Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ МЕХАНИЗМЫ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ PLATYMONAS VIRIDIS

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ МЕХАНИЗМЫ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ PLATYMONAS VIRIDIS"

3-/7Л/

МОСКОВСКИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Na+ — ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ МЕХАНИЗМЫ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ

PLATYMONAS VIRIDIS

Специальность 03.00.12 ,— физиология растений

На правах рукописи

ПОПОВА Лариса Геннадиевна

УДК 581.133.8

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

СЗо^соеим - 'ЭЪмгьсил.а^

Работа выполнена в ордепа Трудового Красного Знамена Институте физиологии растений им. К, А. Тимирязева РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Ю. В. БАЛНОКИН

'■'*.".": Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор II. П. КОРАБЛЕВА,

кандидат биологических паук Н. И. ТИХАЯ

Ведущее учреждение — Институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХП, г. Москва.

Защита состоится г. в ^п?Гг"часов

па заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических паук К 053,05.14 при Московском государственном университете по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук , О. Г. ПОЛЕССКАЯ

. , ; ■ , . / ощая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ . ПРОБЛЕМЫ. , ' Способность-, солеустойчивих ' .; растений осуществлять жизненный цикл при высоких концентрациях ' солей в ; среде ' в значительной степени реализуется за счет поддержания низкого уровня ионов в цитоплазме. Ионное годаостатироватга датоплазмы мокко рассматривать как основную стратегию солеустойчивости, проявляющуюся на клеточном уровне '{Балнокин, Строгонов, 1985;. .1969]. , Механизмы ионного , гомеостатирования позволяют галотолерантным организмам избегать . нарушений в обмене, веществ,, которые были '.. охарактеризованы как , токсические адакты .солей [Строганов, 1962). В связи с втим, ■ исследование механизмов ионного гомеостатирования растительных организмов, обитавших в средах-о высоким содержанием Na+. является одной иэ. актуальных задач ''фитофизиологии.. '■*. •

Важнейший вклад в регуляцию цитоплазматических концентраций ионов вносит плазматическая, мембрана клетки.. В , .условиях высокой солености среды она ограничивает поступление ионов снаружи и обеспечивает их выведение нэ клетки за счет использования метаболической анергии. . . *

У растительных организмов, обитающих в средах с высоким содержанием солей ¿ 'на плазматической мембране поддерживаются градиенты электрохимического, потенциала Ка+ большей величины, "'V чем у растений пресного фона (Raven, 19765 Медведев, 1965].

" Исходя из атого, можнр предположить,■ что плазмалемма клеток ■ •. галотолеранпшх растений обладает специфическими механизмами ■ активного', транспорта Na+, которые отсутствуют в плазмалемма клеток растений ' 1фесиого фона. Считается, что у высших растений-гликофитов и пресноводных водорослей Ка+ выводится из ' ■ цитоплазмы, посредством механизма ионно-обменной диффузии, '.через На /н+ антипортер. Последний использует для этого анергию' градиента электрохимического: потенциала протонов ■— - » генерируемого К*-АТ®азой шюзмалеммы {Sze, 1905] .

■ Активный ;транспорт » Ма+ через шшзмалемму - у. галотолерантных растений изучен мало. В наименьшей степени . исследован вопрос о возможных механизмах первичного активного

ЦЕНТРАЛЬНАЯ > \ НДУЧ 1 гмаПИОТЕКА I : ,

Mow. ч —5:1 академии Г

трансиорта этого ' иона. Поэтому актуальной является задача ' идентификации и исследования свойств йа^-транслортируадих систем в плазмалеммэ галотолерантных растений'.

Галотолерантныв шкроводортсли-эукариоты, ' обиташие в • морской вода ' и. минерализованных водоемах являются удобной моделью для такого рода исследований.■ ;-' ."*

Исследование ион-транслоцирующих систем,' локализованных в плаэмалемме, наиболее успешно может быть 'осуществлено" на выделенных; везикулах этой мембраны tsze, -1955]. . Однако в литературных источниках практически - отсутствуют сведения о выдолонии из ' галотолерантных : микроводорослей - везикул 'плазмалеммы, сохраняющих барьерные свойства ,по-отношению к яоням и функционально актилных. " '

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы: было изучение '" Na*-транспортируицих систем ■ плазматической мембраны морской '.;'■'.■ микро водоросли FJatyeon** viridis. В связи с »TOM, на посредстве пко в задачу работы входило:- " '

(I) Разработать метод выделения чистой фракции плазматической , . ■ мембраны из клеток р. viridis, функционально! активной . по , отношению к транспорту И* и На4"; ■ * . * :

(3> Исследовать свойства АТФазной активности препарата плазмалеммы и сравнить их с известными свойствами Н+-АГФазы „ / штэмавокмы высших растений и пресноводных водорослей; '■ (3) Исследовать АТФ-зависимый транспорт Н+ и иа+. на выделенных везикулах плазмалеммы и идентифицировать системы первичного и вторичного' активного транспорта ионов Na+ в плазматической . мембране р:viridis.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате проведенной работы впервые *.. ' предлокон метод 1 выделения ; шсокоочшеяной • фракции : плазматической мембраны ' из морской одноклеточной' водоросли " р. viridis* сохрадяшей барьерные свойства по-отнотенкп к ионам ' Н* и Na*. Выделенные ■■ везикулы ■ плазмалеивды ' обладают '.И*-. и к»+-транслоцирующими активностями. Показано,' что АТФазнця активность плазматической: мембраны р. viridis по основным характеристикам сходна ' с Н^-АТОйаой'■■ плазмалеммы ■ высших " , растения глико^тов • и . пресноводных водорослей. . Однако', ; по некоторым свойствам она'отличается от последней;-Основные *. различия отнесены к функционированию двjx транспортных АТФаз в' "■:.;,■

' плазмалемме р. viridis. В суспензии везикул плазмалеюш впервые для'• ..галотолерантных микроводорослей * продемонстрирован ' "транспорт. осуществляемыйвйнадат-чувствктельноа АТФазой. . ; Диссипация под ■ действием ионов Ка+ созданного работой этой "• АТФазы протонного градиента указывает на ' функционирование в плазмалемме р. viridis вторичной активной транспортной система ' - Na^/H* антипортера. ■ ':■■ ■'

' •' . .Впервые для галотолерантных водорослей показано, что в условиях когда (¿v^ на мембране отсутствует, поглощение ионов Na* везикулами- осуществляется посредством первичной активной ■ . транспортной- система электрогешой Na1"-АТФазы.

