Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРОТОННЫЙ И НАТРИЕВЫЙ НАСОСЫ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ГАЛОТОЛЕРЛНТНОИ ВОДОРОСЛИ DUNALIELLA MARITIMA MASSJUK.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ПРОТОННЫЙ И НАТРИЕВЫЙ НАСОСЫ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ГАЛОТОЛЕРЛНТНОИ ВОДОРОСЛИ DUNALIELLA MARITIMA MASSJUK."

Asmi

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи УДК 581.1

ШУМКОВА Галина Александровна

ПРОТОННЫЙ И НАТРИЕВЫЙ НАСОСЫ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ГАЛОТОЛЕРАНТ1ЮЙ ВОДОРОСЛИ DUNAUELLA MARITIMA MASSJUK.

Специальность 03.00.12 - физиология и биохимия растений.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2001

Работа выполнена » ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАМ.

Научные руководители: доктор биологических наук Ю. В. БАЛ И ОКИ Н, кандидат биологических наук Л.Г.ПОПОВА.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р.Л Л ВЯ ГИЛ ЬС К А Я, камдидаг биологических наук Е.Н.МАРКАРОВА.

Ведущее учреждение: Институт теоретической и жемери ментальной биофизики РАН, Пушимо.

Защита состоите» 18 декабря 2001 г, в______ часов на заседании«

диссертационного совета ио защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук (К 002.210.01) при Институте физиологии растений РАН по адресу; (27276, Москва, Ботаническая ул., .¡Ь.

С диссертацией можно ознакомиться 8 библиотеке ИФР РАН,

Автореферат разослан __" _............2001 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук М.И.Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Биологические мембраны представляют собой высокоизбирательные барьеры проницаемости. Поток молекул и ионов между клетками и окружающей средой cipo го регулируется. Важнейшим и наиболее изученным механизмом активного транспорта ионов через плазматическую мембрану (ИМ) растительных клеток является протон-транслоцирующая АТФаза. Ее функции исследовали in vino, на интактных клетках, и in vitro, на препаратах различного уровня структурной организации: выделенных везикулах плазмалеммы, белковых препаратах, лротеолипосомах {Serrano, 1989, 1990; Palmaren, Harper, 1999]. Градиент электрохимического потенциала протонов (ЛцН+), генерируемый Я+-АТФазой, используется во вторично-активных транспортных процессах. Сопряжение транспорта ионов натрия с переносом протонов за счет ЛцН+ осуществляет Na+/H+ антипортер. Н*-АТФаза и Na+/H+ антипортер рассматриваются как универсальная Na+-транспортирующая система,

В отличие от Н+-ЛТФазы, Ка+-транспортирующие АТФазы в ПМ. эукариот растительного происхождения обнаружены сравнительно недавно у таких объектов, как галоголерантные водоросли Telraxetmis viridis [Balnokm, Popova, 1994J и Heterosigma akashiwo [Wada ct al., ¡989J. Na+-АТФазы двух названных организмов относятся к АТФазам Р-типа и образуют в ходе каталитического цикла фосфоинтермедиат [Shono et al., 1995; Popova el al., 1998; 1999]. Вместе с тем, эти фермента различаются по ряду параметров, в частности, по молекулярной массе к некоторым функциональным характеристикам.

В целом, механизмы транспорта ионов у галотолерантных водорослей, и особенно Ыа+-транспоргирующие механизмы, изучены слабо. Одним из наиболее интересных объектов для изучения транспорта Na+ через плазмалемму являются клетки водорослей рода Dunalielh. Представители этого рода относятся it

ЦЕНТРАЛЬНАЯ науч: ».ч./.елт

Мас;с, сельсяохэ i. а*&цсмии К. A. Tu^'V^.,,-,-,

экстремально гапотолсрантн ы м организмам, и наличие На+-помпы давно прйдлола|-алось в их ПМ. Однако попытки выделить фу н кцио нально-активную по отношению к транспорту ионов. плазмалемму клеток ОипаЬеМа н идентифицировать Ыа*-помпу и другие ион-транспортиру ющие системы оказались неудачными.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы было исследование транспорта ионов через ПМ гапотолерантной водоросли ИтаНеПа тагШта, в частности, изучение АТФаз, вовлеченных в транспорт N3* и Н+. Непосредственно в задачу работы входило:

1. Исследовать транспорт Ыа* на интактных клетках/Л тагШта.

