Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Na+-АТФазы галотолерантных водорослей

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Na+-АТФазы галотолерантных водорослей"

На правах рукописи

ПОПОВА Лариса Геннадьевна

Ыа+-АТФазы ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2007

003052765

Работа выполнена в лаборатории солевого обмена и солеустойчивости Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук, г. Москва.

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Ю.В. Балнокин

доктор биологических наук, профессор A.B. Бабаков

доктор биологических наук, профессор A.A. Булычев

доктор биологических наук М.С. Трофимова

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится /" марта 2007 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 002.210.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Факс: (495) 977 80 18, электронная почта: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

Автореферат разослан " февраля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук —^ Н.В. Загоскина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. №+-гомеостаз цитоплазмы является общим свойством всех организмов, независимо от их таксономической принадлежности. Исследование механизмов №+-гомеостатирования у представителей разных систематических групп имеет фундаментальное значение и вносит вклад в установление путей эволюционного развития жизни на Земле.

Естественная среда обитания галотолерантных или галофильных организмов содержит в большей или меньшей концентрации ионы Na+. Градиент электрохимического потенциала Na+ направлен из наружной среды в клетку, что приводит к пассивному поступлению этого иона в цитоплазму. Выведение Na+ из клеток должно осуществляться активно, с затратой метаболической энергии. В ходе эволюции в клеточных мембранах организмов, обитающих в соленых средах, возникли многообразные Ыа+-транспортирующие системы, осуществляющие активный (против градиента электрохимического потенциала) перенос этого иона через мембраны. №+-транспортирующие системы делятся на две группы по принципу своей энергизации. Одну группу составляют гетерогенные по своей первичной структуре белки, осуществляющие вторично-активный транспорт Na+ через мембраны в обмен на протон, - Na+/H+ антипортеры (Padan et al., 2001). Na+/H+ антипортеры являются универсальным механизмом, т.е. они обнаруживаются во всех биологических мембранах. Энергетически экспорт Na* из клеток посредством Na+/H+ антипортера поддерживается протонным градиентом, ДдН, на плазматической мембране (направленным, соответственно, из наружной среды в клетку) и зависит от функционирования в мембране генератора протонного градиента.

Другую группу составляют первично-активные механизмы транспорта Na+ -№+-помпы, непосредственно сопрягающие химические реакции превращения субстрата с транспортом ионов Na+ через мембрану. Первичные №+-помпы разнообразной природы найдены в плазматических мембранах представителей прокариотических царств, Bacteria и Archaea (Dimroth, 1997). Это декарбоксилазы, оксидоредуктазы, метилтрансферазы, различные АТФазы. У эукариот обнаружены №+-помпы только АТФазной природы - Ыа+-транспортирующие АТФазы Р-типа. Наиболее широко известной и хорошо изученной №+-помпой является №+,К+-АТФаза животных клеток (Skou, 1957). Долгое время Na+,K+-АТФаза оставалась единственным представителем №+-транспортирующих ферментов, обнаруженных у эукариот. Однако в 90-е годы прошлого века Na+-

транспортирующая АТФаза была найдена у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Наго et al., 1991) и Schwanniomyces occidentalis (Banuelos, Rodriguez-Navarro, 1998), а также у морской микроводоросли Heterosigma akashiwo (царство Chromista, тип Ochrophyta, см. http://anriual.sp2000.org) (Shono et al., 1996). К началу данной работы у представителей царства растений первичные Ыа+-помпы обнаружены не были. Мы предприняли попытку восполнить этот пробел.

Исследования проводили на морских (галотолерантных) микроводорослях двух видов, Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima (царство Plantae, тип Prasinophyta). Был поставлен вопрос о том, какой механизм или какие механизмы отвечают за поддержание 1\1а+-гомеостаза у этих организмов. К началу нашей работы существовали экспериментальные свидетельства тому, что в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует Na+/H+ антипортер (Katz et al., 1986; 1989; 1991). Однако может ли ДцН-зависимый Na+/H+ антипортер быть эффективным регулятором содержания Na+ в цитоплазме у морских микроводорослей? Расчеты (Kotyk, 1983; Balnokin et al., 1997) показывают, что Д(1Н-зависимый Na+/H+ антипортер плазматической мембраны способен осуществлять экспорт Na+ из клеток морских микроводорослей только при нейтральных или кислых pH наружной среды. В естественной среде обитания этих организмов, т.е. в морской воде, где достаточно высокие концентрации NaCI (около 0.5 М) сочетаются со щелочной реакцией среды (pH около 8) (Виноградов, 1967) существуют термодинамические ограничения на экспорт Na+ из клеток посредством ДдН-зависимого Na+/H+ антипортера. Между тем, исследования транспорта ионов Na+, выполненные на клетках морских микроводорослей рода Dunaliella (D. maritima, D. salina) и харовых водорослях (Chara longifolia) свидетельствовали о способности этих организмов поддерживать 1Ма+-гомеостаз цитоплазмы и осуществлять экспорт Na+ из клеток одинаково эффективно как при кислых, так и при щелочных pH наружной среды (Балнокин, Медведев, 1984; Katz et al., 1991; Kiegle, Bisson, 1996). Таким образом, теоретические расчеты и имевшиеся в литературе экспериментальные данные позволили предположить, что экспорт Na+ из клеток галотолерантных микроводорослей осуществляется первично-активным механизмом.

Исходя из вышеизложенного, мы пришли к гипотезе, что в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует первичный Na+-транспортирующий насос. Наиболее вероятно, что это - АТФаза Р-типа,

поскольку, как уже было сказано выше, все обнаруженные к настоящему времени у эукариотических организмов первичные №+-помпы являются Na+-транспортирующими АТФазами Р-типа.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлось экспериментальное подтверждение гипотезы о функционировании в плазматической мембране морских (галотолерантных) микроводорослей первичной Na+-noMnbi - №+-транспортирующей АТФазы, осуществляющей экспорт ионов Na+ из клеток в наружную среду.

Были поставлены и решены следующие задачи, определяемые целью работы:

(1) Разработаны методы получения препаратов плазматической мембраны, находящейся в виде замкнутых везикул и сохраняющей в функционально-активном состоянии ион-транспортные системы, из двух видов галотолерантных микроводорослей, Tetraselmis viridis и Dunaliella marítima.

(2) На выделенных из Т. viridis и D. maritima везикулах плазматической мембраны продемонстрирован АТФ-зависимый транспорт ионов Na+ и получены доказательства его независимости от протон-движущей силы на мембране, т.е. у двух видов галотолерантных микроводорослей функционально идентифицирован первичный №+-транспортирующий механизм - Na+- АТФаза.

(3) На выделенных везикулах плазматической мембраны галотолерантных водорослей продемонстрирован также АТФ-зависимый транспорт Н+, т.е. функционально идентифицирована Н+-АТФаза.

(4) На выделенных везикулах плазматической мембраны из двух видов водорослей функционально идентифицирован Na+/H+ антипортер.

(5) Исследованы свойства обнаруженных в плазматической мембране двух видов галотолерантных микроводорослей №+-АТФаз.

(6) Исследованы Свойства обнаруженных в плазматической мембране двух видов галотолерантных микроводорослей Н+-АТФаз.

(7) Проведен сравнительный анализ свойств двух помп, №+-АТФазы и Н+-АТФазы, функционирующих в плазматической мембране Т. viridis, как механизмов, ответственных за ионное гомеостатирование цитоплазмы у этого организма. Основные положения, выносимые на защиту.

(1) В плазматической мембране галотолерантных (морских) микроводорослей, относящихся к растительному царству, функционирует первичная Na+-noMna -Ма+-транспортирующая АТФаза Р-типа.

(2) Наряду с первичной ^-помпой, №+-транспортирующей АТФазой, в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует Н+-АТФаза - фермент, присутствие которого характерно для плазматических мембран растительных клеток.

(3) В плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует также универсальный механизм транспорта Na+ - Na+/H* антипортер.

(4) В естественных условиях обитания галотолерантных микроводорослей экспорт Na+ из цитоплазмы в наружную среду осуществляет №+-АТФаза, тогда как Na+/H+ антипортер не вовлечен в этот процесс, а является, по-видимому, частью системы рН-статирования цитоплазмы.

Научная новизна. Впервые в плазматической мембране галотолерантных организмов, относящихся к царству растений, функционально идентифицирована и охарактеризована помпа, осуществляющая первично-активный перенос ионов Na+ через эту мембрану, - №+-транспортирующая АТФаза. Ма+-АТФазы обнаружены у двух видов морских микроводорослей - Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima (царство Plantae, тип Prasinophyta, класс Prasinophyceae). Найденные №*-АТФазы являются новыми членами семейства №+-АТФаз, описанных к настоящему времени у представителей домена Еисагуа (животных, грибов и мхов). Показано, что в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей наряду с №+-АТФазой существует вторично-активный механизм переноса ионов Na+ через плазматическую мембрану - Na+/H+ антипортер, работа которого зависит от протон-движущей силы на мембране и сопряжена с работой протонной помпы, Н*-АТФазы. Последняя также функционально идентифицирована в плазматической мембране указанных видов водорослей. На основании данных, полученных при исследовании транспорта ионов Na+ через плазмалемму интактных микроводорослей, а также теоретических расчетов, сделано заключение, что у галотолерантных микроводорослей в естественной среде обитания механизмом, отвечающим за Ма+-гомеостатирование цитоплазмы, является №+-АТФаза, тогда как Na+/H+ антипортер является, по-видимому, частью системы рН-статирования клетки

Исследованы функциональные свойства обнаруженных №+-АТФаз, а также Н+-АТФаз, и выявлена роль таких факторов цитоплазматического окружения как pH, концентрации ионов Na+ и Mg2+, концентрация АТФ в регуляции активности этих ферментов.

Определены механизмы работы двух |\1а+-АТФаз. Показано, что №+-АТФаза Т. viridis осуществляет электрогенный обмен Na+ на Н+ со стехиометрией mNa+/nH+, где m>n. №+-АТФаза D. maritima переносит только ионы Na+ и, соответственно, также является электрогенным ферментом.

Идентифицирован фосфорилированный интермедиат Ма+-АТФазы Т. viridis и определена его кажущаяся молекулярная масса. Исследованы закономерности процессов фосфорилирования и дефосфорилирования 1\1а+-АТФазы Т. viridis в ходе каталитического цикла этого фермента.

На основании исследований транспортных функций 1Ча+-АТФазы Т. viridis предложены: (1) гипотеза, предполагающая функционирование, по крайней мере, двух изоформ этого фермента в плазматической мембране водоросли и (2) математическая модель, описывающая функционирование этих изоформ при адаптации данной водоросли к высоким концентрациям NaCI.

Предложена модель быстрой регуляции активностей №+-АТФазы и Н+-АТФазы - ферментов, сосуществующих в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей, факторами цитоплазматического окружения (pH, концентрации Na+ и Мд2+, АТФ) при гиперосмотическом солевом шоке. Научно-практическая ценность работы. Представленная работа является фундаментальным исследованием, раскрывающим механизмы адаптации одноклеточных галотолерантных эукариот - морских микроводорослей, относящихся к царству растений, к высокому содержанию солей в среде обитания. Полученные новые данные вносят вклад в современные представления о клеточных механизмах ионного гомеостатирования у галотолерантных организмов.

Материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по физиологии солеустойчивости растений и физиологии растительной клетки на биологических факультетах высших учебных заведений. Апробация работы. Результаты работы по теме диссертации были доложены или представлены на V Международном молодежном симпозиуме «Регуляция метаболизма в растениях» (София, 1991), на XV Международном биохимическом конгрессе (Реховот, 1991), на Втором съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1992), на Международном симпозиуме по физиологии, биохимии и генетике солеустойчивости растений (Ташкент, 1992), на VIII Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Антверпен, 1992), на 11-м Международном совещании по биологии мембран растений (Кембридж, 1998),

на IV Съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), на Пятой Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2001), на 27-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Лиссабон, 2001), на 12-м Международном семинаре "Plant membrane biology" (Москва, 2001), на Международном симпозиуме "Plant under environmental stress" (Москва, 2001), на Международном симпозиуме "Signalling systems of plant cells" (Москва, 2001), на II Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Москва, Дубна, 2001), на годичном собрании Общества физиологов растений России «Экспериментальная биология растений 2001» (Уфа, 2001), на Международной научной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001), на III Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на VI испано-португальском симпозиуме "Relaciones hidricas en la plantas" (Памплона, 2002), на 12-м Международном совещании по биологии мембран растений (Мэдисон, 2001), на V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), на 13-м Международном совещании по биологии мембран растений (Монпелье, 2004), на Всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы, в том числе 21 статья в научных журналах и сборниках трудов.

Благодарности. При выполнении данной работы на разных ее этапах в работе принимали участие Л.Я.Пагис, Г.А.Шумкова, И.Г.Стриж, И.М.Андреев. Автор выражает признательность вышеупомянутым коллегам.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, в том числе обзора литературы и описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка литературы (гГ/Р^источников, из них

иностранные). Диссертация изложена на ¿З^У'стр. машинописного текста, содержит табл. и ,.^'гГ'рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Объекты исследования и условия культивирования. Объектами исследования были слабовакуолизированные галотолерантные морские микроводоросли: Tetraselmis (Platymonas) viridis Rouch. (коллекция отдела экологической физиологии водорослей Института биологии южных морей, г. Севастополь, Украина) и Dunaliella maritima Massjuk, штамм IBASU-A D-18 (коллекция отдела споровых растений Института ботаники им. Н.Г. Холодного, Украина) (Владимирова и др., 1991).

Водоросли выращивали в цилиндрических сосудах объемом 1л или в сосудах с плоско-параллельными стенками объемом 7л, толщина слоя водорослей составляла 6 см. Культуру непрерывно продували воздухом с 1,5% содержанием СОг и 14 часов в сутки освещали белым светом люминесцентных ламп при освещенности 15000 лк,

Для выращивания Т. viridis использовали модифицированную среду Шубравого (1983), D. maritima культивировали в среде Балнокина и др. (1983). Получение фракций плазматических мембран (ПМ). Для выделения ПМ брали культуры водорослей в конце логарифмической фазы роста. Выделение ПМ из Т. viridis осуществляли согласно разработанному нами методу (Popova et al., 1993). Метод основан на частичном протеолизе гликопротеиновой клеточной стенки трипсином, мягком гипоосмотическом шоке, которому подвергались клетки с частично нарушенной клеточной оболочкой, и последующем разделении клеточных мембран дифференциальным центрифугированием и центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Выделение плазматической мембраны из D. maritima осуществляли согласно методу (Popova et al., 2005). В основе метода также лежит разрушение клеток мягким гипоосмотическим шоком, с последующим разделением клеточных мембран дифференциальным центрифугированием и финальной очисткой фракции ПМ центрифугированием в ступенчатом сахарозном градиенте. Искусственный маркер ПМ Т. viridis/D. maritima. При разработке метода выделения ПМ из микроводорослей в качестве маркера этой мембраны использовали экзогенную метку, радиактивный иод (125Г). Связывание метки с ПМ осуществляли согласно методике лактопероксидазного/глюкозооксидазного иодирования клеточных поверхностей (Hubbard and Cohn, 1972). При определении чистоты полученных фракций ПМ применялись следующие методики. Содержание белка в мембранных фракциях определяли методом

Симпсона и Зонне (Simpson, Sonne, 1982). АТФазную активность (а также другие фосфогидролазные активности) во фракциях определяли по высвобождению неорганического фосфата (Рн) из соответствующего фосфосодержащего субстрата. Содержание Рн определяли по методу Картера и Карла (Carter and Karl, 1982). Активность цитохром С оксидазы и активность антимицин А-нечувствительной МАО(Р)Н-зависимой цитохром С редуктазы определяли спектрофотометрически по методу Ходжеса и Леонарда (Hodges and Leonard, 1974). Хлорофилл во фракциях определяли по методу Джеффри (Jeffrey, 1972). Регистрация активностей Ыа'-АТФазы и Н*-АТФазы в выделенных везикулах ПМ микроводорослей. Активность №+-АТФазы регистрировали по АТФ-индуцируемым поглощению 22Na+ мембранными везикулами (для Т. viridis и D. maritima), или выходу Н+ из везикул (защелачиванию везикулярного люмена) (для фермента Т. viridis), или генерации электрического потенциала (Дф) на везикулярной мембране (для фермента D. maritima). Активность Н+-АТФазы регистрировали по АТФ-индуцируемым поглощению Н+ везикулами (закислению везикулярного люмена) или генерации Дф на везикулярной мембране. Регистрация поглощения 22Na* везикулами ПМ. Везикулы инкубировали в реакционной среде в присутствии 5 мМ 22NaCI (0,5 МБк), после чего реакцию поглощения 22Na* везикулами инициировали внесением 2 мМ АТФ (в форме Трис-соли). Через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали аликвоты, и везикулы отделяли от среды фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры Synpore. Фильтры промывали реакционной средой, не содержащей 22Na+ и АТФ. Радиоактивность на подсушенных фильтрах определяли на сцинтилляционном ß-счетчике, используя у-виалы С 12/55 (Zinsser analytic).

Регистрация поглощения Н* везикулами ПМ. Поглощение Н+ везикулами ПМ (закисление везикулярного люмена) регистрировали с помощью оптического зонда на ДрН акридинового оранжевого (АО), ведя непрерывную запись изменений дифференциального (А492-А540) поглощения АО на спектрофотометре Hitachi 557.

Регистрация выхода Н* из везикул ПМ. Выход Н+ из везикул (защелачивание везикулярного люмена) регистрировали по изменениям флуоресценции рН-чувствительного зонда пиранина (8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновая кислота), находящегося во внутренней водной фазе везикул. Поскольку пиранин не проникает через мембраны, мембранные везикулы были нагружены этим

зондом в процессе их образования (растворы, применяемые при выделении ПМ, содержали пиранин). Пиранин из наружной среды в конечной суспензии везикул удаляли с помощью гель-фильтрации, пропуская суспензию через колонку с сефадексом G-50. Кинетику изменений pH везикулярного люмена наблюдали, осуществляя регистрацию изменений интенсивности флуоресценции пиранина на спектрофлуориметре Hitachi 850 при >.Возб = 450 нм и ХфЛ= 510 нм. Регистрация электрического потенциала на везикулярной мембране. Генерацию электрического потенциала (Ду) на везикулярной мембране наблюдали по изменению дифференциального поглощения (A62i-A582) оптического зонда на Д\|/ оксонола VI, с помощью спектрофотометра Hitachi 557. Регистрация фосфорилированного интермедиата Ыа*-АТФазы Т. viridis. фосфорилирование мембранных белков осуществляли по методу Поста и Чена (Post and Sen, 1967), при 0°С, с использованием [у-32Р]АТФ. Электрофорез фосфорилированных белков проводили в кислых (pH 2.4) полиакриламидных гелях, по методике Фербенкса и Авруча (Fairbanks and Avruch, 1972).

Радиоавтография гелей. После электрофореза гели переносили на бумагу Whatman, высушивали под вакуумом и экспонировали против рентгеновской пленки, используя интенсифицирующий экран "Lightning Plus Intensifying Screen". Определение молекулярных масс белков. Молекулярные массы белков, соответствующих фосфорилированным полосам на электрофореграммах, оценивали, сопоставляя их с молекулярными массами белков-маркеров, в качестве которых были использованы предварительно окрашенные молекулярные маркеры, выпускаемые фирмой Sigma (набор SDS-7B, 27000- 180000 Да).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

АТФазная активность препаратов плазматической мембраны (ПМ) из двух видов галотолерантных водорослей. Препараты ПМ как Т. viridis, так и D. maritima гидролизуют АТФ в широком диапазоне pH (Рис. 1). Слабо выраженный оптимум АТФазной активности при pH 6,5 - 7,0 соответствует оптимуму работы Н+-АТФазы ПМ высших растений, но высокий уровень гидролиза АТФ в щелочной области pH не характерен для протонной помпы.

Рис. 1. pH-зависимость АТФазной активности препаратов ПМ D. maritima. (о), стандартная реакционная среда (0.4 М сахароза, 20 мМ BTP-MES буфер, pH как указано, 1 мМ MgSCU, 1 мМ ЕОТА, 50 мкМ СССР, 5-10 мкг мембранного белка, 0.5 мМ АТФ (Na-соль); (•), стандартная реакционная среда + 20 мМ NajSO-i; (□), стандартная реакционная среда + 300 мкМ ортованадата; (■), стандартная реакционная среда + 20 мМ Na2S04 + 300 мкМ ортованадата; (А), стандартная реакционная среда + 20 мМ K2SO4. (Аналогичные данные получены для препаратов ПМ Т. viridis).

Данные о влиянии ингибиторов различных мембранных АТФаз на АТФазную активность получаемых препаратов ПМ (Табл. 1) свидетельствуют, что гидролиз АТФ в щелочной области рН, катализируемый фракциями плазмалеммы, не обусловлен их загрязнением внутриклеточными мембранами.

Таблица 1. Влияние некоторых ингибиторов мембранных АТФаз на скорость гидролиза АТФ препаратами ПМ D. maritima. Результаты выражены в процентах от контроля. АТФазная активность в контроле составляла 40 - 60 нмоль Рн на 1 мг белка в мин. (Аналогичные данные получены для препаратов ПМ Т. viridis).

Агент Концентрация,М РН

6.5 8.0

Контроль - 100 100

Ванадат 104 45 58

ДЦКД 10^ 47 97

KN03 5x10"2 100 110

Уабаин 10'5 100 100

Олигомицин 10 мкг/мл 93 96

NaN3 10'3 92 98

Молибдат 10'3 95 100

Специфические ингибиторы митохондриальных АТФаз олигомицин и азид (Quail, 1979), специфический ингибитор кислых фосфатаз молибдат (Gallagher, Leonard, 1982), нитрат, ингибитор АТФазы тонопласта (Walker, Leigh, 1981), не подавляли АТФазную активность препаратов ПМ во всем диапазоне рН. Наиболее сильный ингибирующий эффект, как при слабо-кислых, так и при

щелочных значениях pH, оказывал ортованадат - специфический ингибитор транспортных АТФаз Р-типа, образующих в ходе каталитического цикла фосфорилированный интермедиат (Möller et al., 1996). Ванадат является эффективным ингибитором Н+-АТФазы плазматической мембраны растительных клеток (Vara, Serrano, 1982). Чувствительность АТФазной активности к ортованадату является аргументом в пользу того, что эта активность обусловлена работой АТФазы (АТФаз) Р-типа. Мы предположили, что рН-профиль гидролиза АТФ, катализируемого фракциями ПМ Т. viridis и Р. maritima, отражает работу двух транспортных АТФаз Р-типа в этой мембране: Н+-АТФазы (оптимум работы при pH 6.5 + 7.0) и другой АТФазы, максимальная активность которой наблюдается при щелочных pH. Аргументом в пользу того, что это может быть предполагаемая Na+-транспортирующая АТФаза, является стимуляция АТФазной активности ионами Na* при щелочных pH (при кислых pH Na+ не оказывает заметного стимулирующего действия, Рис. 1).

Н*-АТФаза и Na+/H+ антипортер в ПМ галотолерантных микроводорослей.

Функциональная идентификация Н*-АТФазы в ПМ Т. viridis и Р. maritima . Наличие оптимума АТФазной активности при pH 6,5 - 7,0, а также результаты ингибиторного анализа позволили предположить, что в ПМ галотолерантных микроводорослей, также, как и у высших растений, функционирует протонная помпа, Н+-АТФаза. Действительно, выделенные везикулы ПМ (как Т. viridis, так и D. maritima) были способны к АТФ-зависимому накоплению протонов в везикулярном люмене (Рис. 2, А), что говорит о работе АТФ-зависимого транспортного механизма, переносящего протоны через везикулярную мембрану, т.е. Н+-транслоцирующей АТФазы. Добавление ванадата в реакционную смесь в значительной степени уменьшало величину создаваемого Н*-АТФазой протонного градиента, свидетельствуя о том, что генерация ДрН на везикулярной мембране обусловлена функционированием АТФазы Р-типа.

Максимальная величина ДрН, генерируемого на везикулах ПМ Т. viridis или D. maritima, наблюдалась при pH 6,5 + 7,0 (Рис. 2, Б), что совпадает с кислым оптимумом АТФазной активности во фракциях ПМ (Рис. 1).

Na*/H* антипортер в ПМ Т. viridis и Р. maritima. С функционированием Н+-АТФазы в ПМ растительной клетки сопряжены разнообразные вторично-активные транспортные процессы, в том числе, транспорт ионов Na+, осуществляемый посредством Na+/H+ антипортера. В ПМ Т. viridis и Р. maritima также

Рис. 2. АТФ-зависимое поглощение Н+ везикулами ПМ D. maritima. А: Добавка АТФ (Трис-соль) к везикулам вызывает изменения дифференциальной абсорбции (А492-540) оптического зонда Акридинового оранжевого, свидетельствующие о закислении везикулярного люмена. Протонофор СССР, добавленный к везикулам, возвращает оптическую плотность АО к исходному уровню, т.е. в присутствии протонофора ДрН, созданный Н+-АТФазой, рассеивается. При внесении ванадата ДрН, создаваемый АТФазой, уменьшается. Б: Скорость (произвольные единицы) АТФ-индуцируемого закисления везикулярного люмена, зависимость от pH. (Аналогичные данные получены для препаратов ПМ Т. viridis).

АТФ

vJ

SOmM n»2so4

25мМ Na,SO,

Рис. 3. Распад ДрН, создаваемого на везикулах ПМ D. maritima Н+-АТФазой, под действием ионов Na+. (Аналогичные данные получены для препаратов ПМ Т. viridis).

ЮмМ N12SO4

5 мин

t

функционирует Na+/H+ антипортер, о чем свидетельствуют результаты следующих экспериментов. Протонный градиент, сформированный Н+-АТФазой на везикулярной мембране, распадался под действием ионов Na+ (Рис. 3). Другие катионы (Li+, К+, Rb\ Cs+) были менее эффективны, вызывая гораздо более медленную диссипацию сформированного АрН; амилорид, ингибитор Na+/H+ антипортеров в мембранах различного происхождения, ингибировал также и NaVH+ обмен, наблюдаемый нами на везикулах ПМ водорослей (данные не представлены).

Ыа+-транспортирующая АТФаза в ПМ Т. viridis и D. marítima.

Функциональная идентисЬикаиия Na*-транспортирующей АТФазы. Поскольку теоретические расчеты и экспериментальные данные, полученные на целых клетках (см. выше), предсказывают, что в ПМ галотолерантных микроводорослей функционирует первичный [\1а+-насос, а все известные первичные №+-насосы эукариот являются Ма+-транспортирующими АТФазами, мы предположили, что этим насосом у галотолерантных микроводорослей также является 1Ча+-АТФаза, и именно работой этого фермента обусловлен гидролиз АТФ, катализируемый фракциями ПМ водорослей в щелочной области pH.

Для функциональной идентификации №+-транспортирующей АТФазы на везикулах плазмалеммы, выделенных из двух видов водорослей, были проведены прямые исследования АТФ-зависимого переноса ионов Na+ через везикулярную мембрану с использованием радиоактивного изотопа 22Na+. Поскольку предполагалось, что гипотетическая Ма+-транспортирующая АТФаза в ПМ водорослей функционирует в щелочном диапазоне pH, стандартная реакционная среда для наблюдения поглощения 22Na+ везикулами имела pH 7,8. Надо отметить, что при этом значении pH протонная АТФаза, функционирующая в ПМ водорослей, практически неактивна (Рис. 2, Б), и поэтому к минимуму сводится возможность поглощения ионов натрия везикулами ПМ за счет работы ДрН-зависимого Na+/H+антипортера.

При внесении 22Na+ в инкубационную среду с везикулами ПМ водорослей наблюдалось медленное поглощение 22Na+ везикулами, которое усиливалось при добавлении АТФ (Рис. 4). Протонофор СССР не только не ингибировал, но заметно стимулировал АТФ-зависимое поглощение 22Na+ везикулами. Поскольку протонофор приводит к диссипации ДрН на везикулярной мембране (Рис. 2), то отсутствие ингибирующего эффекта протонофора на АТФ-зависимое поглощение

№+ везикулами свидетельствует о том, что наблюдаемое поглощение ионов №+ является результатом работы первично-активного механизма (АТФазы), а не вторично-активного, зависящего от протон-движущей силы №+/Н+ антипортера.

—ее—|

А 40 ■

30 ■

20 ■

10-

-0—I-1-1-

-20

22

Na+

Г f

10 20 Время, мин

АТФ

Рис.4. Поглощение Na везикулами ПМ D. maritima. Реакционная среда: 0.4 М сахароза, 20 мМ BTP-MES буфер, pH 7.8, 1 мМ MgS04, 1 мМ EGTA; вносили последовательно (указаны конечные концентрации): 5 мМ 22NaCl (0.5 МБк), 2 мМ АТФ (Трис-соль). А: внесение АТФ приводит к усилению поглощения 22Na+ везикулами ПМ. Реакционная среда содержала дополнительно следующие агенты: (о), без добавок; (•), 50 мМ N03" (ВТР-соль, pH 7.8); (■), 50 мкМ СССР; (А), 50 мМ N03" (ВТР-соль, pH 7.8) + 300 мкМ ортованадат. Б: рН-профиль АТФ-зависимого поглощения 22Na+ везикулами ПМ D. maritima. (Аналогичные данные получены для препаратов ПМ Т. viridis)

АТФ-зависимое поглощение 22№+ везикулами существенно усиливалось также в присутствии легко проникающего через биологические мембраны аниона Ы03". Стимулирующие эффекты нитрата и протонофора на АТФ-зависимое поглощение 22№+ везикулами позволяют предположить, что механизм (АТФаза), ответственный за транслокацию ионов натрия через плазматическую мембрану водорослей, является электрогенным. Как N03", так и СССР способствуют ликвидации избыточного положительного заряда внутри везикул. 1МОз" компенсирует положительный заряд, проникая внутрь везикул, а в присутствии СССР, облегчающего диффузию Н+ через мембраны, Дф (положительный внутри), трансформируется в ДрН (щелочь внутри) вследствие выхода протонов из везикул. Таким образом, оба агента снимают тормозящее действие

электрического потенциала, который можно рассматривать как один из продуктов реакции переноса ионов Na+ через мембрану, на работу электрогенной АТФазы.

В экспериментах с потенциал-чувствительным зондом (оксонол VI) мы прямо показали, что при работе Ма+-АТФазы (как D. marítima, так и Т. viridis) на везикулярной мембране действительно происходит генерация электрического потенциала («+» внутри везикул), который распадается при добавлении NO3" или СССР (Рис.5).

АТФ-зависимое поглощение 22Na+ везикулами было чувствительно к ванадату (Рис. 4, А), свидетельствуя о том, что процесс обусловлен функционированием транспортной АТФазы Р-типа.

