Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт ионов кальция через плазматическую мембрану из клеток колеоптилей кукурузы и пшеницы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Транспорт ионов кальция через плазматическую мембрану из клеток колеоптилей кукурузы и пшеницы"

^ С^ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ

^ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

<0 йг -

^р На правах рукописи

мошков

Алексей Владимирович

Транспорт ионов кальция через плазматическую мембрану из клеток колеоптилей кукурузы и пшеницы

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1997

Работа выполнена в лаборатории биофизики растений Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

С.С.Медведев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М.В.Архипов

доктор биологических наук O.E. Лебедев

Ведущее учреждение: Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова.

_ г*'

Защита состоится .1997 года в "О.." час. на заседании Диссертаци-

онного Совета К 063.57.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском госуарственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 7.33

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Горького Санкт-Пстербургского государственного университета по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9.

Автореферат разослан: "Ш ^.^.T5l997 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета <? ^ кандидат биологических наук£-: ¿L'-lJOfy.Ермилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования.

Особое внимание ученых привлекает участие ионов кальция в передаче внешних сигналов внутрь клетки [Marme, 1985; Rasmussen et al., 1990]. Ключевую роль в этом процессе занимает цитоилазматическая мембрана, поскольку под действием внешних стимулов концентрация кальция в цитоплазме увеличивается за счет пассивного поступления ионов кальция в основном, из внешней среды. Показано, что электрохимический градиент этих ионов на плазмалем-ме может достигать 4 порядков. На основании электрофизиологических экспериментов с клетками харовых водорослей было сделано предположение о том, что основная роль в увеличении внутриклеточной концентрации ионов кальция при физиологических реакциях растений на действие факторов внешней среды принадлежит потенциалзависимым Са-каналам плазмалеммы, через которые кальций входит в клетку [Hepler, Wayne, 1985]. Это предположение подтверждается тем, что Са-проницаемость плазмалеммы клеток высших растений, в частности колеоптилей кукурузы, также чувствительна к ингибиторам Са-каналов [Медведев и др., 1989]. В работе, выполненной на встроенных в искусственную мембрану фрагментах плазмалеммы из корней пшеницы электрофизиологическим методом показано, что Са-каналы открываются при потенциалах, намного более отрицательных, чем пороговый потенциал по-тенциалзависимых Са-каналов животных клеток [Pineros, Tester, 1995]. Однако эти данные носят единичный характер. С помощью определения Са-зависимой АТФ-гидролизующей активности и изотопных методов показано, что на плазматической мембране имеются Са-АТФазы, способные осуществлять тонкую коррекцию уровня ионов кальция в клетке [Kubowicz et al., 1982; Dieter, Marme, 1983; Robinson et al., 1988; Graf, Weller, 1989; Zocchi, Rabotti, 1993]. Высказано также предположение о том, что удаление кальция из цитоплазмы клеток растений с помощью Са-АТФаз плазмалеммы осуществляется непрерывно (Briskin, 1990]. Таким образом, сведения о Са-каналах и Са-АТФазах плазмалеммы растительных клеток, имеющиеся в литературе, про-

тиворечивы, а участие систем мембранного транспорта ионов кальция в реализации гормонального сигнала до сих пор еще не выяснено. Цель и задачи исследования . Целью данной работы было оценить участие Са-АТФаз и различных типов кальциевых каналов плазматической мембраны клеток высших растений в мембранном транспорте ионов кальция. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. На основе мебранных везикул и флуоресцентных кальциевых зондов разработать модельную систему, позволяющую анализировать процессы активного и пассивного транспорта ионов кальция через клеточные мембраны растений.

2. Изучить АТФ-зависимый транспорт ионов кальция в мембранных везикулах колеоптилей кукурузы.

3. Выяснить зависимость транспорта ионов кальция в мембранных везикулах от величины мембранного потенциала.

4. Исследовать действие ионофоров, ингибиторов транспортных АТФаз, и блокаторов ионных каналов на транспорт ионов кальция в везикулах плазма-леммы из клеток растений.

5. Изучить влияние ИУК и механических воздействий на ионную проницаемость плазмалеммы колеоптилей кукурузы.

Научная новизна. Впервые на одной модельной системе - загруженных флуоресцентным зондом везикулах плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы -показано функционирование двух типов мембранного транспорта ионов кальция. Проанализирована зависимость работы Са-каналов от мембранного потенциала. Установлено, что система пассивного транспорта ионов кальция плазмалеммы колеоптилей кукурузы представлена потенциалзависимыми Са-каналами, аналогичными потенциалзависимым Са-каналам Ь-типа животных клеток, а также рецепторуправляемыми и механочувствительными каналами. Система активного транспорта ионов кальция представлена Са-АТФазой.