2. Выделить мембранную фракцию, обогащенную везикулами ПМ, функционально активными по отношению к транспорту ионов.

3. С использованием мембранных препаратов идентифицировать N3*-

I ■

транспортирующую АТФазу и Н+-транспортирующую АТФазу в ПМ ¡УтапИма.

4. Исследовать функции транспортных АТФаз ПМ, а также их роль в электрогенезе этой мембраны,

5. Функционально идентифицировать Ыа+/Н* антипортер ПМ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате проведенной работы впервые из клеток

галоголерантной водоросли [ХпюгШта выделена мембранная фракция, обогащенная функционально-активными везикулами плазмал ем мы.Пол ученные везикулы сохраняют барьерные свойства по отношению к ионам И* и Ыат и обладают Н+- и Ма+-транслоцирующими активностями. Установлено, что в ПМ ИтагШта функционируют Н+-АТФаза и №7Н+ анти портер. На интактных клетках и везикулах плаз мал ем мы показано, что в условиях, когда ¿цН* на мембране отсутствует, выведение из клетки осуществляется первично-активной системой - На+-транспортнрующей АТФазой, Н+- и Ыа+-АТФазы

электрогенмы, относятся к АТФазам Р-типа и по основным характеристикам сходны с таковыми другой галотолерантной водоросли, Tetraselmis viridis.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ, Полученные результаты могут быть использованы для развития исследовании в области солеуетойчивости растений. Уникальность Dunalieilcг как модели для изучения ионного транспорта через ГШ делает возможным использование данных научных и методических разработок в исследованиях различного профиля, Проводимых на галотолерантны* микроводорослях в качестве объекта.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований были доложены на IV съезде ОФР России (Москва, 1999), 12 Международном совещании по биологии мембран растительной клетки (USA, Madison, 2001), Международном симпозиуме "Растение в условиях стресса" (Москва, 2001).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора ' литературы, экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 2 таблицы, 24 рисунка; список литературы включает 139 наименований.

- ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования служила морская одноклеточная микроводоросль Dunaliella maritima Massjuk, штамм IBASU-A D-18 коллекции отдела споровых растений Института ботаники им. Н.Г.Холодного (Киев), культивируемая на среде, содержащей необходимые биогенные элемеэты и NaCI. В опытах на интактных клетках среда культивирования содержала ISO мМ NaC!, в опытах на везикулах плазмалеммы - 500 мМ NaCI.. Культуру, непрерывно

продували воздухом с t,5% COj и освещали белым светом люминесцентных ламп (!5000лк) 14 часов в сутки,

В экспериментах in vivo по индукции потоков Na* и К+ через плазмалемму использовали клетки /А maritima, дефицитные по К+, и клетки, находящиеся в условиях гиперосмотического солевого шока. К.+-дефицитные клетки получали на среде культивирования, в которой КН^РСЦ был заменен эквимолярным количеством NaHjPOí. Непосредственно в экспериментах клетки переносили на среду следующего состава, мМ: NaCl - 150, KHjPO^ - 5, MgS04 - 6, Ca(NOj)r 1,5, Tris - 20, pH доводили с помощью MES до значений, указанных в подписях к рисункам. В опытах с К'-дсфицтиыми клетками минимальная среда не содержала KHiPO«. Потоки ионов через плазмалемму оценивали по изменению их внутриклеточного содержания в ответ на внесение в суспензию соответствующего индуктора. Клетки отмывали от солей внешней среды центрифугированием в изотоническом растворе маннита. Содержание К+ и Na+ в клеточной суспензии определяли с помощью пламенного фотометра. Полученные количества ионов относили к суммарному объему клеток в пробе. Объем клеток определяли методом Окамото и Сузуки [Okamoto, Suzuki, 1964].