* ФункционированиеМа+ -АТФаза -в: ллазмалемме; р. viridis отражает адаптацию этой водоросли'к условиям высокой солености среди и V одновременно щелочных pH. ■'•. , - ■ у.. ■-■.-...'

. Фактическая значимость работы, полученные результата"., ^■ мо1^т: Шть. использованн для разшт1«1исследованиЯ на уровне^ ■ ; клетки в - области солеустойчивости растений» " в : частности, механизмов : ионного гомеостатирования : V цитоплазма : у галотолерантных . водорослей и высвих растений-галоСитов. Разработанный' метод выделения-плазмадеммыр. viridis может быть использован в' исследованиях; различного - профиля (физиология, ■ 1 биохимия,. биофизика, ■ молекулярная биология ¡ 'растений), ; проводимых'с использованием галотолерантных микроводорослей в -..' качестве об'екта. • • "*; "y.-V;'', '■■;:.■<"'

. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований' были доложены ■■ на:;: Всесоюзвом совеианш; -"Клето,шы9. механизмы адаптации" (Чернигов, 1991), т ; Международном , молодежном симпозиуме . ^Регуляция метаболизма" в - растениях".' (София^ I99J), XV Международном конгрвссело биохимии (Реювот, 1Э91), и С «езда Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1992), Неждународаом' симпозиуме по физиологии, биохимии и генетике" . солэустойчивостя растений ,(Тавкент, 1992), viu Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Антверпен, 1ээ2>. . • : • "' л • • •. ' ;V-*'v''v> ■

.ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано II печатных работ. \ ■-";..■■; у'.'■■'/ ■■'.■> '■■ ■ у-- /' .■.

СТРУКТУРА VI. OB'Bi РАБОТЫ i Диссертация изложена* на 124 : страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора ■ •

литературы, экспериментальной; чести, заключения * и выводов: Работа содержит 6 таблиц, 21 рисунок; : список литературы включает 178 наименований.1 / ' '

; ОБ'ЕХТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. . • ; . „ '.;'•'

Об'актом исследов а рия служила морская одноклеточная микроводоросль pittysents riridivi ■ культивируемая-на стерилизованной искусственной морской воде; (ШубравьЙ, 1933).: Препараты плазматической' мембраны получади из 7 л культуры, находящейся- в конца логарифмической стадии роста. Дезинтеграции клеток, осуществляемой с помощью гипотонического шока,' предшествовала ' обработка , ' клеток протеолитическим • ферментом (трипсином), которая . приводила . к частичной деградации гликопротеиновой клеточной оболочки. Последующий мягкий 4 гипотонический оок - вызывал - образование цитошгазмагической "каши,"''выходящей'через/' отверстие.-' в; клеточной стенке, которое появлялось в 'реэультате сЮработки клеток трипсином. ..Цитоплазматическиел' капли, • ■ осйждалй. центрифугированием на скорости15000g,:. .получая ; грубую, мембранную вракцмо... Дальнейшее, разделение мембран и ■ очистка лдазмалемьш : осуществлялись центрифугированием грубой мембранной фракции в:ступенчатом градиенте'плотности сахарозы (Balnokin et «1,, 199Э). . v.;. ■ .' ■*_■" '-ч\ 4 "''"V'

. При выделении плазмалеммы в качестве .' маркера ; sroJt .мембраны использовали радиоактивный который ловаяентно

' связывали с внешними белками плаэмалеющ. Связывание метки с плазмалемчой .... . осуществлялось-. ■;/■-.согласно■ 'методике-лактопороксидазного/глшозооксндазного иодирования клеточный, поверхностей -(Hubbard, Cohn, 1972). Процедуру связываний метки с; плазколемиоа осуществляли -после обработки ; клеток трипсином, когда образовавшееся.в меточной стенке отверстие открывало доступ компонентам реакции к плазмалемме. -

АТФ- - гидролазнур активность препаратов (а так жо другие 'фосСогидролазные активности) . определяли, по. - высвобождении неорганического фосфата из соответствуйте го фосфосодаржаиего ■ субстрата..При изучении действия ингибиторов проводили 3Q мин'

1 предынкубацию мембранной, фракции с действующим агентом при -

комнатной температуре. ' "

' -: Содержание неорганического <Ьосфата определяли по методу Картера' иКерла (Carter,- Carl, .19B2) с использованием малахитового зеленого. .*■

Активность штохром с оксидазы . а так же антимишга А ' нечувствительной • НАД(Ф>Н-зависимой цитохром' с редуктазы ■ определяли'спвктрофотометрически (Hod^ae, Leonard, 1974).' '. J.' Хлорофилл ' определяли по Джеффри (Jeffreyt 1973).

.•■'Содержание Селка ' определяли по методу Симпсона и .Сомма (Slrcpaon, Sonne, 19Э2). ■■■■■

.- • -Наблюдение АТФ-эанисимой генерации Аг>Н на. везикулах . плазмалемш; - а так не. На+-индуцируемой диссипации ¿pH , осуществляли, .спектрофотометрически, регистрируя изменения огггической шютности рН-индикатора акридинового оранжевого., .'"■ UO)<Sohuldtner et al., 1972) В двуВОЛНОВОМ режиме (¿492-540'

па спектрофотометре Hitachi 557, Япония. - 'Г - '. V Транспорт ионов' «а* через везикулярную мембрану изучали .также с помощью i5iiNa+i регистрируя поглощение 22Ка+ везикулами " плазматической мембраны; мембранный материал переносился на нитроцеллюлозные фильтры, на которых производилось определение радиоактивности'(Heemer et al., isso).

. ' • • •• РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

'. I .Получение препаратов плазматической мембраны.