рН-профиль АТФ-зависимого поглощения 22Na+ везикулами ПМ водорослей (Рис. 4,Б) дополнительно подтверждает, что оно не обусловлено работой Na+/H+ антипортера, энергизуемого Н+-АТФазой. Поглощение 22Na+ происходит при слабо-щелочных pH с максимумом при pH 7.5 - 8.0, тогда как Н+-АТФаза активна в слабо-кислой области с максимумом при pH 6,5 (Рис. 2,Б). Следует отметить, что рН-профиль гидролиза АТФ фракциями ПМ Т. viridis и D. maritima (Рис.1) охватывает как диапазон pH, в котором происходит генерация на везикулярной мембране ДрН Н+-АТФазой (Рис. 2), так и диапазон АТФ-зависимого поглощения 22Na+ везикулами (Рис. 4, Б).

Таким образом, результаты экспериментов с 22Na+, проведенные на выделенных везикулах ПМ двух видов водорослей, Т. viridis и D. maritima, показывают, что в ПМ галотолерантных микроводорослей функционирует первичный АТФ-зависимый [^-транспортирующий механизм - электрогенная №+-транспортирующая АТФаза Р-типа.

Механизм работы Na+-ATOa3 у двух видов водорослей различается.

Известно, что многие катион-транспортирующие АТФазы Р-типа функционируют, перенося через мембрану катион одного вида в обмен на катион другого вида (стехиометрия обмена не обязательно равна 1:1). К таким обменным АТФазам относятся Ма*,К+-АТФаза и Н\К+-АТФаза клеток животных (Stein, 1986), Са2+,Н+-АТФаза саркоплазматического ретикулума (Yu et al., 1993). Предполагается, что Са2+-АТФаза плазмалеммы растительных клеток также катализирует Са2+/Н+ обмен (Rasi-Caldogno et al., 1987). Мы поставили вопрос о механизме работы обнаруженных нами в плазматической мембране двух видов

Рис. 5. Формирование электрического потенциала (Ау) на везикулярных мембранах фракции ПМ D. maritima в присутствии АТФ (наблюдение по изменениям оптической плотности потенциал-чувствительного зонда Оксонол VI при pH 7.5, когда активны как Н+-АТФаза, так и Na'-АТФаза). А: 1 - генерация Д\|/, обусловленная работой Н+-АТФазы. 2 - внесение Na+ (в виде соли NaaSO.») вызывает заметную стимуляцию генерации A\\i. Потенциал распадается при внесении протонофора СССР или проникающего аниона NCV. Ванадат приводит к подавлению процесса генерации потенциала. (Аналогичные данные получены для препаратов ПМ Т. viridis). Б: Скорость формирования потенциала (произвольные единицы) на везикулах ПМ D. maritima как функция концентраций Na+. На вставке: данные представлены в двойных обратных координатах. Величина кажущейся Км является средним значением из трех независимых определений.

водорослей №+-АТФаз с целью выяснить, функционируют ли эти ферменты как унипортеры или, возможно, при переносе ионов Na+ через мембрану они используют противоион.

В наших экспериментах было показано, что К+ ингибирует АТФ-зависимое накопление 22Na+ везикулами ПМ Т. viridis (Balnokin et al., 1997), а в опытах на целых клетках D. maritima мы продемонстрировали отсутствие прямого сопряжения потоков Na+ и К+ через ПМ этой водоросли (Шумкова и др., 2000). Исходя из этого, представлялось маловероятным участие К+ в качестве возможного противоиона для Na+ при работе №+-АТФаз Т. viridis и D. maritima. В качестве другого реального претендента можно рассматривать Н+, который, как известно, вовлечен в ионный обмен при функционировании ряда транспортных АТФаз (см. выше).

В случае, если при работе №+-АТФазы водорослей Na+ обменивается на Н+, АТФ-зависимое поглощение Na+ везикулами должно сопровождаться выходом протонов из везикулярного люмена, т.е. защелачиванием последнего. Для регистрации защелачивания везикулярного люмена был использован рН-чувствительный зонд пиранин, загруженный в везикулы.

Ыа*-АТФаза Т. viridis и сопряженный транспорт ионов Н+. Эксперименты, проведенные с везикулами ПМ Т. viridis, нагруженными пиранином, показали, что перемещение ионов Na+ через ПМ Т. viridis, осуществляемое №+-АТФазой (т.е. аккумуляция ионов Na+ внутри везикул), сопровождается противоположно направленным движением Н+ (выходом Н+ из везикул) (Рис. 6, А). Ионы Na+ являются существенным и необходимым компонентом реакционной смеси. В отсутствие Na+ добавка АТФ приводит к некоторому закислению везикулярного люмена (Рис. 6, А; трек 3), что, по-видимому, объясняется остаточной активностью Н+-АТФазы при данном pH реакционной среды. Внесение Na+ обращает поток протонов и инициирует интенсивное защелачивание везикулярного люмена. В этом случае Na* не только приводит к диссипации ДрН, созданного работой Н+-АТФазы, но, очевидно, включает №+-зависимую помпу, работа которой сопровождается выходом Н+ из везикул.

Ортованадат подавляет Na+- и АТФ-зависимое защелачивание везикулярного люмена (не представлено), свидетельствуя об участии АТФазы Р-типа в наблюдаемом процессе. Максимум АТФ-зависимого защелачивания везикулярного люмена наблюдается при pH 7,8 + 8.0 (Рис. 6, В), а рН-профиль

Рис. 6. Na - и АТФ-зависимое защелачивание люмена везикул ПМ Т. viridis. А: Треки 1 и 2 - в отсутствие АТФ добавка Na+ к суспензии везикул в реакционной среде, аналогичной среде для наблюдения поглощения 22Na+ везикулами (pH 7.8), инициирует защелачивание их внутренней водной фазы (что регистрируется как усиление флуоресценции пиранина внутри везикул). Такой сдвиг pH, очевидно, отражает работу Na+/H+ антипортера в плазматической мембране Т. viridis, который катализирует обмен наружного Na+ на внутривезикулярный Н+. Последующая добавка АТФ приводит к ускорению выхода протонов из везикул, свидетельствуя о вовлечении АТФазы в наблюдаемый процесс. СССР дополнительно стимулирует выход протонов из везикул (трек 1 - добавка СССР в процессе генерации ДрН, трек 2 - СССР был исходно внесен в реакционную смесь). Стимулирующий эффект СССР объясняется электрофоретическим выходом Н+ из везикул (облегченным в присутствии протонофора) под действием разности электрических потенциалов (Д\|/, «+» внутри везикул), генерируемой на везикулярной мембране №+-/\ТФазой. Трек 3 - изменена последовательность внесения в среду Na+ и АТФ. Закисление везикулярного люмена, наблюдаемое при внесении АТФ обусловлено, вероятно, остаточной активностью Н+-АТФазы. Внесение Na+ приводит к "включению" Ыа*-АТФачы и стимулирует защелачивание везикулярного люмена. Б: АТФ-зависимое защелачивание люмена везикул ПМ Т. viridis, наблюдаемое в присутствии различных одновалентных катионов (катионы были внесены в реакционную смесь исходно; также исходно был внесен и СССР, что обеспечивает максимальную величину ответа). В: pH-зависимость Na+- и АТФ-индуцируемого защелачивания люмена везикул ПМ.

этого процесса в целом совпадает с рН-профилем АТФ-зависимого поглощения ионов 22Na+ везикулами ПМ Т. viridis (Рис. 4, Б).

Наблюдаемый в присутствии ионов Na+ АТФ-зависимый выход протонов из везикул специфически зависит от этих ионов. Na+ может быть заменен Li+, но не другими щелочными катионами (К+, Rb+, Cs+) (Рис. 6, Б). Эти данные согласуются с хорошо установленным фактом, что эффективное использование Li+ вместо Na+ является общим свойством №+-транспортирующих систем (Krulwich, 1983).

Такие характеристики Na+- и АТФ-зависимого защелачивания люмена везикул ПМ Т. viridis, как специфичность к ионам Na+ (Li+) и pH-зависимость с оптимумом при pH 7,8 - 8,0, чувствительность к ортованадату, несомненно, свидетельствуют, что этот процесс обусловлен работой Ма+-транспортирующей АТФазы.

Na*-АТФаза Т. viridis осуществляет электрогенный Na*/И* обмен. Для объяснения механизма наблюдаемого нами на везикулах плазматической мембраны Т. viridis защелачивания везикулярного люмена, сопровождающего работу Na^-транспортирующей АТФазы, могут быть предложены следующие гипотезы.

(1) №+-АТФаза Т. viridis функционирует, непосредственно обменивая ионы Na+ на Н+. Поскольку этот фермент электрогенный (Рис. 5), то стехиометрия обмена Na+ и Н+, осуществляемого АТФазой, должна отличается от стехиометрии 1:1. В общем случае, стехиометрия обмена равна mNa7nH+, где m>n.

(2) Ыа+-транспортирующая АТФаза Т. viridis является электрогенным унипортером, который переносит через мембрану ионы Na+ и работа которого сопровождается накоплением положительных зарядов внутри везикул. В этом случае, движущей силой для перемещения протонов через мембрану является электрический потенциал, генерируемый на мембране АТФазой.

Для того, чтобы подтвердить экспериментально ту или иную гипотезу, мы исследовали влияние электрического потенциала на везикулярной мембране на Na+- и АТФ-зависимое защелачивание везикулярного люмена. В случае, если Дф на мембране является единственной движущей силой для выхода Н+ из везикул, уничтожение Дф приведет к полному подавлению защелачивания везикулярного люмена. Напротив, если АТФаза непосредственно осуществляет обмен Na+ и Н+, выход протонов из везикул будет наблюдаться и в отсутствие электрического потенциала на везикулярной мембране.

В качестве агента, уничтожающего положительный внутри везикул электрический потенциал, мы выбрали легко проникающий через биологические мембраны анион NO3" (Barbier-Brygoo et al., 2000). В нашей экспериментальной системе этот анион практически полностью ликвидировал потенциал, генерируемый №+-АТФазой на везикулярной мембране (Рис. 7, Б). Вместе с тем, NO3" значительно стимулировал Na+- и АТФ-зависимое защелачивание везикулярного люмена (Рис. 7, А). Такой эффект нитрата не согласуется с гипотезой (2), предсказывающей потенциал-зависимое движение Н+ из везикул, но легко объясним в рамках гипотезы (1), предполагающей существование электрогенной Na+/H+ обменной АТФазы. Поступая внутрь везикул по градиенту электрохимического потенциала, NO3" компенсирует избыточный положительный заряд, накапливающийся в везикулярном люмене вследствие работы АТФазы, катализирующей обмен mNaVnH* (m>n). Таким образом, NO3" снимает тормозящее действие положительного (внутри везикул) потенциала на фермент. Результатом является ускорение работы фермента, что мы наблюдаем по усилению защелачивания везикулярного люмена в присутствии нитрата (Рис. 7, А). Добавка СССР в присутствии нитрата приводит к дополнительному выходу протонов из везикул, который, вероятно, обусловлен остаточным потенциалом, сохраняющимся на везикулярной мембране в присутствии этого аниона (Рис. 7, Б).

Доказательства того, что движение протонов через везикулярную мембрану, связанное с работой №+-АТФазы Т. viridis, не зависит существенно от потенциала, генерируемого на мембране этим ферментом, были получены также в другой серии экспериментов, где потенциал на везикулярной мембране модулировался с помощью ионов К+ в присутствии К+-ионофора валиномицина. Для этих экспериментов были получены везикулы, внутренняя среда которых содержала 5 мМ K2SO4. Потенциал на везикулярной мембране варьировали, изменяя концентрацию К* в наружной среде в присутствии валиномицина.

Если везикулы, содержащие 5 мМ K2SO4 во внутривезикулярном пространстве, суспендировать в реакционной среде, также содержащей 5 мМ K2SO4, то индукция К+-проводимости везикулярной мембраны с помощью валиномицина приведет к диссипации электрического потенциала, генерируемого

АТФ

Na2S04

2 мин

+N0

-NO

Рис. 7. Влияние проникающих анионов (NO3 ) на Na+-и АТФ-зависнмое защелачивание люмена везикул ПМ 7". viridis (А) и генерацию электрического потенциала на везикулярной мембране №+-АТФазой Г. viridis (Б).

2 мин

N0,

СССР

Рис. 8. Влияние К и валиномицина на Na+- и АТФ-зависимое защелачивание люмена везикул ПМ Т. viridis, нагруженных К+ (5 мМ K2SO4). Стандартная реакционная среда содержала дополнительно 5 мМ K2S04 (трек 1), или 5 мМ K2SO4 + 3 мкМ валиномицина (трек 2), или 0.5 мМ K2SO4 + 3 мкМ валиномицина (возникает диффузионный К+-потенциал, «минус» внутри везикул.).

на мембране №+-АТФазой. В этих экспериментальных условиях скорость АТФ-зависимого защелачивания везикулярного люмена была лишь немного ниже, чем скорость этого процесса, протекающего в отсутствие валиномицина (Рис. 8, треки 1 и 2). Более того, АТФ-зависимое защелачивание наблюдалось в условиях, когда на везикулярной мембране индуцировали отрицательный внутри везикул диффузионный К+-потенциал, суспендируя нагруженные К+ везикулы (5 мМ K2SO4 во внутривезикулярном пространстве) в реакционной среде, содержащей 0,5 мМ K2SO4 и валиномицин (Рис. 8, трек 3). СССР в средах, содержащих К+ и валиномицин, обращал потоки Н+ на везикулярной мембране. Поскольку протонофор облегчает движение протонов по градиенту их электрохимического потенциала, закисление везикулярного люмена, наблюдаемое после добавки СССР означает, что в этих экспериментальных условиях ДрН направлен из наружной среды во внутривезикулярное пространство и, следовательно, до добавки СССР протоны перемещались из везикул наружу против градиента их электрохимического потенциала. Перемещение протонов против ДрН, очевидно, обусловлено работой первично-активного механизма, т.е. осуществляется непосредственно Ма+-транспортирующей АТФазой.

Таким образом, эксперименты с агентами, изменяющими величину электрического потенциала на везикулярной мембране, показали, что движение протонов через везикулярную мембрану, связанное с работой Ма+-АТФазы, не зависит существенно от потенциала, генерируемого на мембране этим ферментом. Последнее означает, что АТФ-зависимый выход протонов из везикул обусловлен, в основном, Na+/H+ обменом, катализируемым непосредственно АТФазой. Поскольку в процессе работы №+-АТФазы происходит накопление положительных зарядов внутри везикул, стехиометрия такого обмена должна быть mNa+/nH+, где m>n.

Ыа*-АТФаза Р. maritima катализирует Ыа*-унипорт. В опытах на везикулах ПМ D. maritima, нагруженных пиранином, также было продемонстрировано, что в присутствии ионов Na+ и АТФ наблюдается выход протонов из везикул, который, однако, был достаточно заметным только в присутствии протонофора СССР (рис. 9, А). Зависимость интенсивности внутривезикулярного защелачивания от вида присутствующего катиона соответствует ряду катионной специфичности, полученному для №+-АТФазы Т. viridis (Рис. 7; для D. maritima данные не приведены) и подтверждает, таким образом, что наблюдаемое АТФ-зависимое защелачивание везикулярного люмена связано с работой Ма+-АТФазы.

Рис. 9. Na+- и АТФ-зависимое защелачивание люмена везикул ПМ D. maritima. Влияние протоиофора СССР (А) и проникающего аниона ЫОз" (Б). (См. также пояснения к Рис. 6).

Тот факт, что заметная стимуляция защелачивания везикулярного люмена при работе Ыа+-АТФазы наблюдалась только в присутствии протонофора, позволяет предположить, что Ыа+-АТФаза D. maritima непосредственно не переносит протон через мембрану в обмен на ион Na+. Это предположение было подтверждено в экспериментах, в которых исследовали действие проникающего аниона NO3' на АТФ-зависимое защелачивание везикулярного люмена. В данной серии экспериментов реакционная среда для наблюдения защелачивания содержала протонофор СССР, поскольку в его отсутствие интенсивность защелачивания везикулярного люмена была весьма незначительна. Очевидно, что если в среде одновременно присутствуют СССР и проникающий анион, то эти два агента будут конкурировать за диссипацию электрического потенциала, генерируемого на везикулярной мембране №+-АТФазой. Чем выше мембранная проницаемость для аниона, тем сильнее он должен снижать потенциал и тем сильнее тормозить защелачивание люмена в том случае, если генерируемый Na+-АТФазой Дф является движущей силой транспорта Н+. Нитрат эффективно снимал электрический потенциал на везикулярной мембране, создаваемый работой №+-АТФазы D. maritima (Рис. 5).

Проникающие через мембрану и нейтрализующие положительный заряд в везикулярном люмене ионы NO3" в значительной степени устраняли АТФ-зависимое защелачивание везикул (Рис. 9, Б). Данный результат свидетельствует, что движущей силой для выхода протонов из везикул ПМ

D. maritima является положительный заряд, накапливающийся в везикулярном люмене при переносе туда ионов Na+ Ыа+-АТФазой. В случае, если бы сам фермент непосредственно осуществлял перенос Н+ из везикулярного люмена в среду, АТФ-зависимое защелачивание везикул ускорялось бы в присутствии NO3" подобно тому, как в присутствии нитрата происходит ускорение АТФ-зависимого накопления ионов Na+ в везикулах ПМ (Рис. 4).

Сравнительная характеристика двух ионных насосов, Н+-АТФазы и Na+-АТФазы, функционирующих в плазматической мембране Т. viridis.

Как hT-АТФаза, так и №+-АТФаза, функционирующие в ПМ Т. viridis, являются электрогенными ферментами и относятся к классу АТФаз Р-типа, о чем говорит чувствительность соответствующих активностей (АТФ-зависимого поглощения Н+ или АТФ-зависимого поглощения 22Na+ везикулами) к специфическому ингибитору АТФаз Р-типа ортованадату. Полученные нами данные также показывают, что №+-транспортирующая АТФаза Т. viridis осуществляет обмен ионов Na+ на Н+, и, следовательно, выведение этим ферментом ионов Na+ из клеток сопровождается встречным движением Н+ в клетки. Очевидно, что оба фермента вовлечены в ионное гомеостатирование цитоплазмы Т. viridis, включая возможное участие №+-АТФазы в ее рН-статировании. При внезапном изменении наружных концентраций соли (в момент гипер- или гипоосмотического солевого шока) активности АТФаз в клетках водоросли должны измениться в соответствии с произошедшими изменениями в ионном составе цитоплазмы. В частности, в условиях гиперосмотического солевого шока в клетках галотолерантных водорослей наряду с изменениями цитоплазматических концентраций Na\ наблюдаются изменения pH цитоплазмы (защелачивание) (Kuchitsu et al., 1989), а также, возможно, изменения цитоплазматических концентраций Мд2+ и АТФ. В этом разделе описаны эксперименты, в которых дан сравнительный анализ двух АТФаз в ПМ Т. viridis, Н+-АТФазы и Ма+-АТФазы, с точки зрения регуляции активностей этих ферментов такими факторами цитоплазматического окружения, как pH, [Мд2+], [АТФ], [МдАТФ], [Na+], Разумно предположить, что быстрые изменения этих факторов при (гипер/гипо)осмотическом солевом шоке обусловливают быструю регуляцию АТФаз в первые минуты после резких изменений наружной концентрации соли, что способствует восстановлению ионного баланса в клетках микроводорослей.

Активность Н+-АТФазы регистрировали по АТФ-зависимому закислению, а активность Ма+-АТФазы - по Na+- и АТФ-зависимому защелачиванию внутривезикулярного пространства. Na+- и АТФ-зависимое защелачивание везикулярного люмена может служить мерой активности Ыа+-АТФазы Т. viridis, поскольку, как мы показали, №+-АТФаза Т. viridis в каталитическом цикле осуществляет перенос ионов Na+ через мембрану в обмен на протон, т.е. обладает как Na+-, так и Н+-транслоцирующими активностями. pH-зависимости активностей двух АТФаз. pH-зависимости активностей двух АТФаз (Рис. 10, А) показывают, что их максимумы (pH 6.5 для Н+-АТФазы и pH 7.8 для №+-АТФазы) совпадают с кислой и щелочной границами физиологического диапазона pH, т.е. диапазона, в котором могут меняться значения pH цитоплазмы (от 7 до 8) у разных видов галотолерантных водорослей при колебаниях pH наружной среды (Kirst, 1977).

0,05

Км = 4.8 мМ

0.04

0.02

-0,5 •0.02 0,5 1

60 90 120 Na*, mM

2 3 4 MgS04, mM

10

Рис. Ю. pH-зависимости (А), эффекты Na+ (Б), Mg2+ (В) и АТФ (Г) на транспортные активности двух АТФаз: Н+-АТФазы (белые символы) и Na -АТФазы (черные символы) в ПМ Т. viridis. По осям ординат везде указаны (в произвольных единицах) скорости формирования ДрН на везикулярных мембранах, что означает закисление везикулярного люмена в случае Н+-АТФазы и защелачивание - в случае Na -АТФазы.

Н+-АТФаза плазматической мембраны является важной компонентой системы рН-статирования клетки. Одной из основных ее функций является противодействие закислению цитоплазмы, которым сопровождается клеточный метаболизм (Smith, Raven, 1979; Serrano, 1989). Максимум активности Na+-АТФазы Т. viridis лежит в области щелочных pH (pH 7.8 + 8.0). Соответственно, защелачивание цитоплазмы должно стимулировать этот фермент. Поскольку Na+-АТФаза Т. viridis обменивает Na* на Н\ т.е. экспорт Na+ из клеток, осуществляемый АТФазой, сопровождается поступлением Н+ из окружающей среды в клетки, этот фермент можно, по-видимому, рассматривать как механизм, не только участвующий в Ма+-гомеостатировании цитоплазмы, но и препятствующий также ее защелачиванию. Эта функция регуляции цитоплазматического pH особенно важна в условиях гипертонического солевого шока, когда у галотолерантных водорослей происходит защелачивание цитоплазмы (Kuchitsu et al., 1989). Последнее, по-видимому, обусловлено работой Na*/H+ антипортера плазматической мембраны, через который при резком повышении наружных концентраций соли ионы Na+ поступают в клетки в обмен на Н+ (Katz et al., 1991).

Влияние INa*l на активность Ыа*-АТФазы. Начальная скорость АТФ-индуцируемого внутривезикулярного защелачивания, обусловленного работой 1Ча+-АТФазы, возрастает по мере увеличения концентраций Na+ от 0 до 20 мМ и слегка уменьшается при дальнейшем увеличении концентраций этого иона (Рис. 10, Б). Восходящая часть кривой может быть аппроксимирована уравнением Михаэлиса - Ментен с кажущейся Км = 4.8 ± 0.36 мМ Na+. Это значение лежит в диапазоне цитоплазматических концентраций Na+ у Т. viridis (Стриж и др., 2004). Следует также отметить, что активность фермента лишь незначительно подавляется высокими концентрациями Na\ что свидетельствует о потенциальной возможности фермента функционировать в условиях гиперосмотического солевого шока. Как показывают эксперименты, проведенные на интактных клетках галотолерантных водорослей, в условиях гиперосмотического солевого шока кинетика изменений внутриклеточных концентраций ионов Na+ имеет двухфазный характер. В первой фазе наблюдается существенный рост внутриклеточных концентраций Na+, во второй -происходит их снижение практически до исходного уровня (Балнокин, 1993). Наиболее вероятно, что во второй фазе именно №+-АТФаза, экспортирующая Na+H3 клеток, отвечает за снижение внутриклеточных концентраций Na+.

Влияние свободных Ma2* и АТФ на активности двух АТФаз. Субстратом для всех АТФаз Р-типа является комплекс МдАТФ, а изменения концентраций свободных Мд2+ и АТФ могут влиять на активности этих ферментов (Morrison, 1979). Поскольку Н+-АТФаза и №+-АТФаза Т. virídis принадлежат к классу АТФаз Р-типа, то их активности также могут модулироваться изменениями концентраций свободных Мд2+ и АТФ, которые, в свою очередь, являются функцией рН среды и отношения общих концентраций Мд2+/АТФ в среде (Morrison, 1979). В связи с этим, прежде, чем определять сродство АТФаз к субстрату, МдАТФ, мы исследовали отношение этих ферментов к свободным Мд2+ и АТФ. Активности ферментов определяли при соответствующих значениях рН: активность Н+-АТФазы - при рН 6.0, а активность 1Ма+-АТФазы - при рН 7.8.

На Рис. 10, В представлены зависимости активностей АТФаз от общей концентрации MgSC>4 в реакционной смеси. Измерения проводили при постоянной общей концентрации АТФ в среде 2 мМ. Как показывают расчеты, в этих условиях концентрации свободного Mg2t в растворе (как при кислых, так и при щелочных рН) существенно возрастают, когда концентрации общего Mg2+ (MgSCU) превышают 1 мМ (расчет концентраций свободных Мд2+ и АТФ в растворе произведен с использованием пакета программ K.-J. Foehr "Free and total concentrations of divalent metal ions in aqueous solutions containing multiple ligands and metals"). Мы видим, что в исследованном диапазоне концентраций общего Мд2+ не наблюдается ингибирование Н+-АТФазы, тогда как при увеличении концентраций общего Мд2+ выше 1 мМ (что соответствует концентрациям свободного Мд2+ свыше нескольких десятков мкМ) наблюдается ингибирование №"-АТФазы. Применив метод Корниш-Боудена (Cornish-Bowden, 1974), мы определили, что Мд2* является ингибитором смешанного типа для №+-АТФазы (Рис. 11, А; прямые пересекаются в III четверти координатной плоскости), K¡ = 210 мкМ Mg2t.

На Рис. 10, Г представлены зависимости активностей АТФаз от общей концентрации АТФ в реакционной смеси. Постоянная общая концентрация Мд2+ (МдБОд) была 2 мМ при определении активности Н+-АТФазы и 1 мМ при определении активности №+-АТФазы. Вычисления показывают, что в этих экспериментальных условиях, при увеличении концентраций вносимого АТФ свыше 1 мМ увеличивается доля свободного АТФ в среде. Мы видим, что при увеличении концентраций общего АТФ (и, соответственно, свободного АТФ в

растворе) наблюдается незначительное подавление активности Ыа+-АТФазы и весьма существенное - Н+-АТФазы. Анализ параметров ингибирования Н+-АТФазы свободным АТФ по методу Корниш-Боудена (Рис. 11, Б) показал, что свободный АТФ является ингибитором смешанного типа для Н+-АТФазы с К| = 330 мкМ.

Рис.11. Анализ типа

ингибирования двух транспортных АТФаз Т. viridis, Н+-АТФазы и Na+-АТФазы, свободными Mg2+ или АТФ (по [Cornish-Bowden, 1974]). Свободный Mg2+ является ингибитором смешанного типа для Ыа+-АТФазы (А), а свободный АТФ - ингибитором смешанного типа для Н+-АТФазы (Б). В экспериментах концентрация комплекса MgAT® поддерживалась на постоянном уровне (указано на графике рядом с линиями)

Зависимость активностей Н*-АТФазы и Ыа*-АТФазы от кониентоаиии комплекса МаАТФ. Определение Км. Поскольку мы нашли, что избыток свободного АТФ в растворе ингибирует Н+-АТФазу, а избыток свободного Мд2+ -Ыа+-АТФазу, то при определении сродства АТФаз к их субстрату, комплексу МдАТФ2", концентрации свободных форм этих компонент в растворе поддерживались на неингибирующем уровне. Полученные зависимости

(Рис. 12) удовлетворительно описываются уравнениями Михаэлиса-Ментен, с достаточно близкими значениями кажущихся Км: для ЬГ-АТФазы Км составила 34+6 мкМ МдАТФ, для №+-АТФазы - 73 ± 8 мкМ МдАТФ. Значения Км такого же порядка получены для Н+-АТФаз плазматической мембраны некоторых

водорослей: ацидофильной водоросли Dunaliella acidophila (Sekler, Pick, 1993) и харовой водоросли Nitellopsis obtusa (Mimura et al., 1983).

Рис. 12. Транспортные активности двух АТФаз Т. viridis, Н+-АТФазы (белые символы) и Ыа+-АТФазы (черные символы), зависимости от концентрации комплекса MgAT®. По оси ординат указана (в произвольных единицах) скорость формирования ДрН на везикулярных мембранах, что означает закисление везикулярного люмена Н+-АТФазой и защелачивание - №+-АТФазой. На вставке - график Лайнуивера-Берка, который дает значения кажущихся Км: 34 мкМ MgAT® для Н -АТФазы и 73 мкМ - для Na+-АТФазы.

Различия в свойствах Н+-АТФазы и Na^-АТФазы как основа для быстрой регуляции ферментов в условиях гиперосмотического солевого шока.

Наиболее очевидным следствием изменения ионного состава цитоплазмы галотолерантных водорослей в условиях гиперосмотического солевого шока (увеличение концентраций Na+ и уменьшение концентраций Н+) является активация №+-АТФазы возрастающими концентрациями Na+ и защелачиванием цитоплазмы и, соответственно, ингибирование Н+-АТФазы защелачиванием цитоплазмы и, возможно, возрастающими концентрациями Na+. Мы выяснили также, что такие важные факторы цитоплазматического окружения, как Мд2+ и АТФ, различным образом влияют на активности этих ферментов и любые изменения концентраций свободных Мд2+ и АТФ в цитоплазме должны приводить к модификации активностей двух АТФаз. Рассмотрим возможную роль свободного Мд2+ в регуляции активностей двух АТФаз в условиях гипертонического солевого шока.

По имеющимся в настоящее время в литературе данным концентрация свободного Мд2+ в цитозоле растительной клетки составляет 0.2 + 2 мМ (Shaul, 2002). Эти концентрации Мд2+ соответствуют тем, при которых наблюдается оптимальное функционирование Н+- и №+-АТФаз Т. viridis. Уровень свободного Мд2+ в цитозоле любых клеток должен эффективно регулироваться, поскольку Мд2+ является существенным катионом для работы многих ферментов. Мд2+

модулирует ионные потоки через тилакоидные мембраны и тонопласт и может, таким образом, влиять на ионный баланс в различных клеточных компартментах (Shaul, 2002). О белках, ответственных за транспорт Мд2+ через плазмалемму растительной клетки практически ничего неизвестно. Сравнительно недавно был клонирован ген AtMGTI из Arabidopsis, кодирующий локализованный в плазматической мембране переносчик Mg2+, (Li et al., 2001).