Мембранную фракции обогащенную везикулами плазмалеммы, получали согласно метолу, разработанному для выделения плазматической мембраны из водоросли Tetraselmís viridis [Batnokin et al., 1993], с модификациями.

ЁёДО£_в получаемых препаратах определяли по методу Симлсона и Зонне [Simpson, Sonne, 1982].

За АТФ-индуцироваиной генерацией ¿pH на везикулярной мембранб Следили по изменению разности абсорбции при 492 и 540нм ДрН-и ндикатора акридинового оранжевого (АО); генерацию,, трансмембранного электрического потенциала регистрировали по изменению разности абсорбции при 582 и 62Ihm погенциалчувствительного зонда оксонол VI. Измерения проводили на

спектрофотометре НйасМ 557, действующем в двуволновом режиме. Реакционная смесь объемом 2 мл для регистрации ДрН содержала: 0,4 М сахарозу, 10 мМ МЕБ/ВТР буфер, рН 7,0, 100 мМ N0/ (в виде ВТР-соли), 5 мМ ¡^БО^, 1 мМ РТТ, 0,2 мМ Ев ТА, 8 мкМ АО, 100-150 мкг белка. Для регистрации Д\|» из состава вышеггриведенной смеси исключали N0.1" и вместо АО вводили 3 мкМ оксонола VI.

Измерение поглощения ионов везикулами плазм ал ем мы проводили

с помощью как это было описано для везикул ПМ, выделенных из

Т. \ihdi.4 [Ва1пок)п, Ророуа, 1994}. Реакционная смесь объемом 300 мкл содержала:

0.4 М сахарозу, 20 мМ МП5-ВТР буфер, рН 8,0, 1 мМ М(£0,1, 50 мМ ИО)-ВТР, 5 мМ ЫаС1, 350-400 мкг белка.12 N а* добавляли к реакционной смеси до 0,5 МЕЦ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1, Исследование Ма+-тра испорти рующих механизмов плазма леммы на ннтактных клетках О.магШта,

Благодаря наличию у живых клеток функции рН-статирования цитоплазмы, в эксперименте можно изменять ДрН на плазмалемме, изменяя рН наружной среды. На Рис.1 представлена кинетика перекоса ионов Ыа+ и К+ через плазмалемму К+-дефицитных клеток ИтагШта в ответ на внесение К+ в среду при двух значениях рН наружной среды. Водоросль обнаружила способность экспортировать Ыа* и поглощать К* практически одинаково эффективно при слабо-кислых (рН 6,0) и слабо-щелочных (рН 8,0) значениях рН наружной среды (РисЛ, А - 1,3; Б -1, 3).

Протонофор карбонилцианидхлор<}>енилгндразон (КЦХФГ) в концентрации 20 мкМ оказывал лишь слабое действие на транспорт Ыа+, проявляющееся, в основном, в появлении некоторого лаг-периода при запуске процесса ионами К+

100

40 60 Время, мин

100

Рйс.1. Влияние рН наружной среды и лротонофора КЦХФГ на экспорт Na* (А) и поглощение К+ (Б) К*-дефицитнымн клетками D.maritima. К* -дефицитные клетки исходно суспендированы в средах с различными рН, содержащих 150мМ ЫаС1 и, если указано, 20м кМ КЦХФГ. В момент, обозначенный середкой, в.клеточную суспензию внесен KjSO^ до конечной концентрации 2,5мМ, Варишггы: I - рН 6,0; 2 - рН 6,0 + 20мкМ КЦХФГ; 3 - рН 8,0; 4 - рН 8,0 + 20мкМ КЦХФГ.

(Рис.I, А - 2, 4), и тормозил транспорт ионов К* как в кислой, так и в щелочной среде (Рис, I, Б - 2, 4).