В настоящей . работе. предложен метод получения высокоочэденной фракции ; плазматической мембраны . из морской микроводоросли PittyBonaa riridit. Частичные протеолиз гликопротеиновой клеточной* стенки р.viridis, осуществляемый трипсином, с последутаим мягким гипотоническим шоком позволили дезинтегрировать клетки p.viridig таким образом, что уже на ранних: стадиях процедуры'выделения плазмалеммы ее можно'была отделить от большей части других клеточных мембран и органелл. Послелуадее . дифференциальное '.'■ 'центрифугирование ' и. центрифугирование в ступенчатом .градиенте плотности сахарозы (Рис.I) привело к практически полному отделению плазмалеммы от оставшейся части„загрязняющих мембран и органелл. О положения '

ллазмалеммы в градиенте судили по распределению радиоактивной метки, т.к. в данной работе был использован в качества

искусственного маркера плазмалеммы. Радиоактивность дала один пик в градиенте, показывая, .что метко связалась специфически .(С поверхностными белками).. Фракции градиента,' в- которых регистрировался .максимум радиоактивности . (фракции 7-II, Рис.I), были практически свободны от загрязнения тилакоидами и митохондриальными фрагментами. Маловероятно также,. ' что мембраны эндоплазматического ретикудума присутствовали в этих Фракциях. т.к. для фракшготфования в ступенчатом градиенте: был использован мембранный материал, полученный осаждением при скорости центрифугирования . J5000g, ' тогда как . осаждение вндошшлматического ретикулума. требует- высокоскоростного центрифугирования: (около 100000g), Регистрируемая; в -этих фракциях антимдадин А --нечувствительная НАД (Ф)Н-цит01ром с оксидоредуктаэная активность ík свидетельствует, о загрязнения исследуемых фракций мембранами эндоплазматического ретикулума/ т.к.показана, * что оксидоредуктазные '. активности ассоциированы также и о плазматической мембраной растительной - клетки {IvariKlna, Novak, 19Э1 ; Lundborg et' ^l.,; 1931 >. Во "фракциях 7-И градиента регистрируется. также . пирофосфатазная активность, но : это не означает . загрязнение фракций тонопластом, т.к. (I) в'клетках /».V^rfi®.отсутствует крупная■ центральная вакуоль, (2) АТФаэная активность фракций 7-И не подавляется нитратом, (3) свойства шрофосфатазной активности . фракций 7-П градиента отличаются ' от свойств пирофосфатазы ' тонопласта клеток растений, <4) - хотя н+-транслоцируизая пирофосфатаза считается маркером тонопласта; пирофосфатазная активность, - обнаруживается также и в Других клеточных мембранах, в том числе, и в плазмалемме (Klroch et al., 1989J - Williams et al., 1990). . '' ■ :: i-- cS-r-- ';>'.'

Центрифугирование мембранного материала/.содержащегося во фракциях 7-П ступенчатого сахарозного градиента, . до 1 равновесного состояния в, линейном (15 - СО О сахарозном градиенте (6 час при100000в) показало, что мембраны фракций 7-Н ступенчатого градиента. однородны И практически не содержат примесей (Рис.2). В градиенте сформировалась. только , одни полоса при . плотности J,14 ■ - 1,15 г/см3. Мембраны,

=■' Рис. К '- Рапрелелениа ■■ оелка и ■ маркеров меморан пра центрифугировании грубой мембранной,фракции из р, viridi* в сгу* ;" пенчатом градиенте сахарозы.- л: 1 - селок (мг/фр) ,2- радиоэх* тивность (раси./»ош.4р); в:. 3 -хлорофилл <мг/фро» 4 - гшрофос— ' - фатаза (нмольРн/фр.мин); С: 5 - цитохром с оксидаза (нмоль цит/ фр.кин).'6 ~ антшшмн А нечувствительная Н4Д(Ф)н-цит с оксядо- " редуктага (нмоль цит-с/$р.иин>; в: 7 - АТФаэа, измеренная ■ в ■ стандартвой реакционной смеси, 8 - дТФаэа в присутствии ЬО мЫ

. , ■. * ; ю .. :' номер фрагаиш .

Ряс.2. Результат цввпжйггяхван»* ; фракций ? - И ступенчатогоТраДиен га в линейном сахарозном градиенте.' ,1 - белок (мг/фр.). 2 - АТФеда, *з-мереняая в стандартаоЯ реакционной смеем, 3 - ЛТФаза в присутствии 0,1 мИ:ваяапата, 4. - плотность градиента (Г/МЛ). ».-"■■■ ■■..; .■

20 30 40 г

i^-'v'",-' че2*» мм'

Рис.Э. Влияние м«г+ и с*г+. ва АТФаэную ектдвнооть препаратов плазыалешц р. riri-tfi». I - KgClg. 2 - 0»CJ2 '

АТФазная активность'выражена в икмоль F„/w оелзд -■.час. • г- ■ •■■

оораэупдио ©ту полосу -обладали' ванадат-чувствительной, Но^-нечувствительной АТФ-гидролязной активностью, что является • -характеристикой АТФаэы плазмалеюш. • - •

Совокупность представленных данных, свидетельствует., о .том,' \ ? что фракции 7-11' ступенчатого сахарозного'градиента содержат; плазмалемму, которая практически но :, загрязнена .другими / клоточными ■ мембранами. 'Поскольку, в ступенчатом . сахарозном градиенте плазмалема располагалась над верхной ступенью <15* ■ сахароза), в дальнейшем при выделошвд шюзмалема ' вместо -... ступенчатого градиента применялась 15 * сахарозная "подуста"»

2. Свойства АТФ-гидролазной активности препаратов плазмалеммы -

Р. --л": ':

; Исследование • свойств ;•; АТФ-гидролазной ' . активности 'полученных ; препаратов штзмалешш V было предпринято с целью сопоставить эти свойства с известными свойствами К^-АТОазы' . плазмалеммы растительных клеток. . к";,.''.''О'-!.-,V;

■ Гидролиз , АТФ/ катализируемый■ фракцией плазматической; | мембраны р.*1г1<Ня зависел от ионов Ив2*» максимальная - скорость гидролиза достигалась при Б-!0 кратном избытке ионов -. ' Мв2+.над АТФ в реакционной смеси (Рис; 3). Замена ионов ¿в2* • на ионы : Саг+ приводила к существенному снижению скорости гидролиза АТФ (Рис. 3); У "у;■■;:;;'•'

Кинетика гидролиза ; АТФ, катализируемого•' препаратами . плазмалемш описывается кривыми . с . насыщением ' •

' (Гис.4): данные, представленные; в двойных обратных, координатах ■ . (Рис. 4, вставка) показывают, что; только при низких " . концентрациях субстрата гидролиз АТ& описывается; кинетикой ? МиХаэлиса - Монтен. Ку я определенные исходя кз линейных

■ ", участков на гра4ике Лайнуивера-Еорка, лежат в диапазоне: К^ = ;! ■ 0,10 - 0,14 Ш, » 1? - го ккмоль Р„ /мг белка » час, в зависимости от концентрации АТФ и и^ в реакционной смеси.