Как показано на животных клетках, различные стимулы индуцируют потоки Мд2+ через плазматическую мембрану (направленные как в клетку, так и из клетки), что приводит к изменениям содержания Мд2+ в цитозоле (Romani, Scarpa, 2000). Разумно предположить, что аналогичная картина наблюдается и в клетках растений. Возможно также, что возрастание цитоплазматических концентраций Na+, наблюдаемое в клетках галотолерантных водорослей в условиях гиперосмотического солевого шока, приводит к экспорту Мд2+ из клеток. Подобный эффект был обнаружен в клетках поджелудочной железы (Yago et al., 2000). Уменьшение цитоплазматических концентраций Mgz+ у галотолерантных водорослей должно приводить к активации 1Ма+-АТФазы и подавлению ЬГ-АТФазы, что в условиях гиперосмотического солевого шока будет способствовать восстановлению ионного гомеостаза в цитоплазме этих организмов.

Гиперосмотический солевой шок

Na+

Na*/H* антипортер / ^

-активация

-ингибирование

Na+

Рис.13. Модель регуляции активностей двух помп в плазматической мембране Т. viridis - Ка+-АТФазы и Н'-А'ГФачы в начальный период гиперосмотического солевого шока.

Фосфорилированный интермедиат Na+'АТФазы Т. viridis.

Характеристикой и общим свойством АТФаз Р-типа является способность образовывать фосфорилированный интермедиат (скоропреходящее фосфорилированное состояние белка) в ходе каталитического цикла (Hobbs and Albers, 1980; Post et al., 1965; Avruch and Fairbanks, 1972; Glynn and Karlish, 1975; De Meis and Vianna, 1979; Briskin and Poole, 1983). Описанные ниже эксперименты no фосфорилированию белков плазматической мембраны Т. viridis показали, что в ходе каталитического цикла №+-АТФазы этого организма также образуется фосфорилированный интермедиат.

Фосфорилирование белков в препаратах плазматической мембраны Т. viridis. Влияние ионного состава среды. Фосфоинтермедиаты АТФаз Р-типа нестабильны в условиях обычного электрофоретического разделения белков, т.е. при pH 7,0 и комнатной температуре (Weber, Osborn, 1969; Fairbanks et al., 1971). Однако они достаточно стабильны при низкой температуре (2'- 4° С) и низких значениях pH (pH 2 - pH 4) (Bader et al., 1966). В связи с этим, для обнаружения и регистрации подобных фосфоинтермедиатов проводят электрофорез белков в кислых (pH 2,4) гелях при пониженных температурах (Fairbanks and Avruch, 1972; Lichtner and Wolf, 1979; Amory et al., 1980).

На радиоавтографах гелей, полученных нами в этих условиях (Рис. 14), можно наблюдать, в зависимости от ионного состава среды, от одной до трех полос, что соответствует фосфорилированным белкам с молекулярными массами 100 кДа, 76кДа и 26 кДа. Поскольку каталитические единицы почти всех идентифицированных к настоящему времени АТФаз Р-типа эукариот имеют молекулярную массу около 100 кДа (Hobbs and Albers, 1980; Post et al., 1965; Avruch and Fairbanks, 1972; Glynn and Karlish, 1975; De Meis and Vianna, 1979; Briskin and Poole, 1983), а также в связи с тем, что в препаратах ПМ Т. viridis признаками фосфорилированного интермедиата АТФазы Р-типа обладает фосфобелок 100 кДа (см. ниже), мы ограничимся обсуждением закономерностей фосфорилирования именно этого белка.

Белок 100 кДа фосфорилируется только в присутствии ионов Na+ в реакционной смеси. Когда Na+ отсутствует или заменен другими щелочными катионами (Li\ К+, Rb+), этот белок не фосфорилируется (Рис. 14, А). Отметим, что фосфорилирование белков 76 кДа и 26 кДа не зависит от наличия одновалентных катионов (Рис. 14, А, трек 2).

На уровень фосфорилирования белка 100 «Да влияет Мд2+ (Рис. 14, Б). Исключение Мд2+ из реакционной смеси приводит к существенному усилению фосфорилирования этого белка (Рис. 14, Б; трек 3), а увеличение концентрации Мд2+ в реакционной смеси до 5 мМ приводит к некоторому уменьшению уровня его фосфорилирования (Рис. 14, Б; трек 5).

Б

12345 кДа 12345

193 112

100 -

76 -

HMUmu=

— 57 W

100 76

26- ЫкИЛЫШ "'б цуц у _ 26

Рис. 14. Фосфорилирование белков ПМ Т. viridis. Влияние ионного состава среды на образование фосфобелков. А: 1 - фосфорилирование белков в среде следующего состава: 30 мМ BTP-HEPES буфер, pH 8.0, 5 мМ MgCl2, 25 мМ NaCl, 15 нМ [у-32Р]АТФ (3000 Ci моль"1); 2 - Na+ отсутствует в реакционной среде; 3, 4, 5 - вместо Na+ в среде присутствуют К+, Li+ или Rb+, соответственно. Б: 1- реакционная среда без Na+; 2 - в реакционной среде 25 мМ Na+ и 0.1 мМ Mg2+; 3 - в реакционной среде 25 мМ Na, Mg2+ отсутствует; 4 - как 3, но после 30 сек фосфорилирования был добавлен «холодный» АТФ (5мМ); 5 - в реакционной среде 25 мМ Na+ и 5 мМ Mg2+.

Кинетика фосфорилирования белка 100 кДа. Фосфорилирование белка 100 кДа достигает максимума менее, чем за 10 сек (Рис. 15). Подобные быстрые кинетики характерны для образования фосфорилированных интермедиатов АТФаз Р-типа (Stein, 1986). При увеличении времени инкубирования препаратов ПМ с [у-32Р]АТФ уровень фосфорилирования белка 100 кДа несколько падает и в течение 30 сек достигает стационарного состояния.

30000

20000

10000

Рис. 15. Кинетика образования фосфобелка 100 кДа. По оси ординат указана радиоактивность в образцах, имп/мин.

ч 0 20 40 60 80 100 120

Время, сек

Химическая природа фосфатной связи. В каталитическом цикле транспортных АТФаз Р-типа при переносе терминального фосфата от АТФ на фермент образуется ацил-фосфатная ковалентная связь, в формирование которой вовлечена карбоксильная группа аспартата в активном центре фермента (Möller et al., 1996). Эта связь разрывается под действием гидроксиламина. Чувствительность к гидроксиламину продемонстрирована для фосфоинтермедиата Са2+-АТФазы (Degani and Boyer, 1973), 1Ча+,К+-АТФазы (Post and Ките, 1973; Nishigaki et al., 1974), Н+-АТФазы дрожжей (Amory et al., 1980).

В результате обработки гидроксиламином фосфорилированных препаратов ПМ Т. viridis все фосфобелки, обнаруживаемые в контрольном варианте, исчезают (Рис. 16), что указывает на образование характерных для фосфоинтермедиатов АТФаз Р-типа ацил-фосфатных связей при фосфорилировании белков плазматической мембраны Т. viridis.

1 2

Рис. 16. Влияние гидроксиламина на фосфобелки, сформировавшиеся в препаратах ПМ Т. viridis (в присутствии 0.1 мМ Mg2+ и 25 мМ Na+). Эффект гидроксиламина исследовали, инкубируя мембранные белки, осажденные ТХУ после реакции фосфорилирования, в 50 мМ MES-BTP буфере (pH 5,2), в присутствии/отсутствии 250 мМ гидроксиламина. 1 - контрольные образцы (буфер); 2 - образцы, обработанные гидроксиламином.

§

2 3 4 5 6

Рис. 17. Влияние ванадата на образование фосфобелков в препаратах ПМ Т. viridis. Реакция фосфорилирования продолжалась 15 с (/, 4) или 60 с (2, 3, 5, б). 1 - 3: ванадат отсутствует в реакционной смеси; 4 -б: фосфорилирование белков в присутствии 0.5 мМ ванадата. Ионные условия: 1, 2, 4, S - стандартная реакционная среда (25 мМ Na+) без Mg2+; 3, 6 - стандартная реакционная среда (см. подписи к рис. 13).

Влияние ортованадата. Ванадат препятствует фосфорилированию белка 100 кДа (Рис. 17), что соответствует представлениям о механизме ингибирующего действия ванадата на АТФазы Р-типа, согласно которым ванадат замещает фосфатную группу в области связывания АТФ.

Pulse-chase эксперименты. В этих экспериментах исследовали влияние Мд2+, АДФ и "холодного" АТФ на сформировавшиеся фосфобелки. Внесение 5 мМ МдСЬ в реакционную смесь после того, как фосфобелки сформировались, приводит к высвобождению метки из белка 100 кДа (Рис. 18; треки 1 и 2). Внесение наряду с MgCI2 избытка немеченого АТФ приводит к практически полному высвобождению метки из этого белка (Рис. 18; трек 3). В отсутствие Мд2+ добавка немеченого АТФ не приводит к дефосфорилированию белка 100 кДа (Рис. 14, Б, трек 4). Дефосфорилирование фосфобелка 100 кДа (в присутствии ионов Мд2+) под действием немеченого АТФ свидетельствует о быстрой «оборачиваемости» этого белка.

Фосфобелок 100 кДа чувствителен также к АДФ, добавка которого приводит к его полному дефосфорилированию (Рис. 18; трек 4). Наблюдаемое дефосфорилирование является, вероятно, результатом взаимодействия высокоэргического фосфорилированного интермедиата с добавляемым АДФ, что приводит к ресинтезу АТФ (Рис. 19).

12 3 4

100 - ff - -

26

Рис. 18. Pulse-chase эксперименты. Фосфорилирование белков ПМ Т. viridis продолжалось 30 с в стандартной реакционной среде (содержащей 25 мМ Na+) без Mg , затем были внесены указанные ниже агенты и реакция была остановлена через 5 с добавлением холодной (0°С) ТХУ. 1 - без добавок; 2 -5 мМ Mg2+; 3-5 мМ Mg2+ + 5 мМ «холодный» АТФ; 4-5 мМ АДФ.

,2+

Белок 100 кДа - сЬоссЬорилиоованный интеомедиат АТФазы Р-типа. Из трех фосфобелков, наблюдаемых в спектре белков плазматической мембраны Т. viridis в результате фосфорилирования последних с помощью [у-32Р]АТФ, один белок, а именно, белок 100 кДа, проявляет все признаки фосфорилированного интермедиата АТФазы Р-типа. Этот белок требует ионы Na+ для своего фосфорилирования, демонстрирует быструю кинетику фосфорилирования, терминальный фосфат из [у-32Р]АТФ, связавшийся с белком, быстро удаляется под действием немеченого АТФ (в присутствии Мд2+) или под действием АДФ. Ортованадат существенно уменьшает включение метки в этот белок. При фосфорилировании образуется ацил-фосфатная связь. Указанные свойства предполагают, что белок 100 кДа является каталитической субъединицей Na+-АТФазы Т. viridis. Молекулярная масса 100 «Да соответствует молекулярным массам каталитических единиц большинства АТФаз Р-типа, определенным с применением данной методики, а закономерности

фосфорилирования/дефосфорилирования этого белка могут быть описаны в рамках схемы Олберса-Поста (Рис. 19), предложенной для описания работы №+,К+-АТФазы животных клеток (Stein, 1986).

Рис. 19. Упрощенная схема Олберса-Поста (Albers, 1967; Post et al., 1969), описывающая каталитический цикл транспортных АТФаз Р-типа (или Е^-типа) (на примере Ма+,К+-АТФазы животных клеток) (приводится по Stein, 1986).

Ковалентное связывание фосфата ферментом в ходе каталитического цикла (формирование EiP) сопровождается окклюзией Na+ в высокоэргическую форму, EiP(Na)occ- (Окклюзия - связанное состояние, характеризующееся высокой степенью дегидратации или полной дегидратацией катиона). Связывание фосфата ферментом не происходит в отсутствие ионов Na+. Следующая стадия, превращение EiP(Na)0CC в ЕгР и высвобождение Na , требует ионов Mg2+. Mg2+ и АТФ в высоких концентрациях способствуют ускорению цикла. При низких концентрациях АТФ в присутствии ионов Na+ и в отсутствии ионов Mg2+ фермент, преимущественно, находится в форме EiP(Na)0CC. Именно при этих условиях в наших экспериментах наблюдается высокий уровень фосфорилирования белка 100 кДа (Рис. 14). Форма EiP(Na)occ чувствительна к АДФ, в присутствии которого происходит дефосфорилирование EiP(Na)0cc с ресинтезом АТФ. В наших экспериментах под действием АДФ происходит быстрое дефосфорилирование белка 100 кДа (Рис. 18). Последнее позволяет предположить, что фосфобелок 100 кДа является высокоэргическим фосфоинтермедиатом №+-АТФазы Т. viridis в форме EjP(Na)occ. Ванадат связывается с ферментом, находящемся в конформации Ег, и стабилизирует его в этой форме, препятствуя дальнейшим конформационным превращениям и тормозя таким образом работу фермента.

Уменьшение уровня фосфорилирования белка 100 кДа при увеличении концентраций Mg2+, а также быстрое его дефосфорилирование под действием высоких концентраций Mg2+ в pulse-chase экспериментах (Рис. 18) может быть интерпретировано согласно схеме, а именно: Mg2+ способствует высвобождению фосфата, ускоряя цикл фермента на стадии превращения EtP(Na)occ в Е2Р. Последняя форма, в свою очередь, спонтанно высвобождает фосфат и превращается в нефосфорилированный фермент в кофигурации Ei. Каталитический цикл EiEi-АТФаз ускоряется также в присутствии высоких концентраций АТФ, чему соответствует быстрое дефосфорилирование белка ЮОкДа под действием немеченого АТФ (Рис. 18).

Na+-ATOa3a при адаптации Т. viridis к различной солености среды.

Индукция генов, кодирующих белки, вовлеченные в трансмембранный перенос ионов, является важной составляющей в адаптации растений к солевому стрессу (Hasegawa et al., 2000; Serrano, Rodríguez-Navarro, 2001). В условиях солевого стресса наблюдается индукция (или появление новых изоформ) таких важных транспортных белков, как протонные насосы и Na+/H+ антипортеры плазматической мембраны или тонопласта у растений (Apse et al., 1999; Fukuda et al., 2004; Niu et al., 1996). Продемонстрирована индукция Na+-AT<t>a3bi высокими концентрациями соли у дрожжей (Garciadeblas et al., 1993) и у бактерий (Ikegami et al., 1999).

№+-АТФаза галотолерантных микроводорослей, несомненно, является важной детерминантой солеустойчивости этих организмов. Мы попытались выяснить, что же происходит с этим ферментом при адаптации водорослей к различным концентрациям NaCI. Рассматривалась, в частности, возможность индукции фермента или появления новых изоформ №+-АТФазы Т. viridis под действием высоких концентраций NaCI в наружной среде. Эксперименты были проведены на везикулах ПМ, выделенной из клеток Т. viridis, адаптированной к средам с различными концентрациями NaCI (0.01 М, 0.05 М, 0.5 М, 0.9 М и 1.2 М).

Регистрация_ЛоссЬоинтермедиата_Na*-А ТФазы. Регистрация

фосфорилированного интермедиата Na+-ATФaзы была использована как способ обнаружения этого фермента в препаратах плазматической мембраны, полученных из водоросли, выращенной при различных концентрациях NaCI.

Теоретически, усиление интенсивности включения 32Р при образовании интермедиата №+-АТФазы могло бы свидетельствовать об индукции этого фермента. В связи с этим, с помощью [у-32Р]АТФ было осуществлено фосфорилирование белков в препаратах ПМ, полученных из водоросли, адаптированной к вышеуказанным концентрациям NaCI. В присутствии ионов Na+ в препаратах ПМ всех пяти культур регистрировался фосфоинтермедиат Na+-АТФазы (не представлено). Следует отметить, что уровень образования фосфоинтермедиата №+-АТФазы в препаратах ПМ из клеток водоросли, адаптированной к 0.01 М NaCI, оказался достаточно высоким, свидетельствуя о присутствии этого фермента в ПМ Т. viridis даже при таких низких концентрациях соли в среде. Данный факт подтверждает тезис о том, что №+-АТФаза в ПМ Т. viridis является основным механизмом, ответственным за экспорт Na+ из клеток этого организма. Вместе с тем, сравнение на радиоавтографе интенсивности

пятен, отражающих присутствие фосфоинтермедиата №+-АТФазы в препаратах ПМ Т. viridis, адаптированной к различным концентрациям NaCI, не позволяет достоверно оценить возможные изменения в уровне биосинтеза данного фермента при изменении наружных концентраций соли.

Функииональные характеристики Ыа+-АТФазы в препаратах ПМ Т. viridis, адаптированной к различным концентрациям NaCI. Поскольку эксперименты по регистрации фосфоинтермедиата №+-АТФазы в препаратах ПМ Т. viridis, адаптированной к различным концентрациям NaCI, не дали ответа на вопрос о возможных изменениях в уровне биосинтеза этого фермента при изменении наружных концентраций соли, мы исследовали функциональные характеристики Ыа+-АТФазы в различных препаратах ПМ Т. viridis, предполагая, что при адаптации водоросли Т. viridis к различным концентрациям NaCI могут изменяться кинетические параметры, характеризующие работу исследуемого фермента.

В описанных ниже экспериментах активность №*-АТФазы регистрировали по защелачиванию везикулярного люмена, при этом в реакционные среды вносили протонофор для обеспечения максимальной протонной проводимости везикулярной мембраны и, соответственно, максимального ответа на добавку АТФ (Рис. 6А, трек 2). Введение протонофора в экспериментальную систему продиктовано следующими соображениями. При адаптации водорослей к средам различной солености протонная проводимость мембраны может меняться, как это было показано, например, для клеток харовой водоросли Chara buckellii (Yao and Bisson, 1993). В экспериментальной системе в присутствии протонофора лимитирующий и, возможно, вариабельный, фактор - протонная проводимость мембраны, - исчезает; генерируемый на везикулярной мембране при транслокации ионов натрия №+-АТФазой электрический потенциал («+» внутри везикул) полностью трансформируется в ДрН.

Зависимости активности №*-АТФазы от концентрации ионов Na+ в реакционной среде были получены для препаратов ПМ из водоросли, адаптированной к средам с различными концентрациями NaCI (Рис. 20, А). Для всех препаратов, кроме полученных из клеток Т. viridis, выращенной при 0.05 М NaCI, зависимости имели вид сложных двуступенчатых кривых с локальным оптимумом при 2,5 + 5 мМ Na+ и дальнейшим возрастанием активности при увеличении концентрации ионов Na+. В препаратах ПМ, полученных из водоросли,

А

Б

<

15-

<

0-

0.2

03

1Л/

0.1

0.0-

0 5 10 15 20 1/s

0 5 10 15 20

Концентрация Na+, мМ

Рис. 20. А: зависимости активности Ка'-АТФазы от концентрации ионов Na" в реакционной среде для препаратов ПМ из клеток Т. viridis, выращенной при различных концентрациях NaCl: 0.05 М (А), 0.5 М (▼), 0.9 М (•) и 1,2 М (■). Б: данные представлены в координатах Лайнуивера-Берка.

культивируемой при 0.05 М NaCl, максимальная активность №+-АТФазы наблюдалась при 1 мМ Na+, а при дальнейшем увеличении концентрации ионов Na+ активность фермента заметно снижалась. Наблюдавшаяся в последнем случае зависимость с высокой степенью корреляции может быть аппроксимирована кривой, описываемой уравнением реакции субстратного ингибирования (Диксон, Уэбб, 1982) (Рис. 21, а; Табл. 3).

Зависимости активности №+-АТФазы от концентрации ионов Na+ в препаратах ПМ из клеток Т. viridis, выращенной при высоких концентрациях NaCl (0.5 М, 0.9 М, 1.2 М), также не следуют кинетике Михаэлиса-Ментен. В координатах Лайнуивера-Берка они имеют вид выпуклых кривых (Рис. 20, Б). Подобного рода нелинейность может отражать: (1) существование нескольких субстрат-связывающих сайтов в молекуле этого фермента и, как следствие, наличие кооперативных эффектов (Курганов, 1978) или (2) наличие нескольких изоферментов Na'''-АТФазы, катализирующих одну и ту же реакцию, но с разными константами Михаэлиса (Cleland, 1970).

В свете данных о том, что Н+-АТФаза ПМ растений (Palmgren and Harper, 1999), Na+, К+-АТФаза животных клеток (Sweadner, 1989), №+-АТФаза дрожжевых клеток (Rodriguez-Navarro et al., 1994) представлены несколькими изоформами,

можно предположить существование нескольких изоформ и для Ыа+-АТФазы ПМ Т. viridis. В этом случае общая скорость трансмембранного переноса ионов Na+ будет равна сумме скоростей отдельных составляющих этого процесса, катализируемых изоферментами (Cleland, 1970; Диксон, Уэбб, 1982).

Если принять, что в ПМ Т. viridis функционируют две изоформы Na+-АТФазы, причем у клеток, растущих при низких концентрациях соли (50 мМ NaCI), существует только одна изоформа, которая ингибируется высокими концентрациями NaCI, а вторая изоформа индуцируется высокими концентрациями NaCI, то общая скорость реакции, катализируемой препаратами ПМ клеток, выращенных при высоких концентрациях NaCI, может быть описана следующим уравнением:

V = Vimax/(1 + Kim/S + S/Kis) + V2max/(1 + K2M/S)

Здесь первое слагаемое отражает скорость процесса, катализируемого изоферментом, функционирование которого подчиняется кинетике субстратного ингибирования. Второе слагаемое описывает вклад в наблюдаемую реакцию изофермента, действие которого описывается простой кинетикой Михаэлиса-Ментен. Теоретические кривые, полученные на основе этого уравнения и представляющие собой аппроксимацию экспериментальных данных, а также соответствующие кинетические параметры представлены на Рис. 21 и в Табл.3.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что транспорт ионов Na+ из клеток Т. viridis, в норме растущих при 0,5 М NaCI (концентрация, соответствующая содержанию соли в морской воде), осуществляется двумя изоформами №+-АТФазы, различающимися по сродству к ионам Na+ (Табл. 3). Изоформа, характеризующаяся высоким сродством (Км = 0,17 ± 0,03 мМ Na+) является конститутивной. Она обнаруживается в препаратах ПМ, выделенных из клеток, растущих при любой концентрации NaCI (в исследованном диапазоне), и ее активность in vitro падает при увеличении концентрации Na+ свыше 5мМ. Вторая изоформа, с более низким сродством к Na+ (Км = 7,6 ± 3,8 мМ Na+), индуцируется в клетках водоросли при выращивании ее в средах с высоким содержанием NaCI. Активность этой изоформы in vitro не подавляется возрастающими концентрациями ионов Na+ (в исследованном диапазоне).

V = Vlmax/(1 + Кш/S + S/Kis) + V2max/(1 + K2M/S)

0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Концентрация Na\ мМ

Рис.21. Аппроксимация экспериментальных данных, представленных на Рис.20, теоретическими кривыми, построенными по заданным уравнениям. Препараты ПМ получены из клеток Т. viridis, выращенной при: а) 0.05 М , б) 0.5 М , в) 0.9 М и г) 1,2 М NaCl. Математическое представление кривых в виде суммы составляющих и расчеты соответствующих констант осуществлены с использованием программы Origin 6.1.

Таблица 3. Параметры кинетических кривых, описывающих зависимость активности Na+-ATOa3bi в различных препаратах ПМ Т. viridis от концентрации ионов Na* (R2 -коэффициент смешанной корреляции).

Концентрация NaCl в среде выращивания Т. viridis Гипербола I, включающая субстратное ингибирование Гипербола II R2

Kim (ММ) К*(мМ) К2М(мМ)

0,05 М 0,19±0,04 10,6+4,1 — 0,972

0,5 М 0,17±0,03 5,1±2,2 7,6±3,8 0,975

0,9 М 0,21 ±0,02 5,2±3,2 8,4±4,2 0,989

1,2 М 0,19±0,04 4,9+1,3 7,8±4,9 0,955

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Согласно Рэйвену и Смиту (Raven and Smith, 1976), первым в эволюции появился протонный насос в связи с необходимостью регулировать внутриклеточный pH, который имеет тенденцию к снижению вследствие образования органических кислот в реакциях клеточного метаболизма. Другая точка зрения (Maloney and Wilson, 1985) заключается в том, что в отсутствие жесткой клеточной стенки у древних примитивных организмов внеклеточные соли и вода, поступающие в клетки через полупроницаемую мембрану должны вызывать набухание и последующий лизис. В этой ситуации №а+-насос, выводящий Na+ из клеток, был бы первым решением проблемы до тех пор, пока не сформировалась клеточная стенка. Согласно этой модели, хемиосмотический цикл, основанный на Na+ градиенте, был предшественником протонного цикла у древних примитивных клеток. Эта гипотеза учитывает общепринятую точку зрения, что жизнь возникла в океане и первые примитивные клетки обитали в среде с высоким содержанием NaCI. Представляется логичным, что в этих условиях выброс Na+ из клеток был выбран как для регуляции клеточного объема, так и для энергизации клеточной мембраны. В процессе эволюции, с выходом жизни на сушу, животные, которые несли в себе частицу океана и клетки которых лишены клеточной стенки, сохранили древний хемиосмотический цикл Na+ для регуляции объема и энергизации клеточной мембраны. Соответственно, Na+ является существенным элементом в жизненном цикле животных, но он потерял свою актуальность для растений и грибов, у которых сформировалась жесткая клеточная стенка и которые при выходе на сушу попали в среду с низким содержанием Na+ (Subbarao, 2003). У этих организмов на плазматической мембране определяющим стал Н+-цикл (там же).

Вторая точка зрения представляется более привлекательной. Не вызывает сомнений, что системы первично-активного транспорта Na+ появились уже на самых ранних этапах эволюции. Об этом говорит многообразие Na+-транспортирующих белков (^'-транспортирующие АТФазы, Na+-транспортирующие декарбоксилазы и оксидоредуктазы, 1Ча+-транспортирующие метилтрансферазы) в плазматической мембране прокариот, обитающих в средах с высоким содержанием Na+ (Dimroth, 1997). Ма+-транспортирующие системы были необходимы как для поддержания низких концентраций этого иона в цитоплазме, так и для осуществления процессов энергообеспечения клетки, которые у прокариотических организмов локализованы в плазматической

мембране и часто ассоциированы с поступлением Na+ в клетки из наружной среды (Скулачев, 1989). Вероятно, именно последней причиной объясняется многообразие №*-транспортирующих систем, возникших в ходе эволюции у прокариот.

Как уже было отмечено, к началу данной работы первичные Na+-транспортеры не были обнаружены у представителей царства растений (Plantee). Микроводоросли, являющиеся объектами нашего исследования, Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima, принадлежат к этому царству. Проведенные нами исследования однозначно продемонстрировали в плазматической мембране указанных микроводорослей наличие ^^-транспортирующей АТФазы, относящиеся к семейству АТФаз Р-типа. Идентификация этих ферментов была проведена на выделенных везикулах плазматической мембраны по их основной функции - трансмембранному переносу ионов Na+, не зависящему от градиента электрохимического потенциала Н+. Наличие №+-АТФазы Р-типа в плазмалемме Т. viridis было показано также другим методом - по способности формировать фосфорилированный интермедиат, что является характерной чертой АТФаз этого семейства. Присутствие ионов Na+ является обязательным условием образования фосфоинтермедиата АТФазы Т. viridis. Существенно, что дефосфорилирования фосфоинтермедиата АТФазы Т. viridis не происходило под действием ионов К+, что указывает на отличие фермента Т. viridis от №+,К+-АТФазы животных клеток.

Найденные нами первичные №*-помпы, №+-АТФазы, у двух видов галотолерантных микроводорослей, указывают на то, что непосредственные эволюционные предшественники высших растений имели первичные Na+-транспортирующие механизмы. В последнее время №+-АТФаза Р-типа была также обнаружена у мха Physcomitrella patens (Benito, Rodriguez-Navarro, 2003). Это позволяет предположить, что первичные №+-насосы, возможно, существовали и у примитивных наземных растений, но были утрачены высшими растениями в ходе эволюции. Последующая колонизация растениями зон земной суши с засоленными почвами и появление растений-галофитов связаны с развитием новых механизмов солеустойчивости у высших растений, обусловленных их многоклеточным строением и возникновением специализированных тканей и органов.

Исследование свойств Ма+-транспортирующих АТФаз Т. viridis и D. maritima показало, что это, по-видимому, два разных фермента. Хотя оба выполняют одну и ту же функцию экспорта Na+ из цитоплазмы клетки в наружную среду и оба

являются электрогенными, механизмы их функционирования различны. Na+-АТФаза Т. viridis переносит Na+ через мембрану в обмен на протон, а №+-АТФаза D. maritima работает как унипортер.

Наши исследования демонстрируют, что Ма+-транспортирующие АТФазы и у Т. viridis, и у D. maritima сосуществуют в плазматической мембране с Н+-АТФазой и Na+/H+антипортером. Ранее предполагалось, что Д^Н-зависимый Na+/H+ антипортер галотолерантных водорослей отвечает за экспорт ионов Na+ из цитоплазмы этих организмов. Однако, проведенные нами расчеты показывают, что в естественных условиях обитания этих организмов (высокие концентрации NaCI и слабо-щелочная среда) выброс Na+ из клеток посредством ДцН-зависимого Na+/H+антипортера не может быть осуществлен (Balnokin et al., 1997). В связи с этим, основной функцией Na'VH* антипортера у галотолерантных микроводорослей, по-видимому, является участие в рН-статировании цитоплазмы, подобно тому, как это происходит в животных клетках (Orlowski, Grinstein, 1997). Еще одной важной функцией Na'VH* антипортера у галотолерантных микроводорослей является участие в быстром ответе клеток на гиперосмотический солевой шок, когда для предотвращения обезвоживания цитоплазмы и осмотического сжатия в клетку через Na+/H+антипортер в массовом количестве поступают ионы Na+(Katz et al., 1991; Balnokin et al., 1993).

Все три белка плазмалеммы галотолерантных водорослей, о которых выше шла речь, т.е. Н+-АТФаза, Na+/H+антипортер и №+-АТФаза, вовлечены в перенос Н+ через эту мембрану. Н+-АТФаза, которая удаляет в наружную среду избыток Н* из цитоплазмы, образующийся в результате дыхательного метаболизма, является важным элементом системы рН-статирования цитоплазмы у растительных клеток (Smith, Raven, 1979). Не вызывает сомнения, что эта роль данного фермента важна также и для галотолерантных микроводорослей. Однако, эти организмы могут сталкиваться с ситуацией, когда цитоплазматические концентрации Н+ снижаются. В частности, в условиях гиперосмотического солевого шока у галотолерантных водорослей наблюдается защелачивание цитоплазмы (Kuchitsu et al., 1989), которое происходит, вероятно, вследствие поступления Na+ в клетки через Na+/H+антипортер. В этих условиях, 1Ча+-транспортирующие АТФазы микроводорослей могут выступать как участники системы рН-статирования цитоплазмы. Здесь очевидна роль фермента Т. viridis, для которого показано, что он выводит ионы Na+ из клеток в обмен на поступающий в клетки Н+. 1Ча+-АТФаза

D. maritima способствует электрофоретическому току Н+ в клетки из окружающей среды, генерируя электрический потенциал на плазматической мембране.