На Рие,2 представлена кинетика изменений концентраций ионов Na" в цитоплазме клеток D.mariiima с нормальным содержанием К+, находящихся в условиях гиперосмотического солевого шока при трех различных pH наружной среды. За поглощением нонов Na+, происходившим в ответ на внезапное увеличение концентрации соли в среде, следовало выведение этого иона наружу. Кинетики, наблюдавшиеся в кислой, нейтральной и щелочной г средах, свидетельствуют о том, что скорость переноса ионов Na* через мембрану в фазе откачки практически не зависит от величины и направления ЛрН на плазмалемме. Содержание ионов К+ в клетках, подвергавшихся гиперосмотическому солевому шоку, монотонно уменьшалось.

Предполагалось, что как резкое возрастание концентраций Na+ в цитоплазме, так и резкое возрастание концентраций Н+ в наружной среде являются факторами, инициирующими выведение ионов Na* из клеток посредством Na+/H* антипортера. Эффект внезапного закисления среды представлен на Рис.3. Эксперимент был проведен на клетках D.mariiima, выращенных на среде с нормальным содержанием К*. Внезапное закисление наружной среды (быстрое изменение pH среды от 7,0 до 6,0) не стимулировало экструзию ионов Na* из клеток. Более того, внутриклеточные концентрации Na+ при снижении наружного pH возрастали. Концентрации К* в клетках при внезапном закислении среды практически tie изменялись.

Н*-АТФаза является основным генератором ЛдН* - движущей силы экспорта Na+ из клеток, осуществляемого посредством Na+/I Г антипортера [Mitchell, 1973; Скулачев, 1989]. Если NaVll* антипортер вовлечен в экспорт Na+ из клеток D.mariiima, то ингибированне ! Г-АТФазы должно привести к подавлению выведения Na* из клеток, ДЦКД (дициклогексилкарбодиимид) - ингибитор Н+-

Внутриклеточные концентрации Ыа' ммоль/л клеточного объёма

Внутриклеточные концентрации Ыа* ммоль/л клеточного объема

3000

Рис. 14, Эффект ортованадата на АТФ-за аисимое поглощение ионов Ыа* везикулами плазматической мембраны О.тагШта. В реакционную смесь вносили 5мМ ЫаС1 и 2мМ Трие-АТФ. 1: стандартная реакционная среда; 2; стандартная реакционная среда I 300мкМ Ыа(УО^.

ЗОЮ

Рис.13. Аккумуляция ионов везикулами плазматической мембраны О.тагШта. В реакционную смесь вносили 5мМ №С1 и 2мМ Трис-А'ГФ. , I: стандартная реакционная среда; 2; стандартная реакционная среда + 20м кМ КЦХФГ; 3; стандартная реакционная среда без N0/; 4: стандартная реакционная среде без Ы03" + 20м кМ кцхфг:

...........

•20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 | ^ Время, мин

22\'а* АТФ

Рис.15, АТФ-нндуцируемая аккумуляция ионов Ыа* везикулами плазматической мембраны О.тагШта как функция рН реакционной среды.

(Рис. 13), т.е. устранение ДцН* на мембране не подавляло АТФ-зависимый транспорт Na*, свидетельствуя о том, что механизмом, ответственным за аккумуляцию Na" в везикулах является не вторично-энергизуемый NaVl Г антипортер, а первичный Na+-nacoc (№*-АТФаза). Следует отметить, что перемещение Na*'' через мембрану требовало наличия в среде проникающих анионов, в частности, N03" (Рис.13), что подтверждает электрогенный характер транспорта Na* и необходимость элиминации положительного внутри электрического потенциала для аккумуляции Na* везикулами. Ортованадат в концентрации 300 мкМ полностью подавлял .АТФ-завнсимое накопление Na* везикулами ПМ D.mariiima (Рис.14). Наблюдаемое нами АТФ-зависимое поглощение Na* везикулами ПМ D. maritima имеет оптимум pH 7,5 - 8,0 (Рис.15). Этот оптимум совпадает с оптимумом функционирования Na*-трамс!юртнрующей АТФазы ИМ другой морской зеленой мнкроводорослн Т. viridis [Balnokin et а!., 1997]. Следует также подчеркнуть, что pH-оптимум АТФ-за вис им ого транспорта Na* через ПМ D.maritima совпадает с pH-оптимумом АТФ-за висим ой Ыа*-стимулируемой генерации Дц< на везикулах этой мембраны (ср. Рис.15 и Рис.10, кривая 3 предыдущего раздела). Таким образом, результаты исследований АТФ-зависимого транспорта Na* на везикулах ПМ ¡Xmaritima указывают на вовлечение в активный транспорт Na* через эту мембрану первичной электрогенной Ка*-АТФазы Р-типа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследований,полученные на интактных клетках IХтагШта и выделенной из этого организма мембранной фракции, обогащенной плазмалеммой, приводят к выводу о функционировании в ПМ Н*-АТФазы, Ыа*/Н* антн портера и №*-АТФазы.