Практическая значимость. Проведенные исследования вносят существенный вклад в понимание функционирования ионтранспортирующих систем (Са-

каналов п Са-АТФаз), локализованных в плазмалемме клеток раетеннй. Разработанный экономичный метод загрузки везикул кальциевым зондом с использованием малых объемов среды загрузки может быть использован при спектрофлуориметрическом изучении мембранного транспорта ионов в различных объектах.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Третьем Съезде Всесоюзного общества физиологов растений (С.-Петербург, 1993 г.), Втором Съезде Украинского Общества физиологов растений (Киев, 1993), чтениях, посвященных 160-летию И.А.Стебута (С.-Пегербург, Пушкин, 1994), Девятом и Десятом Съездах Федерации Европейских обществ физиологов растений (FESPP) (Брно, 1994 г.; Флоренция, 1996), Международном Симпозиуме по биологин мембран растений (Луид, 1994 г.), Десятой международной школе по биологии мембран растений (Регензбург, 1995 г.), Гордоновской научной конференции по гравитационной биологии (Нью-Лондон, 1996). По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 109 стр. машинописного текста, содержит 20 рисунков и 1 таблицу. Список цитированной литературы включает 220 наименовании, в том числе 180 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

В работе использовали декапитированные на 4 мм колеоптили 4-х дневных проростков кукурузы (Zea mays L.) сорта "Краснодарский-235" и 3-х дневных пшеницы (Tr{ticum aestívum L.) сорта "Аркус", выращенных в темноте при 27 0 С на разбавленном в 10 раз растворе Чеснокова [Чесноков и др., 1968] с добавлением 0.25 мМ сульфата кальция. Гомогенизацию растительного материала проводили при соотношении среда гомогенизации/навеска, равном 0.4. Клеточные стенки и ядра осаждали при 8000 g в течение 5 мин., затем при 18000 g в течение 15 мин. осаждали более мелкие органеллы (пластиды, митохондрии).

-б-

Полученный супернатант снова центрифугировали (80000 30 мин.) для получения осадка грубой микросомальной фракции, который ресуспендировали 2 мл среды выделения, наслаивали на ступенчатый градиент плотности сахарозы, состоящий из 25 мл раствора сахарозы с плотностью 1,17 г/см3 (нижний слой) и 7 мл раствора сахарозы с плотностью 1.13 г/см3 (верхний слой) и центрифугировали при 101000 % 2 часа [Тихая, Максимов, 1986]. При фракционировании мембран колеоптилей кукурузы по модифицированной методике осадок грубой микросомальной фракции ресуспендировали в 0,2 мл среды выделения, наносили на ступенчатый сахарозный градиент, состоящий из 1.5 мл раствора сахарозы с плотностью 1.17 г/см3 (нижний слой) и 3 мл раствора сахарозы с плотностью 1.13 г/см3 (верхний слой) и центрифугировали (153000 60 мин.) для очистки от фрагментов эндомембран. При фракционировании мембран из колеоптилей пшеницы плотности растворов сахарозы для двух слоев составляли 1.15 г/см3 и 1.11 г/см3, соответственно. Фракцию, обогащенную фрагментами плаз-малеммы, отбирали пастеровской пипеткой с границы раздела слоев ступенчатого градиента. Загрузку везикул плазмалеммы средой заданного состава проводили с помощью осмотического шока. Везикулы концентрировали с помощью осаждения (101000 I час). Осадок ресуспендировали в среде А (100 мкл) и использовали для работы с зондами ХТЦ и (¿¡5-Сз-(5). Для работы с зондом индо-1 сначала проводили концентрирование везикул плазмалеммы (153000 1 час), а затем осмотический шок средой А1 в том же объеме. Потенциал на мембране везикул плазмалеммы различной величины задавали как К-диффузионный с помощью валиномицина при варьировании концентрации ионов калия в инкубационной среде. Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре СФР-1 в стандартной кварцевой кювете (У=0.6 мл) и на модифицированном микроскопе ЛЮМАМ-ИЗ (У=0.3 мл). Величину мембранного потенциала определяли с помощью флуоресцентного зонда сИ8-Сз-(5) при длине волны возбуждения 570 нм и флуоресценции - 668 нм. Анализ потоков ионов кальция проводили зондом индо-1 при длине волны возбуждения 334 нм и флуоресценции - 405 нм и ХТЦ (70 мкМ) - при 380 и 520 нм, соответственно.