В заключение хотелось бы упомянуть о теоретической возможности использования генов №+-АТФаз, функционирующих в плазматической мембране галотолерантных водорослей, для создания солеустойчивых форм высших растений методами генной инженерии. Структурные гены, кодирующие белки, ответственные за транспорт ионов (ионные насосы, каналы, переносчики), рассматриваются как основные кандидаты для генно-инженерных манипуляций с целью создания солеустойчивых сортов растений (Yeo, 1998). Работы в этом направлении сейчас успешно ведутся. Так, повышение солеустойчивости растений Arabidopsis thaliana было достигнуто сверхэкспрессией Н+-АТФазы и Na+/H+ антипортера плазмалеммы и тонопласта, что привело к более эффективному экспорту Na+ из цитоплазмы в экстрацеллюлярное пространство или вакуоль (Apse et al., 1999; Shi et al., 2000). Трансгенные растения, несущие ген №+-АТФазы галотолерантных водорослей, возможно, могли бы произрастать на почвах, в которых высокие концентрации соли сочетаются со щелочными pH.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые в плазматической мембране галотолерантных организмов, принадлежащих царству растений, функционально идентифицирована первичная №+-помпа - Ма+-транспортирующая АТФаза, осуществляющая экспорт ионов Na+ из клеток. Ыа+-АТФазы обнаружены у двух видов морских микроводорослей, Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima (царство Piantae, тип Prasinophyta, класс Prasinophyceae), в экспериментах на выделенных из этих водорослей везикулярных препаратах плазматической мембраны.

2. №+-АТФазы галотолерантных микроводорослей являются электрогенными ферментами и принадлежат семейству АТФаз Р-типа. Характерной особенностью №+-АТФаз галотолерантных микроводорослей является щелочной pH-оптимум функционирования.

3. Определен механизм работы двух №+-АТФаз. Ыа+-АТФаза D. maritima осуществляет транслокацию ионов Na+ через мембрану по унипортерному механизму. Фермент Т. viridis, подобно ряду других катион-транслоцирующих АТФаз, является катион-обменной АТФазой и переносит Na+ через мембрану в обмен на Н+ со стехиометрией mNa+/nH+, где m>n.

4. Установлено, что в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует электрогенная протонная помпа, Н+-АТФаза Р-типа, близкая по своим характеристикам Н+-АТФазе плазматической мембраны высших растений, а также электронейтральный Na7H+ антипортер.

5. На основании собственных расчетов и данных из литературных источников постулируется центральная роль Ыа+-транспортирующих АТФаз плазматической мембраны галотолерантных водорослей в Na+-гомеостатировании цитоплазмы в естественных условиях обитания этих организмов. Наличие №+-АТФазы в плазмалемме галотолерантных микроводорослей является биохимической адаптацией, позволяющей осуществлять экспорт Na+ из цитоплазмы в условиях высокой солености и одновременно щелочных pH среды. Функцией Н+-АТФазы у галотолерантных микроводорослей, как и у высших растений-гликофитов, является участие в рН-статировании цитоплазмы.

6. Na+/H+ антипортер не вовлечен в экспорт Na+ из клеток галотолерантных микроводорослей в естественных условиях обитания этих организмов, а является, по-видимому, частью системы рН-статирования цитоплазмы. Важной функцией Na+/H+ антипортера в клетках галотолерантных микроводорослей является также участие в регуляции клеточного объема при осмотическом сжатии клеток в момент гиперосмотического солевого шока.

7. Кажущаяся молекулярная масса Ма+-АТФазы Т. viridis, определенная как масса фосфорилированного интермедиата, образование которого в ходе каталитического цикла является характерной чертой АТФаз Р-типа, составляет около 100 кДа, что соответствует молекулярным массам фосфоинтермедиатов других АТФаз Р-типа

8. Сравнительный анализ транспортных функций №+-АТФазы и Н+-АТФазы Т. viridis показал, что эти ферменты существенно различаются по ряду характеристик. Они имеют разные рН-оптимумы, различаются по отношению к ингибиторам и по некоторым кинетическим параметрам. На основании этих данных предложена модель быстрой регуляции активностей Ыа+-АТФазы и Н+-АТФазы галотолерантных микроводорослей факторами цитоплазматического окружения (pH, концентрации Na+, Mg2+ и АТФ) в момент гиперосмотического солевого шока.

9. На основании данных, полученных при исследовании транспортных функций №+-АТФазы водоросли Т. viridis, выращенной при разных концентрациях NaCI, предложена гипотеза о функционирование двух изоформ №+-АТФазы (с высоким и низким сродством к Na+) в плазматической мембране этого организма. Изоформа, характеризующаяся высоким сродством к Na+, является конститутивной и ингибируется высокими концентрациями этого иона. Изоформа с низким сродством к Na+ является индуцибельной и обнаруживается в плазматической мембране Т. viridis, адаптированной к высоким концентрациям NaCI. Предложена математическая модель, описывающая функционирование этих изоформ.

Основные работы, опубликованные по материалам диссертации.

1. Balnokin Yu.V., Popova L.G., Myasoedov N.A. The ATPase activity of the plasma membrane of marine unicellular alga Piatymonas viridis. II 19th Aharon Katzir-Katchalsky Conference "Plant Bioenergetics and Ion Translocation", Satellite to the 15,h International Congress of Biochemistry (Rehovot, Israel, 1991). Book of abstracts, p. 2.

2. Попова Jl.Г., Белов А.П., Лапушкин Е.В., Мясоедов Н.А., Балнокин Ю.В. Характеристика АТФазной активности плазматической мембраны морской водоросли Piatymonas viridis. II Доклады Академии Наук СССР, 1991, 317: 251 - 256.

3. Popova L., Balnokin Yu.V. H+-translocating ATPase and Na*/H* antiporter in plasmalemma of marine microalga Piatymonas viridis. II 8th Congress of FESPP, Abstr., Physiologia Plantarum, 1992, 85 (part 2): p. A15.

4. Popova L.G. and Balnokin Y.V. ^-translocating ATPase and NaVH* antiport activities in the plasma membrane of the marine alga Piatymonas viridis. II FEBS Lett., 1992, 309: 333 -336.

5. Popova L.G., Myasoedov N.A. and Balnokin Yu.V. Plasma membrane ATPase of marine unicellular alga Piatymonas viridis. // Plant Physiol Biochem., 1993, 31: 159 - 168.

6. Balnokin Y.V. and Popova L.G. The ATP-driven Na*-pump in the plasma membrane of marine unicellular alga, Piatymonas viridis.il FEBS Lett., 1994, 343: 61 - 64.

7. Balnokin Y., Popova L. and Gimmler H. Further evidence for an ATP-driven sodium pump in the marine alga Tetraselmis (Piatymonas) viridis. II J. Plant Physiol., 1997,150: 264 -270.

8. Popova L., Dietz K.-J., Gimmler H. Identification of the catalytic unit of the plasma membrane Na'-ATPase from the marine alga Tetraselmis (Piatymonas) viridis. II 11th Workshop on Plant Membrane Biology (Cambridge, UK, 1998). Book of abstracts, p. 14.

9. Popova L., Balnokin Y., Dietz K.-J. and Gimmler H. Na+-ATPase from the plasma membrane of the marine alga Tetraselmis (Platymonas) viridis forms a phosphorylated intermediate. // FEBS Lett., 1998, 426: 161 - 164.

10. Popova L., Balnokin Y., Dietz K.-J. and Gimmler H. Characterisation of phosphorylated intermediates synthesised during the catalytic cycle of the sodium adenosine triphosphatase in the plasma membrane of the marine unicellular alga Tetraselmis (Platymonas) viridis. II J. Plant Physiol., 1999,155: 302 - 309.

11. Balnokin Yu. V., Popova L. G. and Andreev I. M. Electrogenicity of the Na*-ATPase from the marine microalga Tetraselmis (Platymonas) viridis and associated H* countertransport. // FEBS Lett., 1999,462: 402 - 406.

12. Пагис Л.Я., Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. НГ-АТФаза и NaWTOaaa плазмалеммы морской микроводоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis: свойства и регуляция транспортных функций. // IV Съезд Общества Физиологов Растений России (Москва, 1999). Тезисы докладов, т. I, с. 435.

13. Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. Ыа'-транспортирующая АТФаза плазматической мембраны галотолерантных микроводорослей. // IV Съезд Общества Физиологов Растений России (Москва, 1999). Тезисы докладов, т. I, с. 446.

14. Шумкова Г.А., Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. Na'-стимулируемая АТФ-зависимая электрогенная активность в плазматической мембране галотолерантной микроводоросли Dunaliella maritime. II IV Съезд Общества Физиологов Растений России (Москва, 1999). Тезисы докладов, т. I, с. 502.

15. Шумкова Г.А., Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. Экспорт Na* из клеток галотолерантной микроводоросли Dunaliella maritime: Na*/H* антипортер или первичный Na*-Hacoc? II Биохимия, 2000, 65: 1080-1087.

16. Попова Л.Г., Шумкова Г.А., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. |\1а*-зависимая электрогенная АТФаза плазматической мембраны галотолерантной микроводоросли Dunaliella maritime. II Докл. Акад. Наук, 2000, 375: 544 - 548.

17. Пагис Л.Я., Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. Ионная специфичность Na+-транспортирующих систем в плазматической мембране галотолерантной водоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis Rouch. II Физиол. раст., 2001, 48: 334 - 340.

18. Стриж И.Г., Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. Ыа'-транспортирующая АТФаза плазматической мембраны галотолерантной микроводоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis: частичная очистка и электрофоретическая характеристика. // 5-я Пущинская конференция молодых ученых (Пущино, 2001). Тезисы докладов, с. 181 - 182.

19. Balnokin Y.V., Pagis L.Y., Popova L.G., Andreev I.M. Transport ATPases of halotolerant microalga Tetraselmis viridis and regulation of their activities.// International symposium "Signalling systems of plant cells" (Moscow, 2001). Book of abstracts, p. 12.

20. Pagis L., Popova L., Andreev I., Balnokin Y. H+-ATPase and Na'-ATPase from marine unicellular alga Tetraselmis viridis regulated by Mg2\ ATP and pH. // 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (Lisbon, Portugal, 2001). Eur. J. Biochem., 2001,268, Suppl. 1: 198- 199.

21. Strizh I.G., Popova L.G., Andreev I.M., Balnokin Y.V. Study of Na'-transporting ATPase from marine alga Tetraselmis (Platymonas) viridis during adaptation to different salinity. II 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (Lisbon, Portugal, 2001). Eur. J. Biochem., 2001, 268, Suppl. 1: 237 - 238.

22. Strizh I.G., Popova L.G., Andreev I.M., Balnokin Y.V. The kinetics study of NaMransporting ATPase from marine unicellular alga Tetraselmis (Platymonas) viridis under salinity adaptation. // The 12lh International Workshop on Plant Membrane Biology (Madison, USA, 2001). Book of abstracts, p. 131.

23. Popova L., Shumkova G., Andreev I., Balnokin Y. Primary Na+-pump in the plasma membrane of the halotolerant alga Dunaliella maritima. II The 12"1 International Workshop on Plant Membrane Biology (Madison, USA, 2001). Book of abstracts, p. 149.

24. Balnokin Y., Popova L., Pagis L., Andreev I. Coupling of Na+ and H+ fluxes is an intrinsic property of NaMransporting ATPase from the marine alga Tetraselmis viridis. II The 12th International Workshop on Plant Membrane Biology (Madison, USA, 2001). Book of abstracts, p. 135.

25. Popova L.G., Pagis L.Y., Strizh I.G., Shumkova G.A., Andreev I.M., Balnokin Y.V. Sodium pumps in salt tolerant algae: new members of P-type ATPase family. // International symposium "Plant under environmental stress" (Moscow, 2001). Book of abstracts, p. 228 -229.

26. Strizh I.G., Popova L.G., Balnokin Y.V. Plasma membrane proteins associated with salt adaptation in halotolerant green alga Tetraselmis (Platymonas) viridis. II International symposium "Plant under environmental stress" (Moscow, 2001). Book of abstracts, p. 281 -282.

27. Стриж И.Г., Попова Л.Г., Бапнокин Ю.В. Модельные системы для изучения механизмов солеустойчивости растений на клеточном уровне. // В сб. "Ботанические проблемы регионального природопользования". Рязань, 2001. С. 74 - 76.

28. Стриж И.Г., Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. Изучение солеиндуцированных изменений в спектре белков плазматической мембраны морской микроводоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis. И Труды международной научной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001). С. 254 - 256.

29. Пагис Л.Я., Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. Механизм работы №*-АТФазы морской одноклеточной водоросли Tetraselmis viridis. И III Съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002). Тезисы докладов, с. 98 - 99.

30. Шумкова Г.А., Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. Протонный и натриевый насосы в плазматической мембране галотолерантной водоросли Dunaliella maritime Massjuk. II II! Съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002). Тезисы докладов, с. 127.

31. Стриж И.Г., Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. О возможности изменения кинетических характеристик 1Ма+-АТФазы микроводоросли Tetraselmis viridis при адаптации ее к различным концентрациям NaCI. II Доклады Академии Наук, 2002, 383: 120-123.

32. Balnokin Y.V., Popova L.G., Pagis L.Y. and Andreev I.M. Na*-ATPase from marine unicellular alga Tetraselmis viridis as a possible tool for improving salinity tolerance of higher plants. // Proceedings of VI Symposium Hispano Portuges "Relaciones Hidricas en las Plantas". (Pamplona, Portugal, 2002). P. 133-137.

33. Pagis L.Y., Popova L.G., Andreev I.M. and Balnokin Y.V. (2003) Comparative characterisation of the two primary pumps, ЬГ-ATPase and Na*-ATPase, in the plasma membrane of the marine alga Tetraselmis viridis. II Physiologia Plantarum, 2003,118: 514 -522.

34. Попова Л.Г., Пагис Л.Я., Шумкова Г.А., Балнокин Ю.В. Na'-АТФазы галотолерантных микроводорослей. // V Съезд Общества Физиологов Растений России (Пенза, 2003). Тезисы докладов, с. 321 - 322.

35. Попова Л.Г., Шумкова Г.А., Балнокин Ю.В. Функциональная идентификация первичного Ыа'-насоса в плазматической мембране галотолерантной водоросли Dunaliella maritime. II V Съезд Общества Физиологов Растений России (Пенза, 2003). Тезисы докладов, с. 322 - 323.

36. Стриж И.Г., Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. Влияние кратковременного солевого шока на №+-транспортирующую АТФазу плазматической мембраны микроводоросли Tetraselmis viridis. И V Съезд Общества Физиологов Растений России (Пенза, 2003). Тезисы докладов, с. 340.

37. Balnokin Y.V., Popova L.G., Pagis L.Y. and Andreev I.M. The NaMranslocating ATPase in the plasma membrane of the marine microalga Tetraselmis viridis catalyzes a Na7t~T exchange. // Planta, 2004, 219: 332 - 337.

38. Стриж И.Г., Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. Физиологические аспекты адаптации морской микроводоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis к различной солености среды. Н Физиол. Раст., 2004, 51: 197-204.

39. Popova L., Pagis L., Shumkova G., Andreev I., Balnokin Y. Characterization of the Na*-translocating ATPases from two marine microalga species, Tetraselmis viridis and Dunaliella maritima. II The 13lh International Workshop on Plant Membrane Biology (Montpellier, France, 2004). Book of abstracts, p. 226.

40. Балнокин Ю.В., Попова Л.Г. Na'-АТФэзы галотолерантных микроводорослей и Na*-гомеостаз. II Материалы Всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004). С. 11 - 15.

41.Popova L.G., Shumkova G.A., Andreev I.M., Balnokin Y.V. Functional identification of electrogenic NaMranslocating ATPase in the plasma membrane of the halotolerant microalga Dunaliella maritima. H FEBS Lett., 2005, 579: 5002 - 5006.

42. Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. Механизмы №*-гомеостатирования у галотолерантных микроводорослей. II Материалы Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006). С. 98 -99.

43. Попова Л.Г., Корнилова А.Г., Шумкова Г.А., .Андреев И.М, Балнокин Ю.В. Na*-транспортирующая АТФаза в плазматической мембране галотолерантной микроводоросли Dunaliella maritima катализирует Na^-унипорт. // Физиол. раст., 2006, 53: 1-8.

Зак. 452_Тир. 100

Филиал ФГУП Издательство «Известия» УД П РФ - Спецпроизводство

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Попова, Лариса Геннадьевна

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Активный транспорт ионов Na+ через биологические мембраны

1.1.1. Первичные Na+-nomnbi у представителей различных 17 систематических групп

1.1.1.1. Первичные Ыа+-помпы у представителей царства Bacteria

Na+-транслоцирующие декарбоксилазы

Na+-транслоцирующие NADH.xuhoh оксидоредуктазы (NQR)

Na+-зависимые FiFo-АТФазы

Na*-транслоцирующие АТФазы V-muna

Na+-транслоцирующая А ТФаза Р-типа

Na+-транспортеры АВС-типа

1.1.1.2. Первичные Ыа+-помпы у представителей царства Archaea

Na*-транслоцирующие метилтрансферазы метаногенных бактерий

Na+-зависимые АТФ-синтазы

1.1.1.3. Первичные Иа+-помпы эукариот

Na+,lC-АТФаза клеток животных (царство Animalia)

Na+-A ТФаза клеток животных (царство Animalia)

Na+-A ТФаза дрожжей (царство Fungi)

Na+-A ТФаза морских микроводорослей - представителей царства 30 Chromista

Na+-А ТФаза мхов (царство Plantae)

У высших сосудистых растений первичные Na*-насосы не 32 обнаружены

1.1.2. Na+/H+ антипортер - универсальный механизм вторично- 33 активного транспорта

Na+/H+ антипортеры - гетерогенная группа мембранных белков

Пространственная структура Иа+/Н* антипортеров

Регуляция Ма+/Н+ антипортеров

Функции Ыа+/Н+ антипортеров

1.1.3. У одного и того же организма экспорт Иа+может 39 осуществляться как первично-активным (Ыа+-насос), так и вторично-активным (Ка+/Н+ антипортер) механизмом

1.2. Некоторые аспекты адаптации высших растений к повышенным 40 концентрациям ИаС

1.2.1. Возможные пути поступления Иа+ в цитоплазму растительной 42 клетки

Входные К*-каналы (К1ЯС или КАТ/АКТ)

Выходные К*-каналы (КОЯС)

Потенциал-независимые неселективные катионные каналы (ЫБСС 43 или У1С)

Низкоаффинные катионные переносчики (ЬСТ1)

Высокоаффинные 1С-переносчики: белки семейств К11Р/НАК и НКТ

1.2.2. Галофиты контролируют поступление Иа+ в растение

Ограничение проницаемости плазматической мембраны для ионов 49 Ыа+ у галофитов

Апопластный путь поступления Ыа+ в растение и анатомические 51 особенности строения корня у галофитов

1.2.3. Активный транспорт Иа+ из цитоплазмы растительной клетки: 52 Иа+/Н+ антипортеры плазмалеммы и тонопласта

Ыа+/Н¥ антипортер плазматической мембраны

Ыа+/Н* антипортер тонопласта

Ыа*7Н* антипортеры плазмалеммы и тонопласта в условиях 56 солевого стресса

Компартментация Ш+ в вакуоли и синтез осмолитов

1.2.4. РГ-АТФаза плазматической мембраны клеток растений 59 Н*-А ТФаза - представитель семейства А ТФаз Р-типа

Множественность изоформ ff-АТФазырастений

Различие свойств индивидуальных изоформ if-АТФазы

Регуляция активности If-A ТФазы

С-терминальный домен Н*-А ТФазы - мишень для регуляции 68 фермента

Регуляция hf-A ТФазы в условиях солевого стресса

1.3. Галотолерантные микроводоросли как промежуточное звено между 75 прокариотами и высшими растениями в эволюции систем транспорта Na+

1.3.1. Ионное гомеостатирование цитоплазмы у галотолерантных 77 микроводорослей

1.3.2. ЬГ-АТФаза в плазматической мембране микроводорослей

1.3.3. Na+/H+ антипортер плазматической мембраны микроводорослей

1.3.4. Отвечает ли Na+/H* антипортер за экспорт ионов Na+ из 82 цитоплазмы галотолерантных микроводорослей в естественных условиях обитания этих организмов?

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования и условия культивирования

2.2. Выделение плазматической мембраны из Tetraselmis viridis

2.3. Выделение плазматической мембраны из Dunaliella maritima

2.4. Мечение плазматических мембран Т. viridis и D. maritima 88 экзогенным маркером, 125Г

2.5. Регистрация активностей Na+ -АТФазы и ЬГ- АТФазы в 89 плазматической мембране микроводорослей

2.6. Регистрация фосфорилированного интермедиата Na+-ATOa3bi 92 Т. viridis

2.7. Аналитические методы

2.8. Другие методы

Глава 3. Н+-АТФаза и NaW АНТИПОРТЕР В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ (МОРСКИХ) МИКРОВОДОРОСЛЕЙ Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima.

3.1. Плазматическая мембрана микроводорослей: получение и 100 характеристика

3.1.1. Применение экзогенной метки, 1251, как маркера плазматической 100 мембраны микроводорослей

3.1.2. Плазматическая мембрана микроводоросли Т. viridis

3.1.3. Плазматическая мембрана микроводоросли D. maritima

3.2. АТФазная активность препаратов плазматической мембраны 110 Т. viridis u D. maritima pH-зависимость гидролиза АТФ

Влияние ингибиторов мембранных АТФаз на АТФазную активность 112 препаратов плазматической мембраны микроводорослей.

3.3. Функциональная идентификация протонной помпы (ЬГ-АТФазы) в 116 плазматической мембране Т. viridis и D. maritima

3.4. Na+/H+ антипортер в плазматической мембране Т. viridis и 119 D. maritima

3.5. Теоретическая оценка эффективности экспорта ионов Na+из клеток 121 галотолерантных микроводорослей посредством ДцН-зависимого Na+/H+ антипортера

Глава 4. Na+- АТФаза В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ: ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СВОЙСТВА.

4.1. АТФ-зависимая аккумуляция 22Na+ везикулами плазматической 125 мембраны Т. viridis и D. maritima

4.2. Ыа+-транспортирующая АТФаза галотолерантных водорослей и 131 сопряженный транспорт ионов Н+

4.2.1. Na+- АТФаза Т. viridis осуществляет электрогенный Na+/H+ обмен

4.2.2. Na+-АТФаза D. maritima осуществляет транслокацию ионов Na+ 143 через мембрану по унипортерному механизму

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДВУХ ИОННЫХ НАСОСОВ, Н*-АТФазы и Na'-АТФэзы, ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ в ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ.

5.1. Ыа+-АТФазы Т. viridis и D. maritima как возможные участники 149 системы рН-статирования в клетках этих водорослей

5.2. Ыа+-АТФаза и Ыа+-гомеостаз. Зависимость активностей Na+- 152 АТФаз Т. viridis и D. maritima от концентрации ионов Na+

5.3 Влияние свободных Mg и АТФ на активности двух АТФаз в ПМ

Т. viridis

5.4. Зависимость активностей Н^-АТФазы и Ыа+-АТФазы Т. viridis от 157 концентрации комплекса

§АТФ

5.5. Влияние некоторых ингибиторов мембранных АТФаз на 159 активности ГГ-АТФазы и Ыа+-АТФазы Т. viridis

5.6. Различия в свойствах Н+-АТФазы и №+-АТФазы как основа для 162 быстрой регуляции этих ферментов в условиях гиперосмотического солевого шока

Глава 6. ФОСФОРИЛИРОВАННЫЙ ИНТЕРМЕДИАТ Na+- АТФазы

Tetraselmis viridis.

6.1. Фосфорилирование белков в препаратах плазматической 166 мембраны Т. viridis. Влияние ионного состава среды

6.2. Кинетика фосфорилирования белков

6.3. Влияние ортованадата на фосфорилирование белков

6.4. Химическая природа фосфат-белковых связей

6.5. Pulse-chase эксперименты

6.6. Белок 100 кД - фосфорилированный интермедиат Ыа+-АТФазы

Т. viridis

Глава 7. Ыа+-АТФаза И АДАПТАЦИЯ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

К СРЕДАМ РАЗЛИЧНОМ СОЛЕНОСТИ.

7.1. Регистрация фосфоинтермедиата Иа+-АТФазы в плазматической 180 мембране Т. viridis, адаптированной к средам различной солености

7.2. Функциональные характеристики №+-АТФазы Т. viridis, 181 адаптированной к средам различной солености

7.3. Кинетические модели предсказывают возможность существования, 183 по крайней мере, двух изоформ Ыа+-АТФазы Т. viridis

Введение Диссертация по биологии, на тему "Na+-АТФазы галотолерантных водорослей"

Ыа+-гомеостаз цитоплазмы является общим свойством всех организмов, независимо от их таксономической принадлежности. Исследование механизмов Ыа+-гомеостатирования у представителей разных систематических групп имеет фундаментальное значение и вносит вклад в установление путей эволюционного развития жизни на Земле.

Na+ в высоких концентрациях нарушает нормальную работу биополимеров и поэтому все живые клетки, независимо от таксономической принадлежности и условий обитания, поддерживают низкие концентрации этого иона в цитоплазме. Даже у галобактерий1 - единственных организмов, которые проявляют устойчивость к соли на молекулярном уровне и в клетках которых суммарные концентрации Na+ и К+ достигают, в зависимости от условий выращивания, 3 - 5 М [Brown, 1964; Ginzburg et al., 1971], ионный состав цитоплазмы отличается от ионного состава наружной среды. В то время как в наружной среде доминирующим катионом, как правило, является Na+, в клетках этих организмов в молярных концентрациях накапливается К+ (внутриклеточные концентрации К+ могут в несколько раз превышать концентрации Na4) [Lanyi, 1974; Oren, 1986; Oren et al., 1997; Oren et al., 2002].

Предполагается, что метаболическая токсичность Na+ в большой мере является результатом его способности конкурировать с К+ за места связывания в биополимерах, важных для клеточного функционирования. Следовательно, при высоком соотношении Na+:K+ многие ферментативные процессы в цитоплазме могут быть нарушены. В частности, нарушение процессов синтеза белка высокими концентрациями Na+ рассматривается как один из примеров токсического действия Na+ на клеточный метаболизм. Механизм синтеза белка

1 Здесь термином галобактерии мы объединяем две филогенетически не связанные группы микроорганизмов: экстремально галофильные археи, Halobacteriales, которые не способны расти при концентрациях NaCl менее 15-5-20% [Lanyi, 1974; Кашнер, 1981], и анаэробные галофильные бактерии, Haloanaerobiales [Oren, 1986; Oren et al., 1997]. требует высоких концентраций К+, который необходим для связывания тРНК с рибосомами; в этом процессе выступает в роли конкурента К+ [В1аЬа е1 а!., 2000].

Естественная среда обитания галотолерантных/галофильных организмов содержит в большей или меньшей концентрации ионы Ыа+. Градиент электрохимического потенциала Ыа+ направлен из наружной среды в цитоплазму и, соответственно, Ыа+ поступает в клетки этих организмов пассивно. Выведение из клеток должно осуществляться активно, с затратой метаболической энергии.

В ходе эволюции в клеточных мембранах организмов, обитающих в соленых средах, возникли многообразные ^^транспортирующие системы, осуществляющие активный (против градиента электрохимического потенциала) перенос этого иона через мембраны, ^-транспортирующие системы делятся на две группы по принципу своей энергизации. Одну группу составляют гетерогенные по своей первичной структуре белки, осуществляющие вторично-активный транспорт через мембраны в обмен на протон, - Ма+/Н+ антипортеры [Раёап е1 а1., 2001]. Ма+/Н+ антипортеры являются универсальным механизмом, т.е. они обнаруживаются в различных биологических мембранах и у организмов самого разного эволюционного происхождения. Экспорт из клеток посредством Ма+/Н+ антипортера осуществляется за счет энергии электрохимического градиента который создается на клеточных мембранах генераторами протонного градиента различной природы.

Другую группу составляют первично-активные механизмы транспорта - Ка+-помпы, непосредственно сопрягающие химические реакции превращения субстрата с транспортом ионов через мембрану.

Наиболее широко известной и хорошо изученной Ка+-помпой является открытая в 1957 г. Йенсом Скоу №+,К+-АТФаза животных клеток [вкои, 1957]. Этот фермент, используя энергию гидролиза АТФ, выводит ионы Ыа+ из клеток в обмен на ионы К+, а генерируемый при этом градиент электрохимического потенциала ионов Иа+ используется во вторично-активных процессах котранспорта различных веществ через клеточную мембрану.

Первичные Ыа+-помпы разнообразной природы найдены в плазматических мембранах представителей прокариотических царств, Bacteria и Archaea [Dimroth, 1997]. Это Ка+-транспортирующие декарбоксилазы и оксидоредуктазы бактерий, Ыа+-транспортирующие метилтрансферазы архебактерий, Na+-транспортирующие АТФазы различных типов, обнаруженные у бактерий и архей. Часто в плазматической мембране галотолерантного микроорганизма сосуществуют первичный Ыа+-насос и АцН-зависимый Na+/H+ антипортер [Скулачев, 1986; Dimroth, 1997].

Долгое время Ыа+,К+-АТФаза животных клеток оставалась единственным представителем Ыа+-транспортирующих ферментов, обнаруженных у эукариот. Однако в 90-е годы 20-го века Na+-ATOa3a была найдена у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schwanniomyces occidentalis [Наго et al., 1991; Bañuelos, Rodríguez-Navarro, 1998] и у морской микроводоросли Heterosigma akashiwo [Wada et al., 1989; Shono et al., 1995]. Отметим, что все обнаруженные у эукариот Ыа+-помпы являются АТФазами Р-типа.

Таким образом, к началу нашей работы первичные Ыа+-помпы были обнаружены у представителей большинства царств живого мира - Bacteria, Archaea, Chromistd1 (к этому царству относится микроводоросль Н. akashiwó), Fungi, Animalia, за исключением царства растений. Мы предприняли попытку восполнить этот пробел.