Наличие в ПМ 1-Г-АТФазы продемонстрировано в экспериментах in vitro с ЛрН-индикагором акридиновым оранжевым. Выделенные везикулы поглотали Н* из среды в присутствии АТФ и Mg2+ ( Рис.5). Реакция характеризовалась оптимумом рН 6,5-7,0 Рис,7), что совпадает с рН-оптимумом активности Н*-АТФаз плазмалеммы у многих растительных объектов ¡Briskin, 1990; Serrano, 1990; Michelet, Boutry, 1995].

. Ма+-АТФаза была обнаружена в экспериментах с использованием ^NaCl. Везикулы ПМ были способны поглощать 22Na+ в присутствии Mgí+ в ответ на внесение АТФ в среду. Поглощение uNa+ происходило даже при наличии протонофора КЦХФГ в среде (Рис. 13), свидетельствуя о том, что ДрН не требуется для АТФ-зависимого накопления JÍNa+ везикулами. Этот результат однозначно указывает на вовлечение первичной Na4-помпы (Na4-транспортирующей АТФазы) в поглощение ионов Na+. АТФ-завнсимое поглощение uNaT происходило в слабо-щелочной среде с рН-оптимумом 8,0 (Рис.15), что совпадает с рН-оптимумом функционирования Na+-транснортирующих АТФаз ПМ у других галотолерантных водорослей [Balnokin, Popova, 1994).

Обе АТФазы - и Н*-АТФаза, и Ыа+-АТФаза - обнаружили чувствительность к ортованадату (Рис.6 и Рис.9), что указывает на их принадлежность семейству АТФаз Р-типа. В экспериментах с Лу -индикатором на выделенных везикулах ПМ продемонстрировано также, что обе обнаруженные АТФазы генерируют В присутствии АТФ и Mg2+ трансмембранный электрический потенциал (ДчО '(Рис.9). Вовлечение АТФаз в АТФ-зависимую генерацию Ду подтверждается чувствительностью электрогенеза к ортованадату (Рис.12). Генерация Ду стимулировалась ионами Na*, и эта стимуляция имела оптимум рН 8,0, что является еще одним подтверждением участия Na+- АТФазы в электрогенезе,'

Вывод о наличии NaVhí* антипортера в ПМ О.marítima следует из эксперимента на выделенных везикулах ПМ, в котором ДрН, генерируемый на плазмалемме в присутствии АТФ, диссилировал в ответ на внесение ионов Na1 в Среду (Рис.8). Диссипация была тем заметнее, чем была выше концентрация Na* в среде инкубации везикул.

Можно предположить, что Н*-АТФаза ПМ галотолерантной водоросли является частью системы рН-стата клетки, как и у других' организмов растительного происхождения. Обнаруженная в ПМ D.marítima Na^-АТФаза ответственна за выведение ионов Na* из цитоплазмы, которые поступают в нее из наружной среды по градиенту электрохимического потенциала. Наиболее вероятно, что Na7H+ антипортер ПМ не вовлечен в экспорт Na* из клеток. На это указывает отсутствие эффекта КЦХФГ при изучении АТФ-эависимого поглощения "Na* везикулами ПМ (Рис.13). Возможно, что через Na*/H* анти портер осуществляется поглощение Na* клетками D.maritima в условиях гилеросмотического солевого шока. Вход ионов Na* в клетки через антипортер в обмен на Н* в этом случае должен сопровождаться сдвигом рН цитоплазмы в щелочную сторону, что, в соответствии с гипотезой Балнокина [1993], должно, в свою очередь, привести к включению Ыа*-АТФазы и выведению поглощенного Na* из клетки.

Полученные в экспериментах in vivo результаты на К*-дефицнтных клетках D.maritima находят объяснение в рамках представления о функционировании в ПМ этой водоросли обнаруженных ион-транслортирующих систем н вовлечении в АТФ-зависимый экспорт Na* из клеток Na*- АТФазы, но не NaVH* антипоргера.

Экструзия ионов Na* из К*-дефицитных клеток, индуцированная внесением К* в среду, практически одинаково эффективно осуществлялась как в кислой, так и в щелочной средах, а также при наличии или отсутствии протонофора КЦХФГ в

среде (Рис. 1, а,б). Процесс переноса ионов Ыат из клеток в наружную среду не зависел от величины и направления протонного градиента на ПМ.

В условиях нагрузки цитоплазмы - К+-дефицитных клеток ионами (гигтеросмотический солевой шок) более эффективное выведение ионов Ш* из клеток наблюдалось не при кислых, а при щелочных значениях рН наружной среды (Рис, 2). ■-'■•

Ингибитор Н*-АТФаз ДЦКД, который тормозш!' поглощение К+ клетками, даже несколько стимулировал перенос N8* через ПМ ¡С-дефицитных клеток Рис.4). ■■■ "

Результаты экспериментов, проведенных на К+-дефицитных клетках О.тапНта согласуются с данными, полученными в экспериментах на клетках этой водоросли с нормальным содержанием К*. В условиях гиперосмотического солевого шока накопление Ыа* в цитоплазме приводило к включению механизма экструзии этого иона. Эффективность экструзии мало различалась при проведении гиперосмотического солевого шока в кислой, нейтральной или щелочной средах (Рис. 2). Внезапное зачисление наружной среды, увеличивающее ЛрН на ПМ (направленный из наружной среды в цитоплазму) и этим, как можно было бы ожидать, способствующее экструзии Ыа* из клеток посредством Ма*/Н* антипортера, не только не стимулировало экструзию этого иона, но приводило к увеличению внутриклеточного содержания >1а* (Рис.3),

Не исключено, что способность №+-АТФазы генерировать ¿4/ (Рис.11) является универсальным свойством, характерным для №4-транспортирующих АТФаз и других водорослей [Ва1покш, 1993]. При электрогенном переносе N8* №*-АТФазой 1ХтагШта деполяризация ПМ, происходящая в ответ на внесение К* в суспензию К*-дефицитных клеток, вероятно является триггером №*-АТФазы н, следовательно, индуктором экспорта Ыа+н поглощения К.+.

Маловероятно, что предполагаемый первичный Na+-nacoc ПМ D.maniima является обменной Ыа+,К*-АТФазои, аналогично . Иа^К^АТФазе животных клеток. Результаты проведенных экспериментов показывают, что потоки Na4 и К+ через ПМ D. maritima относительно независимы. По-видимому, сопряжение потоков Na- и К* через ПМ этой водоросли является электрохимическим. Транспорт К+ осуществляется пассивно, через каналы, как результат генерации Дч; на ПМ ЬГ- либо Ыа+-насосом. До момента добавления KiSOj к суспензии К+-дефицитных клеток К* находится на мембране в состоянии электрохимического равновесия [Higinbotham, 1970). Поскольку К+ является хорошо проникающим катионом, внесение К+ в среду, приводящее к изменению АрК на мембране мгновенно компенсируется снижением Д\у таким образом, что п целом ЛцК остается близким к нулю. Деполяризация плазмалеммы, вызванная внесением Кт, индуцирует экструзию ионов Na+, что говорит о включении электро генного Na+-насоса,' которое, в свою очередь, приводит к возрастанию Лу и, следовательно, к смещению электрохимического равновесия на ПМ для К.+ и созданию, таким образом, движущей силы поглощения этого иона. Скорость поглощения К+ отражает величину Лц», генерируемого Ыа+-АТФазой.