Гидролиз АТФ, катализируемый препаратами плазмалеммы. р.осуществляется в широком ; диапазоне ;рН, включая ••' крайнюю полочную область, и имеет выраженный оптимум при рН 6,5 - 7,0 (Гис. 5). • ' ' -у-;Г .

' Исследование • действия юпибиторов различных' АТФаз на '• • АТФ-гидролазнуо активность препаратов плазмалеммы р. *ш<И* .

= : 15

lo

«б

• ь, .6 7 6 9 io ■.■

• " • Рис.Б.рН-зависимость АТФазной ■ е.;".активности.препаратов плазм«-

-.;.>'.леммы p. viridis. Активность . • • •• ' > ' ' выражена в мкмоль Р„/мг белка ■

, V/. V/\4-, . , - г ' •. . .''час. • Н

: Рис.4. зависимость АТФаэяой актив-2 ■ . ности препаратов плазмалеммы p.vj- •••:....

rid is от концентрации АТФ при ( I ) . • • - 0,5 мм iteCi«, 1г> - 5 или .10 moi

ioâ

50

if 4

V Л • -I,>''.»:

у

. !„ : '

3

.', "а"-

-г

у ЛО'У . 10^ 1

300 -

600

соль; m

Ш~? / to"* . 1С кнпйитор; au

рис .6. Влиянии ингибиторов на АТФ— Рис.7.'Влияние KOI (t> о ;

взнув шшгвшеть препар&товтплаэ- ч HaOl (2) ва АТФазну» ак-''

малеыми p.rtriai*. I '- ванадат, ■ ^ тиввость препаратов гш>- :

2— dccd, э - *»втнлмалеиыид, ^ змалемма p. riridia. Art- '

4 - DE.Активность выражена в % • ... явность шражена в * от от контроля. ...у- ч''контроля.

■ показало, что специфические ингибиторы митохондриалышх АТФаз . олигомицим и азид» специфический ;' ингибитор кислых*. фосфатаз "' молибдпт, ингибитор. АТФазы^ тонопласта нитрат,'. ■ уабаин г, ' ингибитор Na+, к+-АТФаэы животных - " клеток- . . неоказывают Г . ингибирумцего действия на исследуемую активность, ' : "•'

Ямиболов сильный ; ингибирупаий эфСект оказывал ванадат <Kj » гь - 40 мкМ), эффекттшшй ингибитор Н^АТФазы . штзматичоской мембраны:* растений; , дициклогексилкарбодиимид , '' (DOCD), посиоцифический ингибитор Н^-АТФаз, и лг-этилмалеикид/ i • < .,. сулфгидрилъиый роагоит, также подавляли исследуемую АТФазиую ?;.

активность (KI>5(j « - 60 -75- мкМ в : jtj ' =• 250 ыкМ, ; соответственноДиэтилстильбёстрол неспе^щфичесясий; r V

ингибитор мембранных АТФаэпрактически не влиял на исслодуемую АТФпзную активность (Гис.6). . .';' ; . • ' . ..

, Препараты " ■ плазмалеммц p.vtridis . с .' одяноковой оффжтишюстью осуществляли гидролиз АТФ и пирофосфата;; " . ' скорость гидролиза этих субстратов была существенно выше, чем . .' '

других, nponepomwx фосфосодержлвд« соединений;(СТР,СТР, игр, : ' ■ арр, хпр, аир, pNrp). Как . обсуждалось выше; - способность . / препаратов плаамалеюш p.riridi* . осуществлять ,' гидрализ • • • тфофосфпта не связана с; загрязнением препаратов плазмэлеммы ' тонопластом. Пирофосфатазная активность, по-видимому, врисуад

■ плазматической мембране г. riridi»\\ : : '(.?.-' ■ 1

В присутствии агента, снимащего протонный градиент:на •/• мембране (1>ротонофор.кврбонилш»п11идхлЬрфенилгидразон; CiCCP), скорость гидролиза АТФ препаратами пдазмалеммы увеличиваюсь - / s (.5 - 2 разе; Это указывало на то, ': что в получаемых препаратах 'плазмалениа r (I) аамккута ' о везикулы, . (2)■""•'. _ '■ проницаемость* мембраны; по', отношению' к. Н* сохраняется на'*■ достаточно низком уровне. . ."••' V. / .

' Одновалентные катионы • (К* . и На4) ; регулировали ' ; '

■ исследуемую активность, причем : зависимость' стимуляция. от. • '.■■■ концентрации катиойов имела необычный характер. , Вио ! •,•

обнаружено . -'лад : ■ концентрационных '-.максимума т cnMyjMUHB;V';. J одновалентными катионами: один в области 25 - 75• »Л; соли, другой - п ' оДяастн; ISO -400 Ш (Гис. 7), \ Синергизм в ■ ■■-'■ стиму.^зти исследуемой АТФазнгЛ - активности " вгнауи К* И \ отсутствовал, что свидетельствовало грел® ^укзеягнкровзния. в.'-' >

;':-.■'■■■ ■.;. - ,-.. • -J3- .■■■...,■ - *

•плазмаледае " p.riridSs_n&+tк+-А1М>азы, , подобной Ка+д+-АТФазе \ животных 'клеток.' ."■' -V \

Таким ' образом, • проведемща исследования показали, ' что свойства:; атф-пмролазной; активности препаратов плаэмаломмы

- p.'vtridis во многом сходны со свойствами Н+-АТФазы пла'змалеммы "высших растений-гликофитов и пресноводных водороолой. Это -оптимум действия"при рН 6,5 7,0. требование ионов Mg2*» но