Объектами нашего интереса являются морские (галотолерантные) микроводоросли двух видов, Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima (царство Plantae, тип Prasinophyta) [Bisby et al., 2006; см. также электронный ресурс

2 В царство Chromista выделены организмы (преимущественно, окрашенные, хотя есть и бесцветные), обладающие рядом особенностей, которые не наблюдаются у представителей других эукариотических царств. У хромист цитоплазма окружена четырьмя мембранами; есть также особенности в строении флагелл, пластид и устройстве генетического аппарата [www//en.wikipedia.org]. Ранее фотосинтезирующие хромисты относили к растительному царству, а нефотосинтезирующие - к грибам и животным. Фотосинтезирующие хромисты имеют ряд принципиальных отличий от растений. Так, хромисты содержат хлорофилл с, а также и другие пигменты, которые не встречаются в растениях. В отличие от растений, хромисты не запасают энергию в форме крахмала.

Catalogue of Life: 2006 Annual Checklist, сайт http://annual.sp2000.org]. Естественной средой обитания этих организмов является морская вода, где концентрация NaCl составляет, в среднем, 0,5 М.

Установлено, что в цитоплазме галотолерантных водорослей концентрации ионов Na+ существенно (в 10-20 раз) ниже, чем концентрации этого иона в наружной среде [Балнокин, Медведев, 1984; Балнокин, Мазель, 1985]. Это предполагает существование механизмов откачки ионов Na+ из цитоплазмы галотолерантных водорослей. Необходимо отметить, что в клетках этих микроорганизмов отсутствует крупная центральная вакуоль, в связи с чем основную роль в поддержании ионного гомеостаза в цитоплазме играет плазматическая мембрана клетки и расположенные в ней ион-транспортирующие механизмы.

На основании данных по измерению внутриклеточных концентраций Na+, был выдвинут постулат о существовании в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей механизмов активного экспорта Na+, но вопрос о том, какие это механизмы, оставался открытым. К началу нашей работы существовали экспериментальные свидетельства тому, что в плазмалемме галотолерантных микроводорослей функционирует КГ-АТФаза (генератор протонного градиента на этой мембране) [Gimmler et al., 1989; Weiss et al., 1989; Smahel et al., 1990] и ДцН-зависимый Na+/H+ антипортер [Katz et al., 1986; 1989; 1991]. Последний рассматривался в качестве возможного механизма экспорта ионов Na+ из клеток в наружную среду.

Однако может ли ДцН-зависимый Na+/H+ антипортер быть эффективным регулятором содержания Na+ в цитоплазме у морских микроводорослей? В естественных условиях обитания этих организмов высокие концентрации соли (около 0.5 М NaCl) сочетаются со щелочной реакцией среды (рН около 8) [Виноградов, 1967]. Поскольку у водорослей рН цитоплазмы не выходит за пределы диапазона 7.1 - 7.9 [Денеш и др., 1977; Kirst, 1977; Goyal et al., 1987], т.е. более кислый, чем наружная среда, становится очевидным, что существуют термодинамические ограничения на экспорт Na+ из клеток посредством ДцН-зависимого Na+/H+ антипортера. Кроме того, ряд экспериментальных данных, полученных в исследованиях in vivo на галотолерантных водорослях, свидетельствовал о том, что экспорт Na+ из клеток этих организмов не вполне может быть описан в рамках работы вторично-энергизуемого механизма [Балнокин, Медведев, 1984; Katz et al., 1991; Whittington, Bisson, 1994; Kiegle, Bisson, 1996].

Исходя из вышеизложенного, мы пришли к гипотезе, что в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует первичный На+-транспортирующий насос. Мы предположили, что этот насос -АТФаза Р-типа, поскольку, как уже было сказано выше, все обнаруженные к настоящему времени у эукариотических организмов первичные Na+-noMnbi являются Ыа+-транспортирующими АТФазами Р-типа.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлось экспериментальное подтверждение гипотезы о функционировании в плазматической мембране морских (галотолерантных) микроводорослей первичной Иа+-помпы - На+-транспортирующей АТФазы, осуществляющей экспорт ионов Na+ из клеток в наружную среду.

Были поставлены и решены следующие задачи, определяемые целью работы:

1) Разработаны методы получения препаратов плазматической мембраны, находящейся в виде замкнутых везикул и сохраняющей в функционально-активном состоянии ион-транспортные системы, из двух видов галотолерантных микроводорослей, Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima.

2) На выделенных из Т. viridis и D. maritima везикулах плазматической мембраны продемонстрирован АТФ-зависимый транспорт ионов Na+ и получены доказательства его независимости от протон-движущей силы на мембране, т.е. у двух видов галотолерантных микроводорослей функционально идентифицирован первичный Ка+-транспортирующий механизм - Na+-АТФаза.

3) На выделенных везикулах плазматической мембраны галотолерантных водорослей продемонстрирован также АТФ-зависимый транспорт Н+, т.е. функционально идентифицирована Н+-АТФаза.

4) На выделенных везикулах плазматической мембраны из двух видов водорослей функционально идентифицирован NaVH* антипортер.

5) Исследованы свойства обнаруженных в плазматической мембране двух видов галотолерантных микроводорослей Иа+-АТФаз.

6) Исследованы свойства обнаруженных в плазматической мембране двух видов галотолерантных микроводорослей iT-АТФаз.

7) Проведен сравнительный анализ свойств двух помп, Иа+-АТФазы и Н+-АТФазы, функционирующих в плазматической мембране Т. viridis, как механизмов, ответственных за ионное гомеостатирование цитоплазмы у этого организма.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) В плазматической мембране галотолерантных (морских) микроводорослей, относящихся к растительному царству, функционирует первичная Ыа+-помпа -Ыа+-транспортирующая АТФаза Р-типа.

2) Наряду с первичной Иа+-помпой, Ыа+-транспортирующей АТФазой, в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует Н+-АТФаза - фермент, присутствие которого характерно для плазматических мембран растительных клеток.

3) В плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует также универсальный механизм транспорта Na+ - Na+/H+ антипортер.

4) В естественных условиях обитания галотолерантных микроводорослей экспорт Na+ из цитоплазмы в наружную среду осуществляет Na+-АТФаза, тогда как Na+/H+ антипортер не вовлечен в этот процесс, а является, по-видимому, частью системы рН-статирования цитоплазмы.

Научная новизна. Впервые в плазматической мембране галотолерантных организмов, относящихся к царству растений, функционально идентифицирована и охарактеризована помпа, осуществляющая первично-активный перенос ионов Na+ через эту мембрану, - Ыа+-транспортирующая

АТФаза. Na+-ATOa3bi обнаружены у двух видов морских микроводорослей -Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima (царство Plantae, тип Prasinophyta, класс Prasinophyceae). Найденные Na+-ATOa3bi являются новыми членами семейства Na+-ATOa3, описанных к настоящему времени у представителей домена Еисагуа (животных, грибов и мхов). Показано, что в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей наряду с Ыа+-АТФазой существует вторично-активный механизм переноса ионов Na+ через плазматическую мембрану -Na+/H+ антипортер, работа которого зависит от протон-движущей силы на мембране и сопряжена с работой протонной помпы, tT-АТФазы. Последняя также функционально идентифицирована в плазматической мембране указанных видов водорослей. На основании данных, полученных при исследовании транспорта ионов Na+ через плазмалемму интактных микроводорослей, а также теоретических расчетов, сделано заключение, что у галотолерантных микроводорослей в естественной среде обитания механизмом, отвечающим за Ыа+-гомеостатирование цитоплазмы, является Иа+-АТФаза, тогда как Na+/H+ антипортер является, по-видимому, частью системы рН-статирования клетки

Исследованы функциональные свойства обнаруженных Иа+-АТФаз, а также tT-АТФаз, и выявлена роль таких факторов цитоплазматического окружения как pH, концентрации ионов Na+ и Mg2+, концентрация АТФ в регуляции активности этих ферментов.

Определены механизмы работы двух Иа+-АТФаз. Показано, что Na+-АТФаза Т. viridis осуществляет электрогенный обмен Na+ на Н+ со стехиометрией mNaVnH*, где m>n. Ыа+-АТФаза D. maritima переносит только ионы Na+ и, соответственно, также является электрогенным ферментом.

Идентифицирован фосфорилированный интермедиат Иа+-АТФазы Т. viridis и определена его кажущаяся молекулярная масса. Исследованы закономерности процессов фосфорилирования и дефосфорилирования Na+-АТФазы Т. viridis в ходе каталитического цикла этого фермента.

На основании исследований транспортных функций Иа+-АТФазы Т. viridis предложены: (1) гипотеза, предполагающая функционирование, по крайней мере, двух изоформ этого фермента в плазматической мембране водоросли и (2) математическая модель, описывающая функционирование этих изоформ при адаптации данной водоросли к высоким концентрациям NaCl.

Предложена модель быстрой регуляции активностей Ыа+-АТФазы и Н*-АТФазы - ферментов, сосуществующих в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей, факторами цитоплазматического окружения (рН, концентрации Na+ и Mg2+, АТФ) при гиперосмотическом солевом шоке.

Научно-практическая ценность работы. Представленная работа является фундаментальным исследованием, раскрывающим механизмы адаптации одноклеточных галотолерантных эукариот - морских микроводорослей, относящихся к царству растений, к высокому содержанию солей в среде обитания. Полученные новые данные вносят вклад в современные представления о клеточных механизмах ионного гомеостатирования у галотолерантных организмов.

Материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в учебные пособия и лекционные курсы по физиологии солеустойчивости растений и физиологии растительной клетки на биологических факультетах высших учебных заведений.

Апробация работы. Результаты работы по теме диссертации были доложены или представлены на V Международном молодежном симпозиуме «Регуляция метаболизма в растениях» (София, 1991), на XV Международном биохимическом конгрессе (Реховот, 1991), на Втором съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1992), на Международном симпозиуме по физиологии, биохимии и генетике солеустойчивости растений (Ташкент, 1992), на VIII Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Антверпен, 1992), на 11-м Международном совещании по биологии мембран растительных клеток (Кембридж, 1998), на IV Съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), на Пятой Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2001), на 27-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Лиссабон, 2001), на 12-м

Международном семинаре "Plant membrane biology" (Москва, 2001), на Международном симпозиуме "Plant under environmental stress" (Москва, 2001), на Международном симпозиуме "Signalling systems of plant cells" (Москва, 2001), на II Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Москва, Дубна, 2001), на годичном собрании Общества физиологов растений России «Экспериментальная биология растений 2001» (Уфа, 2001), на Международной научной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001), на III Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на VI испано-португальском симпозиуме "Relaciones hidricas en la plantas" (Памплона, 2002), на 12-м Международном совещании по биологии мембран растительной клетки (Мэдисон, 2001), на V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), на XIII Международном совещании по биологии мембран растительной клетки (Монпелье, 2004), на Всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы, в том числе 21 статья в научных журналах и сборниках трудов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Попова, Лариса Геннадьевна

ВЫВОДЫ.

1. Впервые в плазматической мембране галотолерантных организмов, принадлежащих царству растений, функционально идентифицирована первичная Ыа+-помпа - Ыа+-транспортирующая АТФаза, осуществляющая экспорт ионов Na+ из клеток. №+-АТФазы обнаружены у двух видов морских микроводорослей, Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima (царство Plantae, тип Prasinophyta, класс Prasinophyceae), в экспериментах на выделенных из этих водорослей везикулярных препаратах плазматической мембраны.

2. Ыа+-АТФазы галотолерантных микроводорослей являются электрогенными ферментами и принадлежат семейству АТФаз Р-типа. Характерной особенностью Иа+-АТФаз галотолерантных микроводорослей является щелочной pH-оптимум функционирования.

3. Определен механизм работы двух Na+-АТФаз. Ыа+-АТФаза D. maritima осуществляет транслокацию ионов Na+ через мембрану по унипортерному механизму. Фермент Т. viridis, подобно ряду других катион-транслоцирующих АТФаз, является катион-обменной АТФазой и переносит Na+ через мембрану в обмен на Н* со стехиометрией mNaVntT, где ш>п.

4. Установлено, что в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует электрогенная протонная помпа, Н*-АТФаза Р-типа, близкая по своим характеристикам ЬГ-АТФазе плазматической мембраны высших растений, а также электронейтральный Na"1"/!!* антипортер.

5. На основании собственных расчетов и данных из литературных источников постулируется центральная роль Ыа+-транспортирующих АТФаз плазматической мембраны галотолерантных водорослей в Na+-гомеостатировании цитоплазмы в естественных условиях обитания этих организмов. Наличие Иа+-АТФазы в плазмалемме галотолерантных микроводорослей является биохимической адаптацией, позволяющей осуществлять экспорт Na+ из цитоплазмы в условиях высокой солености и одновременно щелочных pH среды. Функцией Н^-АТФазы у галотолерантных микроводорослей, как и у высших растений-гликофитов, является участие в рН-статировании цитоплазмы.

6. Na'TtT антипортер не вовлечен в экспорт Na+ из клеток галотолерантных ми!фоводорослей в естественных условиях обитания этих организмов, а является, по-видимому, частью системы рН-статирования цитоплазмы. Важной функцией Na+/H+ антипортера в клетках галотолерантных микроводорослей является также участие в регуляции клеточного объема при осмотическом сжатии клеток в момент гиперосмотического солевого шока.

7. Кажущаяся молекулярная масса Ыа+-АТФазы Т. viridis, определенная как масса фосфорилированного интермедиата, образование которого в ходе каталитического цикла является характерной чертой АТФаз Р-типа, составляет около ЮОкДа, что соответствует молекулярным массам фосфоинтермедиатов других АТФаз Р-типа

8. Сравнительный анализ транспортных функций Ыа+-АТФазы и Н+-АТФазы Т. viridis показал, что эти ферменты существенно различаются по ряду характеристик. Они имеют разные рН-оптимумы, различаются по отношению к ингибиторам и по некоторым кинетическим параметрам. На основании этих данных предложена модель быстрой регуляции активностей Ыа+-АТФазы и ЬГ-АТФазы галотолерантных микроводорослей факторами цитоплазматического окружения (pH, концентрации Na+, Mg2* и АТФ) в момент гиперосмотического солевого шока.

9. На основании данных, полученных при исследовании транспортных функций Ыа+-АТФазы водоросли Т. viridis, выращенной при разных концентрациях NaCl, предложена гипотеза о функционирование двух изоформ Ыа+-АТФазы (с высоким и низким сродством к Na+) в плазматической мембране этого организма. Изоформа, характеризующаяся высоким сродством к Na+, является конститутивной и ингибируется высокими концентрациями этого иона. Изоформа с низким сродством к Na+ является индуцибельной и обнаруживается в плазматической мембране

Т. viridis, адаптированной к высоким концентрациям NaCl. Предложена математическая модель, описывающая функционирование этих изоформ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Ыа+-гомеостаз является фундаментальным свойством всех живых организмов, независимо от их таксономической принадлежности, и поэтому вопрос о На+-транспортирующих системах имеет важное теоретическое и практическое значение. Выяснение механизмов Ма+-гомеостатирования у представителей разных систематических групп не только раскрывает пути эволюционного развития жизни на Земле, но и вносит существенный вклад в создание теоретической основы солеустойчивости растений. Знание этих механизмов позволит решить и практическую задачу - получать устойчивые урожаи сельскохозяйственных культур на засоленных почвах.

Согласно Рэйвену и Смиту [Raven and Smith, 1976], первым в эволюции появился протонный насос в связи с необходимостью регулировать внутриклеточный pH, имеющий тенденцию снижаться вследствие образования органических кислот в процессе клеточного метаболизма. Другая точка зрения [Maloney and Wilson, 1985; Rosen, 1986] заключается в том, что в отсутствие жесткой клеточной стенки внеклеточные соли и вода, поступающие в клетку через полупроницаемую мембрану должны вызывать набухание (учитывая наличие в клетке макромолекул, не проникающих через эту мембрану) и последующий лизис клеток. В этой ситуации Na+-Hacoc, выводящий Na+ из клеток, был бы первым решением проблемы до тех пор, пока не сформировалась клеточная стенка. Согласно этой модели, хемиосмотический цикл клеток животных, основанный на Na+ градиенте, был предшественником протонного цикла. Эта гипотеза учитывает тот общепринятый взгляд, что жизнь возникла в океане и первые примитивные клетки обитали в среде с высоким содержанием NaCl. Представляется логичным, что в этих условиях выброс Na+ из клеток был выбран как для регуляции клеточного объема, так и для энергизации клеточной мембраны. В процессе эволюции, с выходом жизни на сушу, животные, которые несли в себе частицу океана и клетки которых лишены клеточной стенки, сохранили древний хемиосмотический цикл Na+ для регуляции объема и энергизации клеточной мембраны. Соответственно, Na+ является существенным элементом в жизненном цикле животных. Na+ потерял свою актуальность для растений и грибов, у которых сформировалась жесткая клеточная стенка и которые при выходе на сушу попали в среду с низким содержанием Na+. У этих организмов определяющим стал Н+-цикл [Subbarao et al., 2003].

Вторая точка зрения представляется более привлекательной. Не вызывает сомнений, что системы первично-активного транспорта Na+ появились уже на самых ранних этапах эволюции. Ыа+-транспортирующие системы были необходимы древним прокариотическим организмам как для поддержания низких концентраций этого иона в цитоплазме, так и для осуществления процессов энергообеспечения клетки. У прокариот механизмы энергообеспечения локализованы в плазматической мембране и часто ассоциированы с поступлением Na+ в клетки из наружной среды. Вероятно, именно этим объясняется многообразие №+-транспортирующих систем (Глава 1), возникших в ходе эволюции у прокариот, обитающих в средах с высоким содержанием Na+.

Как уже было отмечено, с выходом на сушу растения попали в среду с низким содержанием Na+ и определяющим у этих организмов стал Н+-цикл. В настоящее время высшие сосудистые растения являются единственными представителями эукариот (за исключением представителей царства Protozoa), у которых первичные Na+-Hacocbi не обнаружены [Garciadeblas et al., 2001].

Последующая колонизация растениями зон земной суши с засоленными почвами и появление растений-галофитов связаны с развитием новых механизмов солеустойчивости у высших растений, обусловленных их многоклеточным строением и возникновением специализированных тканей и органов. Важной особенностью строения растительной клетки, которая позволила растениям обойтись имеющимся у них механизмом транспорта ионов Na+, ДцН-зависимым Na+/H+ антипортером, явилось наличие в растительной клетке крупной центральной вакуоли. Благодаря наличию последней и функционирующему в вакуолярной мембране Na+/H+ антипортеру, в надземных органах растений-галофитов депонируются значительные количества ионов Na+, вследствие чего возникает градиент водного потенциала в системе почва-кореньлист соответствующей направленности, позволяющий растению поглощать воду из засоленного субстрата [Балнокин и др., 2005а; 20056].

Микроводоросли, являющиеся объектами нашего исследования, Tetraselmis viridis и Dunaliella marítima, принадлежат царству растений (Plantae, тип Prasinophyta, класс Prasinophyceae, сем. Polyblepharidacea) [Catalogue of Life: 2006 Annual Checklist, http://annual.sp2000.org]. Проведенные нами исследования однозначно продемонстрировали наличие в плазматической мембране указанных микроводорослей Ыа+-транспортирующих АТФаз, относящихся к семейству АТФаз Р-типа. Идентификация этих ферментов была проведена на выделенных везикулах плазматической мембраны по их основной функции - трансмембранному переносу ионов Na+, не зависящему от градиента электрохимического потенциала Н*. О принадлежности АТФаз к семейству АТФаз Р-типа свидетельствовала чувствительность их к ортованадату -специфическому ингибитору АТФаз этого семейства. Наличие Иа+-АТФазы Р-типа в плазмалемме Т. viridis было показано также другим методом - по способности формировать фосфорилированный интермедиат, что является характерной чертой АТФаз этого семейства. Присутствие ионов Na+ было обязательным условием образования фосфоинтермедиата АТФазы Т. viridis. Существенно, что дефосфорилирования фосфоинтермедиата Ыа+-АТФазы Т. viridis не происходило под действием ионов К+, что указывает на отличие фермента Т. viridis от Ыа+,К+-АТФазы животных клеток. Регистрация фосфорилированного интермедиата Na+-АТФазы Т. viridis позволила определить кажущуюся молекулярную массу этого фермента (около 100 кД), которая близка значениям молекулярных масс других АТФаз Р-типа (Глава 6).

Найденные нами первичные Ыа+-помпы, Ыа+-АТФазы, у двух видов галотолерантных микроводорослей (вкупе с данными об обнаружении Na+-АТФазы Р-типа у мха Physcomitrella patens [Benito, Rodríguez-Navarro, 2003]) указывают на то, что эволюционные предшественники высших растений, включая примитивные наземные растения, имели первичные Na+-транспортирующие механизмы, которые были затем утрачены в ходе эволюции.

Исследование свойств Ыа+-транспортирующих АТФаз Т. viridis и D. maritima показало, что механизмы работы этих ферментов различны, хотя оба выполняют одну и ту же функцию экспорта Na+ из цитоплазмы клетки в наружную среду и оба являются электрогенными. Ыа+-АТФаза Т. viridis переносит Na+ через мембрану в обмен на протон, а №+-АТФаза D. maritima функционирует как унипортер, т.е. в ходе каталитического цикла переносит через мембрану ионы только одного вида, а именно, Na+.

В связи с тем, что, как нами показано, Ыа+-АТФаза водоросли Т. viridis обменивает Na+ на Н+, интересно привести некоторые данные из литературных источников, предполагающие наличие первично-энергизуемого Na+/H+ антипортера у бактерий. У Bacillus subtilis и у щелочелюбивого штамма Bacillus pseudoßrmus OF4 Na+/H+ обменная активность, кодируемая опероном тгр, была устойчива к действию протонного разобщителя [Ito et al., 2001]. На основании полученных данных авторы предположили, что Мгр система1 имеет возможность функционировать как вторично-, так и первично-энергизуемым способом. Аналогичные данные были получены и в ранних работах, посвященных исследованию №+-транспортирующих систем у Е. hirae. У этого организма также предполагалась зависящая от АТФ первично-энергизуемая транспортная система, осуществляющая обмен Na+ на Н* [Heefner, Harold, 1982]. Возможно, что первично-энергизуемый Na+/H+ обмен не является экстравагантным явлением в живых системах.

Ыа+-АТФазы, обнаруженные нами у Т. viridis и D. maritima, отличаются от других Ка+-транспортирующих АТФаз, найденных в настоящее время у разных представителей домена Еисагуа: Ыа+,К+-АТФазы животных клеток, Ыа+-АТФазы дрожжей, №+-АТФазы морской микроводоросли Heterosigma akashiwo, Na+-АТФазы мха Physcomitrellapatens. АТФаза животных клеток обменивает Na+ на

1 Мгр-система - тип катионТН* антипортера, широко распространенный у бактерий и архей. В отличие от других антипортеров, являющихся продуктом одного гена, Мгр-система функционирует как олигомер и кодируется опероном, состоящим из шести или семи генов. Не обнаруживается существенной гомологии между Mrp-белками и другими антипортерами [Swatz et al., 2005].

К+. Дрожжевой фермент не является высокоспецифичным по отношению к Na+ и с высокой эффективностью транспортирует ионы К+, в связи с чем дрожжевая Ыа+-транспортирующая АТФаза ENA рассматривается как низкоселективный механизм, осуществляющий транспорт щелочных катионов. Na+-ATOa3a P. patens гомологична дрожжевому ферменту. Na+-ATOa3a водоросли Н. akashiwo имеет существенно большую молекулярную массу (около 150 кД), чем определенная нами для фермента Т. viridis масса 100 кД, и близка по своим свойствам Na+,K+-ATOa3e клеток животных. Мы видим, что Ыа+-АТФазы эукариот разнообразны по своим характеристикам. На филогенетическом древе АТФаз Р-типа они формируют отдельную филогенетическую группу, близкую к Са2+-АТФазам [Axelsen, Palmgren, 1998] (Рис. 45) (очевидно, что №+-АТФазы, обнаруженные нами у Т. viridis и D. maritima, отсутствуют на этой схеме).

Рис. 45. Филогенетическое дерево клонированных АТФаз Р-типа (по Palmgren, 1998)

Встает вопрос о том, насколько широко №+-транспортирующие АТФазы могут бьггь распространены у галотолерантных микроводорослей, принадлежащих растительному царству. Мы можем предположить, что Na+-ATOa3bi присущи подобным эукариотическим микроорганизмам, подобно тому, как дрожжевые ENA АТФазы являются специфичными для представителей царства Fungi: эти ферменты были найдены во всех грибах (даже в солечувствительных штаммах), у которых только был предпринят поиск таких АТФаз [Benito et al., 2002]. Для того, чтобы с большей определенностью ответить на вопрос о распространенности №+-АТФаз у галотолерантных микроводорослей, необходимы дальнейшие исследования, посвященные идентификации гена этого фермента.

Мы продемонстрировали, что №+-транспортирующие АТФазы и у Т. viridis, и у D. maritima сосуществуют в плазматической мембране с Н*-АТФазой и Na+/H+антипортером. У галотолерантных высших растений эта система (Н^-АТФаза + Na+/H+антипортер) отвечает за поддержание Na+-гомеостаза в цитоплазматическом компартменте. Однако проведенные нами расчеты показали (Глава 3), что у галотолерантных микроводорослей в естественных условиях их обитания (высокие концентрации NaCl и слабощелочная среда) выброс Na+ из клеток посредством ДрН-зависимого Na+/H+антипортера не может быть осуществлен. В связи с этим, основной функцией Na+/H+антипортера у галотолерантных микроводорослей, по-видимому, является участие в рН-статировании цитоплазмы. Вовлечение Na+/H+антипортера в рН-статирование цитоплазмы хорошо установлено как для прокариот, так и для эукариот (справедливо для животных клеток) [Schlesinger et al., 1996; Orlowski, Grinstein, 1997; Pogorelov et al., 2003].

Еще одной важной функцией Na+/H+антипортера у галотолерантных микроводорослей является участие в быстром ответе клеток на гиперосмотический солевой шок, когда для предотвращения обезвоживания цитоплазмы и осмотического сжатия в клетку в массовом количестве поступают ионы Na+. Это поступление осуществляется не только через неспецифические для ионов Na+ пути в плазматической мембране, но и через Na+/H+антипортер

Katz et al., 1991; Balnokin et al., 1993]. Данные, полученные в исследованиях на дрожжах (чьи механизмы ионного транспорта находят свои аналоги в растительных клетках), также указывают на многозначную роль Na4/!!4 ангипортера у этих организмов. Предполагается, что у дрожжей Na4/!!4 антипортер участвует не только в выведении Na4 из клеток, но также и в осморегуляции [Blumwald et al., 2000].

Функцию экспорта Na4 из клеток морских микроводорослей в естественных условиях их обитания, сочетающих высокие концентрации NaCl со щелочной реакцией среды, выполняют №+-АТФазы. Интересно отметить, что у тех организмов, где найдена ^^транспортирующая АТФаза, наблюдается индукция этого фермента не только высокими концентрациями Na4, но также и защелачиванием среды. Это, например, показано для бактерии Е. hirae [Murata et al., 1996; Ikegami et al., 1999] и для дрожжей [ Almagro et al., 2001].

Все три белка плазмалеммы галотолерантных водорослей, о которых выше шла речь, т.е. Н4-АТФаза, Na4/!!4 антипортер и Na4-АТФаза, вовлечены в перенос Н4 через эту мембрану. Н4-АТФаза растительных клеток является важным элементом системы рН-статирования цитоплазмы, удаляя в наружную среду избыток протонов из цитоплазмы, являющийся результатом дыхательного метаболизма [Raven, 1985]. Не вызывает сомнения, что удаление Н4 из цитоплазмы Н^-АТФазой имеет важное значение также и для галотолерантных микроводорослей. Однако, эти организмы могут сталкиваться с ситуацией, когда цитоплазматические концентрации Н4 снижаются. В связи с этим, отметим, что наиболее ярким отличием Na4-noMn Т. viridis и D. maritima от протонных помп ПМ является щелочной оптимум функционирования. Соответственно, защелачивание цитоплазмы должно приводить к активации Na4-noMn. В частности, в условиях гиперосмотического солевого шока у галотолерантных водорослей наблюдается не только рост внутриклеточных концентраций Na4, но и защелачивание цитоплазмы [Goyal., 1987; Kuchitsu et al., 1989], которое происходит, вероятно, вследствие поступления Na4 в клетки через Na4/!!4 антипортер. В этих условиях, №4-транспортирующие АТФазы микроводорослей могут не только осуществлять №4-гомеостатирование, но и выступать как участники системы рН-статирования цитоплазмы у этих организмов. Здесь очевидна роль фермента Т. viridis, выводящего ионы Na+ из клеток в обмен на поступающий в клетки Н*. №+-АТФаза D. maritima, вероятно, способствует электрофоретическому току Н+ в клетки из окружающей среды, генерируя электрический потенциал на плазматической мембране (Глава 4).

В заключение хотелось бы упомянуть о возможности использования генов Ыа+-АТФаз, функционирующих в ПМ гал©толерантных водорослей, для создания солеустойчивых форм культурных растений. Проблема сельскохозяйственного производства на засоленных почвах может быть решена путем создания солеустойчивых сортов растений - как методами традиционной селекции, так и с помощью генно-инженерных технологий. В настоящее время рассматриваются следующие "мишени" в растительной клетке для вмешательства на молекулярном уровне с целью повышения солеустойчивости растений: механизмы ионного транспорта и компартментации ионов в растении, синтез осмолитов и осмопротекторов, защита от окислительного стресса [Bartlet, Nelson, 1994; Murghia et al., 1995; Bohnert, Jensen, 1998]. Структурные гены, кодирующие белки, ответственные за транспорт ионов (ион-транспортирующие АТФазы, ионные переносчики и каналы), представляются первыми кандидатами для генно-инженерных манипуляций. Такие свойства ионных транспортеров, как избирательность и способность регулироваться теми или иными факторами, могут рассматриваться как свойства, однозначно определяемые соответствующим геном. Следовательно, модификация этого гена методами генетической инженерии позволит регулировать ионные потоки и компартментацию ионов в клетке [Yeo, 1998]. Исследования в этом направлении сейчас успешно ведутся. Примером могут служить работы, выполненные на A. thaliana. Сверхэкспрессия ЬГ-АТФазы и/или Na+/H* антипортера ПМ или тонопласта приводила к более эффективному экспорту Na+ из цитоплазмы в экстрацеллюлярное пространство или вакуоль и этим повышало солеустойчивостъ растений [Apse et al., 1999; Shi et al., 2000]. Трансгенные растения, несущие ген Ыа+-АТФазы галотолерантных водорослей, экспрессия которого происходила бы в эпидермальных клетках и клетках коры корня, возможно, могли бы произрастать на почвах, в которых высокие концентрации соли сочетаются со щелочными значениями рН.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Попова, Лариса Геннадьевна, Москва

1. Абдуллаев АА, Семененко BE. (1974) Интенсивная культура Dunaliella salina Teod. и некоторые ее физиологические характеристики. // Физиол. Расг.,21: 1145- 1153.

