АТФазная активность фракций 7-II не подавляется нитратом, (3) свойства пирофосфатазной активности фракций 7-11 градиента отличаются ' от свойств пирофосфатазы тонопласта клеток растений, (4) хотя Н+-транслоцирующая пирофосфатаза считается маркером тонопласта, пирофосфатазная активность обнаруживается также и в других клеточных мембранах, в том числе, и в плазмалемме (Kirsch et al., 1989; Williame et al., 1990).

Центрифугирование мембранного материала, содержащегося во фракциях 7-П ступенчатого сахарозного градиента, до равновесного состояния в линейном (I5 - 60 %) сахарозном градиенте (8 час при IOOOOOg) показало, что мембраны фракций 7-П ступенчатого градиента однородны и практически не содержат примесей (Рис.2). В градиенте сформировалась только одни полоса при плотности I.U - 1,15 г/см^. Мембраны,

Pac.I. Рапределение Свлка и маркеров мембран при центрифугировании грубой мембранной,фракции из р. viridis в сту» пенчатом градиенте сахарозы. А: I - белок (мг/фр), 2 - радиоактивность (расп./мин.фр); В: 3 - хлорофилл (мг/фр), 4 - пирофос-фатаза (нмоль Ря/фр.мин); С: 5 - цитохром с оксидаза (нмоль цит/ фр.шш),'6 - внтюйщин А нечувствительная НАД(Ф)Н-цит с оксидо-рэдуктаза (нмоль цит с/фр.мин); D: 7 - АТФаза, измеренная в стандартной реакционной смеси, 8 - АТФаза в присутствии 50 (¿1

кно.

3-

1 5 10

nct.'.sp фракция

Рас.2. Рэзультат центрифугирования фретцяЗ 7 - II ступенчатого градавп та в лшойксм сахарозюп градиенте; 1 - белок (:.т/Фр.). 2 - Атазра, измеренная в стандартной реакционной смеси, 3 - АТФаза в присутствии 0,1 f.t'J ванадата, 4 - плотность градиента (г/мл).

20 30 40 Mg2*, tiJ

Рпс.З. Влияние i?g2+ у Од2* на АТФазную активность препаратов плазмалекад р. viridis. I - Mgci2, г - cacig

АТФазная активность выра-сена в 1жмоль Р„/мг белка час.

образующие эту полосу обладали ванадат-чувствительной, ш^-нечувствительной АТФ-гидролазной активностью, что является характеристикой АТФазы плазмалеммы.

Совокупность представленных данных.свидетельствует о том» что фракции 7-11 ступенчатого сахарозного градиента содержат плазмалемму, которая практически не загрязнена другими клеточными мембранами. Поскольку, в ступенчатом сахарозном градиенте плазмвлемма располагалась над верхней ступенью (15* сахароза), в дальнейшем при выделении плазмалеммы вместо ступенчатого градиента применялась 15 % сахарозная "подушка".

2. Свойства АТФ-гидролазной активности препаратов плазмалеммы

P-xYittdtS.- О ?

Исследование• свойств АТФ-гидролазной активности полученных препаратов плазмалеммы было предпринято с целью сопоставить эти свойства с известными свойствами {^-АТФазы плазмалеммы растительных клеток.

Гидролиз АТФ, катализируемый фракцией плазматической мембраны р.viridis зависел от ионов Hg2+; максимальная скорость гидролиза достигалась при 5-10 кратном избытке ионов Ug2+ над АТФ в реакционной смеси (Рис. 3). Замена ионов Hg2+ на ионы Са2+ приводила к существенному снижению скорости гидролиза АТФ (Рис. 3).

Кинетика гидролиза АТФ, катализируемого препаратами . плазмалеммы р.viridis, описывается кривыми с насыщением (Рис.4); данные, представленные в двойных обратных координатах (Рис. 4, вставка) показывают, что только при низких концентрациях субстрата гидролиз АТФ описывается кинетикой . ЫиХаэлиса - Ментен. Ку и v^^, определенные исходя из линейных участков на графике Лайнуивера-Берка, лежат в диапазоне: Ку = 0,10 - 0,14 мМ, v^ = 17 - 20 мкмоль Рн/мг белка * час, в зависимости от концентрации АТФ и Ug2* в реакционной смеси.