: не' саг+.;для активности; специфичность к АТФ кок к субстрату, ' стимуляция. - ионами К*, йнгиоирооанио :/ ванадатом, •'* dcod и лг-этилмалекмидом, ;нечувствительность к ингибиторам других ' клеточных /- ; АТФаз.Сходство.■ 1характеристик.. '. Позволяет предположить,' что в плазматической 'мембране p.-viridi* tфункционирует фермент, аналогичный протонной помпе"плаэмалеммы" высших растений. /. _ ■ ■■''./. ' ■

'' -:В "то.: же время; имеются'' отличия. ' Такие 'характеристики ;АТФ-гилролазной активности препаратов плазмалеммы р, vlrldlo, ■ как' треОование -избытка! ионов над АТФ для максимальной, активности фермента, низкие значения Кц; нечувствительность к ,' dbs .'могут . выть . " об'яснены ' особенностями : липидного состава плазмалеммы viridia, .'которые,, возмоюго, свойственны р, viridis /как .' галотолерантноЯ. - микроводоросли - (Sheffer ■ ¿Val., 1986). : . •'.' у ... '•:;.'..•' . . "

-;. Вместе '-с. тем, • некоторые отличияЧ; свойств .' исследуемой активности от свойств обычной Н*-АТФазы плазмалеммы высших растений : могутбыть связаны с функционированием, помимо .Н^АТФазы, еое одной АТФазы --в плазмалемме • p. viridia. .Эти ^отличия: (I) относительно высокая АТФ-гидролазная активность препаратов плазмалеммы p. viridia в «елочной области, (2) два концентрационных максимума стимуляции одновалентными катионами ' исследуемой АТФ-гидролазной активности. - '• .' ■

v: :Следует отметить; s что идея о функционировании второй АТФээы (возможно, ''.;...На*-транспортирувдэй) ■ в .' плаэмалемме галотолераятных мшфовддОрослей1 возникла 'также на основании

- данных,'' полученных в ;экспериментах иа интактных. клетках галотолерантных водоослей' сип»а»и» таг Шве (Балнокин; Нехведег, Л564) и р. viridia (Галкияа, Балнокин, J99Z). в этих работах било, «обнаружено, что ;траяслорт ионов* на* через плазмаледау•" галотолерантных ' 'водорослей, не -всегда . "можно

: Ьб'яснить. функционированием • вторичного ' На+/Н+ антигюртера,: ' ' - анергизуемого работой 1{*-АТФазы.' ' • '••'"••'•.': ''•;• "''.'"'•' " V. • '•' ■ Следующие - эксперименты, проведенные ' вами на везикулах плазмалеммы •* р. viridis, . показали, ■ что _ . в-.;- атой. мембрана.. / ■ действительно функционируй/ два механизма1 транслокация ионов с Щ ■ • ; " н»+.:Это: ' (I) К*-АТФаза-'завио»^\га+/И+/антипо]^^^ ,(2) Ацц+ , -/ независимый, • АТСН1шдуцаруе)^ : Na^-у^орт ;^-Дма%трансдоцируюцая АТФаза). /, :*■''■'*,'.■''■;/■/''-S-.'Фт-'-^Л'У-'У'^--'?-' '

3. Н*-граяслоциру»дая АТФаза и NaVa* антйпортер •; в/.-плазматической мембране p. viridïs.:J ■"■'. ;

Добавление AT® к реакционной. смеси,' содервадей'везикула, '- ; . плазмалеммы >.Virirfi» и зонд на-ДрН АО приводило к уменьшению />*• оптической плотности АО/(Рис. -, 8),- Это- свидетельствовало ; о '.../ эакислении внутривеэикулярного пространства,/' обусловленном . • ' -.АТФ-зависишм • переносом • И*~ ; внутрь.■ везикул..- • Добавление •

протонофора oiccp приводило: к быстрой диссипации созданного ' ; протонного градиента i - Вавадат' в значительной: степени умешш'ад - 'у " водичину созданного ÄpK (Рис. 8),' что говорило об ; участии " V ;

ванадат-чувствительной АТФазы в генерация АрН на везикулах. Об . -. ". *" / элоктрогенной природе; протонного насоса мовно было' - судить по : тому,', что генерацию АрН на : везикулах' удавалось наблодать i / . . ;■ 'только; в' присутствий-ppomií^^ ■

■ ко^ н ci". * ч/\. ' • • ; ; '•.,/''///.//'".• \y;¿:''.v '; * /; .' - ..

'• /Величина' генерируемого - na-, везикулах плазмалвюю/ Àf« ; зависела от. pH- реакционной с№св,досп^ая максимума iipra pH \ * 6,0 - 7,а.я резко;спадая в «¿лочной области; У» про рВ 8.0 • • ' практически; не :. удавалось наблвдать! формирование АрН ва '■;>■* везикулах (Fac.9). с. . .... ;--. .v . ÍV'"' •' '

Ионы Na+ вызывали дйссетацво протонного . градиента, : * ■ вредварительно:. ооэданного ... 'ва; "везикулах / работой Н*~АТваза • : ;

: (ГЦсЛО)". - Зависимость скорости . рассада. АрН: о* конце нтраша > . вносимого Na+ • описывается •' кривой . с насиеивем (Пво j • II).':' * : ¡, Экспэримант'адьная кривая мо»гатбцть;дап1юкшировава кривой, описываемой уравнением tenasjmca- Ыентеп о Кц ■ 10 (рис«'у ,..-/ • И, "вставка)» Это ааачешв Ку леягг s ряду щутраклегочша i "v ' концентрадай Ка+ у-галотлеранташ: ^Шфоводорбсигай Ч^двадев,'! /í; "

АТФ '.•"•.;. ■ ' у ■ - 01ССР у.:" 1 /^"СХССР /; IJ.

492f540nra 1

0,0?6 Q.D.V

гоосек \ ванадпт ,

■ Рис.а. АТФ-зависимая генерация-ДрН на везикулах плазмалеюлы р. Пг1<Иа. АТФ,1 С1ССР, в ванадат 'вносили в реакционную смесь в конечных концентрациях: I мм, 12 мкМ и 0,1 мМ, соответственно.

Рис.9. Зависимость величины генерируемого на везикулярной мембране р. viridis Лрн от pH реакционной смеси. По оси ординат: относительная -величина образующегося ЛрН, .выраженная в %.

Рис Л О."Диссипация Art! на везикулярной мембране, р. viridis под . ■ действием ионов» иа». -1.-

Рис.п. Зависимость скорости распада 4рН на везикулярной мембране р.viridis от IKa+J.

1 - экспериментальная кривая.•

2 - теоретическая зависимость Михаалиса - Ментен, Ну-Ю vU.

Наблюдаемые Na+/H+ обмен был специфичен по-отноаеяию к .• ' : ионам ' Na+. Замена Na* другими катионами (К+, ^И*, Св+> . •,г приводила к снижении скорости диссипации ЛрН (Табл. I). . '..'"•''•

Катион* : ■ Относительная скорость : ■ , >

■■■ (100 мМ) .'; диссипации. * "t '' 1 ' ;.. -'V ^ *'..':. •."''.'•'

• . ' —-———--—-- ... '-...—— таблица I. Эффективность

* :. Na* 100' диссипации лрН на везику- . :

к+ ■ ' 22 1 : лах плазматической мемб- • . ; .

, • Се4'- ' ' '10 . : раны P.viridía под деист- • ■

.' Li4"; о *".' ■ вием различных катионов. V .'

Эти катионы также госгибифовали WaVH+ обмен, если были внесены в реакционную смесь до того, как туда, был внесен Wa+ -s. ' (Табл. 2). Амилорвд, ингибитор Яа+/и+ антшортера bÍ''животных-.' " . „ клетках; и в: тонопласте < растений, ингибировал так же ;Na+/H4:'' 'обмен, '' наблюдаемый■ .' на'' везикулах ■ ■ плазмалеммы r.'rirJdt* . (Табл.2). .-'^....V-v- V';-. *';/ í*. V '■ ."Г-" ■:: \ '] ■ -V-v. ■

' Агент ■ Относительная скорость • . > í ■ .■:.. ,■■; '

. '■" " ; •.дисситации, % ■ , , .' • ,i¡ '■■:■'■>"■ -''.-i-":. .-.'■■

■ ■ ■ . ' ■'■_ _"';.'' '-;■■- У ———- Таблица 2. Кнгибгрование

^ . ltacx, ' 100 mW :■ IÓO '' \ Ná+/n* обмева на веалкулах ' .-",

/ +KC1, ' 100 кМ 28 ., плазматической мембраны '•'

. +L1C1, 100 ММ . 37 . .' - ; - : i р. riridiM. Катионы вла :

♦CsCl. 100 мМ "ч. ' 20 •'' емилорид Оыди добавлены до''

♦амилорид, л1*. ■ JO . : внесения N»*. *.'-'::'

■ - \ о.гш .'. у •.-./'у .-V-.V -у'Л^учУ1 У

У у--У i. АТФ-зв'висимое поглощение ^Wa везикулами плазмалеммы % ■■1' -■■'p'.yifidis. >' Эксперименты проводили - при:.'двух';-, значениях рй ;

■ инкубациошюй среда - pH 7,0 в рй 8,0. Пра pH 7,0 вабдададсв - иекспкйч генерации ¿pH на везикулах алазмадеыш p'. tirläim. V, (см. Рис.9),однако в акспериментах с ^а* практически ие ; . ■ удаЬось 'наблюдать поглощэние .вазахулакз.,: обусловлашое ^ работой вторичного'йа+/И+ аятотортера'(Рис. .12, А, г).'Причины . ■:;;'. • ■' ^того не ясны, но, поглощенае- ^^йа4 везикулами, осуществляете

в присутствии экзогенного Ма+/н+: обмеяника моненсина (,Рис. 12, . ' А» 4) свидетельствует о том, что ЛрН на мембране генерируется и в условиях этого.эксперимента. . . - ■

АТФ-завискмое поглощение 22На+ везикулами плазмалеммы при рН 7,0 наблюдалось • так хе в. присутствии лротонофора С1ССР . (Рис.12, А, О), который, снимая АЦ^ на мембране, кнгибирует • : поглощение -22н&+, обусловленное ' работой ЛД^»- - зависимого ■ Ма+/н4 антшюртера. Следовательно,'набладавшееся при рК;7,0в . :.: присутствии 01ССР поглощение■ везикулами ионов «а+ было . обусловлено: работой Ац^ - независимой кга+-транслоцирующ9й " системы. ■! V-:Ч, ■ ' ... . ■ - ■ \ * .* / 1 .

■ -V; V<'■..;",Y: Время.после добавления ATO, мин ■'. '. ''.'.■

Phc.ÍZ. атф-зависимое поглощение ^ка4 везикулами плазма-.< .. леммы р. г iridia при рН 7,0 и 20 мм Maci в реакционной смеси (а) или при рН 8,0 и 50 Ш Nací в реакционной смеси (В). I - контроль (без атф), г -г мм атф, з - атф + гг мкм сюср, 4 - атф + ' 12 мкМ моненсин. Символы: < » )- контроль, (x ) - 2 Ш атф, (а ) : - атф + 12 мкМ СХССР, (д ) - атф + -60 мкм амилорид. По, оси ординат: 22иа+ в везикулах, расп.мин.х1О(-5)/мг белка.

- При рН 8,0, когда не. наблюдалось формирования ДрН на . . .. везикулах плазмалекмы р,vlridis (см. Рис.9), АТФ индуцировал поглощение ^а4 ввзякулаш(№сЛ2,В). Зто поглощение не зависело от присутствия ciccp и не ингибировалось амилоридом. • • Результат» последних экспериментов позволяют " сделать ■ ^ вывод, ■что в плазматической мембране p. rJrJdia. функционирует

ХТФ-индуцируемый, - не зависший механизм транспорта ионов ' Ыа+.* По-видимому,,этот механизм есть первичная • электрогенная ' Ва+-транслошрущая АТФаза. 00 электрогенности свидетельствуют-следушие факты. (!) При нейтральных рН, когда Непроводимость мембраны 'низкая, АТФ-индударуеиое поглощение ггЯв.+ .везикулами можно, было наблюдать лишь в " присутствии; протонофора 01сер^ .C1CCP индуцировал -отток. Ht ■ из везикул,: и/ этим, снимал

• электрический потенциал .на мембране.: который генерировала . На+-АТФаза, транспортируя ионы Иа+ внутрь везикул. (2) При щелочных рН, когда мембрана становилась более проницаемой для протона (см.Рис.9 а раб. Bleson, Walker, 1931), Clсср ве влиял на поглощение везикулами. ■■■'-.,,' ■ ,т ■ -. чJr'.-

. ■ ' ЗАКЛЮЧЕНИЕ ''

г Таким образом, в результате проведенной . работы получен высокоочишешшй препарат плазмалеммы F. viridte. Выделенные ввзикулн плазмалеммы обладают н+- и - Na+. - транслоцируадими активностями и способны удерживать . градиента этих ионов, что позволило использовать препарат в качестве модельной системы ' доя идентификации и исследования свойств Йа^-транспортирущих

• систем плазмалеммы p. vtridts. ■'у - ■ * . ;

Проведенные .. на - ' выделенных . везикулах . исследования ' транспорта ионов показали, что в плазмалемме' -..>. virldi* функционируют две Ка^-транспортирушие системы: (I) Ил*/и* анпшортер, который осуществляет вторичный активный транспорт ■ на+; источником анергия для него является Aff^f, генерируемый первичной ^-помпой (Н+-АТФазой), (2) первичная електрогекная Na^-noMna (Na+-ATSo3a). .-■ ' • '/ .. ■":'. V

На+/Н+ . антипортер, использующий »н ергшо i^ - , функционирует в мембранах клеток' как вукариот, ' так . в прокариот. У еукариогических организмов он- обнаруживается а (мембранах животного и растительного , происхождения, а у растений встречается как среди гликофитов, так и галофнтов.

''. Чем - может быть обусловлено наличие : ещё : - одной Ка*-грансдартирущей системы:. - первичной., : Na+- помпы в плазмалемме p. viridlat . .■'>.-'■'■ ■" *■■■:.■■

ч ' Электроне ятральшй Na+/H+ антипортер (1Н+/1Ма+) способен

выводить /ионы Wat из клетки только-тогда; когда,ЛрН на " плазмалемме »направлен из . среда; в клетку {среда более кислая; /чем-: цитоплазма). ,.. В - щелочной среде, , благодаря функции - рН-статирования цитоплазмы, ¿рН .имеет обратное направление, и, .: следовательно, выведение - ионов Ка+ из клетки посредством , электронейтрэльного Иа+/Н+ ¡антипортера яёвозмото. .■■■;•' ' Электрогекный Иа+/Н+ антиггор^ер (обменивает 2 или большее число н+ -на Г Na+), по-видимому , мог Си выполнять функцию 'выведения,Яа+ из клетки при щелочных значениях рН среды,, т. к. движущей . силой, в: 'этом ,: случае ; слукада бы . ■ электрическая составляющая протонного .градиента, Аф. Однако, имеются . сведения,,'.что , прн . щелочшд.ря возрастает непроводимость .штзмалеммы' растительных клеток (Bieson, walker,' 19ао),при' крайне, щелочных рН ¿fig* на- плазмалемме * приближается к О (Bleeoni Walker, I9al) и, следовательно; не может служить движущей 'силой ' экспорта ионов Na+, Таким образом,'; и-электрогенный на+/н+. внтипортер . при: щелочных рНсреда, по-, 'видимому,■ не способен тршсшртировать Ка* из клетки. В этом случае, проблема; экспорта Ne+; могла бы решаться -за счет функционирования первичной ка*-помпы *'v Na *АТФазы. : ■;.'■■ ',-'■■ Последняя продемонстрирована нами в-плазмалемме р', tdridia' .в экспериментах - с , ^Na* (Рис.' 12). . Предполагаемый *"рН оптимум работы,этого фермента (около в,О), а так же активация фермента высокими концентрациями Na+\(Piic.7), соответствуют условиям, возникающим, в - цитоплазме: при гишрошотическбм • солевом шоке^ Концентрация На* ; в цитоплазме в »том случае достигает нескольких * сот *dl (Балнокин"и др., 1990), что приближается к значениям-второго концентрационного' максимума стимуляции:А1Ф-гидролазной активности ионами Na+, а цитоплазма зашелачивается, приблизительно,'до .рН 8,0 (Kuohiteu.et' al., 1909). ; Защелачивание: наружной среди так же сдвигает цятоплазматический рН в слабо щелочную'область (Kugelet al., 1937).; При таких значениях рн■ адтоцлазмы обычная и+-^ТФзза. (оптимум .' 6,5-7,0) функционирует менее эффективно. С учетом того, что при повышении наружных рН проницаемость 'плазмалеммы для прстона увеличивается, ; величина генерируемого ¿(3^+ .может-бить крайне .незначительной, ,*, В ,'этой . ситуации ■ энергизация плазмалеммы Смогла бы .осуществляться за.; счет .работы

'влактрогенной ка+-АТФазы (оптимум рН 8,0). Электрический потенциал, создаваемый - на .плазмалемме' работой';'- На*-АТФазы,:; ".способствует электрофоретическому поступлению н+ в клетку, что ' ' ■ препятствует защелачиваяию цитоплазмы, . когда клетка находится ' '.;*." ' в щелочной среде ■■*■■ (Скулачев, ■ - 1986).' . Следовательно;

электрогенная , Иа+-транслоциругаая' . АТФаза/.'. в ! '.плаздалемме . галотолэршшшх мюфоводоросдей является, по- видимо»лу, :так «е' . и частью системы рп-статирования цитоплазмы. ^г.1^;.;;.

Как отмечалось - выше, на+/н+ ентшортер,^ шергизуемый ; протон-движущей силой; есть универсальная Иа+-транспортиру пцая система, функционирующая в: плазмалемме ' организмов самих : разнообразных таксонов и различных; экологических гругст.У'В ■

■ отличие от . него,; На+-АТФаза является особенностью некоторых'-

, прокариот,' . обитающих ' в условиях ; высокой солености, .'.*■.■ ;

галотолерантшх водорослей и, ^по-видимому,'некото^'"'высших'. ■ .. растеиий-галофш®. : '"■"■'■ ■''

у У.;/'^ : Г вывода - V; .

' 1. Разработан метод выделения . плазматической мембраны. из • клеток морской микроводоросли pi»tyaon^^s Yiridta. X > Л. ;/" '""' ■ ' .2. Полученные везикулы плазмалемма .практически свободны .от."''

■ загрязнения*. '■ другими . клеточными мембранами, способны удерюшать градиенты ионов н+ и Кв+ и > обнаруетвают функциональную активность в отношения транслокация ' етих ионов ■ через мембрану. .■; -'^.'.у "■■','-■ : ■ '■V'"':',.-: ;:'.".'.''

. 3. ■ АТФ-гвдролазная активность полученного препарата '

шазмалеммы 'имеет. черты как сходства, так и различлясо • - Свойствами Н*-АТФаэы плазмалеммы высших растений-гликофитов,' что связано с функционированием в плазматической мембране р.^гЛе«*. наряду с Н+-АТФазой, .еще одной ион-транслощфупцой АТФазы.' - /: ;'■■'.'■ Ч "^у '^-у1-' *''

4. .' В • плазмалеиме .'"■ р,Нг!41* функционирует ваяадат-чувстбительная . алектрогенная ■ Н^-поша (Н^-АТФаза), которая ■ транспортирует ^ .из: щзгаплазмы в наружную среду-к генерирует на мембране градиент электрохимическогопотенциала .- протонов - АДл*. -г;: ' • '.'-."-у.--

•5.. В плазмалемме Функшояирует вторичшй йктивныЯ 'Л-

На+-транслошфупций механизм - Ка+/Н+ антипортер, использующий для выведения ионов wa+ из клетки энерпш

6. Наряду с Na+/H+V антшюртером в плазматической мембране р. viridis функционирует - независимый первичный активный Ма+-транс1к>ртйрущий .механизм . - алактрогенная Ка+-тршслоцирущая АТФаза. .'"

7. Н+-АТФаза и Na+/H+ ; антипортер являются .универсальной' : На+-транспортирующ0й системой, которая свойственна организмам

как пресного фона, так и обитающим в условиях 'высокого 'содержания . солей в ; .среде. ка+-АТФаза ■'. является , ка+-транспортирумщей системой, специфичной для галоЫтрантных организмов.,; у : ;' ■

/СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ' •

. I. . Попова Л.Г.,. Балнокин Ю.В., Мясоедов H.A. Характеристика АТФазной активности плазматической мембраны, морской . одноклеточной водоросли Plmtyuonas Viridis. //Всесоюзное совещание "Клеточные. механизмы адаптации". Тез. докл. Цитология, 199!i Т.33(5), е. 128.- ' , .

-, 2. Попова Л.Г.-, ' Башжин Ю.В., Белов A.n.,* Мясоедов H.A. АТФаза (АТФазы) .плазматической мембраны морской мшфоводорослй Piatynonxs ' viridis. // II с'езд Всесоюзного общества физиологов растений. Тез.док., 2ч., Москва, 1992, сЛ67.

• 3. ■ Попова Л.Г., Балноккн . C.B., - Мясоедов : H.A. Пирофоофатаза мембранной фракции, обогащенной плазмалеммой, выделенной ИЗморской микроводоросли Platyvonta viridis. //II с*езд Всесоюзного общества физиологов растений. Тез.дох., 2ч., Москва, 1992, с.167. * '

- 4. Попова Л.Г.. '_'■ Балнокин.Й.В.,'• Мясоедов . 'H.A..' Лапушкин Е.В., Белов А.П. Характеристика АТФезной активности плазматической мембраны* морскоД ■. '.водоросли piatynonts viridis. //Доклады ■ Академик. Наук - СССР, : 199U т.3|7(1), с.261-256. ■',-" ..■■-.■' ;' ■ " '

5.; Ророта L.C., BaltioJcln' ÏU.V;, Jiyasoedov M.A. Charao teriza t i on of plasma ' membrane ATPase from, вее • unioellular algb i'Jatj'jJiJflei viridis.: //. Proceedings of 5th; International. yoùth symposium "plant metabolism regulation".

■ Sofia. 1991. P.341 - 345. . .. . -"':..

6. Balnokin Vu.Y.. Popova L.C., Myaeoedov N.A. The ATPaae ' aotivity or the ■ plasma membrane of. marine unicellular, alga , Platynonas viridls. // ' 19th Aharon : Katzir-Katohaleky Conference, - Satellite to the 15th International Congress of ;' Bioohemietry,' "Plant Bloenergatioe 'and Ion translocation". Abstr., Rehovot (Israel)1991,' p.2. 1

. . ■. 7- Popova L.C., ' Balnokin YU.7.Myaeoedov ; M.A. Na+-extruding systems in the plasma membrane of . the marine alga' 'Piatymonas viridls. // International. Symposium, on Physiology, Biochemistry and Censtioa of Plant salt reaistanoe. Abstr., Tashkent, 1992, p.64.

8. Popova L.O., Balnokin Yu.V. ■ H^-translooating ATPaee , and Na+/H+ antiporter in plasmalennia of marine mioroalga

Platynonas riridis' // 8th Congress or the Federation of European Boolftties of Plant; Physiology. Abetr.,. .Physiologift Flantarum, 1992, v. 85(3), part 2, p.A15. *

9. Popova L.C., Balnokin YU.V. H+-translooatlng ATFase and Ha+/H+ antlport activities in the plasma membrane of the marine alga Pltttyaonaa 1 virJrfis. ' 7/PIBS , Letter», 1992, ■v.309(3) t p.333-336.' "■"

10. Balnokin Yu.V., Popova L.O., llyasoeitev N.A., plasma membrane ATPase Of marine unioellular alga Pltlyeonaa viridia. //Plant Physiol.Bloohem., 1993. (2), p.159 -168.

: 11. Balnokin Yu.V., Popova, £.0. The ATP-driven Na+-pump in > the plasma membrane of the marine unioell-ular alga Platyuonaa virirfi*. //PEBS Letters, 1994t v.342(2). '.*■>.■

/

Подп. к печ. 26.04.94. Объем 1,25 д. л. Зак. 205. Тир. 100 Тшпогр»ф«я ЦП ГУ жиенв В, И, Левин*

I

\l

■ I