2. Алешина Н.В., Балнокин Ю.В. (1984) Влияние NaCl на цитохромоксидазу, сукцинатдегидрогеназу и фумаразу галофильных водорослей Dunaliella in vitro. II Известия AHCCCP, сер. Биологическая, 5: 722 728.

3. Балнокин Ю.В. (1993) Ионный гомеостаз и осморегуляция у галотолерантных микроводорослей. // Физиол. Раст., 40: 567 576.

4. Балнокин Ю.В., Калашникова Т.С., Мазель Ю.Я. (1989) Барьерные свойства плазмалеммы при адаптации водоросли Chlorella pyrenoidosa к засолению. // Известия ТСХА, 6: 64-71.

5. Балнокин Ю.В., Мазель Ю.Я. (1985) Проницаемость плазматической мембраны галофильных водорослей Dunaliella для ионов натрия. // Физиол. Раст., 32: 33-41.

6. Балнокин Ю.В., Медведев A.B. (1980) Влияние ионов на транспортэлектронов в хлоропластах галофильных водорослей Dunaliella. II Физиол.1. Раст., 27:1229-1236.

7. Балнокин Ю.В., Медведев A.B. (1984) Транспорт Na+, К+ и Н* через плазмалемму К+-дефицитных клеток галофильной водоросли Dunaliella maritima. // Физиол. Раст., 31: 805 809.

8. Балнокин Ю.В., Мясоедов H.A., Шамсутдинов З.Ш., Шамсутдинов Н.З. (20056) Роль Na+ и К+ в поддержании оводненности тканей органов галофитов сем. Chenopodiaceae различных экологических групп. // Физиол. Раст., 52: 882 890.

9. Богачев A.B., Верховский М.И. (2005) №+-транслоцирующие NADH:xhhoh оксидоредуктазы: достижения и перспективы исследований. //Биохимия, 70:177- 185.

10. Болдырев A.A., Мельгунов В.И. (1985) Транспортные АТФазы. // Сб.: Итоги науки и техники, сер. Биофизика, т. 17. М.: ВИНИТИ, 245 с.

11. Боулинг Д.Ж.Ш., Туркина М.В., Красавина М.С., Крючешникова A.JI. (1972) Ка+,К+-активируемая АТФаза проводящих тканей. // Физиол. Раст., 19:968-977.

12. Вассер СП, Кондратьева НВ, Масюк НП. (1989) Водоросли. // Киев: Наукова думка, 489с.

13. Виноградов А.П. (1967) Введение в биохимию океана. // М.: Наука, 378с.

14. Владимирова МГ, Барцевич ЕД, Жолдаков МА, Епифанова ОО,

15. Воробьев Л.Н., Федулов Ю.П., Хитров Ю.А. (1974) Солеустойчивость растительных клеток и проницаемость их мембранной системы. // В сб.: Физиология и биохимия солеустойчивости растений. Алма-Ата, с. 49 51.

16. Денеш М., Андрианов В.К., Булычев А.А., Курелла Г.А. (1977) Действие разобщителя карбонилцианидфенилгидразона на мембранные потенциалы и величину рН вакуолярного сока клеток Nitella. Косвенное определение рН цитоплазмы. // Физиол. Раст., 24: 528 533.

17. Диксон М., Уэбб Э. (1982) Ферменты. Т. 1,2. // М.: Мир. 806 С.

18. Кашнер Д. (1981) Жизнь микробов в экстремальных условиях. // М.: Мир, с. 365-425.

19. Кометиани З.П., Векуа И.Г. (1988) Кинетика мембранных транспортных ферментов. // М.: Высшая школа. 112 с.

20. Красавина М.С., Выскребенцева Э.И. (1971) О некоторых свойствах АТФазы растительных тканей. // Физиол. Раст., 18: 575 581.

21. Красавина М.С., Выскребенцева Э.И. (1972) АТФазная активность и транспорт калия и натрия в тканях корня. // Физиол. раст., 19:978 983.

22. Курганов Б.И. (1978) Аллостерические ферменты. // М.: Наука, 248 с.

23. Куркова Е.Б., Балнокин Ю.В., Мясоедов Н.А. (1992) Некоторые особенности ультраструюуры клеток и накопление Na+ и СГ в тканях галофита Petrosimonia triandra. I ! Физиол. Раст., 39: 32-38.

24. Мишустина Н.Е., Тихая Н.И., Чаплыгина Н.С. (1979) (Иа^К^АТФазная активность изолированных мембран побегов галофита Halocnemum strobilaceum. II Физиол. Раст., 26: 541 547.

25. Нобел П. (1973) Физиология растительной клетки. // М.: Мир, 288с.

26. Пагис ЛЯ., Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокин Ю.В. (2001) Ионная специфичность Ка+-транспортирующих систем в плазматической мембране галотолерантной водоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis Rouch. II Физиол. раст., 48: 334 340.

27. Скулачев В.П. (1986) Натриевая энергетика живых систем. // Биологические мембраны, 3: 5 -25.

28. Скулачев В.П. (1989) Энергетика биологических мембран. // М.: Наука, 565с.

29. Стриж И.Г., Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. (2004) Физиологические аспекты адаптации морской микроводоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis к различной солености среды. // Физиол. Раст., 51:197-204.

30. Строгонов Б.П. (1962) Физиологические основы солеустойчивости растений. // М.: Изд-во АН СССР, 366с.

31. Тихая Н.И., Мишустина Н.Е., Куркова Е.Б., Вахмистров Д.Б., Самойлова С.А. (1976) Оуабаин-чувствительная (№+-К+)АТФазная активностьклеточных мембран, изолированных из корней ячменя. // Физиол. Раст., 23: 1197- 1206.

32. Хаббард А., Кон 3. (1979) Специфические метки для клеточных поверхностей. // В кн.: Биохимическое исследование мембран. Ред. Э. Мэдди, М.: Мир, с. 376 447.

33. Хочачка П., Сомеро Дж. (1977) Стратегия биохимической адаптации. // М.: Мир, с. 124- 136.

34. Шумкова Г.А., Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. (2000) Экспорт Na+ из клеток галотолерантной микроводоросли Dunaliella maritima\ NaVtT антипортер или первичный Na+-Hacoc? // Биохимия, 65:1080 1087.

35. Шумкова Г.А. (2001) Протонный и натриевый насосы в плазматической мембране галотолерантной водоросли Dunaliella maritima Massjuk. II Дисс. канд. биол. наук. Москва.

36. Allen G.J., Wyn Jones R.G., Leigh R.A. (1995) Sodium transport measured in plasma membrane vesicles isolated from wheat genotypes with different K+/Na+ discrimination traits. // Plant Cell Environ., 18: 105 115.

37. Almagro A., Prista C., Benito В., Lourero-Dias M.C., Ramos J. (2001) Cloning and expression of two genes coding for sodium pumps in the salt-tolerant yeast Debariomyces hansenii. //J.Bacteriol., 183:3251 3255.

38. Amtmann A., Laurie S., Leigh R.A., Sanders D. (1997) Multiple inward channels provide flexibility in Na+/K+ discrimination at the plasma membrane of barley suspension culture cells. // J. Exp. Bot., 48:481 497.

39. Amtmann A., and Sanders D. (1999) Mechanisms of Na+ uptake by plant cells. //Adv. Bot. Res., 29:75-112.

40. Amory A, Foury F, Goffeau A. (1980) The purified plasma membrane ATPase of the yeast Schizosaccharomyces pombe forms a phosphorylated intermediate. J. Biol. Chem. 255,9353 9357.

41. Anthon G.E., Spanswick R.M. (1986) Purification and properties of the tT-translocating ATPase from the plasma membrane of tomato roots. // Plant Physiol., 81:1080- 1085.

42. Apse M.P., Aharon G.S., Snedden W.A., Blumwald E. (1999) Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis. II Science, 285:1256-1258.

43. Aravind L., Galperin M.Y., Koonin E.V. (1998) The catalytic domain of the P-type ATPase has the haloacid dehalogenase fold. // Trends in Biochem. Sci., 23: 127-129.

44. Aronson P.S. (1985) Kinetic properties of the plasma membrane Na-H exchanger.// Annu. Rev. Physiol., 47: 545 560.

45. Arystarkhova E., Wetzel R.K., Asinovski N.K., Sweadner K.J. (1999) The □ subunit modulates Na+ and K+ affinity of the renal Na,K-ATPase. // J. Biol. Chem., 274: 33183-33185.

46. Ashraf M. (1994) Breeding for salinity tolerance in plants. // Critical reviews in plant sciences, 13: 17-42.

47. Atack J.R. (1995) Structure and mechanism of inositol monophosphatase. // FEBS Letters, 361: 1 -7.

48. Avruch J, Fairbanks G. (1972) Demonstration of a phosphopeptide intermediate in the Mg2+-dependent, Na+- and K+-stimulated adenosine triphosphatase reactions of the erythrocyte membrane. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69,1216- 1220.

49. Ayala F., O'Leary J.W., Schumaker K.S. Increased vacuolar and plasma membrane FT-ATPase activities in Salicornia bigelovii Torr. in response to NaCl. // J. Exp. Bot., 1996, v.47, n.294, p.25-32.

50. Axelsen K., Palmgren M.G. (1998) Evolution and substrate specificities in the P-type ATPase superfamily. // J. Mol. Evol., 46: 84 101.

51. Babakov A.V., Chelysheva V.V., Klychnikov O.I., Zorinyanz S.E., Trofimova M.S., De Boer A.H. (2000) Involvement of 14-3-3 proteins in the osmotic regulation of H4-ATPase in plant plasma membranes. // Planta, 211:446 448.

52. Bader H., Sen A.K., Post R.L. (1966) Isolation and characterization of a phosphorylated intermediate in the (Na++K+)system-dependent ATPase.// Biochim. Biophys. Acta 118,106 115.

53. Ball S.G. (2005) Eukaryotic microalgae genomics. The essence of being a plant. // Plant Physiol., 137: 397 398.

54. Bañuelos M.A., Quintero F.J., Rodríguez-Navarro A. (1995) Functional expression of the ENA1 (PMR2)-ATPase of Saccharomyces cerevisiae in Schizosaccharomyces pombe. // Biochim. Biophys. Acta, 1229: 233 238.

55. Bañuelos M.A., Rodríguez-Navarro A. (1998) P-type ATPases mediate sodium and potassium effluxes in Schwanniomyces occidentalis. II J. Biol. Chem., 273: 1640-1646.

56. Bañuelos M.A., Sychrov H., Bleykasten-Grosshans C., Souciet J.L., Potier S. (1998) The Nhal antiporter of Saccharomyces cerevisiae mediates sodium and potassium efflux. // Microbiology, 144: 2749 2758.

57. Barbier-Brygoo H., Vinauger M., Colcombet J., Ephritikhine G., Frachisse J.-M., Maurel C. (2000) Anion channels in higher plants: functional characterization? Molecular structure and physiological role. // Biochim Biophys. Acta, 1465:199-218.

58. Bardsley W.G., Childs R.E. (1975) Sigmoid curves, non-linear double-reciprocal plots and allosterism. // Biochem. J., 149:313 328.

59. Bardsley W.G, Leff P., Kavanagh J., Waight R.D. (1980) Deviations from Michaelis Menten kinetics. // Biochem. J., 187: 739 - 765.

60. Barkla B.J., Zingarelli L., Blumwald E., Smith J.A.C. (1995) Tonoplast Na+/H* antiporter activity and its energization by the vacuolar H^-ATPase in the halophytic plant Mesembryanthemum crystallinium L. // Plant Physiol., 109: 549-556.

61. Barr R., Sandelins A.S., Crane F.L., Morre D.J. (1986) Redox reactions of tonoplast and plasma membranes isolated from soybean hypocotyls by freeflow electrophoresis. // Biochim. Biophys. Acta, 852: 254 261.

62. Bashford CL, Chance B, Prince RC (1979) Oxonol dyes as monitors of membrane potential. Their behavior in photosynthetic bacteria. // Biochim. Biophys. Acta, 545:46 57.

63. Baxter R.M. (1959) An interpretation of the effects of salts on the lactix dehydrogenase of Halobacterium salinarium. I I Canad. J. Microbiol., 5: 47 -57.

64. Béguin P., Wang X., Firsov D., Puoti A., Claeys D., Horisberger J.D., Geering K. (1997) The □ subunit is a specific component of the Na,K-ATPase and modulates its transport function. // EMBO J., 16:4250 4260.

65. Becher B, Müller V, and Gottschalk G. (1992) The methyltetrahydromethanopterin -coenzyme M methyltransferase of Methanosarcina strain Gö 1 is a primary sodium pump. // FEMS Microbiol. Lett. 91:239-244.

66. Becher B, and Müller V. (1994) ApNa Drives the synthesis of ATP via an ApNa-translocating FiF0-ATP synthase in membrane vesicles of the archaeon Methanosarcina mazei Gö 1. // J. Bacterid. 176:2543 2550.

67. Belmans D., VanLaere A. (1987) Glycerol cycle enzymes and intermediates during adaptation of Dunaliella tertiolecta cells to hyperosmotic stress. // Plant Cell Environ., 10:185-190.

68. Ben-Amotz A., Avron M. (1972) Photosynthetic activities of the halophilic alga Dunaliella parva. II Plant Physiol., 49:240 246.

69. Benito B., Quintero F.J., Rodríguez-Navarro A. (1997) Overexpression of the sodium ATPase of Saccharomyces cerevisiae. Conditions for phosphorylation from ATP and P¡. // Biochim. Biophys. Acta, 1328: 214 226.

70. Benito B., Garciadeblas B., Rodríguez-Navarro A. (2000) Molecular cloning of the calcium and sodium ATPases in Neurospora crassa. II Mol. Microbiol., 35: 1079-1088.

71. Benito B., Garciadeblas B., Rodriguez-Navarro A. (2002) Potassium- or sodium-efflux ATPase, a key enzyme in the evolution of fungi. // Microbiology, 148:933-941.

72. Benito B., Rodriguez-Navarro A. (2003) Molecular cloning and characterization of a sodium-pump ATPase of the moss Physcomitrella patens. //Plant J., 36:382-389.

73. Bennett A.B., O'Neill S.D., Eilmann M. and Spanswick R.M. (1985) H4-ATPase activity from storage tissue of Beta vulgaris. III. Modulation of ATPase activity by reaction substrates and products. // Plant Physiol., 78: 495499.

74. Bhandal I.S., Malik C.P. (1988) Potassium estimation, uptake, and its role in the physiology and metabolism of flowering plants. // International review of cytology, 110:205-254.

75. Bisby F.A., Ruggiero MA, Roskov YR, Cachuela-Palacio M, Kimani SW, Kirk PM, Soulier-Perkins A and van Hertum J, eds (2006). Species 2000 & ITIS Catalogue of Life: 2006 Annual Checklist. CD-ROM; Species 2000: Reading, U.K.

76. Blatt M.R., Beilby M.J., Tester M. (1990) Voltage dependence of the Chara proton pump revealed by current-voltage measurement during rapid metabolic blockade with cyanide. // J. Membr. Biol., 114:205 23.

77. Blumwald E. (2000) Sodium transport and salt tolerance in plants. // Curr. Opin. Cell Biol., 12:431 -434.

78. Blumwald E., Poole R. (1985) Na+/H+ antiport in isolated tonoplast vesicles from storage tissue of Beta vulgaris. II Plant Physiol., 78:163 167.

79. Blumwald E., Poole R. (1987) Salt-tolerance in suspension cultures of sugar beet. I. Induction ofNa+/H+ antiport activity at the tonoplast by grown in salt. // Plant Physiol., 83:884-887.

80. Blumwald E., Aharon G.S., and Apse M.P. (2000) Sodium transport in plant cells. II Biochim. Biophys. Acta, 1465:140-151.

81. Borowitzka L.J., Brown A.D. (1974) The salt relations of marine and halophilic species of the unicellular green alga Dunaliella: The role of glycerol as a compartible solute. // Arch. Microbiol., 96: 37 52.

82. Bowman B.J., Slayman C.W. (1977) Characterization of plasma membrane adenosine triphosphatase of Neurospora crassa. II J. Biol. Chem., 252: 3357 -3363.

83. Bowman B.J., Slayman C.W. (1979) The effect of vanadate on the plasma membrane ATPase of Neurospora crassa. 11 J. Biol. Chem., 254:2928 2934.

84. Boyer J.S. (1982) Plant productivity and environment. // Science, 218: 443 -448.

85. Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 72:248 254.

86. Brauer D., Tu S.-I., Hsu A.-F., Thomas C.E. (1989) Kinetic analysis of proton transport by the vanadate-sensitive ATPase from maize root microsomes. // Plant Physiol., 89:464 471.

87. Brett C.L., Donowitz M., Rao R. (2005) Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288:223 239.

88. Briskin D.P. (1990) The plasma membrane iT-ATPase of higher plant cells: biochemistry and transport function. // Biochim. Biophys. Acta, 1019:95 109.

89. Briskin D.P., Leonard R.T. (1982) Phosphorylation of the adenosine triphosphatase in a deoxycholate-treated plasma membrane fraction from corn roots. // Plant Physiol., 70: 1459 1464.

90. Briskin D.P., Poole R.J. (1983) Plasma membrane ATPase of red beet forms a phosphorylated intermediate. // Plant Physiol. 71,507 512.

91. Briskin D.P., Reynolds-Niesman I. (1991) Determination of FT/ATP stoichiometry for the plasma membrane tT-ATPase from red beet {Beta vulgaris L.) storage tissue. // Plant Physiol. 95: 242 250.

92. Broun Y., Hassidim M., Lerner H.R., Reinhold L. (1988) Evidence for a Na+/H+ antiporter in membrane vesicle isolated from roots of the halophyte Atriplex nummularia. II Plant Physiol., 87:104 108.

93. Brown A.D. (1964) Aspects of bacterial response to the ionic environment. // Bacteriol. Revs., 28:296 329.

94. Brown A., and Simpson J. (1972) Water relations of sugar-tolerant yeasts: the role of intracellular polyols. // J. General Microbiol., 72: 589 591.

95. Briiggemann W., Janiesch P. (1987) Characterisation of plasma membrane H*-ATPase from salt tolerant and salt sensitive Plantago species. // J. Plant Physiology, 130:395-411.

96. Briiggemann W., Janiesch P. (1988) Properties of native and solubilized plasma membrane ATPase from the halophyte Plantago crassifolia, grown under saline and non-saline conditions. // Physiologia Plantarum,74:614-622.

97. Buckel W., Semmler R. (1982) A biotin-dependent sodium pump: CoA decarboxylase from Acidaminococcus fermentons. // FEBS Lett., 148:35-38.

98. Buckel W., Semmler R. (1983) Purification, characterization and reconstitution of glutaconyl-CoA decarboxylase, a biotin-dependent sodium pump from anaerobic bacteria. // Eur. J. Biochem., 136:427 434.

99. Campbell N., and Thomson W.W. (1975) Chloride localization in the leaf of Tamarix. Il Protoplasma, 83:1 8.

100. Campbell N., and Thomson W.W. (1976) The ultrastructural basis of chloride tolerance in the leaf of Frankenia. II Ann. Bot., 40: 687 693.

101. Caracuel Z., Casanova C., Roncero M.I., Di Pietro A., Ramos J. (2003) pH responce transcription factor PacC controls salt stress tolerance and expression of the P-type Na+-ATPase Enal in Fusarium oxysporum. // Eukaryot. Cell, 2: 1246-1252.

102. Carper SW, and Lancaster JR, Jr. (1986) An electrogenic sodium-translocating ATPase in Methanococcus voltae. IIFEBS Lett. 200: 177 -180.

103. Carter SG, Karl DW. (1982) Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. // J. Biochem. Biophys. Meth. 1:1 13.

104. Caruso-Neves C., Francisco-Pedro L.G., Souza L.P., Chagas C., Lopes A.G. (1997) Effect of adenosine on the ouabain-insensitive Na+-ATPase activity from basolateral membrane of the proximal tubule. // Biochim. Biophys. Acta, 1329:336-344.

105. Caruso-Neves C., Meyer-Fernandes J.R., Saad-Nehme J., Proverbio F., Marin R., Lopes A.G. (1998) Ouabain-insensitive Na+-ATPase activity of Malpighian tubules from Rhodnius prolixus. II Comparative Biochem. Physiol., 119B: 807 -811.

106. Caruso-Neves C., Siqueira A.S.E., Iso-Cohen G., Lopes A.G. (1999) Bradykinin modulates the ouabain-insensitive Na+-ATPase activity from basolateral membrane of the proximal tubule. // Biochim. Biophys. Acta, 1431: 483-491.

107. Caruso-Neves C., Lara L.S., Rangel L.B.A., Grossi A.L., Lopes A.G. (2000) Angiotensin (1-7) modulates the ouabain-insensitive Na+-ATPase activity from basolateral membrane of the proximal tubule. // Biochim. Biophys. Acta, 1467: 189-197.

108. Chanson A., Fichmann J., Spear D., Taiz L. (1985) Pyrophosphate-driven proton transport by microsomal membranes of corn coleoptiles. // Plant Physiol., 79: 159-164.

109. Chen Q., Boss W.F. (1990) Short-term treatment with cell wall degrading enzymes increases the activity of the inositol phospholipid kinases and the vanadate-sensitive ATPase of carrot cells. // Plant Physiol., 94:1820 1829.

110. Cheeseman J.M. (1982) Pump-leak sodium fluxes in low salt corn roots. // J. Membr. Biol., 70:157 -164.

111. Cheeseman J.M. (1988) Mechanisms of salinity tolerance in plants. // Plant Physiol., 87:547-550.

112. Cheffings C.M. (2001) Calcium channel activity of a plant glutamate receptor homologue. // 12th Int. Workshop Plant Membr. Biol., Madison, WI, USA, August, 2001.

113. Chen W, and Konisky J. (1993) Characterization of a membrane-associated ATPase from Methanococcus voltae, a methanogenic member of the Archaea. //J. Bacterid. 175: 5677 5682.

114. Cheng J., Guffanti A.A., Krulwich T.A. (1997) A two-gene ABC-type transport system that extrudes Na+ in Bacillus subtilis is induced by ethanol or protonophore. // Mol. Microbiol., 23:1107 1120.

115. Cid A, Vara F, Serrano R. (1987) Inhibition of the proton pumping ATPases of yeast and oat roots plasma membranes by dicyclohexylcarbodiimide. // Arch. Biochem. Biophys., 252:496 500.

116. Cleland W.W. (1970) Steady state kinetics. The enzymes, kinetics and mechanism. V. II. // Ed. Boyer P.D. Acad. Press, New York, p. 1 65.

117. Clement N.R., Gould J.M. (1981) Pyranine (8-hydroxy-1,3,6-pyrenetrisulfonate) as a probe of internal aqueous hydrogene ion concentration in phospholipid vesicles. // Biochem., 20:1534 -1538.

118. Clint G.M., McRobbie E.A.C. (1987) Sodium efflux from perfused giant algal cells.//Planta, 171:247-253.

119. Cornish-Bowden A. (1974) Simple graphical method for determining the inhibition constants of mixed, uncompetitive and non-competitive inhibitors. // Biochem. J., 137: 143 144.

120. Costa M.S. and de Meis L. (1996) Regulation of plasma membrane HT-ATPase from corn root by Mg2+ and pH. // Biochim. Biophys. Acta, 1279:214-218

121. Counillon L., Pouyssegur J. (2000) The expanding family of eukaryotic Na+/H+ exchangers. // J. Biol. Chem., 275:1 -4.

122. Crowe J.H., Hoekstra F.A., and Crowe L.M. (1992) Anhydrobiosis. // Annu. Rev. Physiol., 54: 579 599.

123. Cruz-Mireles R.M., Ortega-Blake I. (1991) Effect of Na3V04 on the P state of Nitella translucens. II Plant Physiol., 96: 91 97.

124. Dambly S., Boutry M. (2001) The two major plant plasma membrane HT-ATPases display different regulatory properties. // J. Biol. Chem., 276: 7017 — 7022.

125. Davenport R., James R.A., Zakrisson-Plogander A., Tester M., Munns R. (2005) Control of sodium transport in durum wheat. // Plant Physiol., 137: 807 -818.

126. Davenport R.J., Reid R.J., Smith F.A. (1997) Sodium-calcium interactions in two wheat species differing in salinity tolerance. // Physiol. Plant., 99: 323 -327.

127. Davenport R.J., Tester M. (2000) A weakly voltage-dependent nonselective cation channel mediate toxic sodium influx in wheat. // Plant Physiol., 122: 823 -834.

128. Day D.A., Wiskich J.T. (1975) Isolation and properties of the outer membrane of plant mitochondria. // Arch. Biochem. Biophys., 171: 117 123.

129. Degani C., Boyer P.D. (1973) A borohydride reduction method for characterization of the acyl phosphate linkage in proteins and its application to sarcoplasmic reticulum adenosine triphosphatase.// J. Biol. Chem. 248, 8222 -8226.

130. De Meis L., Vianna A.L. (1979) Energy interconversion by the Ca2+-dependent ATPase of the sarcoplasmic reticulum. // Annu. Rev. Biochem. 48,275 292.

131. Demidchik V., Tester M. (2002) Sodium fluxes through non-selective cation channels in the plasma membrane of protoplast from Arabidopsis thaliana roots. // Plant Physiol., 128: 379 387.

132. Demidchik V., Davenport R.J., Tester M. (2002) Nonselective cation channels. // Annu. Revs. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 53: 67 107.

133. Deppenmeier U., Blaut M., Mahlmann A., Gottschalk G. (1990) Reduced coenzyme F420: heterodisulfide oxidoreductase, a proton-translocating redox system in methanogenic bacteria. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9449 -9453.

134. Deppenmeier U., Miiller V., Gottschalk G. (1996) // Arch. Microbiol., 165: 149 -163.

135. Diatloff E„ Kumar R., Schachtmann D.P. (1998) Site directed mutagenesis reduced the Na+ affinity of HKT1, a Na+ energized high affinity K+ transporter. //FEBS Lett., 432: 31 -36.

136. Di Berardino M., Dimroth P. (1995) Synthesis of the oxaloacetate decarboxylase Na+ pump and its individual subunits in Escherichia coli and analysis of their function. // Eur. J. Biochem., 231: 790 801.

137. Dibrov P. (1991) The role of sodium ion transport in Escherichia coli energetics. // Biochim. Biophys. Acta 1056:209 224.

138. Dibrov P., Fliegel L. (1998) Comparative molecular analysis of Na*/!^ exchanger: a unified model for Na+/H* antiport? // FEBS Lett., 424:1 5.

139. Dibrov PA, Skulachev VP, Sokolov MV, Verkhovskaya ML. (1988) The ATP-driven primary Na+ pump in subcellular vesicles of Vibrio alginolyticus. // FEBS Lett., 233:355-358.

140. Dibrov P., Smith J.J., Young P., Fliegel L. (1997) Identification and localization of the sod2 gene product in fission yeast // FEBS Lett., 405: 119 -124.

141. Dickson D.M.S., Kirst G.O. (1986) The role of P-dimethylsulphoniopropionate, glycine betain and homarine in the osmoacclimation of Platymonas subcordiformis. //Planta, 167: 536-543.

142. Dimroth P. (1980) A new sodium-transport system energized by the decarboxylation of oxaloacetate. // FEBS Lett., 122:234 236.

143. Dimroth P. (1997) Primary sodium ion translocating enzymes. // Biochim. Biophys. Acta, 1318: 11-51.

144. Dimroth P., Hilbi H. (1997) Enzymic and genetic basis for bacterial growth on malonate. // Mol. Microbiol., 25: 3 10.

145. Dodd W.A., Pitman M.G., and West K.R. (1966) Sodium and potassium transport in the marine alga Chaetomorpha darwinii. II Austr. J. Biol. Sci., 19: 341-354.

146. Donnet C., Arystarkhova E., Sweadner K.J. (2001) Thermal denaturation of the Na,K-ATPase provides evidence for a-cç oligomeric interaction and y-subunit association with the C-terminal domain. // J. Biol. Chem. 276:7357 7365.

147. Doyle D.A., Cabrai J.M., Pfuetzner R.A., Kuo A., Gulbis J.M., Cohen S.L., Chait B.T., MacKinnon R. (1998) The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. // Science, 280:69 77.

148. DuPont F. (1992) Salt-induced changes in ion transport: regulation of primary pumps and secondary transporters. // In: D.Cooke, D.Clarkson, eds., Transport and Receptor Proteins of Plant Membranes. Plenum Press, New York, pp. 91 -100.

149. Dybas M, Konisky J. (1992) Energy transduction in the methanogen Methanococcus voltae is based on a sodium current. // J. Bacteriol. 174: 5575 -5583.

150. Ehrenfeld J., Cousin J.L. (1984) Ionic regulation of the unicellular green algae Dunaliella tertiolecta: response to hypertonic shock. // J. Membr. Biol., 77: 45 -55.

151. Epstein E. (1961) The essential role of calcium in selective cation transport by plant cells. // Plant Physiol., 36:437 444.

152. Epstein W., Laimins L.A. (1980) // Trends Biochem. Sci., 5:21- 23.

153. Epstein E., Rains D.W., Elzam O.E. (1963) Resolution of dual mechanism of potassium absorbtion by barley roots. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 49: 684 -692.

154. Fairbanks G., Avruch J. (1972) Four gel systems for electrophoretic fractionation of membrane proteins using ionic detergents. // J. Supramol. Struct. 21: 66-75.

155. Favournoux P., Noel J., Pouyssegur J. (1994) Evidence that Na+/H* exchanger isoforms NHE1 and NHE3 exist as stable dimmers in membranes with a high degree of specificity for homodimers. // J. Biol. Chem., 269:2589 2596.

156. Findley G.P., Tyerman S.D., Garrill A., and Skerrett M. (1994) Pump and K+ inward rectifiers in the plasmalemma of weat root protoplasts. // J.Membr.Biol., 139:103-116.

157. Flowers T.J., Troke P.F., and Yeo A.R. (1977) The mechanism of salt tolerance in halophytes. // Annu. Rev. Plant Physiol., 28: 89 121.

158. Flowers T.J., Yeo A.R. (1986) Ion relations of plantsunder drought and salinity. // Australian J. Plant Physiol., 13:75 91.

159. Fu H., Luan S. (1998) A dual affinity K+ transporter from Arabidopsis. II Plant Cell, 10: 63-73.

160. Fukuda A., Nakamura A., Tagiri A., Tanaka H., Miyao A., Hirochika H., Tanaka Y. (2004) Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+ antiporter from rice. // Plant Cell Physiol., 45: 149- 159.

161. Gallagher S.R., Leonard R.T. (1982) Effect of vanadate, molybdate, and azide on membrane-associated ATPase and soluble phosphatase activities of corn roots. // Plant Physiol., 70:1335 -1340.

162. Garbarino J., DuPont F.M. (1989) Rapid induction of Na+/H+ exchange activity inbarley root tonoplast. // Plant Physiol., 89: 1 -4.

163. Garciadeblas B., Benito B., Rodriguez-Navarro A. (2001) Plant cells express several stress calcium ATPases but apparently no sodium ATPase. // Plant Soil, 235:181 -192.

164. Gassmann W., Schroeder J.I. (1994) Inward-rectifying K+ channel currents in root hairs of weat: A mechanism for aluminium-sensitive low-affinity K+ uptake and membrane potential control. // Plant Physiol., 105:1399 1408.

165. Gassmann W., Rubio F., Schroeder J.I. (1996) Alkali cation selectivity of the weat root high-affinity potassium transporter HKT1. // Plant J., 10: 869 882.

166. Gaxiola R.A., Rao R., Sherman A., Grisafi P., Alper S.L., Fink R.G. (1999) The Arabidopsis thaliana proton transporter AtNhxl and Avpl can function in cation detoxification in yeast. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96:1480 1485.

167. Geering K., Meyer D.I., Paccolat M.P., Kraehenbuhl J.P., Rossier B.C. (1985) Membrane insertion of and G-subunits of Na+,K+-ATPase. // J. Biol. Chem., 260:5154-5160.

168. Gemperli A.C., Dimroth P., Steuber J. (2002) The respiratory complex I (NDH I) from Klebsiella pneumoniae, a sodium pump. // J. Biol. Chem., 277(37): 33811 -33817.

169. Gimmler H., Härtung W. (1988) Low permeability of the plasma memrane of Dunaliella parva for solutes. // J. Plant Physiol., 133: 165 172.

170. Gimmler H., Kugel H., Leibfritz H., Mayer A. (1988b) Cytoplasmic pH of Dunaliella parva and Dunaliella acidophyla as monitored by in vivo 31P-NMR spectroscopy and the DMO method. // Physiol. Plant., 74: 521 530.

171. Gimmler H., Schneider L., Kaaden R. (1989) The plasma membrane ATPase of Dunaliella parva. II Z.Naturforsch, 44c: 128 138.

172. Gimmler H., Weiss U., Weiss C., Kugel H„ Treffiny B. (1989) Dunaliella acidophyla (Kalina) Masyuk an alga with a positive membrane potential. // New Phytol., 113: 175-184.

173. Ginzburg M., Sach L., and Ginzburg B.Z. (1971) Ion methabolism in a halobacterium. 2. Ion concentration in cell at different levels of methabolism. // J.Membr. Biol., 5: 78-101.

174. Glenn E.P., Brown J.J., Blumwald E. (1999) Salt tolerance and crop potential of halophytes. // Critical Rev. Plant Sci., 18:227 255.

175. Glynn IM, Karlish S.(1975) The sodium pump. // Annu. Rev. Physiol. 37,13 -55.

176. Gobert A., Park G., Amtmann A., Sanders D., Maathuis F.J. (2006) Arabidopsis thaliana cyclic nucleotide gated channel 3 forms a non-selective ion transport involved in germination and ion transport // J. Exp. Bot., 57: 791 800.

177. Goijan A., Plemenitas A. (2006) Identification and characterization of ENA ATPases HwENAl and HwENA2 from the halophilic black yeast Hortaea wernwckii. //FEMS Microbiol. Lett., 265:41 50.

178. Goyal A., Brown A.D., Gimmler H. (1987) Regulation of salt-induced starch degradation in Dunaliella tertiolecta. II J. Plant Physiol., 129: 77 96.

179. Greenway H., and Osmond C.B. (1972) Salt responses of enzymes from species differing in salt tolerance. // Plant Physiol., 49:256 259.

180. Gutknecht J. (1966) Sodium, potassium, and chloride transport and membrane potential in Valonia ventricosa. //Biol. Bull., 13: 331 334.

181. Habbard A.L., Cohn Z.A. (1972) The enzymatic iodination of the red cell membrane. // J. Cell Biol. 55:390 411.

182. Hahnenberger K.M., Jia Z.-P., Fleigel L., Dibrov P.A., Hemmingsen S.M., Young P.G. (1995) Yeast 11 (sp. iss.), 437.

183. Hajibagheri M.A., and Flowers T.S. (1989) X-ray microanalysis of ion distribution within root cortical cells of the halophyte Suaeda marítima (L.) Dum//Planta, 177:131 -138.

184. Halfter U., Ishitani M., Zhu J.-K. (2000) The Arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:3735 3740.

185. Haro R., Garciadeblas B., Rodríguez-Navarro A. (1991) A novel P-type ATPase from yeast involved in sodium transport. // FEBS Lett., 291:189 191.

186. HSse C.C., Fedorova N.D., Galperin M.Y., Dibrov P.A. (2001) Sodium ion cycle in bacterial pathogens: evidence from cross-genome comparisons. // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65:353 370.

187. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.K., Bohnert H.J. (2000) Plant cellular and molecular responses to high salinity. // Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51:453-499.

188. Hassidim M., Braun Y., Lerner H.R., Reinhold L. (1990) NaVff and K+/H* antiport in root membrane vesicles isolated from the halophyte Atriplex and the glycophyte cotton. //Plant Physiol., 94:1795-1801.

189. Heefher D.L., Harold F.M. (1982) ATP-driven sodium pump in Streptococcus faecalis. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2798 2802.

190. Heise R, Miiller V, and Gottschalk. (1992) Presence of a sodium-translocating ATPase in membrane vesicles of the homoacetogenic bacterium Acetobacterium woodii. II Eur. J. Biochem. 206: 553 557.

191. Hertz K., Vimont S., Padan E., Bercher P. (2003) Roles of NhaA, NhaB and NhaD Na+/H+ antiporters in survival of Vibrio cholerae in a saline environment. // J. Bacteriol., 185:1236 -1244.

192. Hess W.M., Hanson D.J., and Weber D.J. (1975) Light and electron microscopy localization of chloride ions in cells of Salicorniapacifica var.utahensis. II Can. J. Bot., 53: 1176-1183.

193. Hilbi H., Dehning I., Schink B., Dimroth P. (1992) Malonate decarboxylase of Malonomonas rubra, a novel type of biotin-containing acetyl enzyme. // Eur. J. Biochem. 207:117-123.

194. Hilpert W., Dimroth P. (1982) Conversion of the chemical energy of methylmalonyl-CoA decarboxylation into a Na+ gradient. // Nature, 296: 584 -585.

195. Hilpert W., Dimroth P. (1983) Purification and characterization of a new sodium-transport decarboxylase. Methylmalonyl-CoA decarboxylase from Veillonella alcalescens. // Eur. J. Biochem., 132: 579 87.

196. Hilpert W., Dimroth P. (1983) Purification and characterization of a new sodium-transport decarboxylase. Methylmalonyl-CoA decarboxylase from Veilonella alcalencens. II Eur. J. Biochem., 132: 579 587.

197. Hilpert W., Schink B., Dimroth P. (1984) Life by a new dacaeboxylation-dependent energy conservation mechanism with Na+ as coupling ion. // EMBO J.,3:1665-1680.

198. Hobbs A.S., Albers R.W. (1980) The structure of protein involved in active transport. //Annu. Rev. Biophys. Bioenerg. 9,259 291.

199. Hodges T.K., Leonard R.T. (1974) Purification of a plasma membrane-bound adenosine triphosphatase from plant roots. // Meth. Enzymol. 32B: 392 406.

200. Honer zu Bentrup K., Ubbink-Kok T., Lolkema J.S., Konings W.N. (1997) An Na+-pumping Vi V0- ATPase complex in the thermophilic bacterium Clostridium fervidus. U J. Bacteriol., 179: 1274 1279.

201. Horie T., Schroeder J.I. (2004) Sodium transporters in plants. Diverse genes and physiological functions. //Plant Physiol., 136: 2457 2462.

202. Ikegami M., Kawano M., Takase K., Yamato I., Igarashi K., Kakinuma Y. (1999) Enterococcus hirae vacuolar ATPase is expressed in response to pH as well as sodium. // FEBS Lett., 454: 67 70.

203. Ikegami M., Takahashi H., Igarashi K., Kakinuma Y. (2000) Sodium ATPase and sodium/proton antiporter are not obligatory for sodium homeostasis of Enterococcus hirae at acidic pH. // Biosci. Biotechnol. Biochem., 64: 1088 -1092.

204. Ito M., Guffanti A., Krulwich T. (2001) Mrp-dependent NaTH* antiporters of Bacillus exhibit characteristics that are unanticipated for completely secondary active transporters. // FEBS Lett., 496:117 120.

205. Ivankina N.G., Novak V.A. (1988) Transplasmalemma redox reactions and ion transport in photosynthetic and heterotrophic plant cells. // Physiol. Plantarum, 73:161 -169.

206. Jacobsen T., and Adams R.M. (1958) Salt and silt in ancient Mesopotamian agriculture. // Science, 128:1251 1258.

207. Jeffrey S.W. (1972) Preparation and some properties of crystalline chlorophyll Ci and C2 from marine alga. // Biochim. Biophys. Acta 279: 15-33.

208. Jia Z.-P., McCullough N., Martel R., Hemmingsen S., Young P.G. (1992) Gene amplification at a locus encoding a putative Na+/H+ antiporter confers sodium and lithium tolerance in fission yeast. // EMBO J., 11:1631 1640.

209. Johnson M.K., Johnson E.J., MacElroy R.D., Speer H.G., and Bruff B.D. (1968) Effects of salt on the halophilic alga Dunaliella viridis. II J. Bacteriol., 95:1461 -1468.

210. Kaaden R., Gimmler H. (1989) The Ca2+ and Mg2+ dependent ATases of the endoplasmic reticulum of Dunaliella parva. II J. Plant Physiol., 133:678 685.

211. Kader M.A., Lindberg S. (2005) Uptake of sodium in protoplasts of saltsensitive and salt-tolerant cultivars of rice, Oryza sativa L. determined by the fluorescent dye SBFI. //J. Exp. Bot., 56: 3149 3158.

212. Kader M.A., Seidel T., Golldack D., Lindberg S. (2006) Expression of OsHKTl, OsHKT2 and OSVHA are differentially regulated under NaCl stress in salt-sensitive and salt-tolerant rice (Oryza sativa L.) cultivars. // J. Exp. Bot., 57:4257-4268.

213. Kaieda N., Wakagi T., Koyama N. (1998) Presence of Na+-stimulated V-type ATPase in the membrane of a facultatively anaerobic and halophilic alkaliphile.// FEMS Microbiol. Lett, 167: 57 61.

214. Kaim G. and Dimroth P. (1993) Formation of a functionally active sodium-translocating hybrid F.F0 ATPase in Escherichia coli by homologous recombination. // Eur. J. Biochem. 218: 937 944.

215. Kakinuma Y, Igarashi K. (1990) Mutants of Streptococcus faecalis sensitive to alkaline pH lack Na(+)-ATPase. // J. Bacterid., 172:1732 1735.

216. Kakinuma Y., Yamato I., Murata T. (1999) Structure and function of vacuolar Na+-translocating ATPase in Enterococcus hirae. II J. Bioenerg. Biomembr. 31: 7-14.

217. Kaplan A., Schriber U. (1977) A proton gradient in intact cells of Dunaliella salina. II Carnegie Inst. Year Book, 76:320 323.

218. Kaplan A., Schriber U. (1981) Light-induced proton gradient formation in intact cells of Dunaliella salina. II Plant Physiol., 68:236 239.

219. Kasamo K. (1986) Purification and properties of the plasma membrane H4-translocating adenosine triphosphatase of Phaseolus mungo L. roots. // Plant Physiol., 80:818-824.

220. Katz A., Kaback H.R., Avron M. (1986) Na+/H+ antiport in isolated plasma membrane vesicles from the halotolerant alga Dunaliella salina. IIFEBS Lett., 202:141 -144.

221. Katz DB, Sussman MR. (1987) Inhibition and labeling of the plant plasma membrane H^ATPase with N-ethylmaleimide. // Plant Physiol., 83: 977 981.

222. Katz A., Pick U., Avron M. (1989) Characterization and reconstitution of the Na+/H+ antiporter from the plasma membrane of the halotolerant alga Dunaliella. II Biochim. Biophys. Acta, 983:9 -14.

223. Katz A., Bental V., Degani H., Avron M. (1991) In vivo pH regulation by a Na+/H+ antiporter in the halotolerant alga Dunaliella salina. II Plant Physiol., 96:110-115.

224. Katz A., Kleyman T.R., Pick U. (1994) Utilization of amiloride analogs for characterization and labeling of the plasma membrane Na+/H+ antiporter from Dunaliella salina. // Biochemistry, 33:2389 2393.

225. Keifer D.W., Spanswick R.M. (1978) Activity of the electrogenic pump in Chara coralline as inferred from measurements of the membrane potential, conductance, and potassium permeability. // Plant Physiol., 62: 653 661.

226. Kiegle E.A., Bisson M.A. (1996) Plasma membrane Na+ transport in a salttolerant charophyte. I I Plant Physiol., 111:1191 1197.

227. Kim E.J., Kwak J.M., Uozumi N. Schroeder J.L. (1998) AtKUPl: An Arabidopsis gene encoding high-affinity potassium transport activity. // Plant Cell, 10:51-62.

228. Kinclova O., Potier S., Sychrova H. (2002) Difference in substrate specificity divides the yeast alkali-metal-cation/H+ antiporters into two subfamilies.

229. Kirsch Th., Rojahn B., Kindl H. (1989) Diphosphatase related to lipid metabolism and gluconeogenesis in cucumber cotyledons localization in plasma membrane and etioplast. // J. Biosci., 44:937 945.

230. Kirst G.O. (1977) The ion composition of unicellular marine and freshwater algae with special reference to Platymonas subcordiformis cultivated in media with different osmotic strength. // Oecologia, 28:177 189.

231. Kleyman T.R., Cragoe E.J. (1988) Amiloride and its analogs as tools in the study of ion transport. // J. Membr. Biol., 105:1 21.

232. Kotyk A. (1983) Coupling of a secondary active transport with ApH. // J. Bioenerg. Biomembr., 15: 307 319.

233. Koyama N. (1999) Presence of Na+-stimulated P-type ATPase in the membrane of a facultatively anaerobic alkaliphile, Exiguobacterium aurantiacum. II Curr. Microbiol., 39: 27 30.

234. Krulwich T.A. (1983) Na7eT antiporters. // Biochim. Biophys. Acta, 726: 245 -264.

235. Kugel H., Mayer A, Kirst G.O., Leiblitz D. (1987) In vivo P-31 NMR measurements of phosphate metabolism in Platymonas subcordiformis as related to external pH. // Eur. Biophys. J., 14:461 470.

236. Kunter H.J. (2006) Osmoregulation in bacteria: compatible solute accumulation and osmosensing. // Environ. Chem., 3; 94 99.

237. Kylin A., Gee R. (1970) Adenosin triphosphatase activities in leaves of the mangrove Avicennia nitida Jacg. Influence of sodium to potassium ratios and concentrations. // Plant Physiol., 45:169 172.

238. Lacombe B., Becker D, Hedrich R, DeSalle R, Hollmann M., Kwak J.M., Schroeder J.I, LeNovere N, Nam H.G, Spalding E.P. et al. (2001) The identity of plant glutamate receptors.// Science, 292:1486 1487.

239. Lanyi J.K. (1974) Salt-dependent properties of protein from extremely halophilic bacteria. // Bacterid. Revs, 38:272 290.

240. Lanyi J.K., McDonald R.E. (1976) Existence of electrogenic hydrogen/sodium antiport in Halobacterium cell envelope vesicles. // Biochemistry, 15: 4608 -4614.

241. Lanyi J.K., Silverman, M.P. (1979) Gating effects in Halobacterium halobium membrane transport. // J. Biol. Chem., 254:4750 4755.

242. Latorella A.H., Vadas R.L., (1973) Salinity adaptation by Dunaliella tertiolecta. I. Increase in carbonic anhydrase activity and evidence for a light-dependent NaTtf" exchange. // J. Physiol., 9:273 277.

243. Laubinger W. and Dimroth P. (1987) Characterization of the Na+-stimulated ATPase of Propionigenium modestum as an enzyme of the FiFo-type. // Eur. J. Biochem. 168:475-480.

244. Laubinger W. and Dimroth P. (1988) Characterization of the ATP synthase of Propionigenium modestum as a primary sodium pump. // Biochemistry 27: 7531-7537.

245. Laubinger W, Deckers-Hebestreit G, Altendorf K, Dimroth P. (1990) A hybrid adenosinetriphosphatase composed of Fi of Escherichia coli and Fo of Propionigeniummodestum is a functional sodium ion pump. // Biochemistry 29: 5458-5463.

246. Laurie S„ Feeney K.A., Maathius F.J.M., Heard P.J., Brown S.J., Leigh R.A. (2002) A role for HKT1 in sodium uptake by wheat roots. // Plant J., 32: 139 -149.

247. Lemas M.V., Hamrick M„ Takeyasu K., Fambrough D.M. (1994) 26 Amino acids of an extracellular domain of the Na,K-ATPase D-subunit are sufficientfor assembly with the Na,K-ATPase □-subunit. // J. Biol. Chem., 269: 8255 -8259.

248. Leng Q., Mercier R.W., Hua B.G., Fromm H., Bercowitz G.A. (2002) Electrophysiological analysis of cloned cyclic nucleotide-gated ion channels. // Plant Physiol., 128: 400-410.

249. Leonard R.T., Hodges T.K. (1973) Characterization of plasma membrane associated adenosine triphosphatase activity of oat roots. // Plant Physiol., 52: 6 -12.

250. Li L., Tutone A.F., Drummond R.S., Gardner R.C., Luan S. (2001) A novel family of magnesium transport genes in Arabidopsis. II Plant Cell., 13: 2761 -2775.

251. Lichtenbergfrate H., Reid J.D., Heyer M., and Hofer M. (1996) The Sptrk gene encodes a potassium-specific transport protein Trkp in Schizosaccharomyces pombe. II J. Membr. Biol., 152:169 -181.

252. Lichtner R., Wolf H.U. (1979) Dodecyl sulphate/polyacrylamide-gel electrophoresis at low pH values and low temperatures. // Biochem. J. 181,759 -761.

253. Lichtner F.T., Lucas W.J., Spanswick R.M. (1981) Effect ofsulfhydryl reagents on the biophysical properties of the plasmalemma of Chara corallina. II Plant Physiol., 68: 899-904.

254. Liu J., Ishitani M., Halfter U., Kim C.-S., Zhu J.-K. (2000) The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes protein kinase that is required for salt tolerance. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:3730 3734.

255. Liu J., Zhu J.-K. (1997) An Arabidopsis mutant that requires increased calcium for potassium nutrition and salt tolerance. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14960-14964.

256. Liu J., Zhu J.-K. (1998) A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance. // Science, 280:1943 1945.

257. Lolkema J.S., Speelmans G., Konings W.N. (1994) Na+-coupled versus H*-coupled energy transduction in bacteria. // Biochim. Biophys. Acta, 1187:211 -215.

258. Lolkema J.S., Chaban Y., Boekema E.J. (2003) Subunit composition, structure and distribution of bacterial V-type ATPases. // J. Bioenerg. Biomem., 35: 323 -335.

259. Lundborg T., Widell S., Larsson C. (1981) Distribution of ATPases in wheat root membranes separated by phase partition. // Physiol. Plantarum, 52: 89-95.

260. Luo H., Morsomme P., Boutry M. (1999) The two major types of plant plasma membrane FT-ATPases show different enzymatic properties and confer differential pH sensitivity of yeast growth. // Plant Physiol., 119:627 634.

261. Lutsenko S., Kaplan J.H. (1995) Organization of P-type ATPases: significance of structural diversity. // Biochemistry, 34:15607 15613.

262. Maathuis F.J.M., Flowers T.J., Yeo A.R. (1992) Sodium chloride compartmentation in leaf vacuoles of the halophyte Suaeda maritima (L.) Dum. and its relation to tonoplast permeability. // J. Exp. Bot., 43:1219 1223.

263. Maathuis F.J.M., Ishida A.M., Sanders D., and Schroeder J. (1997) Roles of higher plant K+ channels. // Plant Physiol., 114:1141 1149.

264. Maathuis F.J.M., Sanders D. (1996) Mechanisms of potassium absorption by higher plant roots. // Physiol. Plant., 96:158 168.

265. Maathuis F.J.M., Sanders D. (1997) Regulation of K+ absorption in plant root cells by external K+: interplay of different plasma membrane K+ transporters. // J.Exp. Bot. 48:451 -458.

266. Maathuis F.J.M., Sanders D. (2001) Sodium uptake in Arabidopsis roots is regulated by cyclic nucleotides. // Plant Physiol., 127:1617 1625.

267. Maathius F.J.M., Verlin D., Smith F.A., Sanders D., Fernandez J.A., and Walker N. A. (1996) The physiological relevance of Na+-coupled K+ transport. //Plant Physiol., 112:1609-1616.

268. Mahnensmith R.L., Aronson P.S. (1985) The plasma membrane sodium-hydrogen exchanger and its role inphysiological and pathophysiological processes. // Circ. Res., 56: 773 788.

269. Maloney P.C., and Wilson T.H. (1985) The evolution of ion pumps. // Biosciences, 35:43 48.

270. Malpartida F, Serrano R. (1981) Phosphorylated intermediate of the ATPase from the plasma membrane of yeast. Eur. J. Biochem. 116,413 417.

271. Mardh S, Post RL (1977) Phosphorylation from adenosine tripohosphate of sodium and potassium-activated adenosine triphosphatase. Comparison of enzyme-ligand complexes as precursors to the phosphoenzyme. // J.Biol.Chem, 252:633-638.

272. McCue K.F, and Hanson A.D. (1990) Drought and salt tolerance: towards understanding and application. // Trends Biochem, 8: 358 362.

273. Meloni D.A, Oliva M.A, Martinez C.A., Cambraia J. (2003) Photosynthesis and activity of superoxide dismutase, peroxidase and glutathione reductase in cotton under salt stress. // Env. Exp. Bot, 49: 69 76.

274. Mercer R.W. (1993) The structure of Na,K-ATPase. // Int. Rev. Cytol, 137C: 139- 168.

275. Michelet B, Boutry M. (1995) The plasma membrane H'-ATPase. A highly regulated enzyme with multiple physiological functions. // Plant Physiol, 108: 1-6.

276. Mimura T, Shimmen T. and Tazawa M. (1983) Dependence of the membrane potential on intracellular ATP concentration in tonoplast-free cells of Nitellopsis obtusa. II Planta, 157: 97 104.

277. Mitchell P. (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. //Nature, 191:144 148.

278. Mitchell P. (1966) Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. // Biol. Rev., 41:445 502.

279. Mitsui K., Ochi F., NakamuraN., Doi Y., Inoue H., Kanazawa H. (2004) A novel membrane protein capable of binding the NaVFT antipporter (Nhalp) enhances the salinity-resistant cell growth of Saccharomyces cerevisiae. // J.Biol. Chem., 279:12438 -12447.

280. Mittler R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. // Trends Plant. Sci., 7:405-410.

281. Moe O.W. (1999) Acute regulation of proximal tubule apical membrane Na/H exchanger NHE-3: role of phosphorylation, protein trafficking and regulatory factors. // J. Am. Soc. Nephrol., 10:2412 2425.

282. Moretti R., Martin M., Proverbio T., Proverbio F„ Marin R. (1991) Ouabain-insensitive Na+-ATPase activity in homogenates from different animal tissues. // Comparative Biochem. Physiol., 98B: 623 626.

283. Morrison J.F. (1979) Approaches to kinetic studies on metal-activated enzymes. // Methods Enzymol., 63: 257 294.

284. Moller JV., Juul B., le Maire M. (1996) Structural organization, ion transport and energy transduction of P-type ATPases. // BBA, 1286:1-51.

285. Munns R. (1993) Physiological processes limiting plant growth in saline soil: some dogmas and hypothesis. // Plant, Soil and Env., 16:15-24.

286. Munns R. (2002) Comparative physiology of salt and water stress. // Plant Cell Env., 25: 239-250.

287. Murakami N., Konishi T. (1989) Mechanism of functioning of dicyclohexylcarbodiimide-sensitive NaVrf" antiporter in Halobacterium halobium: pH effect. // Arch. Biochem. Biophys., 271: 515 523.

288. Murata T., Yamato I., Igarashi K., Kakinuma Y. (1996) Intracellular Na+ regulates transcription of the ntp operon encoding a vacuolar-type Na+-translocating ATPase in Enterococcus hirae. II J. Biol. Chem., 271: 23661 -23666.

289. Murata T., Takase K., Yamato I., Igarashi K., Kakinuma Y. (1997) Purification and reconstitution of Na+-translocating vacuolar ATPase from Enterococcus hirae. II J. Biol. Chem., 272:24885 24890.

290. Murata T., Takase K., Yamato I., Igarashi K., Kakinuma Y. (1999) Properties of the VoVi Na+-ATPase from Enterococcus hirae and its Vo moiety. // J.Biochem„ 125:414-421.

291. Murata T., Kawano M., Igarashi K., Yamato I., Kakinuma Y. (2001) Catalytic properties of Na+-translocating V-ATPase in Enterococcus hirae. II Biochim Biophys. Acta, 1505: 75-81.

292. Milller V, Blaut M, and Gottschalk G. (1987) Generation of a transmembrane gradient of Na+ in Methanosarcina barker. II Eur. J. Biochem. 162: 461 466.

293. Navarre C., Goffeau A. (2000) Membrane hyperpolarization and salt sensitivity induced by deletion of PMP3, a highly conserved small protein of yeast plasma membrane. // MBO J., 19:2515 2524.

294. Nelson N. (1992) Evolution of organellar proton-ATPases. // Biochim Biophys. Acta 1100: 109-124.

295. Nerke K., Melvin J.E. (2002) The NHX family of Na'-H* exchangers in Caenorhabditis elegance. // J. Biol. Chem., 277:29036 29044.

296. Neumann S, Matthey U, Kaim G, and Dimrith P. (1998) Purification and properties of the F|Fo ATPase of Ilyobacter ttartaricus, a sodium ion pump. // J. Bacterid. 180:3312-3316.

297. Nikaido H., Saier M.H., Jr. (1992) Transport proteins in bacteria: common themes in their design. // Science, 258:936 942.

298. Nishi T., Yagi T. (1995) efflux of sodium ions by a Na+/H* antiporter during salt stress in the salt tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii. II J. Gen. Appl. Microbiol., 41: 87-97.

299. Numata M, Orlowski J. (2001) molecular cloning and characterization of a novel (Na+,K+)/H+ exchanger localized to the trans-Golgi network. // J. Biol. Chem., 276:17387-17394.

300. Nuccio M.L., Rhodes D., McNeil S.D., Hanson A.D. (1998) Metabolic engineering of plants for osmotic stress resistance. // Curr. Opin. Plant Biol, 2: 128-134.

301. Obsil T, Merola F, Lewit-Bentley A, Amler E. (1998) The isolated H4-H5 cytoplasmic loop of Na,K-ATPase overexpressed in Escherichia coli retains its ability to bind ATP. // FEBS Lett, 426: 297 300.

302. Oecking C, Piotrovski M, Hagemeier J, Hagemann K. (1997) Topology and target interaction of the fusicoccin-binding 14-3-3 homologs of Commelima communis. //Plant J, 12:441-453.

303. Oleski N.A, Bennet A.B. (1987) if-ATPase activity from storage tissue of Beta vulgaris. IV. N,N'-dicyclohexylcarbodiimide binding and inhibition of the plasmamembrane tT-ATPase. // Plant Physiol,. 83: 569 572.

304. Oren A. (1986) Intracellular salt concentrations of the anaerobic halophilic eubacteria Haloanaerobium praevalens and Halobacteroides halobius. // Can. J.Microbiol, 32:4-9.

305. Oren A. (1999) Bioenergetic aspects of halophilism. // Microbiol. Molecular Biol. Rev, 63:334 348.

306. Oren A., Heldal M., Norland S. (1997) X-ray microanalysis of intracellular ions in the anaerobic halophilic eubacterium Haloanaerobium praevalens. II Can. J. Microbiol., 43:588-592.

307. Orlowski J., Grinstein S. (1997) Na+/H+ exchangers in mammalian cells. // J.Biol. Chem. 272:22373 22376.

308. Orlowski J., Grinstein S. (2004) Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. // Eur. J. Physiol., 447: 549 565.

309. Padan E., Schuldiner S. (1993) Na+/H+ antiporters, molecular devices that couple the Na+ and H* circulation in cells. // J. Bioenerg. Biomembr., 25: 647 -669.

310. Padan E., Schuldiner S. (1994) Molecular physiology of Na+/H+ antiporters, key transporters in circulation of Na+ and H+ in cells. // Biochim Biophys Acta, 1185:129-151.

311. Padan E., Venturi M., Gerchman Y., Dover N. (2001) Na+/lf antiporters. // Biochim. Biophys. Acta, 1505:144 157.

312. Padan E., Tzubeiy T., Herz K., Kozachkov L., Rimon A., Galili L. (2004) NhaA of Escherichia coli, as a model of a pH-regulated Na+/H+ antiporter. // Biochim. Biophys. Acta, 1658:2- 13.

313. Palmgren M.G., Harper J.F. (1999) Pumping with plant P-type ATPases. // J. Exp. Bot/. 50: 883-893.

314. Palmgren M.G., Larsson C. (1990) Proteolitic activation of the plant plasma membrane tf'-ATPase by removal of a terminal segment. // J. Biol. Chem., 265: 13423 13426.

315. Palmgren M.G., Sommarine M. (1989) Lysophosphatidilcholine stimulates ATP dependent proton accumulation in isolated oat root plasma membrane vesicles. // Plant Physiol., 90:1009 1014.

316. Pardo J.M., Cubero B., Leidi E.O., Quintero F.J. (2006) Alkali cation exchanger: roles in cellular homeostasis and stress tolerance. // J. Exp. Bot., 57: 1181-1199.

317. Perlin D.S., San Francisco M.J., Slayman C.W., Rosen B.P. (1986) H+/ATP stoichiometry of proton pumps from Neurospora crassa and Escherichia coli. I I Arch. Biochem. Biophys., 248: 53 61.

318. Phillips D.R., Morrison M. (1971) Exposed proteins on the intact human erythrocyte. //Biochemistry, 10:1766-1772.

319. Poljakoff-Mayber A. (1975) Morphological and anatomical changes in plants as a response to salinity. // In: Poljakoff-Mayber A., Gale J., eds. Plants in saline environments. Berlin: Springer-Verlag, 97 117.

320. Portillo F., Mazon M. (1985) Activation of yeast plasma membrane ATPase by phorbol ester. // FEBS Lett., 192: 95 98.

321. Post RL, Sen AK, Rosenthal AS. (1965) A phosphorylated intermediate in adenosine triphosphate dependent sodium and potassium transport across kidney membranes. J. Biol. Chem. 240,1437 1445.

322. Post R.L., Sen A.K. (1967) 32P.-labeling of a (Na+,K+)-ATPase intermediate. // Methods Enzymol. 10: 762 768.

323. Post RL, Kume S. (1973) Evidence for an aspartyl phosphate residue at the active site of sodium and potassium ion transport ATPase. J. Biol. Chem. 248, 6993 7000.

324. Prior C., Potier S., Souciet J.-L., Sychrova H. (1996) Characterization of the NHA1 gene encoding a Na+/H+ antiporter of the yeast Saccharomyces cerevisiae. IIFEBS Lett., 287: 71 74.

325. Proverbio F., Marin R., Proverbio T. (1989) The "second" sodium pump and cell volume. // Current Topics in Membranes and Transport, 34:105 119.

326. Qui Q.S., Barkla B.J., Vera-Estrella R., Zhu J.K., Schumaker K.S. (2003) Na'TFT1" exchange activity in the plasma membrane of Arabidopsis. // Plant Physiol., 132:1041 1052.

327. Qiu Q.S., Guo Y., DietrichM.A., Schumaker K.S., Zhu J.K. (2002) Regulation of SOS1, a plasma membrane NaVH* exchanger in Arabidopsis thaliana, by SOS2 and SOS3. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 8436 8441.

328. Qui QS., Guo Y., Quintero F.J., Pardo JM., Schumaker KS., Zhu J-K. (2004) Regulation of vacuolar Na+/H+ exchange in Arabidopsis thaliana by the salt-overly-sensitive (SOS) pathway. // J. Biol. Chem., 279:207 215.

329. Quail P.H. (1979) Plant cell fractionation. // Annu. Rev. Plant Physiol., 9:425 -485.

330. Quintero F.J., Blatt M.R. (1997) A new famility of K+ transporter from Arabidopsis that are concerved across phyla. // FEBS Lett. 415:206 -211.

331. Quintero F.J, Ohta M, Shi H, Zhu J.K, Pardo J.M. (2002) Reconstitution in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na+ homeostasis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9061 9066.

332. Rains D.W. (1972) Salt transport by plants in relation to salinity. // Annu. Rev. Plant Physiol, 23:367-388.

333. Rains D.W, and Epstein E. (1965) Transport of sodium in plant tissue. // Science, 148:1611.

334. Rasi-Caldogno F, Pugliarello M.C., DeMichelis M.I. (1987) The Ca2+ -transport ATPase of plant plasma membrane catalyzes a nHVCa2+ exchange. // Plant Physiol, 83:994-1000.

335. Ratner A, Jacoby B. (1976) Effects of K+, its counter anion and pH on sodium efflux from barley root tips. // J. Exp. Bat, 27: 843 852.

336. Raven J.A. (1976) Transport in algal cells. // In: Encyclopedia of plant physiology. N.S. v.2. Berlin Heidelberg - New-York: p. 129 - 188.

337. Raven I.A. (1985) pH-regulation in plants. // Sci. Prog. Oxford, 69:495 509.

338. Raven J.A, Smith F.A. (1976) The evolution of chemiosmotic energy coupling. //J. Theor. Biol, 57: 301-312.

339. Rea P.A, Poole R.J. (1985) Proton-translocating inorganic pyrophosphatase in red beet (Beta vulgaris L.) tonoplast vesicles. // Plant Physiol, 77:46 -52.

340. Rea P.A, Sanders D. (1987) Tonoplast energization: Two H+ pump, one membrane. //Physiol. Plant, 71:131 141.

341. Reed R.H., and Collins J.C. (1981) Membrane potential measurements of marine microalgae: Porphyra purpurea and Viva lactuea. // Plant Cell Env., 4: 257-260.

342. Reidlinger J. and Müller V. (1994) Purification of ATP synthase from Acetobacterium woodii and identification as a Na+-translocating FiF0-type enzyme. // Eur. J. Biochem. 223:275 283.

343. Reimann C., and Breckle S.W. (1993) Sodium relations in Chenopodiaceae: A comparative approach. // Plant Cell Env., 16: 323 328.

344. Reinhardt D.H., Rost T.L. (1995) Salinity accelerates endodermal development and induces an exodermis in cotton seedlings roots. // Env. Exp. Bot., 35: 563 -574.

345. Remis D., Simonis W., Gimmler H. (1992) Measurements of the transmembrane electric potential of Dunaliella acidophila by microelectrodes. //Arch. Microbiol., 158: 350-355.

346. Roberts S.K., Tester M. (1995) Inward and outward K+-selective currents in the plasma membrane of protoplasts from maize root cortex and stele. // Plant J., 8: 811-825.

347. Roberts S.K., Tester M. (1997) A patch clamp study of Na+ transport in maize roots. // J. Exp. Bot., 48:431 440.

348. Rodríguez-Navarro A., Quintero F.J., Garciadeblas B. (1994) Na+-ATPase and Na+/H+ antiporters in fungi. // Biochim. Biophys. Acta, 1187:203 205.

349. Romani A., Scarpa A. (2000) Regulation of cellular magnesium. // Front Biosci., 5: D720 D734.

350. Rosen B.P. // Resent advances in bacterial ion transport. // Annu. Rev. Microbiol., 40:263-286.

351. Rotin D., Grinstein S. (1989) Impaired cell volume regulation in Na^H* exchange-deficient mutants. // Am. J. Physiol., 257: CI 158 CI 165.

352. Rubio F., GassmannW., Schroeder J.I. (1995) Sodium-driven potassium uptake by the plant potassium transporter HKT1 and mutations conferring salt tolerance. // Science, 270:1660 1663.

353. Rungel L.B.A., Caruso-Neves C., Lara L.S., Brasil F.L., Lopes A.G. (1999) Angiotensin II activates the ouabain-insensitive Na+-ATPase from renal proximal tubules through a G-protein. // Biochim. Biophys. Acta, 1416: 309 -319.

354. Rus A., Yokoi S., Sharkhuu A., Reddy M., Lee B.H., Matsumoto T.K., Koiwa H., Zhu J.K., Bressan R.A., Hasegawa P.M. (2001) AtHKTl is a salt tolerance determinant that controles Na+ entry into plant roots. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98: 14150-14155.

355. Rus A, Lee B, Munoz-Mayor A., Sharkhuu A, Miura K, Zhu J-K, Bressan RA, Hasegawa PM. (2004) AtHKTl facilitates Na+ homeostasis and K+ nutrition in planta. // Plant Physiol, 136:2500 2511.

356. Santa-Maria G, Rubio F, Dubcovsky J, Rodriguez-Navarro A. (1997) The HAK1 gene of barley is a member of a large gene family and encodes a high-affinity potassium transporter. // Plant Cell, 9:2281 2289.

357. Scarborough G.A. (1999) Structure and function of the P-type ATPases. // Curr.Opin. Cell Biol, 11: 517 522.

358. Schachtman D.P, and Schroeder J.I. (1994) Structure and transport mechanism of high-affinity potassium uptake transporter from higher plants. // Nature, 370: 655-658.

359. Schachtman D, Liu W. (1999) Molecular pieces to the puzzle of the interaction between potassium and sodium uptake in plants. // Trend Plant Sei, 4: 281 -286.

360. Schäfer G. and Meyering-Vos M. (1992) F-type or V-type the chimeric nature of the archaebacterial ATP synthase. // Biochim. Biophys. Acta 1101: 232 -235.

361. Schaller G.E, Sussman M.R. (1988) Phosphorylation of the plasma-membrane tT-ATPase of oat roots by a calcium-stimulated protein kinase. // Planta, 173: 509-518.

362. Scheiner-Bobis G, Farley F.A. (1994) Subunit requirements for the expression of functional sodium pumps in yeast cells. // Biochim. Biophys. Acta, 1193: 226-234.

363. Scheiner-Bobis G. (2002) The sodium pump. // Eur. J. Biochem., 269: 2424 -2433.

364. Sekler I., Glasser H.U., Pick U. (1991) Characterization of a plasma membrane H^ATPase from the extremely acidophilic alga Dunaliella acidophila. II J. Membr. Biol., 121:51-57.

365. Sekler I., Pick U. (1993) Purification and properties of a plasma membrane H*-ATPase from the extremely acidophilic alga Dunaliella acidophila. II Plant Physiol., 101:1055-1061.

366. Serrano R. (1985) Plasma membrane ATPase of plant and fungi. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. 174 pp.

367. Serrano R. (1988) Structure and function of proton translocating ATPase in plasma memranes of plants and fungi. // Biochim. Biophys. Acta, 947:1-28.

368. Serrano R. (1989) Structure and function of plasma membrane ATPase. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40:61 94.

369. Serrano R. (1996) Salt tolerance in plants and microorganisms: toxity targets and defence responses. // Int. Rev.Cytology, 165:1 52.

370. Serrano R., Gaxiola R. (1994) Microbial models and salt stress tolerance in plants. // Critical Rew. Plant Sci., 13:121 138.

371. Serrano R., Mulet J.M., Rios G., Márquez J.A., Larrinoa I.F., Leube M.P., Mendizabal I., Pascual-Ahuir A., Proft M., and Montesinos C. (1999) A glimpse of the mechanisms of ion homeostasis during salt stress. // J. Exp. Botany, 50:1023 1036.

372. Serrano R., and Rodríguez-Navarro A. (2001) Ion homeostasis during salt stress in plants. // Curr. Opin. Cell Biology, 13:399 404.

373. Serrano R., Ruiz A., Bernal D., Chambers JR., Arino J. (2002) The transcriptional response to alkaline pH in Saccharomyces cerevisiae: evidence for calcium-mediated signaling. // Mol. Microbiol., 46:1319 1333.

374. Shainskaya A., Karlish S.J. (1994) Evidence that the cation occlusion domain of Na+/K+-ATPase consists of a complex of membrane-spanning segments. Analysis of limit membrane-embedded tryptic fragments. // J. Biol. Chem., 269: 10780- 10789.

375. Shaul O. (2002) Magnesium transport and function in plants: the tip of the iceberg. // Biometals, 15: 309 323.

376. Sheffer M, Avron M. (1986) Isolation of the plasma membrane of the halotolerant alga Dunaliella salina using sulforhodamine B as a probe. // Biochim. Biophys. Acta, 857:155 164.

377. Shi H., Ishitani M., Kim C., Zhu J.K. (2000) The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+ antiporter . // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6896-6901.

378. Shi H., Quintero F.J., Pardo J.M., Zhu J.K. (2002) The putative plasma membrane Na+/H+ antiporter SOS1 controls long-distance Na+ transport in plants. // Plant Cell, 14:465 477.

379. Shimmen T., Tazawa M. (1977) Control of membrane potential and excitability oí Chara cells with ATP and Mg2+. // J. Membr. Biol., 37:167 192.

380. Shone M.G.T., Clarkson D.T., and Sanderson J. (1969) The absorbtion and translocation of sodium by maize seedlings. // Planta, 86: 301 314.

381. Shono M., Hara Y., Wada M., Fujii T. (1996) A sodium pump in the plasma membrane of the marine alga Heterosigma akashiwo. II Plant Cell Physiol., 37: 385-388.

382. Shono M, Wada M, Fujii T. (1995) Partial purification of a Na+-ATPase from the plasma membrane of the marine alga Heterosigma akashiwo. Plant Physiol. 108, 1615- 1621.

383. Shono M., Wada M., Hara Y., Fujii T. (2001) Molecular cloning of Na+-ATPase cDNA from a marine alga, Heterosigma akashiwo. II Biochim. Biophys. Acta, 1511:193 -199.

384. Simpson I.A., Somme O. (1982) A simple, rapid and sensitive method for measuring protein concentration in subcellular membrane fractions prepared by sucrose density ultracentrifugation. // Anal. Biochem. 119:424 427.

385. Skou, J.C. (1957) The influence of some cations on adenosine-triphosphatase from peripheral nerves. // Biochim. Biophys. Acta, 23:394 401.

386. Skulachev V.P. (1985) Membrane-linked energy transduction. Bioenergetic functions of sodium: H+ is not unique as a coupling ion. // Eur. J. Biochem., 151:199-208.

387. Skulachev V.P. (1989) The sodium cycle: a novel type of bacterial energetics. // J. Bioenerg. Biomembr. 21: 635 647.

388. Skulachev V.P. (1991) Chemiosmotic systems in bioenergetics: Recycles and Na+-cycles. // Biosci. Rep., 11:387 441.

389. Smahel M, Hamann A, Gradmann D. (1990) The prime plasmalemma ATPase of the halophilic alga Dunaliella bioculata: purification and characterization. // Planta, 181:496-504.

390. Smahel M, Klieber H-G, Gradmann D. (1992) Vanadate-sensitive ATPase in the plasmalemma of Acatabularia: biochemical and kinetic characterization. // Planta, 188:62-69.

391. Smigan P, Majernik A, Polak P, Hapala I, Greksak M. (1995) The presence of H* and Na+-translocating ATPases in Methanobacterium thermoautotrophicum and their possible function under alkaline conditions. //

392. Smith F.A, and Raven J.A. (1979) Intrecellular pH and its regulation. // Annu. Rev. Plant Physiol., 30:289 311.

393. Smith F.A, Walker N.A. (1989) Transport of potassium in Chara australis: I. A symport with sodium. // J. Membr. Biol, 108:125 137.

394. Solioz M, Davies K. (1994) Operon of vacuolar-type Na+-ATPase of Enterococcus hirae. I I J. Biol. Chem, 269: 9453 9459.

395. Spalding E.P, Hirsch R.E, Lewis D.R, Zhi Q, Sussman M.R, Lewis B.D. (1999) Potassium uptake supporting plant growth in the absence of AKT1 channel activity. Inhibition by ammonium and stimulation by sodium. // J. Gen. Physiol. 113:909-918.

396. Spanswick R.M, (1972) Evidence for an electrogenic ion pump in Nitella translucens. I. The effects of pH, K+, Na+, light and temperature on the membrane potential and resistance. // Biochim. Biophys. Acta, 288: 73 89.

397. Spanswick R.M., (1974) Evidence for an electrogenic ion pump in Nitella translucens. II. Control of light-stimulated component of the membrane potential. // Biochim. Biophys. Acta, 332: 387 398.

398. Speelmans G., Poolman B., Abee T., Konings W.N. (1993) Energy transduction in the termophilic anaerobic bacterium Clostridium fervidus is exclusively coupled to sodium ions. // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 7975 7979.

399. Staal M., Maatius J.M., Elzenga J.T., Overbeek J.H.M., Prins H.B.A. (1991) Na'VH* antiport activity in tonoplast vesicles from roots of salt tolerant Plantago maritima and the salt sensitive Plantago media. II Physiol. Plant., 82: 179- 184.

400. Stein WD (1986) Transport and diffusion across cell membranes, 477 571. Academic Press, San Diego, CA.

401. Stephens R.S., Kalman S., Lammel C., Fan J., Marathe R., etc. (1998) Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis. II Science, 282: 754 759.

402. Steuber J., Schmid C., Rufibach M., Dimroth P. (2000) Na+-translocation by complex I (NADH:quinine oxidoreductase) of Escherichia coli. II Mol. Microbiol., 35:428-434.

403. Stevens T.H., Forgac M. (1997) Structure, function and regulation of the vacuolar if-ATPase. // Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 13:779 808.

404. Subbarao G.V., Ito O., Berry W.L., Wheeler R.M. (2003) Sodium a functional plant tutrient. // Critical Rev. Plant Sci., 22:391 - 416.

405. Sullivan C.W., Volcani B.B. (1974) Synergistically stimulated (Na+,K> adenosine triphosphatase from plasma membrane of a marine diatom. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:4376 4380.

406. Sunarpi, Horie T., Motoda J., Kubo M., Yang H., Yoda K., Horie R., Chan W.Y., et al. (2005) Enchanced salt tolerance mediated by AtHKTl transporter-induced Na unloading from xylem vessels to xylem parenchyma cells. // Plant J., 44: 928-938.

407. Sussman M.R., Surowy T.K. (1987) Physiology and molecular biology of membrane ATPases. // Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, 4: 47 70.

408. Sussman M.R. (1994) Molecular analysis of proteins in the plasma membrane. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 45:211 234.

409. Swatz T.H., Ikewada S., Ishikawa O., Ito M., Krulwich T.A. (2005) The Mrp system: a giant among monovalent cation/proton antiporters? // Extremophiles, 9:345-354.

410. Sweadner KJ. (1989) Isozymes of the Na+,K+-ATPase. // Biochim. Biophys. Acta, 988: 185-220.

411. Sze H. (1984) iT-translocating ATPases of the plasma membrane and tonoplast of plant cells. // Physiol. Plantarum, 61: 683 691.

412. Sze H. (1985) FT-translocating ATPases: advances using membrane vesicles. // Ann. Rev. Plant Physiol., 36: 175 208.

413. Sze H., Li X., Palmgren M.G. (1999) Energization of plant cell membranes by FT-pumping ATPases: regulation and biosynthesis. // The Plant Cell, 11: 677 -689.

414. Taji T., Seki M., Satou M., Sakurai T., Kobayashi M., Ishiyama K., et al. (2004) Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. // Plant Physiol., 135:1697-1709.

415. Takase K., Kakinuma S., Yamato I., Konishi K., Iragashi K., Kakinuma Y. (1994) Sequencing and characterization of the ntp gene cluster for vacuolar-type Na(+)-translocating ATPase of Enterococcus hirae. // J.Biol. Chem., 269: 11037-11044.

416. Takeshige K., Shimmen T., Tazawa M. (1986) Quantitative analysis of ATP-dependent FT efflux and pump current driven by an electrogenic pump in Nitellopsis obtusa. II Plant Cell Physiol., 27: 337 348.

417. Therien A.G., Karlish S.J., Blostein R. (1999) Expression and functional role of the □ subunit of the Na,K-ATPase in mammalian cells. // J. Biol. Chem., 274: 12252 -122556.

418. Tokuda H. (1984) // Solubilization and reconstitution of the Na+-motive NADH oxidase activity from the marine bacterium Vibrio alginolyticus. II FEBS Lett., 176:125 128.

419. Tokuda H., Udagawa T., Unemoto T. (1985) Generation of the electrochemical potential of Na+ by the Na+-motive NADH oxidase in inverted membrane vesicles of Vibrio alginolyticus. IIFEBS Lett., 183:95 98.

420. Tokuda H., Unemoto T. (1981) A respiration-dependent primary sodium extrusion system functioning at alkaline pH in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. II Biochem. Biophys. Res. Commun., 102: 265 271.

421. Tokuda H., Unemoto T. (1982) Characterization of the respiration-dependent Na+ pump in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. II J. Biol. Chem., 257: 10007-10014.

422. Tokuda H., Unemoto T. (1983) Growth of a marine Vibrio alginolyticus and moderately halophilic V. costicola becomes uncoupler resistant when the respiration-dependent Na+ pump functions. // J. Bacterid., 156: 636 643.

423. Tokuda H., Unemoto T. (1984) Na+ is translocated at NADH:quinone oxidoreductase segment in the respiratory chain of Vibrio alginolyticus. II J. Biol. Chem., 259: 7785 7790.

424. Tokuoka K. (1993) Sugar- and salt-tolerant yeasts. // J. Appl. Bacterid., 74: 101-110.

425. Tyerman S.D., Skerrett I.M., Garrill A., Findlay G.P., Leigh R.A. (1997) Pathways for the permeation of Na+ and CI* into protoplasts derived from the cortex of wheat roots. // J. Exp. Bot., 48:459 480.

426. Tyerman S.D., Skerrett I.M. (1999) Root ion channels and salinity. // Sci. Hortic. 78:175-235.

427. Ueno S, Kaieda N, Koyama N. (2000) Characterization of a P-type Na+-ATPase of a facultatively anaerobic alkaliphile, Exiguobacterium aurantiacum. //J. Biol. Chem., 275: 14537-14540.

428. Vara F, Serrano R. (1982) Partial purification and properties of the proton-translocating ATPase of plant plasma membranes. // J.Biol.Chem, 257: 12826 -12830.

429. Vasekina AV, Yershov PV, Reshetova OS, Tikhonova TV, Lunin VG, Trofimova MS, Babakov AV. (2005) Vacuolar Na+/H* antiporter from barley: identification and response to salt stress. // Biochemistry (Moscow), 70: 100 -107.

430. Venema K, Palmgren M.G. (1995) Metabolic modulation of transport coupling ratio in yeast plasma membrane FT-ATPase. // J. Biol. Chem, 270: 19659 -19667.

431. Vera-Estrella R, Barkla BJ, Garcia-Ramirez L, Pantoja O. (2005) Salt stress in Thellungiella halophila activates Na+ transport mechanisms required for salinity tolerance. // Plant Physiol, 139:1507-1517.

432. Volkov V, Amtmann A. (2006) Thellungiella halophila, a salt tolerant relative of Arabidopsis thaliana, has specific root ion-channel features supporting K+/Na+ homeostasis under salinity stress. // Plant J, 48: 342 353.

433. Wach A., Ahlers L. and Graber P. (1990) The if-ATPase of the plasma membrane from yeast. Kinetics of ATP hydrolysis in native membranes, isolated and reconstituted enzymes. // Eur. J. Biochem., 189:675-682.

434. Wada M„ Satoh S., Kasamo K., Fujii T. (1989) Presence of a Na+-activated ATPase in the plasma membrane of the marine raphidophycean Heterosigma akashiwo. II Plant Cell Physiol., 30: 923 928.

435. Wada M., Urayama 0., Satoh S., Hara Y., Ikawa Y., Fujii T. (1992) A marine algal Na+-activated ATPase possesses an immunologically identical epitope to Na+,K+-ATPase. // FEBS Lett., 309:272 274.

436. Wakabayashi S., Pang T., Su X., Shigekawa M. (2000) A novel topology model of the human NaVlf exchanger isoform 1. // J. Biol. Chem., 275: 7942 7949.

437. Walker N.A., Sanders D. (1991) Sodium-coupled solute transport in charophyte algae: a general mechanism for transport energization in plant cells? // Planta, 185:443-445.

438. Walker N.A., Sanders D., and Maathuis F.J.M. (1996) High-affinity potassium uptake in plants. // Science, 273:977 978.

439. Walker R.R., Leigh R.A. (1981) Mg2+-dependent, cation stimulated inorganic pyrophosphatase associated with vacuoles isolated from storage roots of red beet CBeta vulgaris L.). // Planta, 153: 150 155.

440. Wang B., Davenport RJ., Volkov V., Amtmann A. (2006) Low unidirectional sodium influx into root cells restricts net sodium accumulation in Thellungiella halophila, a salt tolerant relative of Arabidopsis thaliana. // J. Exp. Bot., 57: 1161-1170.

441. Wang B., Luttge U., Ratajczak R. (2001) Effect of salt treatment and osmotic stress on V-ATPase and V-PPase in leaves of the halophyte Suaeda salsa. II J. Exp. Bot., 365:2355-2365.

442. Wang T.B., Gassmann W„ Rubio F., Schroeder J.I., Glass A.D.M. (1998) Rapid upregulation of HKT1, a high-affinity potassium gene, in root of barley and weat following withdrawal of potassium.// Plant Physiol., B118: 651 659.

443. Wang T., Hropot M., Aronson P.S., Gieblish G. (2001) Role of NHE isoforms in mediating bicarbonate reabsorption along the nephron. // Am. J. Physiol., 281: F1117-F1122.

444. Warncke J., Slayman C.L. (1980) Metabolic modulation of stoichiometry in a proton pump. // Biochim. Biophys. Acta, 591:224 33.

445. Watad A.A., Pesci P., Reinhold L., Lerner H.R. (1986) Proton fluxes as a response to external salinity in wild type and NaCl-adapted Nicotiana cell lines. // Plant Physiol., 81:454 459.

446. Watanabe Y., Miva S., Tamai Y. (1995) Characterization of NaTrf" antiporter gene closely related to the salt-tolerance of yeast Zygosaccharomyces rouxii. II Yeast, 11:829-838.

447. Watanabe Y., Shimono Y., Tsuji H., Tamai Y. (2002) Role of glutamic and aspartic residues in Na+-ATPase function in the ZrENAl gene of Zygosaccharomyces rouxii. IIFEMS Microbiol. Lett., 209:37-41.

448. Weber K, Osborn M. (1969) The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. // J. Biol. Chem. 244: 4406 4412.

449. Weiss M., Pick U. (1996) Primary structure and effect of pH on the expression of the plasma membrane H+-ATPase from Dunaliella acidophila and Dunaliela salina. II Plant Physiol., 112:1693 -1702.

450. Weiss M., Sekler J., Pick U. (1989) Characterization of soluble and membrane-bound forms of a vanadate sensitive ATPase from plasma membranes of the halotolerant alga Dunaliella salina. II Biochim. Biophys. Acta, 974:254 260.

451. Weiss D.S., Thauer R.K. (1993) Methanogenesis and the unity of biochemistry. //Cell, 72:819-822.

452. White P.J. (1997) Cation channels in the plasma membrane of rye roots. // J. Exp. Bot. 48:499-514.

453. White P.J. (1999) The molecular mechanism of sodium influx to root cells. // Trends in Plant Scinces, 4: 245 246.

454. Wittington J., Bisson M.A. (1994) Na+ fluxes in Chara under salt stress. // J. Exp. Bot., 45:657-665.

455. Widell S, Larsson C. (1990) A critical evaluation of markers used in plasma membrane purificatio. // In: The plant plasma membrane, Ch.2. C.Larsson, I.MMdller, eds.; Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 265pp.

456. Wieland J., Nitsche A.M., Strayle J., Steiner H. and Rudoloph H.K. (1995) The PMR2 gene cluster encodes functionally distinct isoforms of a putative Na+ pump in the yeast plasma membrane. // EMBO J., 14: 3870 3882.

457. Williams L.E., Nelson S.J., Hall J.L. (1990) Adenosine triphosphatase and pyrophosphatase activities associated with a plasma membrane fraction isolated by phase partitioning. // Planta, 182: 532 539.

458. Williams K.A. (2000) Three-dementional structure of the ion-coupled transport protein NhaA. // Nature, 403:112-115.

459. Willsky G.R. (1979) Characterization of the plasma membrane Mg2+-ATPase from the yeast, Saccharomyces cerevisiae. II J. Biol. Chem. 254,3326 3332.

460. Wilson C., Shannon M.C. (1995) Salt-induced NaW antiport in root plasma membrane of a glycophytic and halophytic species of tomato. // Plant Sci., 107: 147-157.

461. Woehlke G., Dimroth P. (1994) Anaerobic growth of Salmonella typhimurium on L(+)- and D(-)-tartrate involves an oxaloacetate decarboxylase Na+ pump. // Arch. Microbiol., 162: 233 237.

462. Wolf A.H., Slaymann C.W., Gradmann D. (1995) Primary structure of a plasma membrane H^ATPase from the halotolerant alga Dunaliella bioculata. II Plant Mol. Biol., 28:657-666.

463. Wu S.J, Ding L, Zhu J.K. (1996) S0S1, a genetic locus essential for salt tolerance and potassium acquisition. // Plant Cell, 8: 617 627.

464. Wyn Jones R.G, Brady C.J, and Speirs J. (1979) Ionic and osmotic relations in plant cells. // In: Recent Advances in the Biochemistry of Cereals, pp. 63 103, Laidman D.C, and Wyn Jones R.G, eds. Academic Press, New York.

465. Yadav R, Flowers T.J, Yeo A.R. (1996) The involvement of the transpirational bypass-flow in sodium uptake by high and low sodium-transporting lines of rice developed through intravarietal selection. // Plant Cell Env, 19: 329 336.

466. Yago M.D, Manas M, Singh J. (2000) Intracellular magnesium: transport and regulation in epithelial secretory cells. // Front Biosci, 5: D602 D618.

467. Yamaguchi T, Apse M, Shi H, Blumwald E. (2003) Topological analysis of a plant vacuolar Na+/H+ antiporter reveals a luminal C terminus that regulates antiporter cation selectivity. // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100:12510 12515.

468. Yamaguchi T, Aharon G.S, Sothosanto J.B, Blumwald E. (2005) Vacuolar Na+/H+ antiporter cation selectivity is regulated by calmodulin from within the vacuole in a Ca2+ and pH-dependent manner. // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 102: 16107-16112.

469. Yamashita K, Mimura T, Shimazaki K. (2003) Evidence for nucleotide-dependent passive HT-transport protein in the plasma membrane of barley roots. // Plant Cell Physiol, 44: 55 61.

470. Yanagita Y, Abdel-Chany M, Raden M, Nelson N, Racker E. (1987) Polypeptide-dependent protein kinase from bakers yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:925-929.

471. Yao X., Bisson MA. (1993) Passive proton conductance is the major reason for membrane depolarization and conductance increase in Chara buckellii in highsalt conditions. // Environ. Stress Physiol., 103:197 203.

472. Yeo A.R., Yeo M.E., Flowers T.J. (1987) The contribution of an apoplastic pathway to sodium uptake by rice roots in saline conditions. // J. Exp. Bot., 38: 1141-1153.

473. Yeo A. (1998) Molecular biology of salt tolerance in the context of whole-plant physiology. // J. Exp. Botany, 49: 915 929.

474. Yokoi S., Quintero F.J., Cubero B., Ruiz M.T., Bressan R.A., Hasegawa P.M., Pardo J.M. (2002) Differential expression and function of Arabidopsis thaliana NHX Na+/H+ antiporters in the salt stress response. // Plant J., 30: 529 539.

475. Yoon H.S., Hackett J.D., Ciniglia C., Pinto G., Bhattacharya D. (2004) A molecular timeline for the origin of photosynthetic eukaryotes. // Mol. Biol. Evol., 21: 809-818.

476. Yu X., Carrol S., Rigaud J.-L., Inesi G. (1993) if counter transport and electrogenicity of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump in reconstituted proteoliposomes. // Biophys. J., 64:1232 1242.

477. Zhang H.X., Blumwald E. (2001) Transgenic salt tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. // Nat. Biotechnol. 19: 765 768.

478. Zhu J.K. (2000) Genetic ahalysis of plant salt tolerance using Arabidopsis. // Plant Physiol., 124: 941-948.

479. Я приношу благодарность тем коллегам, которые на разных этапах данной работы принимали в ней участие ЛЛ. Пагис, И.Г. Стриж, Г.А. Шумковой, А.Г. Корниловой.

480. Я благодарна профессору К.-Й. Дитцу и покойному профессору X. Гиммлеру, которые помогали ценными советами во время моей работы в Университете г. Вюрцбург в Германии, где был сделан ряд важных экспериментов по теме нашего исследования.

481. Благодарю всех сотрудников лаборатории солевого обмена и солеустойчивости ИФР РАН, бывших и нынешних, за дружеское участие и поддержку, которые они оказывали мне в течение многих лет.