Состав сред (конечные концентрации, мМ): 1) среда гомогенизации: сахароза -250, трис - 35, ЗДТА - 10, аскорбиновая кислота - 4; 2) растворы для градиентов: сахароза, трис-мэс (рН 7.2) - 1, плотность 1.11, 1.13, 1.15 и 1.17 г/см3; 3) среда A: K2SO4 - 150, сахароза - 150, трис-мэс (рН 7.2) - 1; 4) среда Al: K2SO4 -150, сахароза - 150, ЭГТА - 0,67, индо-1 - 0.017, трис-мэс - 10, рН доводили до 12,0 с помощью КОН; 5) среда Б: Na2S04 - 150, сахароза - 150, трис-мэс (рН 7,2) -1; 6) среда Б1: Na2S04 - 150, сахароза - 150, трис-мэс буфер (рН 7,2) - 10. В некоторых случаях рН доводили до 12,0 с помощью КОН. Опыты проводили в 4-5 биологических и 3-4 аналитических повторностях. На гистограммах показаны стандартные ошибки. Кривые динамики флуоресценции приведены для одного из наиболее характерных экспериментов. Результаты и обсуждение

Установлено, что везикулы плазмалеммы обладают слабой ионной проницаемостью [Батов, Максимов, 1985; Инге-Вечгомова и др., 1987; Максимов, Батов, 1989]. Поэтому, индукция кальциевой проницаемости везикул плазмалеммы из клеток колеоптилей, загруженных зондом индо-1, с помощью ионофора А23187 позволит ответить одновременно на два вопроса: 1) насколько успешно прошла загрузка везикул зондом и 2) как зонд индо-1 реагирует на увеличение концентрации Са2+ внутри везикул. При обработке Са-ионофором А23187 (10 нМ) везикул плазмалеммы из колеоптилей пшеницы в среде с низкой концентрацией кальция существенных изменений интенсивности флуоресценции индо-1 не наблюдалось (рис.1,а). В кальций содержащей среде (30 мкМ) наблюдалось увеличение флуоресценции зонда (рис. 1,6). Титрование везикул ионами кальция в присутствии Са-ионофора А23187 увеличивало флуоресценцию индо-1 до максимального уровня (рис. 1, а). При наведении мембранного потенциала с помощью валиномицина (так называемый "калий-валиномициновый клямп") на мембране везикул плазмалеммы из клеток колептилей пшеницы наблюдалось увеличение флуоресценции индо-1 (рис.1,в), аналогичное таковому при действии А23187, что свидетельствовало об увеличении концентрации Са2+ внутри везикул. Аналогичные данные получены и для везикул плазмалеммы из

клеток колеоптилей кукурузы (рис,1,д). Таким образом, изменения флуоресценции индо-1 свидетельствуют о пассивном поступлении ионов Са2+ во внутреннее пространство везикул. Ранее была показана пассивная Са-проницае-мость плазмалеммы колеоптилей кукурузы,активируемая напряжением на мембране и чувствительная к двум ингибиторам Са-каналов, верапамнлу и рутениевому красному [Медведев и др., 1989]. Действие ингибитора оценивалось в момент создания потенциала по изменению интенсивности флуоресценции Са-чувствигелького зонда ХТЦ.

Рис. 1. Изучение кальциевой проницаемости везикул плазмалеммы клеток колеоптилей пшеницы (а-г) и кукурузы (д-ж) .Внутри везикул: среда А1; снаружи - Б1. Стрелками обозначены моменты добавления: 1 - А23187 (10 нМ), 2 - СаСЬ(1 мкМ), 3 ■ валиномици-на (8 нМ) и 4 - верапамила (300 мкМ). За 100% принята интенсивность флуоресценции зонда (ИФ) после добавления 20 мкл везикул, а, б - изменения флуоресценции загруженного внутрь везикул зонда индо-1 под влиянием А23187 и ионов кальция; в, д - индукция пассивной кальциевой проницаемости при наведении на мембране везикул плазмалеммы клеток колеоптилей пшеницы (в) а кукурузы (д) калиевого диффузионного потенциала с помощью вадцномицнна; г, е - влияние верапамнла (30 мкМ) на потенциал-зависимый транспорт ионов кальция; ж - влияние лндокациа (50 мкМ) на потенцпалзави-симый транспорт ионов кальция.