Остается неясным эффект стимуляции экструзии ионов Na*" и торможения поглощения" К+ ингибитором Н*-АТФаз ДЦКД (Рис.4). Отсутствие чувствительности к ДЦКД Ыа*-насоса С одновременным деполяризующим действием этого агента вследствие ингибирования Н^-АТФазы может лежать в основе наблюдавшегося эффекта.

В заключение следует сделать вывод о различиях в механизмах экспорта Na* из цитоплазмы одноклеточных галотолерантных водорослей и клеток растений пресного фона. У последних он осуществляется посредством Ыа7Н+ антипортера, энергизуемого Н+-АТФазой, Экспорт может осуществляться на ПМ а наружную

среду или на тонопласте в вакуоль. У галотолерантных одноклеточных водорослей зз выведение Na^ ответственна №*-АТФаза плазмалеммы. Еще одна физиологическая роль Ыа*-АТФазы ПМ галотолерантных водорослей может состоять в предотвращении защелачикания цитоплазмы. Такого рода вовлечение Ыа*-АТФазы в рН-сгатированне клетки особенно важно для водорослей, обитающих в щелочной среде [Kugel et а!., 1987]. В частности, pH.морской воды близок к 8,0 [Виноградов, 1967]. генерируемый на ПМ Ыа*-АТФазой ("-" внутри клеток), должен'препятствовать выходу FT из цитоплазмы в наружную среду, v ■

ВЫВОДЫ,

1. Из клеток галотолерантной водоросли D.maritima выделена фракция мембран, обогащенная везикулами плазмалеммы. Полученные везикулы способны удерживать градиент ионов Н* и Na* и являются функционально активными в отношении транспорта этих ионов через мембрану.

2. В плазматической мембране D.mantima функционирует электро генная Н*-АТФаза Р-тнпа, близкая по своим характеристикам Н*-АТФазе высших растений.

3. В плазматической мембране D,maritima функционирует первичный Na*-насос, электрогеиная Ыа*-транспортирующая АТФаза Р-типа

4. В плазматической мембране D.mantima функционирует Na*/H* антипортер, который, однако, не отвечает за экспорт Na* из клеток данной водоросли; а является, по-видимому, частью системы рН-стата клетки.

5. Иа^-транспортирующая АТФаза является основным механизмом выведения Na* из клеток ¡Xmaritimä.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шумкова Г.А., Попова Л.Г., Андреев И.М., Балнокнн Ю.В. Na+-стимулнруемая АТФ-зависимая электро генная активность в плазматической мембране галотолерантнон микроводоросли DunaUella marittma. //IV Съезд ОФР, Тез, док., Москва, 1999, с.502.

2. Шумкова Г.А., Попова Л.Г., Балнокнн Ю.В. Экспорт Na+ из клеток галотолерантной мнкроводоросли Dunaliclla maritime/: Na+/H* антипортер или первичный Ыа^-васос?//Биохимия, 2000, т.65,вып.8,с,108О-Ю87.

3. Попова Л.Г., Шумкова Г.А., Андреев И.М., Балнокнн Ю.В. Na+-зависимая электрогенная АТФаза плазматической мембраны галотолерантной микроводоросли Dunalii'Ila mariiima. //Доклады Академии Наук, 2000, т.375 (4), с 544-548,

4. Popova L., Shumkova G., Andrcev I., BaJnokin Y. Primary Na^-pump in tbe plasma membrane of the halotolerant alga Dunaiiella maritima. //The 12th International workshop on Plant Membrane Biology, 2001 (Madison, USA). Abstracts, p.149.

5. Popova L.G., Pagis L.Y., Strizh I.G., Shumkova G.A., Andreev I.M., Balnokin Y.V. Sodium pumps in salt tolerant algae; new members of P-type ATPase family, //Plant under Environmental Stress. International Symposium, 2001, Moscow. Abstracts, p.228.

(гКлДа^.

Объем печ.л. За к. Тираж 100 экз.

АНО «Издательство МСХЛ» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44