Гидролиз АТФ, катализируемый препаратами плазмалеммы f.viridis, осуществляется в широком; диапазоне pH. включая крайнюю велочную область, в имеет выраженный оптимум при pH 6,5 - 7,0 (Рис. 5). Л '

Исследование действия ингибиторов различных АТФаз на АТФ-гидролазную активность препаратов плазмалеммы р.viridis

IS

10

MTlaH)

Рис.5.рН-зависимость АТФазной активности препаратов плазма-леммы р.viridis. Активность выражена в мкмоль Р„/мг белка час. "

Рис,4. Зависимость АТФазной активности препаратов влазмалеммы р. viridis от концентрации АТФ при (I) - 0,6 мМ MgOlj,, (2) - 5 или 10 мМ Mgolg- 2

Ю"1 10" ИНГИбВГОр» Ш

Рао.В. Вяаягоя ингибиторов на АТФ-взауп активность препаратов плаз-малекиа p. riridia. I - ванадат, 2 - dccd, з - //-этилмалеишд, : 4 - DES. Активность внрагена в S от контроля.

Соль, т

Рио.7. Влияние KOl (1? я IfaOl (2) на АТФазнуи ая- ■ тивность препаратов шга-змалеммн р. viridis. Активность выражена в % от контроля.

noKfuifijio, что специфические ингибиторы митохондриальных АТФаз олигомицин и азид, специфический ингибитор кислых фосфатаз молибдпт, ингибитор АТФазы тонопласта нитрат, уабаин -ингибитор Na+,к+-АТФазы животных клеток- не оказывают -иигибирушого действия на исследуемую активность.

Наиболее сильный ингибируиций эффект оказывал ванадат (Kj^y » 23 - 40 мкМ), эффективный ингибитор Н^-АТФазы плазматичоской мембраны растений; дициклогексилкарбодиимид (DOOP), носпоцифический ингибитор Н+-АТФаз, и л-этилмалеимид, сул1>фгидрилышй роагент, также подавляли исследуемую АТФазную . активность (Kj = 60 -75 мкМ и Kj 50 = 250 мкМ, соответственно). Диэтилстильбестрол (DES), неспецифический ингибитор мембранных АТФаз практически не влиял на исследуемую АТФлпную активность (Рис.6).

препараты плазмалеммы р. viridis с .'одинаковой оффектигшостыо осуществляли гидролиз АТФ и пирофосфата; скорость гидролиза этих субстратов была существенно выше, чем других нронерегошх фосфосодоржащих соединений (стр, gtp, otp, adp, inp, amp, pfipp). Как обсуздалось выше, способность препаратов плазмалеммы р. viridis осуществлять гидролиз пирофосфата не связана с загрязнением препаратов плазмалеммы'. тоноплястом. Пирофосфятазная активность, по-видимому, присуща плазматической мембране г.viridis.

В присутствии агента, снимающего протонный градиент на мембране (протонофор.карбонилцишшдхлорфенилгидразон, ciccp), скорость гидролиза АТФ препаратами плазмалеммы увеличивалась в 1,5 - 2 раза. Это указывало на то, что в получаемых препаратах плазмалемма (I) замкнута в везикулы, (2) проницаемость мембраны по отношению к Н+ сохраняется на достаточно низком уровне.

Одновалентные катионы (К+ и Na+ ) стимулировали исследуемую активность, причем зависимость стимуляции от концентрации катионов имела необычный характер.. Было . обнаружено два концентрационных максимума стимуляции, одновалентными катионами: один в области 25 - 75 Ш. соли, другой - в области 150 -400 мы (Гис. 7). Синергизм в спгуу."Я1ага исследуемой АТФазюй активности ионами К+ и Na+ отсутствовал, что свидетельствовало против Функционирования. в

плазмалемме р. viridis Na+,K+-АТФазы, подобной Na+Д+-АТ'Фазв животных клеток.