При анализе влияния верапамила на кальциевую проницаемость везикул плазмалеммы корней пшеницы его ингибирующее действие проявлялось только в концентрации 0.5 мМ, а при более низкой наблюдалось усиление работы Са-каналов [Huang et al., 1994]. Концентрация кальция в этих опытах составляла 100-200 мкМ, что возможно, понижало сродство канала к верапамилу. В аналогичной работе, выполненной на каналах плазмалеммы из клеток корней кукурузы, не было получено доказательств чувствительности каналов к какому-либо органическому блокатору Са-каналов мембран за исключением рутениевого красного [Marshall et al., 1994]. В наших опытах верапамил использовался в концентрации (30 мкМ), при которой он специфически подавляет токи через потенциалзависимые Са-каналы растительных клеток [Pantoja et al., 1992; Allen, Sanders, 1994; Gelli, Blumwald, 1993; Pineros, Tester, 1995; Klusener et al., 1995]. Верапамил и лидокаин добавляли к везикулам перед внесением во внешнюю среду ионов кальция, так как известно, что связывание верапамила наиболее эффективно при низком содержании Са2+ [Kostyuk et al., 1983]. Бло-катор фенилалкиламинового ряда верапамил на 30% по сравнению с контролем подавлял вход Са2+ в везикулы плазмалеммы из клеток колеоптилей пшеницы (рис.1,в,г) и на 50% - кукурузы (рис.1,д,е). Местный анестетик лидокаин на 35% уменьшал транспорт Са2+ на везикулах колеоптилей кукурузы (рис.1,ж). Неполное ингибирование Са-проницаемости (рис.1,г,е,ж) может объясняться тем, что, с одной стороны, для данных объектов концентрация блокаторов мала, а с другой - подавлялась только активность Са-каналов нормально ориентированных везикул. Таким образом, результаты ингибитор-ного анализа пассивной Са-проницаемости плазмалеммы колеоптилей кукурузы согласуются с данными о влиянии верапамила на Са-каналы растительных объектов [Ketchum, Poole, 1991; Findley et al., 1991; Pineros, Tester, 1995; Klusener et al., 1995]. Из данных, представленных на рис.2.а, видно, что в том случае, когда мембранный потенциал везикул был близок к нулю, наблюдалось минимальное изменение флуоресценции ХТЦ. При создании на мембране градиента электрического потенциала (знак "минус" внутри везикул), флуо-

ресценция зонда усиливалась, что можно объяснить появлением мембранного потока кальция. Наиболее интенсивными изменения флуоресценции были при величине мембранного потенциала от -50 мВ до -70 мВ и уменьшались при создании на мембране везикул более отрицательных потенциалов. Аналогичные результаты получены также с помощью зонда, индо-1 (рис.2,б), который в отличие от ХТЦ находится практически целиком в водной фазе внутри везикул и регистрирует только ионизированный кальций [Grynkiewicz et al., 1985]. Следовательно, на основании флуоресцентных ответов обоих зондов можно утверждать, что под действием наведенного мембранного потенциала происходит транспорт ионов Са2+ внутрь везикул. В зависимости от состава инкубационного раствора потенциал клетки находится в пределах -100 + -140 мВ [Muller, Nelles, 1986].

28

£

_Г 24

I

S 20

к

a i6

8112

8

-100 -80 Ed, мВ

—i—■—i—-—i— -60 -40 -20

14

12°.

10

I

я

1

o. о

Í

Рис. 2. Зависимость транспорта ионов кальция через мембрану вези-куа лазмалеммы колеоптилей кукурузы от величины К-диффузионного потенциала (ЕЛ).

а - изменения флуоресценции зонда ХТЦ после генерации с помощью валиномицина (8 нМ) на мембране везикул Ы. Внутри везикул: среда А, снаружи - среда Б, с добавлением ХТЦ (70 мкМ) и СаСЬ (100 мкМ).

б - изменения флуоресценции зонда индо-1 после генерации с помощью валиномицина (8 нМ) на мембране везикул Ес1. Внутри везикул: среда А!, снаружи - среда Б1.

Отсюда следует, что потенциал, при котором наблюдался минимальный транспорт ионов кальция (-100 мВ) соответствовал мембранному потенциалу клеток колеоптиля в покое. Полученные результаты хорошо согласуются с данными, полученными на Са-каналах харовых водорослей рКерелова, Грищенко, 1988] и каналах высших растений, встроенных в билигшдную мембрану [Pineros, Tester, 1995], а также о том, что пассивная проницаемость везикул плазмалем-

6

о

мы из корней проростков пшеницы и кукурузы максимальна при -100 и -80 мВ, соответственно [Marshall et al., 1994; Huang et al., 1994]. Таким образом, пассивная проницаемость плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы зависит от величины мембранного потенциала в широком диапазоне потенциалов (от 0 до -120 мВ) и обеспечивается работой Са-каналов, по-видимому, L-типа.

Активность многих ион-транспортирующих систем в условиях целого растения и, в том числе, Са-каналов зависит от различных факторов (гормональный баланс, энергетика клетки) [Saunders, 1990]. В работе Максимова [1989] с использованием зонда diS-C3-(5) было показано, что изменения натриевой проницаемости плазмалеммы из клеток корней и колеоптилей кукурузы под действием гормонов зависели от физиологического состояния мембран растений перед обработкой фитогормонами. Для плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы показано, что обработка ауксином (1 мкМ) приводила к увеличению пассивной калиевой проницаемости [Шишова, 1990]. Можно предположить, что изменение пассивной проницаемости мембраны для одновалентных катионов под влиянием фитогормонов обусловлено их влиянием на работу ионных каналов. В нашей работе для оценки влияния фитогормонов на пассивную проницаемость плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы в условиях предложенной модельной системы также использовался зонд diS-C3-(5). В опытном варианте перед индукцией потенциала валиномицном в среду вносили ИУК в концентрации 5 мкМ. (рис.3,а). В качестве контроля аналогичным образом добавляли дистиллированную воду. Внесение ИУК в виде водного раствора вызывало значительно большее тушение флуоресценции зонда diS-C3-(5) , чем добавление воды. Эти результаты согласуются с данными Шитовой [Шишова , 1990] и могут быть объяснены повышением калиевой проницаемости везикул под действием гормона. Абсолютное изменение флуоресценции красителя при добавлении моненсина в варианте с добавлением дистиллированной воды, было выше, чем в случае добавления раствора ИУК, но ниже, чем в варианте без добавок (рис.3,б). При этом проценты возврата (отношение величины абсолютного увеличения

Рнс. 3. Влияние ауксина на пассивную проницаемость везиьул плазмалеммы клеток колеогпглеГг кукурузы а - характерные кривые изменения флуоресценции зовда (3]3-Сз-(5), Стрелками показано добавление: 1 - везикул (1 мкл); Г - везикул, прсдобработаиых 10 мкМ ИУК, 2 - воды (5 мкл); 2' - ИУК (5 мкМ);

3 - валшюмицина (8 нМ);

4 - моненсина (30 нМ).

б - шменешя интенсивности флуоресценции зовда Ш5-Сз-(5) после добавления моненяиа.н проценты возврата. Внутри везикул: среда А, снаружи - среда Б.

1мин

а" 10-1

8 -

контроль

О

ауксин

флуоресценции зонда сПЭ-Сз-(5) при добавлении моненси-на к абсолютной величине тушения под влиянием вали-номицина) в обоих контрольных вариантах были . сравнимы, но превосходили • процент возврата в опытном варианте (рис.3,б). Таким образом процент возврата,

4 -

2

0

т. е. отношение величин флуоресцентных ответов зонда при создании и сня-

тии потенциала под действием валиномицина и моненсииа, в наибольшей степени отражает увеличение пассивной проницаемости мембраны везикул, обусловленное действием ауксина. Осмотически-индуцированные изменения объема везикул могут изменять поверхностное натяжение, структуру мембранного бислоя [Morre, Bracker, 1976; Маркин, Козлов, 1986] и проницаемость мембран [Hoffman, 1958; Johnson, Miller, 1975 ; Taupin, 1975]. На рис.4,а показаны ответы зонда при снятии потенциала моненсином, полученные на везикулах, загруженных средой А, добавленных в натриевую среду с различным содержанием сахарозы. Величина абсолютного увеличения флуоресценции зонда diS-C3-(5) при добавлении моненсина не изменялась, если везикулы помещали в среду, содержащую 100 мМ сахарозы по сравнению со средой, содержавшей 150 мМ, следовательно, понижение осмолярности внешней среды не вызывало существенных изменений в пассивной проницаемости везикул. Повышение осмолярности до 200 мМ понижало на 34 % флуоресцентный ответ зонда, вызванный моненсином, что свидетельствует об увеличении пассивной проницаемости везикул для ионов натрия при отклонении от изоосмо-тичности в сторону гипертоничности наружной среды. Таким образом, везикулы, помещенные в среды с различной концентрацией сахарозы, неодинаково реагировали на добавление моненсина, что свидетельствовало о том, что натриевая проницаемость везикул зависит от осмотически-индуцированных изменений объема везикул. