Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ионный гомеостаз у галотолерантных водорослей

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ионный гомеостаз у галотолерантных водорослей"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи О Д УДК 571.17

БАЛНОКИН Юрий Владимирович

ИОННЫЙ ГОМЕОСТАЗ У ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в лаборатории солевого обмена и солеустой-чивости Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.Б. ВАХМИСТРОВ

доктор биологических наук, профессор Г.Н. БЕРЕСТОВСКИЙ

доктор биологических наук A.A. ЗАХАРИН

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится «... ....... ...1995 г. в

io часов

на заседании Специализированного Совета Д 002.45.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Адрес: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Физиологии растений РАН.

Автореферат разослан «.... л..,. ..^LL&.d.... 1995

года.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

Н.В. ЗАГОСКИНА

ктуалыгость проблемы. Высокая соленость среды оказывает на астение многофакторное действие. К наиболее вредоносным, по-идимому, следует отнести осмотический и токсический факторы. Они эрвыми привлекли внимание исследователей.

Еще в конце прошлого века Шимпером была выдвинута концепция физиологической сухости" почвы, согласно которой имеющаяся в эстаточном количестве вода остается недоступной растению из-за збытка солей в почвенном растворе [Schimper, 1898]. Эта энцепция получила дальнейшее развитие в работах ряда зследователей. [Bernstein, 1961; 1977; Slatyer, 1961,, 1967; ainty, 1963; Hellebust, 1976; Jefferies, 1980; Wyn Jones, 1978, 381].

Наряду с изучением солевых эффектов осмотической природы яроко проводились исследования повреждающего действия ионов на язиологические процессы и метаболизм растений. Были выявлены зиболее чувствительные к ионам физиологические функции и звенья этаболизма, а также изменения последнего под действием ионов у элеустойчивых и несолеустойчивых форм растений [Шахов, '1956; грогонов, I9G2; 1973; Кабанов, 1967; Кабанов, Денов, 1973; эонова, Шевякова, 1970; Жуковская, 1973; Удовенко, 1977; 1979; звякова, 1979]. Авторы этих исследований, как правило, связывали аблвдавтиеся солевые эффекты с. накоплением ионов в цитоплазме и непосредственным действием ионов на цитоплазматические юполимеры. Такой взгляд нашел свое выражение в концепции эксического действия солей на растение [Строгонов, 1962; 1973].

соответствии с этой концепцией, наличие .признака злотолерантности у растения обусловлено специфическими зобенностями метаболизма и низкой чувствительностью к ионам щкционирующих в цитоплазме биополимеров.

Такой взгляд, однако, в недостаточной степени учитывал слад, который вносят в способность растения противостоять змотическиму и токсическому действию соли клеточные мембраны, дознание роли мембран в формировании признака солеустойчивости гало возможным лишь с развитием представлений об их структуре и рнкциях. Такие свойства мембран, как полупроницаемость, юсобность создавать барьер на пути движения ионов, регулировать энные потоки путем изменения проводимости ион-селективных аналов, а также транспортировать ионы против градиентов их

электрохимических потенциалов благодаря наличию систем активного транспорта сделали очевидным участие мембран в процессах адаптации растений к высокой солености среды.

Физико-химический подход в исследованиях мембранных функций позволил составить весьма целостное представление о механизмах ионного гомеостатирования и осморегуляции у растений [см. Нобел, 1973; Jescttke, 1973; 1984; Кларксон, 1978; Воробьев, 1980; 1988; Люттге, Хигинботам, 1984; Pitman., 19В4; Вахмистров 1985; Мазель, 1989; Юрин с соавт., 1991; Захарин 1994]. Речь идет о механизмах, проявляющихся как на клеточном уровне, так и уровне целого организма. Однако, работы в этом направлении были проведены большей частью на растениях-гликофитах и, соответственно, полученные данные и сформированные на их основе представления могут считаться справедливыми в основном для растений пресного фона. Механизмы ионного гомеостатирования и осморегуляции у галотолерантных растений оставались в основном нераскрытыми.

В наименьшей степени был изучен транспорт ионов на уровне клетки. В целом, ион-транспортирущие системы, функционирующие в клеточных мембранах галотолерантных растений, не были идентифицированы. Вследствие этого, оставалось неясным, в чем состоят различия между ион-транспортными механизмами клеток солеустойчивых и несолеустойчивых растений. Не было установлено, каким образом осуществляется интеграция процессов транспорта ионов и процессов осморегуляции в единую систему обеспечения водно-солевого режима клетки и как у галотолерантных видов такая система функционирует в условиях гшеросмотического солевого шока.■

Познание механизмов, лежащих в основе высокой эффективности функций осморегуляции и ионного гомеостатирования у галотолерантных видов, в настоящее время является одной из актуальных проблем физиологии солеустойчивости растений.

Цель и задачи работы. Основная цель настоящей работы состояла в исследовании механизмов ионного гомеостатирования, функционируицих в клетках растений, обитающих в условиях высокой солености среды.

Сложная • система межклеточного транспорта ионов в высшем растении создает немалые методические трудности при исследовании

ион-транспортных механизмов на клеточном уровне. Вследствие этого, решение поставленной в работе задачи проводилось на галотолерантных микроводорослях.

Непосредственно в задачу исследования входило:

1. Показать ведущую роль плазматической мембраны (ПМ) в регуляции ионного состава цитоплазмы у галотолерантных микроводорослей; оценить эффективность функций ионного гомеостатирования цитоплазмы у различающихся . по солеустойчивости видов и исследовать, как изменяется эффективность этой функции при длительной адаптации галотолерантных микроводорослей . к средам с повышенным и пониженным содержанием NaCl.

2. Исследовать проницаемость Ш микроводорослей для ионов в стационарных условиях культивирования . и при адаптации к повышенному содержанию NaCl в среде.

3. Исследовать активный транспорт ионов через ПМ галотолерантных микроводорослей на целых клетках и на выделенных везикулах этой мембраны.

4. Идентифицировать системы первичного и вторичного активного транспорта Na+, функционирущие в ПМ галотолерантных микроводоро слей.

5. Исследовать функционирование ион-транспортирующих систем ПМ галотолерантных микроводорослей в условиях гиперосмотического солевого шока.

Научная новизна. Показано, что клетки галотолерантных водорослей поддерживают низкие концентрации ионов Na+ и С1- в цитоплазме в некотором диапазоне наружных концентраций NaCl. Значение пороговой концентрации, превышение которой приводит к нарушению ионного гомеостаза, определяется степенью солеустойчивости водоросли, а также концентрацией NaCl в среде, использовавшейся для выращивания клеток предавствущих поколений. Способность галотолерантных водорослей поддерживать низкие концентрации ионов в цитоплазме в условиях высокой солености среды создает благоприятное ионное микроокружение для функционирования цитоплазматических биополимеров.

Низкие концентрации Na+ в цитоплазме галотолерантных водорослей поддерживаются благодаря: (I) ограничению пассивного потока Na+ из наружной среды в цитоплазму, что обеспечивается

низкой Ыа+- проницаемостью ПМ, (2) эффективным функционированием систем активного транспорта Иа+, выводящим Иа+ из клетки в наружную среду.

В ПМ галотолерантных водорослей идентифицированы две системы активного транспорта (I) вторичный Ыа+/н+ антипортер,

экспортирующий Ыа+ из клеток за счет' энергии протонного градиента (ДрН+), который генерируется Н^-транслоцируюшей АТФазой; (2) первичная Ыа+-помпа (Ыа+-АТФаза), не энергизуемая протон-движущей силой. Первый механизм является универсальной Ка+-транслоцирующей системой, функционирующей в БМ всех растительных организмов, второй, по-видимому, специфичен для галотолерантных растений. На основании полученных данных высказано предположение, что включение в работу одной из двух Ыа+-транслоцирущих состем определяется направлением ДрН на ПМ. Ма+/Н+ антипортер функционирует, когда рНцит > рН^ Условием функционирования Ыа+-АТФазы является рНцит_< РН^^

Исследованы ион-транспортные функции ПМ галотолерантных водорослей в условиях гиперосмотического солевого шока. На основании обобщения собственного экспериментального материала и литературных данных представлена гипотеза о вовлечении ион-транслоцирунщих систем ПМ в процесс осмоадаптации и о последовательности событий, происходящих в клетках галотолерантных водорослей при их ответной реакции на повышение наружной концентрации соли.

Научно-практическое значение. Представленная работа является фундаментальным исследованием, раскрывающим механизмы адаптации галотолерантных видов растений к средам к высоким содержанием солей. Полученные новые данные вносят существенный вклад в современные представления о клеточных механизмах ионного гомеостатирования и осморегуляции у галотолерантных растений.

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре физиологии растений Московского государственного университета и могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по физиологии солеустойчивости растений на биологических факультетах других университетов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены или представлены: на XXV ежегодной научной конференции МФТИ (Москва,

1979); XI Всесоюзном совещании по вопросу круговорота веществ- в замкнутой система (Канев, 1981); II Всесоюзной конференции по морской биологии (Владивосток, 1982); ill Международной конференции "Вода и ионы в биологических системах" (Бухарест, 1984); in, IV и V Международных симпозиумах по регуляции метаболизма в растении (Варна, 1984, 1986; София, 1991); IV Всесоюзной конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985); V Всесоюзном биохимическом с'езде (Киев, I98G); IV Всесоюзной конференции по биохимии и физиологии солеустойчивости растений (Ташкент, 1986); Vin и IX Сабининских семинарах, ИФР АН СССР (Москва, 1987, 1989); I Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы современной альгологии" (Черкассы, 1987); XII Всесоюзном совещании по транспортным АТФазам (Иркутск, 1987); Всесоюзном совещании "Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, 1991); xv Международном конгрессе по биохимии (Реховот, Израиль, 1991); II и III с'ездах Всесоюзного общества физиологив растений (Минск, 1992; Санкт-Петербург, 1994); Международном симпозиуме по физиологии и генетике солеустойчивости растений (Ташкент, 1992); vin Конгрессе федерации европейских обществ физиологов растений (Антверпен, 1992); семинаре института Биологических наук при университете г. Вюрцбург (Германия, 1Э94); расширенном семинаре ИФР РАН (Москва, 1995).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано в отечественных и зарубежных изданиях 41 работа.

Об'екты и метода исследований.

В качестве основных об'ектов исследований использованы следующее слабовакуолизированные микроводоросли:

Chlorella pyrenolâoaa Chick, ШТЭММ IPPAS С-2 - ЭВриГаЛИННЭЯ

водоросль, обладает способностью делиться и накапливать биомассу в среде с 340 Ш NaCl, р такой же скоростью, как в среде, не содержащей NaCl.

Chlorella atigmatophara Butch-, ШТЭММ IPPAS C-144 - бОЛев солеустойчива, чем предыдущий штамм, выделена из пробы морской воды, растет в широком диапазоне концентраций Naoi в среде вплоть до I м, однако, значительно снижает скорость накопления биомассы при отсутствии этой соли в среде.

Водоросли рода Chlorella получены из коллекции института Физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН [Владимирова и др., 1991].

Bunaltel la maritima Massjuk, ШТЭММ IBASU-A D-18 - Морская

водоросль.

Dunaî tel la salina Teod., ШТЭММ IBASU-A D-1Q Обитает В

водоемах с самым высоким содержанием солей.

Характерной особенностью водорослей рода Шпаи&иа является отсутствие клеточной стенки.

Водоросли рода Bunaiieiia получены из коллекции отдела Споровых растений института Ботаники им. Н. Г. Холодного Украинской АН [Владимирова и др., 1991].

ziatymanas viridis Rouch. (коллекция отдела экологической физиологии водорослей института Биологии Южных морей, г.Севастополь ) - морская водоросль. Особенностью этого организма является необычная для растений клеточная стенка гликопротеиновой природы [Вассер и др., 1989].

Для выращивания водорослей рода Chlorella использовали среду Калашниковой и др. [19873- Водоросли рода vunaiieiia культивировали в модифицированной среде Абдуллаева, Семененко [1974] или среде Балнокина и др. [1983], р.viridis - в модифицированной среде Шубравого [1983]. Концентрации Nací в

КуЛЬТураЛЬНЫХ Средах СОСТаВЛЯЛИ (В ММ): ДЛЯ ch.pyrenoidosa - 0, Ch.stigmatophora - 340, Я.maritima - 500, D.salina - 2000.

Водоросли культивировали в сосудах с плоско-параллельными стенками, толщина слоя клеточной суспензии составляла 6 см. Культуры продували воздухом с 1,5% содержанием С02 и освещали белым светом люминесцентных ламп при интенсивности 15000 лк 16 часов в сутки.

•При адаптировании Ch.pyrenoidosa И D.maritima К ВЫСОКОЙ солености среды в культуральные среды дополнительно вносили Nací, постепенно увеличивая концентрации этой соли в ряду последовательных пассажей. Длительность адаптационной процедуры составляла не менее двух месяцев. Аналогичным образом, ch.stigmatophora, "в норме" выращивавшуюся на среде с высокой концентрацией NaCl, адаптировали к среде, не содержащей Nací.

Хлоропласты И митохондрии ИЗ водорослей рода Bunaliella и тканей гликофита Ph.vulgar is выделяли методом дифференциального

центрифугирования, используя различные приемы разрушения клеток [Балнокин и др., 197Э; Алешина, Балнокин, 1984].

Скорость фотосинтеза в интактных клетках и скорость реакции Хилла в изолированных хлоропластах определяли по выделению 02 на белом свету (450 тыс. эрг см-2). В качестве акцептора электрона в реакции Хилла использовали I мМ K3Fe(CN)6. Скорости выделения 02 измеряли амперометрическим методом [Балнокин, Фохт, 1977].

- Активность сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и фумаразы в митохондриальных фракциях определяли спектрофотометрическими методами [Muller et al., 196а].

Содержание белка определяли методом Лоури [Lowry et al., 1951].

Эксперименты с интактндаи клетками.

Внутриклеточные концентрации Na+, к+ и ci~ в большинстве экспериментов определяли методом, основанным на измерении содержания ионов в клетках после быстрого отделения последних от солей наружной среда (метод быстрой отмывки) [Балнокин, Мазель, 1985].

Для определения внутриклеточного содержания ионов отмытые клетки- разрушали ультразвуком в дистиллированной воде. В полученном растворе измеряли содержание Ыа+ и К+ с помощью пламенного фотометра Karl Zeiss (ГДР) и Gl", используя С1~-селективный электрод Orion (США). Полученные массы ионов относили к суммарному об'ему клеток в пробе, который определяли по разности электропроводности среды и клеточной суспензии с помощью кондуктометра 0K-I02/I (ВНР) [Okamoto, Suzuki, 1964].

к+-дефицитные клетки V.maritima И D.salina ПОЛуЧаЛИ, выращивая' водоросли в культуральных средах, в которых КН2Р04 заменяли эквимолярным .количеством NaH2F04 (среда без К+).

Чистые потоки ионов К+ через ПМ : К+-дефицитных клеток, индуцированные внесением К+ в среду регистрировали двумя способами: (I) по изменению внутриклеточных концентраций К+, (2) по изменению концентрации К+ в среде, используя К+-селективные электроды, изготовленные по методу Никольского и др. [1974]-

Чистые потоки Na+ через ПМ в.maritima, индуцированные внесением К+ в суспензию К+-дефицитных клеток, определяли так же, как чистые потоки К+ способом (I).

Кинетику К^-индуцированных изменений pH незабуференной

суспензии клеток в.maritima регистрировали с помощью стеклянного электрода ЭСЛ-63-07 и рН-метра рН-121." Чистый поток Н+ через Ш, индуцированный добавкой К+, определяли путем титрования суспензии клеток до исходного значения pH, наблюдавшегося непосредственно перед внесением К+ в суспензию.

".' Содержание АТР в К+-дефицитных клетках d. mari tima определяли методом, основанным на использовании АТР в реакции фосфорилирования 3-фосфоглицериновой кислоты (3-pga) с последующим восстановлением i,3-pga посредством ■ nadh и регистрацией образовавшегося nad+ ' по изменению оптической плотности раствора [Bucher, 1947].

Потоки Ыа+ из наружной среды в клетки определяли с помощью 22Na+, потоки К+ - с помощью S6Rb+. Клетки в пробах отделяли от радиоактивной среда методом быстрой отмывки [Балнокин, Мазель, 1985] и определяли радиоактивность клеток с помощью ^-спектрометра Compugamma Waliaok (Финляндия).

Электрический потенциал (Дф) на ПМ клеток водорослей рода Chlorella измеряли методом проникающих ионов [biberman et al., 1970), используя липофильный катион тетрафенилфосфоний (ТРР+). Для определения концентрации ТРР+ в суспензии клеток изготавливали ТРР+-селективные электроды по методике Шинбо и др. [Shinbo et al., 1978].

Эксперименты с выделенной фракцией ПМ р. и indis.

Выделение ПЬ! из клеток р.viridis осуществляли согласно разработанному нами методу [Balnokin et al., 1993]. Метод основан на частичном протеолизе гликопротеиновой клеточной стенки трипсином, мягком гипоосмотическом шоке и последующем разделением клеточных мембран посредством дифференциального центрифугирования и центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы.

Эксперименты с каналогенным антибиотиком аламетицином, делающим ПМ проницаемой для молекул АТР [Тихая и др., 1984; Бутылин, Ритов, 1990], показали что полученный препарат на 70-80% состоял из инвертированных везикул.

АТР-гидролазную, а также другие фосфогидролазные активности препарата ПМ определяли по высвобождению неорганического фосфата

<рн>-

Содержание Рн определялим методом Картера и Карла [Carter, Karl, 1982] с использованием малахитового зеленого.

АТР-зависимое формирование и Па+-индуцированную диссипацию : АрН на везикулах ПМ определяли по изменению оптической плотности суспензии в присутствии ДрН-индикатора акридинового оранжевого (АО) [Scliuldiner et al., 1972] с помощью спектрофотометра Hitachi 557 (Япония). Кинетику изменения оптической плотности регистрировали в двухволновом режиме (^492-540)•

АТР-зависимое поглощение Na+ везикулами определяли с помощью 22Na+. Образцы инкубировали в реакционной среде, чтобы уравновесить меченый Na+- по обе стороны мембраны. Последующее дабавление АТР инициировало поглощение Na+. Везикулы отделяли от радиоактивного раствора с помощью нитроцеллюлозных фильтров "Сыппор". Радиоактивность везикул определяли на сцинтилляционном |3-счетчике, используя 7-виалы С 12/55 (Zinsser analytic).

Содержание белка в пробах в экспериментах с выделенными везикулами ПМ определяли методом Симпсона и Зонна [Simpson, Sonne, 1982].

Результаты и обсуждение.

I. Ионное гоыеостатирование цитоплазмы и галотолерантность. Роль ПМ в регуляции цктоплазматкческих концентраций ионов.

Рассмотрение механизмов регуляции цитоплазматических концентраций ионов у микроводорослей целесообразно начать с демонстрации самой функции ионного гомеостатирования и . ее эффективности у разных по солеустойчивости об'ектов.

I.I Чувствительность ферментов цитоплазмы к WaCl у галотолерантных водорослей и гликофитов.

Поддержание. низких концентраций ионов в цитоплазме галотолерантных водорослей при высоких наружных концентрациях солей предполагает, что -цитоплазматические биополимеры у этих организмов, так же, как и биополимеры, функционирующие в цитоплазме клеток растений-гликофитов, обладают высокой чувствительностью к солям.

В связи с этим, на двух видах галотолерантных водорослей рода Dunaiieiia исследовали in vitra чувствительность хлоропластных и митохондриальных ферментов к NaCl.

Прежде, чем перейти непосредственно к результатам этих

Концентрация HaCl, к

Рис I. Зависимость скорости фотосинтеза интактных

клеток микроводорослей от концентрации Nací в среде. I. - экстремально

галотолерантная водоросль d.sauna, выращивавшаяся на среде с 2 м Nací; 2. -морская водоросль

D.maritima, ВЫраЩИВаВШаЯСЯ на среде с 0,5 М NaCl; 3. -эвригалинная водоросль

Ch.pyrenoidoea,

выращивавшаяся на среде без KaCl.

экспериментов, рассмотрим, как у этих водорослей in vivo Nací влияет на фотосинтез, одну из важнейших физиологических функций автотрофных клеток. Зависимости скорости фотосинтеза' галотолерантных водорослей D.salina, Г.maritima И ВЗЯТОЙ ДЛЯ сравнения менее солеустойчивой эвригалинной водоросли ch.pyrenaiaoea, длительно выращивавшейся на среде без Nací, от концентрации NaCl в наружной среде, представлены на Рис.1 Наибольшая скорость фотосинтеза у в.salina, обладающей самой высокой солеустойчивостью, наблюдалась при 2,5-3,5 M Nací, у морской водоросли D.maritima При 0,9 M, а у Ch.руreno idasа - При отсутствии NaCl в среде. Полученный результат отражает адаптацию трех видов водорослей к условиям различной солености среды .и характеризует использовавшиеся в работе виды с точки зрения их солеустойчивости.

В противоположность интактным клеткам, выделенные из

D.salina И D.maritima ХЛОроПЛаСТЫ Обнаружили ОДИНЭКОВО ВЫСОКУЮ

чувствительность к NaCl (Рис.2г). Максимальная скорость реакции у обоих видов наблюдалась при относительно низких концентрациях NaCl (0,2-0,3 M), что практически совпадает с максимумом реакции Хилла, который получен на хлоропластах, выделенных из листьев гликофита Ph.vulgaris.

Из клеток О.sal i na, D.maritima И Корней Ph.vulgaris ВЫДеЛЯЛИ также митохондрии и определяли в митохондриальных фракциях чувствительность к NaCl сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и

Рис 2. Зависимость активности ферментов митохондриальной фракции (а - сукцинатдегидрогеназы, б - цитохромоксидазы, в - фумаразы) и скорости реакции Хилла в хлоропластах (г) от концентрации Nací в среде. a,6¿B: I. - корни Ph.. vulgaris, 2. - D.maritima, 3. -D. salina; Г: I . - П.salina.; 2, 3 - D.maritima; 4. - ЛИСТЬЯ Ph.vulgaris ; I, 2 - хлоропласта выделены и скорость транспорта электронов измерена в глицериновых средах; 3, 4 - в сахарозных средах.

фумаразы (Рис.2а-в). Гомологичные ферменты у резко различающихся по солеустойчивости об'ектов обладали практически одинаковой реакцией на NaCl. Сукцинатдегидрогеназа и фумараза подавлялись при внесении в среду NaCl даже в миллимолярных концентрациях, а цитохромоксидаза имела максимум активности при 100 мМ NaOl.

Фосфогексоизомераза, лактатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, рибулозобисфосфаткарбоксилаза,

пентозофосфатизомераза клеток Dunaiieiia в экспериментах in vitra также подавлялись гораздо более низкими концентрациями NaCl, чем те, при которых эти водоросли культивируются [Johnson et al., 1968; Ben-Amota, Avron, 1972; Borowitzka, Brown, 1974; ].

Таким образом, ферменты различных компартментов клетки галотолерантных водорослей (цитоплазмы, митохондрий, хлоропластов), ферменты мембранные и водорастворимые, как правило, не обладают собственной "устойчивостью" к действию высоких концентраций соли. Этим они отличаются от ' ферментов галобактерий, адаптированных к функционированию в высокосолевой среде [Baxter, 1959; Brown, 1964; Xanyi, 1974; Хочачка, Сомеро, 1977; Кашнер, 1981].

Представленные в этом разделе данные позволяют предположить, что клетки галотолерантных микроводорослей способны эффективно регулировать цитоплазматические концентрации ионов при высоком содержании соли в наружной среде. При. отсутствии в клетках этих организмов крупной центральной вакуоли основная нагрузка в ионном гомеостатироваяии цитоплазмы, по-видимому, ложится на ПМ.

1.2 Распределение ионов Na+ и С1~ в систеие клетка-среда при инкубации водорослей в растворах различной солености.

Роль ПМ в поддержании низких концентраций ионов в цитоплазме у микроводорослей и различная эффективность функции ионного гомеостатирования для различающихся по солеустойчивости об'ектов показана в следующий серии экспериментов.

Со сред культивирования клетки переносили на ряд таких же растворов, но с более высоким содержанием NaCl. После 3-3,5-часовой инкубации в указанных растворах определяли внутриклеточное содержание Na+ и С1~. На Рис.3 представлены внутриклеточные концентрации Na+ и ci- как функции концентраций NaCl в среде. Для всех видов водорослей в распределении ионов

мМ'

200 150 100 JO

ММ

то

200 -

мМ.

250 200 150 too

50

400

1500

1000

500

,mM .

500 SOO 1000

500

1000 1500 2000

1000

гооо

JOOS то

Рис 3. Зависимость внутриклеточных концентраций Na+ (I) и Cl (2) ОТ КОНЦеНТраЦШ NaCl В Среде. а - CK.pyreno Idos а, о -Ch.3t Igmatophora, В - D.marítima, Г - D.saZina. По ОСИ ОрДИНЭТ -

внутриклеточные концентрации Na+, Cl~; по оси абсцисс -концентрации Nací в среде.

можно отметить общее свойство. В некотором диапазоне наружных концентраций соли внутриклеточное содержание ионов поддерживается на постоянном уровне или относительно слабо изменяется по мере увеличения наружной концентрации NaCl. Превышение некоторой пороговой, специфичной для каждого вида, концентрации приводит к резкому увеличению внутриклеточного содержания Na+ и, ci~. Величина порога тем выше, чем выше солеустойчивость водоросли, а также, чем выше концентрация NaCl в среде, в которой водоросли предварительно культивировались. Для выращивавшейся на пресном фоне эвригалинной водоросли ch.pyrenoidosa диапазон гомеостаза лежит в интервале наружных концентраций NaCl 0-25 мМ (Рис.За). У более СОЛеуСТОЙЧИЕОЙ морской водоросли Ch.stigmataphora, культивировавшейся в среде с 340 мМ NaCl, пороговая концентрация составляет 450 Ш ( Рис.36). У морской водоросли В.maritima, при концентрации Nací в культуральной среде 500 мМ пороговое значение достигает 1500-1750 мМ (Рис.Зв), и, наконец, у п.salina, обитающей в водоемах с самым высоким содержанием NaCl и культивировавшейся при 2000 мМ NaCl, диапазон гомеостаза простирается до 3000-3250 мМ (Рис.Зг). Очевидно, что диапазон наружных концентраций NaCl, в котором поддерживается ионный гомеостаз, определяется генотипом каждого вида. Однако, в связи со способностью организмов адаптироваться к изменяющимся внешним условиям этот диапазон может быть расширен, поскольку пределы адаптации также определены генотипом. Адаптация водорослей на протяжении нескольких десятков генераций к повышенному содержанию соли в среде приводила к изменению диапазона наружных концентраций соли, в котором действует ионный гомеостаз.

ch.pyrenoidosa, исходно выращивавшуюся на среде без NaCl, в течении двух месяцев культивировали на среде, в которую был внесен NaCl в концентрации 340 мМ. Длительное культивирование в высокосолевой среде привело к появлению у водоросли способности расти на- этой среде так же интенсивно, как растет неадаптированная культура в отсутствие NaCl. Пороговые значения при этом сместились в область более высоких концентрации Nací (от исходного значения 25 мМ к 400 мМ). Длительная адаптация в.maritima к среде с 2,0 М NaOi (в норме клетки выращивали на растворе с 0,5 М NaCl) привела к изменению пороговых концентраций ОТ 1,5-1,75 М, ДО 2,5-3,0 М.

В то же время, адаптация солеустойчивых водорослей, в норме выращивавшихся в солевом растворе высокой концентрации, к среде без Nací приводила к смещению пороговых концентраций в область более низких значений. Такой результат был получен в опытах с морской водорослью ch.stigma-tophora. Таким образом, величина порога, при котором происходит нарушение ионного гомеостаза, определяется не только видовой принадлежностью водоросли и ее солеустойчивостью, но и условиями предварительной адаптации к той или иной концентрации соли. Регуляция внутриклеточных концентраций ионов у микроводорослей в значительной степени осуществляется за счет функционирования локализованных в ИМ ион-транспортирующих белков. Их регуляторные функции условно можно разделить на две группы: I) регуляция ионной проницаемости Ш, посредством этой' функции осуществляется контроль пассивного транспорта ионов извне в цитоплазму; 2) работа ионных насосов, переносящих ионы против термодинамического градиента, т.е. осуществляющих активный транспорт ионов.

Для клеток микроводорослей, лишенных крупной центральной вакуоли, значение пороговой концентрации UaGi, превышение которой ведет к неконтролируемому накоплению ионов Na+ в цитоплазме, определяется величиной FWa ПМ и производительностью локализованных в ПМ систем активного транспорта Na+.

2. Барьерные свойства ИМ микроводорослей по отношению к ионам.

Ограничение ионных потоков из наружной среды в цитоплазму может быть одним из путей приспособления организмов к условиям высокой солености среды. Предполагалось поэтому, что ПМ галотолерантных водорослей, по-сравнению с ПМ растений пресного фона, обладает более низкой ионной проницаемостью, а в процессе адаптации организма к условиям повышенной солености среда возможно снижение проницаемости. В соответствии с этим, целью экспериментов, представленных в этом разделе, было измерение ионных потоков и определение коэффициентов- проницаемости ПМ у галотолерантных водорослей рода vunaHeiia. Кроме того, исследовали, как изменяется ионная проницаемость ПМ эвригалинной водоросли сн. ругетю icLosa при ее адаптации к повышенному содержанию Nací в среде.

2.1 На+-проницаемость ПМ водорослей рода xmnaiieiia в стационарных, условиях.

, Измерения потоков меченого Na+ из наружной среда в клетки проводили в средах, идентичных средам культивирования при ПОСТОЯННЫХ концентрациях NaCl: 0,5 М ДЛЯ В.marítima и 2,0 М для В.salina.

На Рис.4 представлена кинетика поглощения 22ш+ клетками двух видов. Параллельное с измерением радиоактивности определение внутриклеточных концентраций Na+ позволило рассчитать удельные радиоактивности изотопа в клетках и значения радиоактивностей при полном обмене метки между средой и клетками. Поглощенный 22Ыа+ выражали в процентах от его количества в клетках при полном обмене.

Характер поглощения ионов Na+ указывает на наличие двух компартментов, заполняемых меткой: I - с высокой скоростью поглощения , II - с низкой. Отбор первой пробы из суспензии осуществлялся через 15-20 мин после внесения в нее метки. За это время насыщение компартмента I было уже завершено, далее наблюдалось медленное поглощение изотопа компартментом II.

Об* ем компартмента I характеризовался существенной

вариабельностью. Его величина зависела от ионного состава

инкубационной среды, а также от состава отмывочных растворов,

через слой которых центрифугировали клетки, чтобы отделить их от

наружного Ка+ при взятии проб. Наименьшие об'емы были получены в

том случае, если инкубационная среда содержала Са2+, а клетки

отмывали солевыми растворами; наибольшие, - если клетки

инкубировали в среде, не содержащей Са2+, а отмывали раствором

карбогидратов. На основании этого можно заключить об адсорбции

некоторой части ионов на поверхности клетки. При отсутствии Са2+

2? +

в среде увеличивается поверхностное связывание Na , а замена солей карбогидратами в отмывочном растворе приводит к менее __ эффективному вытеснению изотопа с поверхности клетки. Таким образом, заполнение компартмента I связано с поверхностной сорбцией ионов Na+, а заполнение компартмента II - с их переносом через ПМ.

У обоих видов водорослей перенос Na+ через ПМ характеризовался крайне низкими скоростями (Табл. I). Время полуобмена изотопа составило несколько сот часов. В стационарных

Продолжительность . инкубации, ч

Рис.4. Поглощение 2¿Na+ клетками В.mar i tima (I) И п.salina (2), инкубированными в культуральных средёх при постоянной концентрации Nací: для В.mar i tima - 0,5 М NaCl, ДЛЯ В.salina - 2 М.

Таблица I. Потоки Иа из среды инкубации в клетки (<1"0{) и проницаемость плазматической мембраны водорослей рода шпаНеНа для Ыа+ 0?Ка).

Культура

Среда инкубации

J ., (нмоль м 2с '^ V°¿, (10!4 м с-')

T3.ma.rit ima

(В)

(а)

0,100 5.4

0,087 4,7

В.salina

(В)

(а)

0,120 1,6

0,109 1,5

Таблица 2. Ионные потоки и ) и ионная проницаемость (Р^) М сыогеНа ругепо1Лоза цри адаптации к высокой солености среды (340 мМ ИаСХ).

Параметры Неадаптированные клетки Адаптированные клетки

Na+ К+(И>+) Na+ K+(Rb+)

3У •> -2-1 нмоль м с 0,49-0,26 0,50-0,09 0,28-0,07

Р,(Ю",м с"') 0,85-0,46" I,75^0,31 0,П±0,04 1,24-0,29

условиях для полного обмена Na+ между средой и клеткой требуется несоизмеримо большее время, чем то, которое занимает онтогенетический цикл этих организмов.

По полученным значениям потоков из уравнения потока Гольдмана [Goldman, 1943], рассчитали коэффициенты проницаемости ПМ для Na+ (Табл.1). Значения Аф на ПМ в.maritima, и B.saiina (89 мВ и - 91 мВ,' соответственно), необходимые для рассчета, были получены из уравнения Нернста [Нобел, 1973], исходя из равновесного распределения иона К+ в системе клетка-среда (раздел 3.1 Л).

Полученные значения коэффициентов проницаемости ПМ V.mar itima И D.saiina ДЛЯ ИОНОВ Na+ (ТабЛ. 2) На НвСКОЛЬКО порядков меньше, . чем РКо ПМ многих пресноводных и морских водорослей [Raven, 1976]. Низкая проницаемость ПМ водорослей рода Eunaiieila для Na+, по-видимому, является свойством, которое обеспечивает им выживаемость в условиях сверхвысокой солености.

Низкая проницаемость ПМ, обусловливая низкую скорость поступления ионов йа+ в цитоплазму, способствует снижению энергетических затрат клетки на откачку Na+.

2.2 Ионная проницаемость ПМ сн.ругenoidosa, адаптированной и не адаптированной к NaCl.

Измерение потоков Na"1"(22Na+) и K+(s6Rb+) из наружной среды в клетки и определение Na+- и К+~ проницаемости ПМ проводили на ch.pt/renoidaea, длительно культивировавшейся в среде без NaCl (-NaCl культура) и ch.pyrenaidasa, адаптированной в течении 60 дней к 340 мМ NaCl (+ NaCl культура). Потоки определяли при постоянной концентрации NaCl в инкубационной среде (для неадаптированной культуры - 10мМ, для адаптированной - 340мМ). Концентрация К+ в среде в обоих вариантах составляла БмМ. Средние скорости переноса Na+ и К+ через ПМ приведены в Табл. 2.

На основании значений потоков Na+ и к+ и значений Аф на ПМ (- 146 мВ и - 113 мВ, для неадаптированной и адаптированной водоросли, соответственно) из уравнения потока Гольдмана рассчитали коэффициенты проницаемости для этих ионов (Табл. 2). Приведенные выше значения Аф, необходимые для рассчета коэффициентов проницаемости, получены, исходя из равновесного распределения на ПМ проникающего катиона ТРР+ (раздел 4.2).

Подученные значения PWa и Рк для ПМ не адаптированных к NaQl клеток Ch.pyrenoidosa бЛИЗКИ К ЗНаЧвНИЯМ КОЭффИЦИВНТОВ проницаемости для Na+ и К+, установленным Барбером и Шихом на этой же водоросли [Barber, 1968; 1969; Shieh, Barber, 1972]. Б процессе адаптации ch.pyrenoidosa к высокой солености среды ПМ стала менее проницаемой для ионов Na+. В результате длительного культивирования водоросли в + NaCl среде PNa, измеренный в этой же среде, оказался почти на порядок ниже, чем его исходное значение, полученное в - NaCl среде для неадаптированных клеток. В то же время, проницаемость мембраны для ионов К+ изменилась незначительно (Табл.2).

Снижение Ыа+-проницаемости ПМ имеет следствием непосредственное торможение поступления Na+ в клетку. Другим, не менее важным результатом снижения Рт (при возможном сохранении Рсг на исходном уровне), может быть более слабая зависимость электрического потенциала на ПМ от концентации ыаС1 в среде. Способность поддерживать Дф на ПМ на высоком уровне в условиях изменяющихся концентраций NaCl в среде особенно важна для водорослей, обитающих в приливно-отливной зоне морской литорали, и подверженных, следовательно, значительным колебаниям наружных концентраций солей.

3. Активный транспорт ионов через ПМ галотолерантных микроводорослей.

Общепринято, что у растений пресного , фона Иа+-транспортирующим механизмом ПМ является Na+/H+ антипортер, который осуществляет перенос Ыа+ из цитоплазмы в наружную среду за счет энергии протонного градиента - Д(1н+ [Jeschke, 1980; Watad et al., 1986; Glint, MoRobbie, 1987; Hassidim et al., 1990]. ЛрН+ на ПМ создается Н+-АТФазой, которая транспортирует Н+ из цитоплазмы в наружную среду [Полевой, Саламатова, 1980; Goffeau, Slayman, 1981; Serrano, 1984; 1988; 1989; 1990; Палладина, 1985; 1987; Sze, 1985; Sussman, Surowy, 1987; Максимов, 1989; Скулачев, 1989; Sanders, Slayman, 1989]. АцН+ может создаваться также другими генераторами - редокс-цепью ПМ [Новак, Иванкина, 1978; Möller, bin, 1986; Novak et al., 1988] ИЛИ Н+-траН0Л0ЦирующеЙ пирофоефатазой [Williams et al., 1990]. Сформированный на ГОД AjlH+ является движущей силой и для переноса ионов калия. к+ поступает

в клетки электрофоретически при гиперполяризации мембраны, происходящей при включении н+-помпы [Воробьев, 1980; 1998; Tester, 1990]. Перенос К+ осуществляется через к+-селективные каналы [Shiranen, Tazawa, 1983; Sokolik, Yurin, 1986; Bush et al., 1988; Ketohum et al., 1989; Kourie, Goldsmith, 1989].

Исследования активного транспорта ионов на ПМ галотолерантных микроводорослей, представленные в этом разделе, были предприняты с целью получить ответы на следующие вопросы:

(1) Какие транспортные системы осуществляют перенос Na+, К+ и К* через ПМ галотолерантных микроводорослей?

(2) Может ли вторичный На+/Н+ антипортер служить эффективным регулятором содержания Na+ в цитоплазме этих организмов?

(3) Не функционирует ли в ПМ этих организмов первичная Na+-помпа?

Эксперименты были проведены на целых клетках галотолерантных микроводорослей и на выделенных из них везикулах ПМ.

3.1 Исследование транспорта ионов на целых клетках галотолерантных микроводорослей.

3.1 Л. Поглощение К+ И экспорт На+ водорослями рода Bunaliella. Связь транспорта К+ и Na+ с генерацией АДН+ на ПМ.

Удобной модельной системой для исследования ион-транспортных процессов в ПМ являются клетки, дефицитные по К+. Внесение К+ в суспензию таких клеток индуцирует потоки ионов через мембрану. Для изучения транспорта ионов на целых клетках галотолерантных микроводорослей были получены К+- дефицитные клетки водорослей

рода Bunalleila.

При внесении К+ в концентрациях от 0,1 до 10 мМ в К+-дефицитную суспензию наблюдалось его поглощение клетками. Ю-6 м валиномицин не ускорял перенос к+ через ПМ, что свидетельствует о ее высокой к+- проводимости. На высокую к+- проводимость ПМ водорослей Bunaiieiia указывают также эксперименты, выполненные на клетках с нормальным содержанием К+. Снижение -концентрации К+ в среде в 2, 5, 10 и 20 раз с последующим внесением в среду валиномицина не индуцировало поток этого иона из клеток наружу. Высокая проницаемость ПМ для ионов К+ означает, что в культуре, находящейся в стационарном состоянии, электрохимический градиент

К+ на Ш близок к нулю. По-видимому, перенос калия через ПМ при внесении к+ в суспензию к+- дефицитных клеток обусловлен гиперголяризацией мембраны, происходящей в результате включения Н+- помпы. Скорость переноса к+, вероятно, зависит от величины Аф на ПМ, которая находится в гиперполяризованном состоянии во время поглощения К+ клетками. С этим предположением согласуется тот факт, что освещение, которое, как известно, приводит к увеличению электрического потенциала на ПМ в зеленых клетках [High.inboth.am, Anderson, 19743, стимулировало в наших опытах транспорт калия. Факторы, снижающие Аф на мембране, снижали скорость поглощения К+. К числу таких факторов относится увеличение концентрации NaCl в среде.

Наблюдавшееся поглощение калия к+-дефицитными клетками сопровождалось переносом Na"1" из цитоплазмы в наружную среду (Рис.5). В результате переноса ионов внутриклеточное содержание К+ первоначально К+-дефицитных клеток достигало нормы, а содержание Na+ снижалось. Наряду с трансмембранным переносом к+ и Na+ наблюдались изменения pH незабуференной наружной среды (Рис.6). В ответ на добавление к+ в темноте происходило подкисление. Внесение к+ при освещении также вызывало подкисление. Однако, в этом случае смещение pH в кислую область наблюдалось на фоне общего подщелачивания суспензии, которое связано с поглощением соэ на свету за счет фотосинтеза. Полученный результат указывает на выход Н+ из клеток в ответ на внесение К+ в среду. Титрование суспензии после внесения KCl до исходного значения pH щелочью в темновом варианте и кислотой на свету показало: чистые потоки Na и К в десятки раз превосходят чистый поток Н+. Несоизмеримо более низкий выход Н4" по сравнению с изменениями внутриклеточных концентраций К+ и Na+ может означать, что противоградиентный транспорт Н+ из цитоплазмы в среду сопровождается пассивным током Н+ в обратном направлении. По-видимому, пассивный поток н+ в клетку сопряжен с переносом Na+ из клетки в наружную среду. В этом случае выведение Na+ из клетки осуществляется через механизм ион-обменной диффузии - Na+/H+ антипортер за счет энергии ДрЛ+, генерируемого н+-помпой.

Для изучения связи транспорта Na+ и К+ с генерацией АрЛ+ на ПМ исследовали действие протонофора CICCP на потоки этих ионов. Чтобы исключить действие CICCP, опосредованное его разобщающим

Рис.5 Рис.6

Рис.5. Поглощение К И экспорт Na клетками D.maritima при внесении 5 мМ KCl в К - дефицитную культуру. , ,

Концентрация Na в среде - 0,5 М; pH 7,2; I.- Na ; 2.- К .

Рис.6. Изменения pH незабуференной суспензии К+-дефицитных клеток в.marttima в ответ на добавление К . В момент, отмеченный стрелкой, внесен 1мМ KCl и включен свет (I), или-включен свет без добавки KCl (2), иливнесен I мМ KCl в темноте (3). Интенсивность света 450 тыс эрг см с -

Таблица 3- Влияние С1ССР на скорость переноса Na и К через ПМ К -дефицитных клеток D.marítima при внесении в среду 5 мМ KCl. (В % от контроля, концентрация Na в среде - 0,05 М, pH 7,2).

эффектом, следовало использовать концентрации протонофора, не • снижающие содержания внутриклеточного ATP. CICCP в концентрациях до 2 мкМ не влиял на содержание АТР в клетках B.maritima. При более высоких концентрациях протонофора содержание АТР в клетках уменьшалось. Низкая, "неразобщащая" концентрация протонофора (1мкМ) приводила к незначительному торможению поглощения К+ и снижала скорость выхода Na+ из клетки приблизительно на. 50%. 10 мкМ CICCP, снижающий содержание АТР в клетках, в значительной

Ион С1ССР

1мкМ IOmkM

Na+ 56+6 15+3

К+ 88+11 30+7

степени подавлял как выход Na+, так и поглощение К+ (Табл. 3). Снижение потока Na+ под действием I мкМ CICCP указывает на его зависимость от Д|1Н+ на ПМ. Сильное подавление транспорта Na+ и К+ при действии 10 мкМ CICCF, по-видимому, обусловлено не только диссипацией ДрН+ на мембране, но и снижением уровня АТР, доступного для транспортных АТФаз.

Проведенные на К+-дефицитных клетках vunaiieiia исследования транспорта ионов указывают-на качественное сходство механизмов транспорта К+ и Па+ у галотолерантных микроводорослей и растений пресного фона. В основе этого сходства лежит зависимость транспорта К+ и Na+ от Дря1", генерируемого на ПМ Я^-помпой.

3.1.2. Наличие на ПМ v.maritima ДрН+- независимой составляющей транспорта Na+.

Не полное подавление протонофором (ImkM ciccp) транспорта Na+ на ПМ К+-ДефИЦИТНЫХ клеток D.maritima (Табл. 3), по-видимому, указывает на функционирование в этой мембране, помимо Na+/H+ антипортера, другого Ка+-транспортирущего механизма, не зависящего от протон-движущей силы.

Наличие функции рН-статирования, поддерживающей pH цитоплазмы в узком интервале значений нейтральной и слабощелочной области [Лялин, Ктиторова, 1976; Raven, 1985; Kugel et al., 1987; Трофимова, Молотковский, 1988; Madshus, 1988; Трофимова, 1992], позволяет регулировать величину и направление ДрН на ПМ, изменяя pH наружного раствора.

Если наружная среда более кислая, чем цитоплазма, АрН, направленный в этом случае из среда в клетку, используется Na+/H+ антипортером как источник энергии для выведения Na+ наружу. Если наружный pH превышает pH цитоплазмы, АрН приобретает противоположный знак и должен стать при этом источником энергии для движения Na+ через Na"1"/^ антипортер в противоположном направлении, т.е. из среды в клетку.

Принимая во внимание зависимость ДрН на ПМ от наружного pH, измеряли при разных pH раствора потоки Na+ и К+, индуцируемые внесением К+ в суспензию К+-дефицитных клеток v.maritima (Табл. 4). По мере снижения концентрации Н+ в наружном растворе способность к выведению Na+ из клеток с помощью Na+/H+ антипортера должна снижаться. Действительно, скорость транспорта

Таблица 4. Влияние pH среда на транспорт Na+ и К+ через плазматическую мембрану К+-дефицитных клеток в.maritima, при внесении в среду 5 мМ KCl. Концентрация Na+ в среде - 0,5 М.

Параметры рн ■

6,2 7,2 8,5

Поток Na+ Поток К+ Na+/K+ 49-7 70-9 0,70±0,i0 34-12 63-8 0,54-0,11 61-9 51-4 I,20±0,24

Примечание:

Потоки ионов выражены в ммоль/л клеточного об'ема 20 мин.

На+ и отношение иа+/К+ (число перенесенных ионов к числу перенесенных . ионов К+) имели тенденцию к снижению при подщелачивании среды. Однако, это снижение наблюдалось только при переходе от рН 6,2 к рН 7,2, т.е. к значению, близкому значению рН цитоплазмы. При наружном рН 8,5, когда ЛрН был направлен из цитоплазмы в наружную среду, и в силу этого не мог служить движущей силой для экспорта Ыа+, поток Иа+ не только не снижался, но наблюдалось его увеличение. Возрастало также отношение ш+/к+.

В другой серии экспериментов (Рис.7), которые проводили на

Рис 7. Динамика внутриклеточных концентраций иа при одновременном увеличении концентрации ЫаС1 и изменении рН наружного раствора у р.1Нг{<«а. Клетки, выращенные на искусственной морской воде при 0,46 М НаС1 и рН 7,2, перене сены на такие же растворы, но с повышенной концентрацией ЯаС1 (1,25 М N301) при различных рН: I. - 5,5; 2.- 7,2; 3.- 9,0. Для поддержания необходимого рН в средах использовали 25 мМ Тг1б/МЕЗ буфер.

0.0 0.5 t.O 1-е 2.0 2.5 3.0 3.5 Продолжительность инкубации. часа

О

клетках р.viridis, выращенных на искусственной морской воде при нейтральном pH, увеличивали наружную концентрацию NaCI (от 460 до 1250 мМ) и одновременно изменяли pH либо в кислую (pH 5,5), либо в щелочную (pH 9,0) сторону. Кислая среда обеспечивала направление АрН на ПМ, благоприятное для выведение ионов Na+ наружу посредством Na+/H+ антипортера, щелочная - для их поступления в клетку. Если Na+/H+ антипортер является единственной На+-транспортирующей системой ПМ, то ионы Na+ должны аккумулироваться в клетках, помещенных в щелочную; среду, тогда как это не должно происходить в кислой среде. Однако., проведенные измерения содержания Na+ в клетках показали, 4fo f.viridis одинаково эффективно поддерживает концентрации Na+ /В цитоплазме на низком уровне при pH 5,5 и pH 9,0. Аналогичный результат 0ыл получен нами на другой галотолерантной . ^икроводоросли

Nophrochlorls salina. .

Способность галотолерантных водорослей выводить Na+ из клеток в щелочной среде с высоким содержанием соли указывает на то, что в их ПМ, помимо Na+/H+ антипортера, функционирует механизм выведения Ыа+ из клеток, нэ энергизуемый протон-движущей силой.

3.2 Исследование АТР-зависимого транспорта ионов на выделенных везикулах ПМ р.viridis.

Прежде, чем перейти непосредственно к АТР-зависимому транспорту ионов на везикулярной мембране, рассмотрим результаты экспериментов, в которых изучали АТР-гидролазную активность полученного препарата ПМ.

3.2.1 Свойства АТР-гидролазной активности ГОЛ р.vir idle.

Проведенные эксперименты показали, что свойства АТР-гидролазной аКТИВНОСТИ ПМ Р.viridis, в основном, сходны со свойствами Н+-АТФазы ПМ высших растений и пресноводных водорослей. К чертам сходства следует отнести: (I) требование для проявления активности ионов Mg2*, но не Са2+, (2) наличие оптимума при pH 6,5-7.0, (3) стимуляция одновалентными катионами в концентрационном ряду 25-75 мМ, (4) действие большинства ингибиторов, подавляющих Н+-АТФазу ПМ высших растений (ванадат, DCCD, N-этилмалеимид), (5) специфичность по-отношению к АТР, как

к субстрату.

В то же время, у АТР-гидролазной активности IM р.viridis обнаружены свойства, отличающие ее от свойств обычной Н+-АТФазы р-типа: (I) требование для проявления полной „активности избытка ионов %2+ по-отношению к АТР, (2) высокая активность в широком диапазоне pH, включая крайне щелочную облость, (3) наличие второго концентрационного максимума стимуляции одновалентными катионами, (4) низкая чувствительность к des, (5) более низкие, чем для Н+-АТФазы ПМ растительных клеток, значения Ку по отношению к АТР.

Наличие сходств в свойствах, по-видимому, указывает на функционирование в Ш т.viridis, как и в ПМ высших растений и пресноводных водорослей, Н+-транслоцирующей АТФазы. Более интересен другой вопрос. С чем связаны обнаруженные отличия, которые, по-видимому, отражают адаптацию р.viridis и других галотолерантных водорослей к условиям высокой солености среды?

Возможны следующие об'яснения: (I) Н+-АТФаза ПМ галотолерантных водорослей может быть модифицированным вариантом белка, функционирующего в ПМ растений пресного фона. Известно, что АТФазы, образующие в каталитическом цикле фосфорилированный интврмэдиат, при наличии общей для всех консервативной аминокислотной последовательности, различаются молекулярной массой и структурой [Serrano, 1988; 19893- Эти различия, многообразие ион-транспортных функций этих ферментов, а также широкое распространение среди про- и эукариот, по-видимому, отражают их способность легко трансформироваться в ходе эволюции в соответствии с конкретными физиологическими задачами и условиями среды. (2) Необычные свойства АТР-гидролазной активности ПМ р.и iridis и других галотолерантных водорослей могут быть результатом необычного липидного микроокружения обычной Н+-АТФазы [Sheffer et al., 19863. (3) В ПМ галотолерантных водорослей наряду с обычной Н+-АТФазой функционирует другая АТФаза, не типичная для ПМ растений пресного фона.

В связи с возможностью функционирования в ПМ галотолерантных водорослей второй АТФазы расмотрим два из обнаруженных различий в свойствах АТР-гидролазной активности более подробно.

Гидролиз АТР, катализируемый фракцией ПМ р.viridis, осуществлялся в широком диапазоне pH с оптимумом 6,5-7,0 (Рис.8).

« «г

/

о

7

9

10

II

o. loo 200 300 «О 500 Концентрация солея, мы

рН

Рис.8

Рис.9

Рис 8. рН-зависидасть АТР-гидролазной активности фракции ПМ т.virtáis Использованные буферные системы (25мМ): MES/втр, рН 5,5 - 7,5; НЕРЕ5/ВТР, рН 7,0 - 9,5; CAPS/NaOH, рН 9,0 - 10,5-

Рис 9. Влияние КС1 (I, 2) и NaCl (3, 4) на АТР-гидролазную активность фракции ПМ p.utndie при рН 7,0 (1,3 ) и рН 9,0 (2, 4).

Характерной особенностью препаратов ПМ р.иiridie является способность гидролизовать АТР при щелочных значениях рН среда. Высокий уровень АТФазной активности в щелочной области наблюдался также для препаратов ПМ, выделенной из галотолерантных микроводорослей рода Thinaliella [Gimmler et al., 1999; Weiss et al., 1989].

Н+-АТФаза ПМ высших растений и пресноводных водорослей также имеет оптимум активности при рН 6,0-7,0. Однако, в отличие от АТФазы ПМ галотолерантных водорослей, она проявляется в более узком диапазоне рН, обнаруживая крайне низкую активность в щелочной области. [DuPont et al., 1981; Soiranarin et al., 1985; Anth.on, Spanswiok, 1986].

Стимуляция низкими концентрациями одновалентных катионов (25-75 мМ) типична для Н^-АТФазы ПМ растительных клеток [DuPont et al., 1981; Kasamo, 1986]. В НЭШИХ Экспериментах КС1 И NaCl вызывали увеличение АТР-гидролазной активности ПМ v.viriais. (Рис.9). Однако, их действие было необычным. И KCI, и NaCI обнаружили два концентрационных максимума стимуляции, один

максимум при 25-75 мМ, другой - при 150-400 мМ. Наличие двух концентрационных максимумов наблюдалось как в нейтральной области, так и при щелочных значениях pH среды.

По-видимому, первый концентрационный максимум стимуляции гидролиза АТР одновалентными катионами принадлежит Н+-АТФазе, второй - "высокосолевой" ион-активируемой АТФазе. Аналогичным образом, pH-оптимум 6,5-7,0 (Рис.8) принадлежит Н+-транслоцируюшей АТФазе, тогда как вторая АТФаза функционирует при более щелочных pH.

3.2.2 Исследования транспорта Н+ и Na+ на везикулах ПМ р.viridis.

3.2.2.1 АТР-зависимая генерация протонного градиента и его диссипация под действием Na+.

Формирование АрН на везикулярной мембране и его диссипацию регистрировали по изменениям оптической плотности зонда на ДрН акридинового оранжевого (АО). Добавление АТР к реакционной смеси,' содержащей везикулы ПМ р.uiridis, приводило к заметному уменьшению оптической плотности АО (Рис.10). Протонофор CICGP полностью устранял уменьшение оптической плотности суспензии в присутствии АО. Полученный результат указывает на АТР-зависимый перенос н+ внутрь везикул и на генерацию АрН на везикулярной мембране. Добавление ванадата в значительной степени уменьшало величину генерируемого АрН (Рис.10), что говорит о вовлечении ванадат-чувствительной АТФазы в генерацию ДрН на везикулах ПМ

Р.viridis.

Величина генерируемого АрН зависела от pH реакционной среды. Максимум наблюдался при pH 6,0-7,0 (Рис.II), совпадая с максимумом АТР-гидролазной активности ПМ р.viridis. Однако, в отличие -от pH-зависимости АТР-гидролазной активности, функция ДрН/рН имела резкий спад в щелочной области и уже при pH 8,0 практически не удавалось наблюдать генерацию ДрН на везикулах. Последний факт может быть об'яснен высокой Непроводимостью ПМ при щелочных pH [Bisson, Walker, 1980; 1981].

Ионы Na+ вызывали диссипацию сформированного АТФазой АрН. Скорость диссипации зависела от концентрации добавляемого к суспензии Na+ (Рис.12). Зависимость имела форму кривой с насыщением, которую аппроксимировали кривой Михаэлиса-Ментен с

ATP - I мМ, C1CCP - 12 мкМ, ванадат - 0,1 мМ.

pH

РисЛI.Зависимость ДрН, генерируемого на везикулах ПМ р. viт•ldiз, от рН реакционной смеси.

Рис.12. Диссипация АрН, гене- Рис.13. Зависимость скорости рас-рированного на везикулах ПМ р. пада ДрН на везикулярной мембране viridis,, под действием Na . р.viridis от концентрации Na.

I.- экспериментальная кривая; 2.-зависимость, рассчитанная по уравнению Михаэлиса-Ментен, К,,=10мМ.

Kj^IO мМ (Рис. 13). Это значение находится в ряду концентраций Na+ в клетках р.viridis, инкубируемых в искусственной морской Еоде.

Диссипация сформированного ДрН была специфичной по отношению к Ыа+. Другие одновалентные катионы, которые были внесены в инкубационную среду вместо Na+ (К+, Cs+ и Li+), вызывали значительно более медленную диссипацию ДрН. По-видимому, К+, Cs+, bi+ являются ингибиторами Na+/H+ обмена. Если любой из них был добавлен до внесения Na+ в среду, то Na+/H+ обмен подавлялся. Амилорид, ингибитор Na+/H+ антипорта, также существенным образом снижал скорость диссипации ДрН под действием ионов Ыа+.

Таким образом, в ПМ галотолерантной водоросли f.viridis функционирует ванадат-чувствительная Н+-транслоцирующая АТФаза. По-видимому, это первая, прямая демонстрация Н+-транслоцирующей АТФазы в ПМ галотолерантных водорослей. Наряду с Н+-АТФазой, в ПМ р.viridis обнаружен Na+/H+ антипортер. Последний, используя энергию протонного градиента, сформированного Е^-АТФазой, обменивает внутриклеточный Ыа+ на Н+ наружной среды. Ыа+/н+ антипортер был обнаружен также в ПМ c.eaHna [Katz et ai., 1989J-Н+-АТФаза и Na+/H+ антипортер могут рассматриваться как механизм выведения Na+ из цитоплазмы, аналогичный Na"1--транспортирующей системе, которая функционирует в ПМ клеток высших растений-гликофитов и пресноводных водорослей.

3.2.2.2 АТР-зависимая аккумуляция Na+ везикулами в отсутствии протонного градиента на везикулярной мембране.

Для транслокации Na+/H+ антипортером ионов Na+ против градиента электрохимического потенциала требуется протон-движущая сила. Напротив, йа+-АТФаза не требует энергии предварительно сформированного ДрЙ+. Чтобы дискриминировать эти две

4- ?? +

Na -транслоцирующие системы, исследовали с помощью Na поглощение ионов натрия при различных значениях ДрН на везикулярной мембране. Максимум АТР-зависимой генерации ДрН наблюдался при pH 7,0 реакционной среды (Рис.П), тогда как при pH 8,0 ДрН был близок к 0. Следовательно, pH 7,0 является благоприятным условием для функционирования Na+/H+ антипортера, тогда как при pH 8,0 включение антипортера в работу невозможно и поэтому следует ожидать, что поглощение Na+ будет обеспечиваться

предполагаемой На+-АТФазой.

Результаты исследования поглощения везикулами 22Na+ при рН 7,0 представлены на Рис.14. Вопреки ожидаемому, добавление АТР к суспензии везикул практически не приводило к поглощению меченого Ыа+. Другими словами, нам не удалось продемонстрировать ATF-зависимую аккумуляцию 22ыа+, обусловленную работой Ка+/Н+ антипортера. Это противоречит результатам эксперимента, который демонстрирует иа+-зависимую диссипацию АрН, предварительно сформированного на везирулярной мембране в присутствии АТР (Рис.12).

АТР-зависимая аккумуляция 22Na+ везикулами при рН 7,0 наблюдалась, когда они были предынкубированы с натриевым ионофором моненсином (Рис.14). Аккумуляция 22Ыа+ везикулами со встроенным в мембрану экзогенным Na"1"/!^ обменником подтвердила, что генерация АрН в присутствии АТР действительно имеет место при рН 7,0. однако, остается неясным, почему эндогенный Na+/H+ антипортер мембраны не был активен при этих условиях эксперимента.

В эксперименте, который демонстрирует распад ДрН при добавлении Na+ (Рис.12), АТР-зависимый АрН был сформирован до внесения Na+ в среду. При исследовании поглощения 22Na+ (Рис.14) АТР был добавлен к среде после Na+. По-видимому, предынкубация везикул в течение некоторого времени в условиях, когда на мембране существует АрН, необходима, чтобы активировать эндогенный Na+/H+ антипортер.

АТР-зависимое поглощение 22Na+ везикулами p.virhns при рН 7,0 было индуцировано также добавлением CI.CCP (Рис.14). Присутствие CICCP в среде исключает формирование ДрН на мембране и, следовательно, вовлечение Na+/H+ антилортера в АТР-зависимую аккумуляцию Na+. Таким образом, в условиях, когда мембрана обладает высокой протонной проводимостью, по-видимому, включается другая Иа+-транслоцирующая система, которая не зависит от АрЛ+.

Добавление АТР к суспензии при рН 8,0 приводило к накоплению 22Na+ везикулами (Рис.15). Может ли Ыа+/Н+ антипортер вносить вклад в поглощение Ыа+ везикулами ПМ p.utriats в условиях этого эксперимента? Ответ является отрицательным. В качестве аргументов могут быть приведены следующие наблюдения: (I) В экспериментах с АО при рН 8,0 была зафиксирована лишь ничтожно малая величина ДрН

О 4__

Время после JKK5аВЛйЯИЯ из

0 4 8

Время после добавления Ü?.

БИС.14

Рис Л 5

Рис 14. АТР-зависимое поглощение Na везикулами ИМ р.viridis при pH 7,0 и 20 мМ Nací в реакционной смеси. I.- контроль (без АТР); 2.- 2 Mili ATP; 3.- 2 мМ ATP плюс 12 МКМ CICCP; 4.- 2 мМ АТР плюс 12 мкМ моненсин.

Рис 15. АТР-зависимое поглощение 22Na+ везикулами БМ р.viridis при pH 8,0 и 50 мМ Nací в реакционной смеси. Добавки: (А) - без добавок; (а) - 2 мМ АТР; (о) - 2 мМ АТР плюс 12 мкМ G1GCP; (+) -2мМ АТР плюс 50 мкМ амилорйД.

(Рис.II), т.е. ничтожно малая движущая сила для переноса Na+, опосредованного Na+/H+ антипортером. (2) В случае, если заметная генерация йрН все-таки имела бы место при pH 8,0, внесенный в суспензию 01ССР полностью устранял бы такую возможность и, соответственно, ингибировал бы поглощение 22Na+, обусловленное работой Na*/!?4" антипортера. Однако, CICCP не влиял на этот 'процесс. (3) Амилорид, ингибитор ш+/Е+ антипортера, также не влиял на поглощение 22Na+ везикулами в условиях этого эксперимента.

Таким образом, результаты последних экспериментов указывают на функционирование в им f.viridis Ыа+-транспортирующей системы, которая не зависит от протон-движущей силы. Более того, эта транспортная система включалась тогда, когда ЛрН на везикулярной мембране тем' или иным способом был устранен (CICCP или исходно высокая Непроницаемость везикул при pH 8,0). Очевидно, что эта

Na^-транспортирукщая система является Иа+-АТФазой.

4. Микроводоросли в условиях гиперосмотического солевого шока.

Гиперосмотический' солевой . шок - наиболее критическая ситуация для организмов с точки зрения их солеустойчивости. Резкое увеличение наружной концентрации соли вызывает в клетке процесс, в результате которого она переходит из одного стационарного состояния в другое. В целом, индуцируемый резким возрастанием наружной концентрации соли процесс направлен на поддержание низких концентраций ионов в . цитоплазме и,. одновременно, на сохранение оводненности клетки. Важнейшую роль в переходном процессе играют ион-транспортирующие• системы ПМ, а также локализованные в цитоплазме системы биосинтеза низкомолекулярных органических соединений (осмолитов), выполняющих осморегуляторную функцию.

С функционированием этих систем связаны процессы, рассматриваемые в настоящем разделе.

4.1. Динамика внутриклеточного содержания ионов у микроводорослей при солевом шоке.

Галотолерантная микроводоросль v.maritima, была выращена на среде, содержащей 0,5 М NaCI и перенесена на такую же среду, но с концентрацией NaGl 1М. Динамика внутриклеточного содержания Na+ в ходе ответной реакции клеток на гиперосмотический шок имела двухфазный характер. Сначала водоросли поглощали Na+ (Рис.16,7). Внутриклеточные концентрации Na+ возрастали более чем в два раза-по-сравнению.с их исходным уровнем (фаза "входа"). Вход сменялся выведением Na+ наружу (фаза "выхода"). Внутриклеточные концентрации Na+ в конце фазы "выхода" приближались к своим исходным значениям (до момента увеличения наружной концентрации соли).

При перенесении клеток о.maritima на среду, содержащую 2М NaCl, динамика внутриклеточных концентраций Na+ также- имела двухфазный характер (Рис.16,2). Однако, в этом случае внутриклеточные концентрации Na+ в конце фазы "входа" достигали более высоких значений, чем в варианте с I М NaCl, а после завершения фазы "выхода" концентрации NaCl в клетках оставались на более высоком уровне, чем исходные. Этот результат находится в

к

/ \z -

• V \ \ —»-...

/

' 2 Прододштельвость инкубации, чаек

выращенной на среде Г n М^м

SeW0^ ВШСе™

количества w.m Д°полнительного

KoSS*:N О1) -ЛОш ГЛТ)

внесения ¿ас 1 Йтевдал!3^™^ мем0Р™о

кадра^^^Гстде^! °Т клетки, выращенные в cpe¿e ¿e¡

растворах63 15 ^ =н?рацией Kaci. Б. ¡

Ж!4??3^8 к 340 мм ;

нерез 15 мин. инкубации R

метки, выращенше в среде без !

Nací, через 3 часа инкуЗвд. i

го а г-

<0

- 100 •э-

so

в ^

к*

3 —-----

А■

■V

<5 1 2 э Ч 5 в Время, часы j

Рис 18. Поглощение ~Na+ клетками c.№ittmi перенесенными со спелы содержащей 0,5М Nací, н4 „ С0ДеР®ащую 2,ОМ Nací. Момент увеличения наружной концентрации Nací отмечен стрелкой^

~ внутриклеточные i концентрации NaT измерены ! с помощью пламенного í фотометра; 2 '

содержание поглощенного «а в клетках рассчитано ;

йдаЖэгги

Б —а-

ЧОО БОО sao

Концентрация NaCl б среЗе, /чМ

таи

соответствии с данными, представленными в разделе 1.2. IM NaCl лежит в диапазоне наружных- концентраций соли, в котором клетки поддерживают ионный гомеостаз, а 2 M NaCl - за пределами этого диапазона.

Аналогичные изменения внутриклеточного содержания Na+, а также ci-, в ответ на гиперосмотический солевой шок ' наблюдались на других водорослях. Двухфазный характер. этих изменений был обнаружен нами У Ch.pyrenoidosa, F.viridis И A.variabilis, а также у Ch.emersonii [Greenway, Setter, 1979], V.parva [Ginsburg, 1981], D.tertiaiecta .[Ehrenfeld, Cousin, 1984], • что свидетельствует об. универсальности двухфазной реакции. Во всех случаях, когда наружные концентрации соли превышали пороговое значение, ион-транспортирующие системы не справлялись с удалением избытка ионов из клетки.

4.2. Электрический потенциал на Ш микроводорослей при солевом шоке.

i

Важнейшей характеристикой микроводорослей в условиях гиперосмотического солевого шока является электрический потенциал на ПМ. Дф участвует в создании движущей силы переноса ионов через ПМ, а также является фактором, регулирующим ионную проницаемость этой мембраны посредством потенциал-зависимых ионных каналов [ЛунеВСКИЙ и др., 1980; Shimmen, Tazawa, 1983; Sokolik, Yurin, 1986; Азимов и др., 1987; Берестовский и др., 1987]. Кроме того, измерение Дф.может дать информацию об участии электрогенных ион-транспортирующих систем в ответной реакции клетки ' на гиперосмотический солевой шок.

Измерения Аф на ПМ в условиях гиперосмотического солевого шока были проведены на водоросли Ch.pyrenoidosa, не адаптированной к Nací, и этой же водоросли, адаптированной к 340 мМ NaCl.

Со сред культивирования клетки ' переносили на ряд таких же растворов, но с более высоким содержанием NaCl. После 15-минутной (фаза "входа") и 3-часовой (завершение фазы "выхода") инкубации водорослей в указанных растворах измеряли Аф.

Через 15 мин после перенесения не адаптированных к соли водорослей на среды с NaCl (фаза "входа") наблюдалась деполяризация ПМ. По мере увеличения наружной концентрации соли

деполяризация усиливалась, Дф снижался и. достигал некоторого минимального уровня уже при 50 мМ NaCl (Рис. I7Â).

После 3-часовой инкубации клеток в солевых растворах (завершение фазы "выхода") наблюдалась реполяризация мембраны. Дф восстанавливался практически до исходного уровня (Рис! I7B).

Изменения Аф через 15 мин после увеличения наружной концентрации соли у адаптированной культуры носили такой же характер, как у неадаптированной, хотя эти изменения были значительно слабее и проявлялись в области более высоких концентраций NaCl (Рис. 17Б).

Из значений концентрационных градиентов Ыа+ и Дф легко оценить направление движущих сил для перемещения этого иона через IM. В условиях гиперосмотического солевого шока в фазе "входа" при концентрациях NaCl в среде, лежащих как в допороговом, так и запороговом .диапазонах, градиент электрохимического потенциала Na+ направлен из наружной среда в клетки. Принимая во внимание крайне низкую проницаемость для ионов липидного бисдоя, можно рассматривать лишь два пути поступления ионов Na+ в клетку : ( I ) через обратимо функционирующий Na+/Н+ антипортер, (2) через потенциал-зависимые ионные каналы. Поступление Na+ в клетку первым путем было продемонстрировано на морской водоросли D.tertioiecta [Kuchitsu et al., 1989]. Перенос Na+ вторым путем, по-видимому, обусловлен переходом потенциал-зависимых ионных каналов в открытое состояние и, следовательно, увеличением Ма+-проницаемости Ш. Как показали результаты экспериментов, представленных в следующем разделе, возрастание Ка+-проницаемости ПМ в ответ на внесение NaCl в среду действительно имеет место.

4.3. Na+-npoHm;aeuocTb ПМ п.maritima при солевой шоке.

Измерения проводили с помощью 2%а+. Клетки п.maritima были выращены в среде, содержащей 0,5 M NaCl. В соответствий с вышеприведенными данными (раздел 2.1), при инкубации клеток в среде выращивания штоки Na+ через ПМ характеризовались крайне низкими значениями. Последующее перенесениё водорослей на такую же среду, но содержащую 2 M NaCl, приводило к резкому увеличению потока меченого Na+ внутрь клетки (Рис.18). Общее содержание Na+ в клетках, измеренное с помощью пламенного фотометра, изменялось адекватно возросшему потоку меченого Na+ внутрь. Отсутствие

возможности измерить Дф на ПМ, к сожалеют, не позволило рассчитать значения для ПМ в ходе ответной реакции п.maritima на солевой шок. Однако, многократное, по-сравнению со стационарными условиями, возрастание потока Na+ внутрь клеток однозначно свидетельствует о резком увеличении На+-проницаемости мембраны в фазе "входа" ионов.

Наряду с индукцией потоков ионов через ПМ, изменениями Дф и Na+-npoHmiaeMocra ПМ в клетках галотолерантных микроводорослей в условиях гиперосмотического солевого шока происходят следующие события:

(1) Изменяется содержание • воды. Эти изменения носят двухфазный характер. Внесение соли в среду приводит к быстрой потере внутриклеточной воды с последующим медленным восстановлением оводненности клетки [Gimmler et al., 1977; 1931].

(2) -В цитоплазме включается биосинтез осмолитов. В частности, в клетках водорослей рода снгагвиа синтезируется пролин [Калинкина, Строгонов, 1985; Калинкина, Удельнова, 1991], в клетках Dunaiieiia - глицерин [Ben-amotz, Avron, 1981; Gimmler, MÖller, 1981], в клетках Vlatlmanas - маннит [Kirst, 1980; Richter, Kirst, 1981].

(3) Цитоплазматический pH смещается в щелочную сторону, изменяясь от приблизительно нейтрального значения до pH 8 [Kuohitsu et al.,1989]. Можно предположить, что восстановление исходных концентраций ионов в клетках и исходного содержания воды в процессе осмоадаптации сопровождается восстановлением исходного значения pH цитоплазмы.

Заключение.

Клетки галотолерантных микроводорослей обладают эффективными механизмами ионного гомеостатирования. За счет работы этих механизмов в цитоплазме поддерживаются низкие концентрации ионов, что позволяет цитоплазматическим биополимерам функционировать при незначительных ионных нагрузках в условиях высокого содержания солей в среде. 'Соответственно, биополимеры цитоплазмы галотолерантных водорослей, так же, как и биополимеры цитоплазмы растений-гликофитов, обладают высокой чувствительностью к ионам, что было продемонстрировано в экспериментах in vitro. Способность галотолерантных водорослей эффективно регулировать ионный состав

цитоплазмы была выявлена при исследовании распределения ионов в системе клетка-среда. Водоросли поддерживают цитоплазматические концентрации ионов на постоянном и относительно низком уровне в некотором диапазоне наружных концентраций Nací. Возрастание верхней границы этого диапазона при переходе к обитанию в засоленных средах, по-видимому, обусловлено: (I) изменениями барьерных свойств ПМ, в частности, снижением ее проницаемости для ионов Na+; (2) увеличением мощности систем, откачивающих Na+ из клетки. Адаптационный механизм первого типа - более низкие' значения р БЫ у галотолерантных водорослей рода Dunaileí la, чем у пресноводных, а также снижение Р ПМ при длительной адаптации к NaOi эвригалинного вида ch.pyrenoidasa - продемонстрирован нами. Наличие у растений адаптационных механизмов второго типа -выведение Naf в наружную среду с большей скоростью - остается неизученным, хотя у животных такие адаптации хорошо известны. Ион-транспортирующие системы, обеспечивающие низкий уровень соли, в организме морских животных, имеют более низкое .сродство к Na+, чем соответствующие системы у пресноводных организмов, а максимальная скорость трансмембранного переноса Ыа+ у морских организмов достигается при гораздо более высоких концентрациях соли, чем у пресноводных. [Хочачка, Сомеро, 1977]. Возможно, такого же рода адаптации имеют . место и у галотолерантных водорослей. Более эффективное удаление Иа+ из цитоплазмы этих организмов, по сравнению с растениями пресного фона, может быть обусловлено функционированием в ПМ их клеток ш+-АТФазы.

Исследования, проведенные на интактных клетках галотолерантных водорослей рода Eunaiieiia показали, что полученные характеристики транспорта ионов к+, Na+ и Н4" через ПМ этих водорослей,в основном, укладываются в схему, которая описывает механизм транспорта этих.ионов через ПМ гликофитов. В соответствии с этой схемой, поглощение К+ и экспорт Na+ клетками зависит от генерации Арн+ на ПМ; в генерацию Дрл+ вовлечена н+-транслоцирующая АТФаза.

Вместе с тем, некоторые данные, полученные на интактных клетках, не согласуются со схемой транспорта ионов через ПМ клеток растений пресного фона, а именно, наличие Арй+-независимой составляющей транспорта Na+.

В соответствии с этим, в экспериментах на выделенных из

клеток в.viridis везикулах были получены прямые доказательства функционирования в Ш галотолерантных водорослей Н+-транслоцирующэй и Ка+-транслоцирующей АТФаз. Помимо двух транспортных АТФаз, в этих экспериментах в ПМ р. viridis был обнаружен Na+/H+ антипортер.

Таким образом, в ПМ галотолерантных водорослей функционируют две ^-транспортирующие системы: (Н+-АТФаза + На+/Н+ антипортер) и Ыа+-АТФаза (Рис 19). Первая может рассматриваться, как универсальный механизм выведения Na+ из клеток. Она встречается в ПМ как про-, так и эукариот, обнаруживается в мембранах растительного и животного происхождения и свойственна представителям различных экологических групп. Вторая, по-видимому, специфична для галотолерантных об'ектов и функционирует в ПМ наряду с универсальной Ыа+-транспортирущей системой, т.е. Na+/H+ антипортером, использующим для переноса Na+ энергию АцН+. Чем обусловлено наличие в ПМ галотолерантных водорослей двух Ыа+-транспортирующих систем? Какова физиологическая роль Ка+-АТФазы?

Как обсуждалось выше, за счет функции рН-статирования pH цитоплазмы поддерживается в узком диапазоне нейтральной и слабощелочной области. У p.subcordiformis при изменении наружных pH в широком диапазоне, включая кислую и щелочную области, pH цитоплазмы изменялся от 7,0 до 7,8 [Kugel et al., 19871 - pH 7,0 совпадает с максимумом фукционирования Н+-АТФазы и генерации АрН

А Б

Рис.19. иа+-транспортирующие системы ПМ растительных клеток. А - растения пресного фона, Б. - галотолерантные растения.

на мембране, тогда как рН 7,8 близок к предполагаемому оптимуму функционирования Ыа+-АТФазы. Таким образом, защелачивание наружной среды создает более благоприятные условия в цитоплазме для включения На+-АТФазы и менее благоприятные для функционирования Н^-АТФазы. Условием выведения Ыа+, из клеток посредством электронейтрального Ыа+/Н+ антипортера является: РНцаруж < рНЦЙТ0Ш1 . При защелачивании среда наружный рН может превысить цитоплазматиче ский и вышеприведенное условие для Переноса Na+ наружу через Na+/H+ антипортер выполняться не будет.

Электрогенный Na+/iï+ антипортер при щелочных наружных рН мог бы выполнять функцию выведения Na+ из клеток за счет Аф. Однако, в случае высокой протонной проводимости при рН 8 [Bisson, Walker, 1980; 1981] ДДЕ+= 0. Другими словами, разнонаправленные и равные по абсолютной величине АрН и Аф уравновешивают друг друга, исключая наличие движущей силы для выведения Ыа+ из клеток Na+/H+ антипортером. В этом случае выведение Na+ наружу должно осуществлятся исключительно Ыа+-АТФазой. Направление и величина АрН на ПМ могут быть регулирущим фактором, обеспечивающим переключение двух Ка+-транспортирующих систем.

Обитание в условиях высокой солености среды в сочетании со щелочными рН, является широко распространенным явлением в живой природе. Планктонные организмы постоянно находятся в таких условиях. рН морской воды, как правило, близок к 8 [Виноградов, 1967]. Эвригалинные виды пршшвно-отливной зоны эстуариев рек и морской литорали испытывают колебания не только солености, но и рН.

Ма+-транспортирувщая АТФаза обнаружена в ПМ ряда гетеро- - и автотрофных прокариот, обитающих в условиях высокой солености и одновременно щелочных рН среды [Benyoncef et al,, 1982; Heefner, Harold, 1982; Скулачев, 1989; Dibrov, 1991].

Высокая соленость и щелочные рН свойственны солонцам [Ковда, 1937]. Указанием в пользу функционирования у солонцовых растений первичной Na+-помпы являются результаты исследования АТФазной активности ПМ Ealocnemum etr-оЫ laceum. В ПМ, ВЫДвЛвННОЙ ИЗ побегов этого растения, была обнаружена АТФаза, стимулируемая ионами Na+ и К+ и активная при рН 8. [Мишустина и др. 1979].

Возможно, Na+-АТФаза ПМ p.vinaia является электрогенной. В случае электрогенности Na+-noMma индукция поглощения Na+

везикулами' при добавлении С1С0Р (Рис. 14) находит еще одно об'ясненив. С1ССР индуцировал АТР-зависимов поглощение Na+ лишь при нейтральных рН, когда исходно Н+-проводимость ПМ низка. В то же время, СЮСР не стимулировал накопление Na+ везикулами при рН 8,0 (Рис. 15), когда Непроводимость ПМ высокая. Возможно, при нейтральных рН ClCCP-опосредованный отток Н+ из везикул снимает Аф на мембране, который генерируется потоком Na+, создаваемым Иа+-АТРазой. В ^условиях высокой проницаемости мембраны для Н+ сюср не влияет на поглощение Na+ везикулами, поскольку он не требуется для разрядки Аф [Avetisyan et al., 19913- При гиперосмотическом солевом шоке и щелочных наружных рН, когда рН цитоплазмы приближается к 8 [Kirst, Bisson, 1982; Kugel et al., 1987], активность Н+-АТФазы резко снижается. Na+-AT®a3a в этих условиях может быть основным генератором Аф на ПМ. Аф, генерируемый Иа+-АТФазой, способствует электрофоретическому поступлению Н+ в клетку. Следовательно, электрогенная Na+-AT$a3a может рассматриваться как часть системы рН-статирования клетки. Н+-АТФаза, функционируя, при цитоплазматических рН 6,5-7,0 и выводя Н+ наружу, препятствует закисленшо цитоплазмы [Лялин, Ктиторова, 1976; Bates, Goldsmith, 1983; Трофимова, Молотковский, 1988; Магге et al., 1988]. В отличие от нее, Яа+-АТФаза, включаясь в работу, предположительно, при рН 8 и генерируя Аф на мембране, препятствует защелачиванию цитоплазмы. Это также является аргументом в пользу того, что Иа+-АТФаза играет особо важную роль в условиях гиперосмотического - солевого шока. Последний сопровождается увеличением концентраций Na+ в цитоплазме (раздел 4.1), деполяризацией плазмалеммы (раздел 4.2) и смещением цитоплазматического рН в щелочную область [Kuchitsu et al., 1989].

Рассмотренные в работе ион-транспортируклцие системы ПМ вовлечены не только в поддержание ионного, но' и водного баланса клетки. Внесение соли в среду вызывает процессы, отвечающие двум различным потребностям клетки в этих условиях. С одной стороны, водоросли должны сохранить оводненность при действии соли как осмотического фактора, с другой - поддержать содержание ионов в цитоплазме на низком уровне. Приведенные на Рис.20 схематизированные графики показывают связь двухфазной динамики внутриклеточного содержания вода и ионов, с функцией

Рис 20. Схематизированные графики, описывающие

изменения некоторых

параметров клетки в ходе гиперосмотического солевого шока у галотолерантных микроводорослей: I. содержание воды в цитоплазме; 2. - внутриклеточные концентрации 3.

внутриклеточные концентрации осмолита.

Время инкубации

Синтез визкомолекулярщи осмолятов

Увеличение АТФазной активности ПМ

Рис.21.Гипотетическая схема участия ион-транспортирующих систем ПМ в процессе осмоадаптации у галотолерантных микроводорослей при гипврос-мотическом солевом шоке.

Восстановление содержания воды в клетке

Выведение Ка*. СГиз клетки. Реполяризация ПМ

осморегуляции. Внесение соли в среду приводит к потере внутриклеточной воды. Быстрое устранение обезвоживания может быть достигнуто путем увеличения ионной проницаемости Ш, что в действительности наблюдалось на клетках випаНэНа в экспериментах с 22Na+ (раздел 4.3). Происходящее при этом возрастание внутриклеточных концентраций ионов в фазе "входа" приводит к повышению внутриклеточного осмотического давления, что, в свою очередь, вызывает обратный ток воды в клетку. В результате оводненность клеток восстанавливается. Поступление ионов внутрь в этот момент может рассматриваться как осморегуляторный процесс быстрого реагирования, запускаемый Клеткой в ответ на повышение наружной концентрации соли. Увеличение внутриклеточных концентраций ионов, однако, само по себе не является желательным, так как приводит к нарушению метаболизма. В связи с этим, включается синтез осмотиков органической природы и происходит постепенное замещение избытка ионов низкомолекулярными органическими соединениями. По мере накопления осмолитов поглощенные в фазе "входа" ионы транспортируются назад в наружную среду (фаза "выхода"). В результате, необходимое увеличение осмотического давления в клетках в отиет на гиперосмотический шок обеспечивается синтезированным органическим соединением.

Гипотеза о последовательности событий, происходящих в клетках галотолерантных водорослей в ответ на гиперосмотический солевой шок, представлена на Рис. 21.

Увеличение наружной концентрации соли вызывает потерю воды клеткой и приводит к деполяризации ПМ. Снижение Дф являетя результатом снижения его диффузионной составляющей, а также, возможно, происходит за счет ингибирования солью электрогенной помпы.

При низких значениях Дф активируются потенциал-зависимые ионные каналы, переходя в открытое состояние, что, в свою очередь, приводит к увеличению ионной проницаемости мембраны и возрастанию потоков ионов внутрь. Вход Na+ в клетки может осуществлятся через низкоселективные ионные каналы [Луневский и др., I9B0; lunevslcy et al., 1983; Берестовский и др., 1987; Tester, 1983; Stoekel, Takeda, 1989]. Наряду с ионными каналами в переносе Na+ через ПМ в фазе "входа" принимает участие Na+/H+

антипортер, что приводит к защелачиванию цитоплазмы. Высокие концентрации ионов и щелочной рН цитоплазмы активируют: (1) Биосинтез ОСМОЛИТОВ. У водорослей рода Bunalleí la ферменты метаболической ветви глицеринового цикла имеют максимум активности при рН 8,0; катаболической - при рН 6,5 [Ъегпег, Avron, 1977; Goyal et al ., 19373. У водорослей рода piatуmoñas высокие концентрации Nací актхшируют ферменты метаболической ветви и подавляют ферменты катаболической ветви маннитного цикла [Kremer, Kirst, 1982; Rioliter, Kirst 1987]- (2) Яа+-АТФазу. Включение На+-АТФазы приводит к выведению избытка ионов из клетки (фаза "выхода"), к реполяризации Ш, и, по-видимому, к восстановлению исходного нейтрального значения рн цитоплазмы.

Необходимое осмотическое давление в клетках поддерживается в первой фазе высокими концентрациями ионов, благодаря чему, оводненность клетки восстанавливается уже через несколько минут после возрастания наружной концентрации соли. Во второй фазе неорганические ионы заменяются низкомолекулярными органическими осмолитами, не оказывающими на биополимеры цитоплазмы токсического действия.

Вывода. '

1. Галотолерантные. микроводоросли способны поддерживать концентрации Ыа+ и С1~ в цитоплазме на значительно более низком' уровне, чем в среде, в некотором диапазоне наружных концентраций NaCl. Превышение верхней границы этого диапазона приводит к неконтролируемому накоплению ионов в цитоплазме. Пороговая концентрация NaCl в среде, превышение которой приводит к нарушению ионного гомеостаза клетки, тем выше, чем выше солеустойчивость водоросли, а также концентрация NaCl в культуральных средах, на которых были выращены клетки предшествующих поколений.

2. Плазматическая мембрана галотолерантных микроводорослей обладает более низкой проницаемостью для ионов Na+, чем плазмалемма растений . пресного фона. При адаптации микроводорослей к . условиям повышенной солености среды На+-проницаемость плазмалеммы снижается, К+-проницаемость при этом остается без изменения. Низкая ^+-проницаемость плазмалеммы является адаптацией, направленной на ограничение штока Na+ в

клетку в условиях высокой солености среды.

3. .В плазматической мембране галотолерантных микроводорослэй функционирует электрогенная Н+-помпа (Н+-АТФаза), генерирующая на этой мембране градиент электрохимического потенциала протона.

4. В плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционируют две Ыа+-транспортирующие системы: Na+/H+ антипортер, энергизуемый протон-движущей силой, и Л(Ш+-независимый Na+-Hacoc (Иа+-А!ГФаза). Na+/H+ антипортер является универсальной Na+-транспортирующей системой. Na+-AT$a3a, по-видимому, специфична для плазмалеммы об'ектов, обитающих в условиях высокого содержания Na+ в среде. Наличие Иа+-АТФазы в плазмалеммэ является биохимической адаптацией, позволяющей растительной клетке транспортировать Na+ из цитоплазмы в условиях высокой солености и одновременно щелочных pH среды.

5. Поглощение К+ клетками галотолерантных микроводорослей, так же, как у растений пресного фона, происходит за счет энергии AjlH+, генерируемого на плазматической мембране Н+-помпой.

6. Двухфазная динамика потоков ионов,. изменения электрического потенциала и Ыа+-проницаемости плазмалеммы у галотолерантных водорослей в условиях гиперосмотического солевого шока отражают работу единой функциональной системы осморегуляции и ионного гомеостатирования, сигналом для запуска которой является увеличение концентрации NaCl в среде. В работу этой системы вовлечены ион-транспортирующие АТФазы плазмалеммы, а также звенья метаболизма, ответственные за биосинтез осмолитов. Ее функционирование направлено на поддержание водного и солевого режима клетки в условиях гиперосмотического солевого шока.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Валнокин Ю.В., Фохт A.C. Амперометрический метод определения скорости кислородного обмена фотосинтезирующих организмов при различном содержании кислорода в среде. // Физиол. раст., 1977, т.24, с.207-214.

2. Балнокин Ю.В., Строгонов Б.П., Кунаева Е.А., Медведев A.B., Защитная функция мембран клеток пипаИвгга при высоких концентрациях Nací в среде. //Физиол. раст., 1979, т.26, вып.З, с.552-559.

3. Балнсжин Ю.В., Медведев А.В. Влияное ионов на транспорт

Электронов В ХЛОрОПЛаСТЭХ ГаЛОфИЛЬНЫХ ВОДОрОСЛеЙ Dunaliella. // ФИЗИОЛ. раст., 1980, Т.27, ВЫП.6, СЛ229-1236.

4. Медведев А.В., Фохт А.С., Балнокин Ю.В. Роль плазмалеммы в поддержании ионного гомеостаза клеток галофитов. //Труды МФТИ; сер. Общая и молекулярная физика, 1980, М.:МФТИ, с.56-62.

5. Балнокин Ю.В. Алешина Н.В., Медведев А.В., Строганов Б.П. Адаптация морской водоросли Dunaliella maritimn. к высокой солености среды, //и Всесоюзная конференция по морской биологии "Биология шельфовых зон мирового океана". Тезисы докл.,

-Владивосток, 1982, ч.И, с Л 37-138.

6. Балнокин Ю.В., Медведев А.В. К вопросу о роли калия в жизнедеятельности ГаЛОфИЛЬНЫХ водорослей рода Dunaliella. //СО. Круговорот веществ в замкнутых системах на основе жизнедеятельности низших организмов. Киев: Наукова думка, 1983,

с.14-18.

7. Балнокин Ю.В., Медведев 'А.В., Боднар И.В. Системы транспорта калия в клетках галофильных водорослей Bunaiieiia. // Физиол. раст., 1983, т.30, с.955-963.

8. Балнокин Ю.В., Медведев А.В. Влияние п-хлормеркурибензоата и Ы,м-дивдклогексилкарбодиимида на транспорт калия у Dunaliella maritima. //ФИЗИОЛ. paCT., 1983, Т.30, С.1117—1125.

9. Kalashnikova T.S., Balnokin Yu.V. The Ыа+, K+ and CI-contents in cells of halophilio alga Dunaliella maritima. // Proceedings of 3th International- symposium "Plant metabolism regulation". Bulgarian Acad. Sci., Sofia, 1983, p.205-209-

10. Alyoshina N.V., Balnokin Yu.V. The role of plasma membrane in regulation of ion contenst in halophilic algae Dunaliella maritima. //Proceedings of 3th International symposium "Plant metabolism regulation". Bulgarian Acad. Sci., Sofia, 19S3, p-253-256.

11. Алешина H.B., Балнокин Ю.В. Влияние NaCl на цитохромоксидазу, сукцинатдегидрогеназу и фумаразу галофильных водорослей Dunaliella in vitro. // Известия АН СССР, 1984, N 5, с.722-728.

12. Balnokin Yu.V., Kalashnikowa T.S. Coupliug Na+ transport through plasmalemma of Dunaliella maritima with fluxes of H+, K+. and Cl-. // Proceedings of 3th International conference on

water and ions in biological systems. Bucharest, 1984, p.169.

13. Балнокин Ю.В., Медведев A.B. Транспорт Na+, к+ и Н~ через плазмалемму К+-дефицитных клеток галофильной водоросли Dunaliella mar-ittract. // ФйЗИОЛ. раСТ., 1984, T.31, С.805-809.

14. Балнокин Ю.В., Мазель, Ю.Я. Проницаемость плазматической мембраны ГЭЛОфИЛЬШХ водорослей Eunallella для ионов натрия. // Физиол. раст., 1985, т.32, с.33-41.

15. Балнокин Ю.В., Строганов Б.П. Солевой обмен и проблема солеустойчивости растений. //Сб. Новые направления в физиологии растений. Ред. акад. А.Л.Курсанов. М.:Наука,'1985, с.199-213.

16. Калашникова Т.е., Балнокин Ю.В. Внутриклеточное содержание Na+ и ci" и электрический потенциал на плазмалемме Chlorella pyrenotdoaa в связи с адаптацией к засолению. //IV Всесоюзная конференция по биологии клетки. Тезисы докл., 1985, Тбилиси, ТГУ, с.284.

17. Балнокин Ю.В., Алешина Н.В., Калашникова Т.О. Регуляция ИОННОГО СОСТава ЦИТОПЛаЗМЫ ГаЛОфИЛЬНОЙ ВОДОрОСЛИ Eunaliolla maritima. //Всесоюзный биохимический с'езд. Тезисы докл., Киев, 1986.

18. Балнокин Ю.В., Строганов Б.П. Значение солевого обмена в солеустойчивочти растений. //IV Всесоюзная конференция по биохимии и физиологии солеустойчивости растений. Тезисы докл.-, Ташкент, 1986.

19- KalasïiniKova T.S., Balnokin Yu.V. Na+ and Cl- distribution in unicellular green alga Chlorella according to their adaptation to NaCl. //Proceedings of 4th International symposium "Plant methabolism regulation". Bulgarian Aoad.- Soi., Varna, 1986, p.47.

20. Балнокин Ю.В. Регуляция содержания Na+ в цитозоле у одноклеточных водорослей при засолении. //Тезисы ■ докладов I Всесоюзной ■ конференции "Актуальные проблемы современной альгологии". Черкассы, 1987, с.206-207.

21. Балнокин Ю.В. Транспортные АТФазы и солеустойчивость. // Тезисы докладов XII Всесоюзного совещания по транспортным АТФазам "Ионный гомеостаз и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клетки". Иркутск, МГУ, 1987, с.55.

22. Калашникова Т.С., Балнокин Ю.В., Мазель Ю.Я. Адаптация пресноводной водоросли Chlorella pyrenaidasa К NaCl. // Физиол. раст., 1987, т.34, C.II59-II66.

23- Калашникова Т.О., Балнокин ю.В. Внутриклеточное содержание Ыа+ и С1~ и электрический потенциал на плазмалемме chioreiia pyrenoidosa в связи с адаптацией к засолению. //ВИНИТИ, Москва, 1987, N3156 - В87.

24. Калашникова Т.е., Балнокин Ю.В. Определение мембранного потенциала у хлореллы по аккумуляции тетрафенилфосфония (ТФФ+), регистрируемого с помощью ТФФ+-селективного электрода. //ВИНИТИ, Москва, 1987, N3159 -В87.

25. Балнокин Ю.В., Строгонов Б.П. Значение солевого обмена в солеустойчивости растений. // Коллективная монография "Проблемы солеустойчивости растений". Ташкент: ФАН, 1989, с.3-33.

26. Балнокин Ю.В. Регуляция ионного состава растений в условиях солевого стресса. // 2-й С'езд ВОФР. Тезисы докл., Минск, 1990, ч.1, с.13.

27. Балнокин Ю.В., Медведев А.В., Калашникова Т.е., Галкина "И.В. Ионный гомеостаз в цитозоле одноклеточных водорослей при засолении среды хлористым натрием. // Журнал общей биологии,

1990, т.51 (2), С.234-246

28.. Попова Л.Г., Балнокин Ю.В., Мясоедов Н.А. Характеристика АТФазной активности плазматической мембраны морской

одноклеточной водоросли Platymonas vírídis. //Всесоюзн. совещание "Клеточные механизмы адаптации". Тезисы докл., Чернигов, 1991, "Цитология", т.33, N5, с.128.

29. Попова Л.Г., Балнокин, Ю.В., Мясоедов Н.А., Лапушкин Е.В., Белов А.П. Характеристика АТФазной активности плазматической мембраны морской водоросли Platymonas viridie. //ДОКЛ. АН СССР,

1991, N1, С. 251-256. -

30. Popova L.G., Balnokin Yu.V., Myasoedov N.A. CharaGterization of plasma membrane ATPase from sea unicelular alga Platymonas viridis. // Proceedings oí 5th. International Symp. "Plant Methabolism Regulation". Bulgarian Acad. Soi., Soíia, 1991, p.341-345.

31. Balnokin Yu.V., Popova L.G., Myasoedov N.A. The ATPase aotivity of trie plasma membrane of marine unioellular alga Platymonas viridie. //19th Aharon Katzir-Katehalsky Coníerenoe, Satellite to the 15th International Congress of Bioohemistry, "Plant Bioenergetics and Ion Translooation". Abstr-, Rehovot (Israel), 1991, P-2.

32. Попова JI.Г., Мясоедов Н.А., Белов А.П., Балнокш Ю.В. АТФаза (АТФазы) плазматической мембраны морской микроводоросли Piatymonas virtdis. //II С'езд Всесоюзного общества физиологов растений. Тезисы докл., 2ч., Москва, 1992, с. 167.

33.Попова Л.Г., Мясоедов Ю.В.,Балнокин Ю.В. Пирофосфатаза мембранной фракции, обогащенной плазмалеммой, выделенной из морской микроводоросли Platутопав viridis. //II С'еЗД Всесоюзного общества физиологов растений. Тезисы докл., 2ч., Москва, 1992, с.167.

34. Балнокин Ю.В., Галкина И. В. Эффективность поддержания Яа+-градиента на плазмалемме микроводорослей при различных рН в условиях засоления. // 2-й С'езд Всесоюзного общества физиологов растений. Тезисы докл., 2ч., Москва, 1992, с.48.

35. Balnokin Yu.Y. Ion extrusion mechanisms in the plasma membrane of halotolerant plants. // International. Symp. on Physiology, Biochemistry, and. Genetics of Plant Salt Resistance. Abstr. Tashkent, 1992, p. 19.

36. Popova L.G., Balnokin Yu.Y., Myasoedov N.A. Na+-extruding system in the plasma membrane of the marine alga Platymonas viridis. // International Symp. on Physiology, Bioohemistry, and Genetics of Plant Salt Resistance. Abstr. Tashkent, 1992, p.64.

37. Popova b., Balnokin Yu.V. H+-translocating ATPase and Na+/H+ antiporter in plasmalemma of marine microalga Platymonas viridis. // 8th Congress of Federation of European

Societies of Plant Physiology. Abstr. Physiologia Plantarum, 1992, v.83(3), part 2, A15.

38. Popova L.G., Balnokin Yu.V. H+-transloeating АТРазе and Na+/H+ antiport activities in the plasma membrane of the marine alga Platymonas viridis. //JEBS Letters, 1992, 309(3), p.333-336. 39- Balnokin Yu.V., Popova L.G., Myasoedov N.A. Plasma membrane ATPase of marine unicellular alga Platymonas viridis. // Plant Physiol. Biochem., 1993, 31(2), p.159-168.

40. Балнокин Ю.В. Ионный гомеостаз и осморегуляция у галотолерантных микроводорослей. // Физиология раст., 1993, Т.40, N 4, С. 567-57641. Balnokin Yu.V., Popova Ь-G. The ATP-driven Na+-pump in the plasma membrane of the marine unicellular alga Platymonas viridis. // PEBS letters, 1994, 342(2), p.61-64.

Подп. к печ. 26.04.95 Объем 3,25 п.л. Зак. 147 Тир. 100 Типография МПГУ имени В.И.Ленина