Таким образом, проведенные исследования показали, ' что свойства АТФ-гидролазной активности препаратов плазмалеммы Р. viridis во многом сходны со свойствами Н+-АТФазы плазмалеммы высших растений-гликофитов и пресноводных водорослей. Это -оптимум действия при pH 6,5 - 7,0, требование ионов Mg2\ но не Са2+ для активности, специфичность к АТФ как к субстрату, стимуляция ионами К+, ингибирование ванадатом, DCCD и уу-этилмалеимидом, нечувствительность к ингибиторам других клеточных АТФаз. Сходство характеристик . . позволяет предположить, что в плазматической мембране p.viridis функционирует фермент, аналогичный протонной помпе плазмалеммы" высших растений.

В то. же время имеются отличия. Такие характеристики АТФ-гидролазной активности препаратов плазмалеммы р, viridis, как требование избытка ионов Mg над АТФ для максимальной, активности фермента* низкие значения К^, нечувствительность к des могут быть об'яснены особенностями липидного состава • плазмалеммы p.viridis, которые, возможно, свойственны , Р. viridis как галотолерантной микроводоросли ( Sheffer et al., 1986).

Вместе с тем, некоторые отличия свойств исследуемой активности от свойств обычной Н^-АТФазы плазмалеммы высших растений могут быть связаны с функционированием, помимо Н+-АТФазы, еще одной АТФазы в плазмалемма р. viridis. Эти отличия: (I) относительно высокая АТФ-гидролазная активность препаратов плазмалеммы p.viridis в щелочной области, (2) два концентрационных максимума стимуляции одновалентными катионами исследуемой АТФ-гидролазной активности.

Следует отметать, что идея о функционировании второй АТФазы (возможно, Ка^-транспортируицей) в плазмалемме галотолерантных микроводораслей возникла также на основании данных, полученных в экспериментах на интактянх клетках галотолерантных водоослей Dunaliella наг Шва (Балнокин, Мвдведег, ,1984) и p.viridis (Галкина, Балнокин, 1992). ß этих работах было, 'обнаружено, что транспорт ионов' На+ через плазмалемму галотолерантных водорослей не -всегда , можно

Об'яснить функционированием вторичного Na+/H+ аятипортера, енергизуемого работой К^АТФазы. •

Следующие эксперименты, проведенные нами на везикулах плазмалеммы р.viridis, показали, что в этой мембране действительно функционируют два механизма транслокации ионов Na+. Это: (I) К^-АТФаза + Ь^ - зависимый Ка+/Н+ анткггартер, (2) Ajlpj-v - независимый, АТФ-индуцируемый Иа+-ункпорт .(Ка+-транслоцирующая АТФаза). '

3. Н^-транслоцируицая АТФаза и На+/Н* антипортер в плазматической мембране р. viridis. ■ , : '

Добавление АТФ к реакционной смеси,' содержащей везикулы плазмалеммы р. viridis и зонд на ДрН 40 приводило к уменьшению оптической плотности АО (Рис. 8). Это свидетельствовало о закислении внутривезикулярного пространства, - обусловленном .АТФ-зависимым переносом Н4" внутрь везикул. - Добавление протовофора oiccp приводило к быстрой, диссипации созданного протонного градиента. Ванадат в значительной степени уменьшал величину созданного АрН (Рис. 8), что говорило об участии .ванадат-чувствительной АТФазы в.генерации АрН на везикулах. Об електрогенной природе протонного насоса можно было судить по тому, что генерации АрН на везикулах удавалось наблюдать только в присутствии проникающих через плазмаламму анионов -NOg и сГ. * "; '."■;;.' ■

Величина генерируемого на- везикулах шазмапеммн АрН зависела от pH реакционной смеси, достигая максимума при pH 6,0 - 7,а и резко спадая в щелочной области. Уеэ при pH 8.0 практически не удавалось наблвдать : формирование ¿pH на везикулах (Рис.9). ' ; '"

Ионы Na+ вызывали диссипацию протонного градиента, предварительно, созданного на везикулах работой tf^-АТФазц. (Рис .10)". Зависимость скорости расаада АрН' от концентрации вносимого Ка+ описывается кривой с насзденаеи (Рис. И). Экспериментальная кривая мояет быть аппроксимирована кривой, описываемой уравнением Шхаэлиса - Нантен с Ку ■ 10 Ш (Рис* 11,'вставка). Это значение Ку лэигг в ряду внутриклеточных концентраций Na+ у галотолерантных макроводороодей (1йдаедзв,

Рис.8. АТФ-зависимая генерация ДрН на везикулах плазмалеммы р. viridis. АТФ, С1ССР и ванадат вносили в реакционную смесь в конечных концентрациях: I мМ, " 12 мкМ и 0,1 Ш, соответственно.

Рис.10." Диссипация ДрН на везикулярной мембране, р. viridis под действием ионов( На+.

Рис.9. Зависимость величины генерируемого на везикулярной мембране р. viridis АрН от pH реакционной смеси. По оси ординат: относительная величина образувдегося АрН, выраженная в %,

Рис.II. Зависимость скорости распада ДрН на везикулярной мембране р. viridis от [wa+J.

1 - экспериментальная кривая,

2 - теоретическая зависимость Мяхаэлиса - Мвнтен, Ку=1.0 мМ.

Наблюдаемый Иа+/Н+ обман был специфичен' по-отношению к ионам Яа*. Замена Ка+ другими катионами (К*, ,Ы* приводила к снижению скорости диссипации ДрН (Табл. 1).

Св+)

Катион' Относительная скорость

(100 мМ) диссипации, %

Na* 100

К+ 22

Cs* 10

Li* 0 •

Таблица 1. Эффективность диссипации ДрН на везикулах плазматической мембраны р. viridis под действием различных катионов.

Na*/H* обмен, если были

Эти катионы также ингибировали внесены в реакционную смесь до того, как туда был внесен (Табл. 2). Амилорид, ингибитор На*/Н* антипортера в животных клетках и в тонопласте растений, ингибировал так ке Ка*/Н* обмен, наблюдаемый на везикулах плазмалемш. Р.у1г1ахв (Табл.2).

Агент Относительная скорость диссипации, %

Naci, юо мМ +КС1, 100 мМ +ЫС1, 1Q0 ММ +CsCl, 100 ММ +амилорид,

. 0,2 мМ

100 га

37 20 10

Таблица 2. Ингибироваше Na*/H+ обмена на везикулах плазматической мембраны Р.viridis. Катионы или амилорид были добавлены до внесения Na*.

4. АТФ-зависимое поглощение 2%1а везикулами плазмалекмз р. viridis. Эксперименты проводили при двух значениях pH 1Шкубационной среда - pH 7,0 и pH 8,0. При pH 7,0 ваолэдался максимум генерации АрН на везикулах шшзмалешц р. viridis (см. Рис.9),однако в экспериментах с 22Ка* практически ю удалось наблюдать поглощение'. Ua+ везикулами,.' обусловленное работой вторичного йа*/н+ антшортора (Рис. 12, А, 2). Прзчкш ^того не ясны, но поглощение- 22Ка* везикулой!, осуществляемое

в присутствии экзогенного На /н обмешшка моненсина (Рис. 12, А, 4) свидетельствует о том, что АрК на мембране генерируется и в условиях этого эксперимента.

АТФ-зависимое поглощение 22Ка+ везикулами плазмалеммы при рН 7,0 наблюдалось ■ так же в присутствии протонофора С1ССР (Рис.12, А, 3), который, снимая на мембране, ингибярует поглощение 22Ка+, обусловленное1 работой Др^ - зависимого. На+/Н+ антипортера. Следовательно, наблюдавшееся при рН:7.,0в присутствий 01ССР поглощение везикулами ионов Нз+ было обусловлено работой Ай^ - независимой Иа+-транслоцирующей системы. ■•■"".

2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 I Ь

' А 4

»

* X • I ■

8

12

0.8

Время после добавления АТФ, мин

Рис.12. АТФ-зависимое поглощение 22Ма+ везикулами плазма-леммы р. у^гйИз при рН 7,0 я 20 Ш НаС1 в реакционной смеси (А) или при рН 8,0 и 50 мМ НаС1 в реакционной смеси (В), I - контроль (без АТФ), 2 -2 чИ АТФ, 3 - АТФ + 12 мкМ С1ССР, 4 - АТФ +■ 12 мкМ мояенсин. Символы: ( » )- контроль, (к ) - 2 Ш АТФ, (А ) - АТФ + 12 мкМ С1ССР, (&) - АТФ + 50 мкМ ашлорид. По. оси ординат; 22г?а+ в везикулах, расп.мин.х10(~5)Л!г белка.

При pH 8,0, когда не. наблюдалось формирования АрН на везикулах плазмалегжы р, viridis (см.. Рис.9), АТФ индуцировал поглощение 22на+ везикулаш (РисЛ2,. В). Это поглощение не зависело от присутствия clccr и не ннгибировалось амилоридом, ■ Результат« последних экспериментов позволяют сделать вывод, что в плазматической мембране р. viridis, функционирует

АТФ-индуцируемый, Ajlj^f - независимый механизм транспорта ионов Na+.. По-видимому!.этот механизм есть первичная алектрогенная Иа+-транслоцирущая АТФаза. Об элвктрогенности свидетельствуют следующие факты. (I > При нейтральных pH, когда Непроводимость мембраны 'низкая, АТФ-индуцируемое поглощение 22На+ везикулами можно было наблюдать лишь в присутствии протонофора сюср. .С1ССР индуцировал отток Н+ из везикул,, и этим снимал • электрический потенциал на мембране, который генерировала Ка+-АТФаза, транспортируя ионы На+ внутрь везикул. (2) При щелочных pH, когда мембрана становилась более проницаемой для протона (см.Рис.9 и раб. Bisson, Walker, 19S1), С10СР не влиял на поглощение 22На+ везикулами.

' ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенной работы получен высокоочищенный препарат плазмалеммы р. viridis- Выделенные везикулы плазмалеммы обладают н+- и Na+ - транслоцирующиш активностями и способны удерживать градиенты этих ионов, что позволило использовать препарат в качестве модельной системы •для идентификации и исследования свойств ^-транспортирующих систем штзмале!у!мы р. viridis.

Проведенные на выделенных везикулах исследования транспорта ионов показали, что в плазмалеммо р. viridis функционируют две ^-транспортирующие системы: (I > Иа+/Н+ антшортер, который осуществляет вторичный активный транспорт Na+; источником энергии да него • является АД^, генерируемый первичной. Н^-помпой (Н^-АТФазой), (2) первичная электрогашая Иа+-пота (На+-АТФаза).

iia+/H+ . антшортер, использующий э и ерпш Ajlj^f , функционирует в мембранах клеток как эукариот, так и прокариот. У эукарнотических организмов он ' обнаруживается в мембранах животного а растительного происховдения, а у растений встречается как среда гликофитов, так и галофитов.

Чем монет быть обусловлено наличие еще одной Na*-транспортирующей системы - первичной иа+- помпы в плазмалеммо р. viridis?

% ЭлектроиэйтралышЯ На+/Н+ антипортер (1Н+/1Ыа+) способен

выводить ионы . Na+ из клетки только тогда, когда, ЛрН на плазмалемме■направлен из среды в клетку (среда более кислая, чем цитоплазма).. В щелочной среде, благодаря функции рН-статирования цитоплазмы, ДрН имеет обратное направление, и, следовательно, выведение ионов Na+ из клетки посредством электронейтрального Na+/H+ антипортера невозможно.

Электрогенный Na+/H+ антипортер (обменивает 2 или большее число н+ на I Na+), по-видимому, мог бы выполнять функцию выведения Ка+ из клетки при щелочных значениях pH среды, т. к. движущей силой в этом случав служила бы электрическая составляющая протонного градиента, Дф. Однако, имеются сведения, что при щелочных pH возрастает н+-проводимость плазмалеммы растительных клеток (Bisson, V7alker, 1980), при' крайне щелочных pH ¿¡х^ на плазмалемме приближается к О (Biseon, Walker, I98I) и, следовательно, не может служить движущей силой экспорта ионов Na+. Таким образом, и электрогенный Ка+/Н+ антипортер при щелочных pH среда, по-, видимому, не способен транспортировать Ка+ из клетки. В этом случае проблема экспорта Na+ могла бы решаться за счет ' функционирования первичной 1{а*-помш - Na -АТФазы.

Последняя продемонстрирована нами в плазмалемме p.vJLridis рр +

в экспериментах с Na (Рис. 12). Предполагаемый pH оптимум работы этого фермента (около 8,0), а так ке активация фермента высокими концентрациями Na+ ' (Рис.7), соответствуют условиям, возникающим в ■ цитоплазме при пшеросмотическЬм солевом шоке. Концентрация iîa+ в цитоплазме в этом случае достигает нескольких ' сот (,?,! (Балнокин и др., 1990), что приближается к значениям второго концентрационного максимума стимуляции АТФ-гидролазной активности иона'л Ua+, а цитоплазма защелачивается, приблизите льда, до .pH 8,0 (Kuchitsu. et al., 1989). Заболачивание наружной среды так se сдвигает цитоплазматический pH в слабо щело.чную'область (Kugel et ai., 1987 ). При таких значениях pH ■ цитоплазш обычная н+-ДТФаза (оптш'ум 6,5-7,0) функционирует 'менее эффективно. С учетом того, что при поеымшп! наружных pH проницаемость шгазмалеюш для протона увеличивается, величина генерируемого A|Iff+ .мопзт-быть крайне .незначительной. В этой ситуации ' знергизация плазмалеиш могла бы осуществляться за .• счет .работы

' электрогенной Na+-AT<Da3U (оптимум pH 8,0). Электрический потенциал, создаваемый на плазмалемме работой Иа+-АТФазы, способствует электрофоретическому поступлению н+ в клетку, что препятствует защелачиванию цитоплазмы, когда клетка находится в щелочной среде (Скулачев, 1986). Следовательно, электрогенная Na+-транслоцирующая АТФаза в плазмалемме . галотолерантных микроводорослей является, по- видимому, так же - и частью системы pH-статирования цитоплазмы.

Как отмечалось выше, Na+/H+ антипортер, энергизуемый протон-движущей силой, есть универсальная Na+-транспортирующая система, функционирующая в плазмалемме организмов самых разнообразных таксонов и различных экологических групп. В отличие от него, Na+-АТФаза является особенностью некоторых прокариот, обитающих в условиях высокой солености, галотолерантных водорослей и, по-видимому, некоторых высших растений-галофитов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения плазматической мембраны из •клеток морской микроводоросли Platyeonas viridis.

2. Полученные везикулы плазмалеммы практически свободны от загрязнения* другими клеточными мембранами, способны удерживать градиенты ионов н+ и Na+ и обнаруживают функциональную активность в отношении транслокации этих ионов через мембрану. •

3. АТФ-гидролазная активность полученного препарата плазмалеммы имеет черты как сходства, так и различия со .свойствами Н^-АТФазы плазмалеммы высших растений-гликофитов, что связано с функционированием в плазматической мембране p.viridis, наряду с Н^-АТФазой, еще одной ион-транслоцирувдей АТФазы." :

4. В плазмалемме p.viridis функционирует ванадат-чувствительная электрогенная ^-помпа (Н^-АТФаза), которая транспортирует Н4" из цитоплазмы в наружную среду. и генерирует на мембране градиент электрохимического потенциала протонов - Apgf.

<5. В плазмалеша р. viridis функционирует вторичный активный

^-транслоцирующий механизм - Ма+/н+ антипортер, испдльзующий для выведения ионов Na+ из клетки энергию Ajl^.

6. Наряду с Na+/H+ антипортером в плазматической мембране р. viridis функционирует АЦЦ+ - независимый первичный активный ^-транспортирующий механизм - электрогенная Ыа+-транслоцирующая АТФаза.

7. ■ Н+-АТФаза и Na+/H+ антипортер являются универсальной ^-транспортирующей системой, которая свойственна организмам как пресного фона, так и обитающим в условиях высокого содержания солей в среде. Иа^-АТФаза ■' является Иа^-транспортирующей системой, специфичной для галотолерантных

• организмов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

I. Попова Л.Г., Балнокин Ю.В., Мясоедов H.A. Характеристика АТФазной активности плазматической мембраны. морской одноклеточной водоросли Platymonas viridis■ //Всесоюзное совещание "Клеточные механизмы адаптации",. Тез. докл. Цитология, 1991; т.33(5), с.128.-

• 2. Попова Л.Г.,- Балнокин D.B., Белов А.П., Мясоедов H.A. АТФаза (АТФазы) плазматической мембраны морской микроводоросли Platymonas viridis. // II с'езд Всесоюзного общества физиологов растений. Тез.док., 2ч., Москва, 1992, с.167.

3. Попова Л.Г., Балнокин Ю.В., Мясоедов H.A. Пирофосфэтаза мембранной фракции, обогащенной плазмалеммой, выделенной ИЗ МОрСКОЙ МШфОВОДОрОСЛИ Platymonas viridis. //II с'езд Всесоюзного общества физиологов растений. Тез.док., 2ч., Москва, 1992, с.167.

4. Попова Л.Г., Балнокин. Ю.В.,' Мясоедов .-H.A., Лапушкин Е.В., Белов А.П. Характеристика АТФазной активности плазматической мембраны' морской водоросли piatynanas viridis. //Доклады Академии. Наук СССР, J991, т.3{7(1), С.251-256. ' • .

5., Popova L.C. , Balnokin' Yu.V;, Ifyasoedov N.A. Characterization oí plasma membrane ATPase from . see '

unicellular alga Platymonas viridis., //. Proceedings of 5th •

%

International youth symposium "Plant metabolism regulation".

Sofia, 1991, p.341 - 345.

6. Balnokin Yu.V., Popova L.G., Myasoedov N.A. The ATPase activity of the - plasma membrane of marine unicellular alga Piatymonas viridis. // 19th Aharon Katzir-Katchalsky Confereno'e, Satellite to the 15th International Congress of Biochemistry, "Plant Bioenergetios and Ion translocation". Abstr., Rehovot (Israel), 1991, p.2.

7. Popova L.G., Balnokin Yu.V., Myasoedov N.A. Na+-extrutiing systems in the plasma membrane of the marine alga 'Platymonas viridis. // International Symposium on Physiology, Biochemistry and Genetics of Plant salt re3istanoe. Abstr., Tashkent, 1992, p.64.

8. Popova L.G., Balnokin Yu.V. H+~translocating ATPase and Ka+/H+ antiporter in plasmalemma of marine microalga Platymonas viridis• // 8th Congress of the Federation of

.European Societies of Plant Physiology. Abstr.,. Physiologia Plantarum, 1992, v. 85(3), part 2, p.A15.

9. Popova L.G., Balnokin Yu.V. H+-translooating ATPase and Na+'/H+ antiport activities in the plasma membrane of the marine alga Platykonas viridis. //PEBS Letters, 1992, ■v.309(3), p.333-336.

10. Balnokin Yu.V., Popova L.G., liyasoedov N.A. Plasma membrane ATPase of marine unioellular alga Platyeonas viridis. //Plant Physiol.Biochem., 1993, v.31(2), p.159 -168.

11. Balnokin Yu.V., Popova. 1.0. The ATP-driven Na+-pump in , the plasma membrane of the marine unioellular alga Platymonas viridis. //FEBS Letters, 1994, v.342(2).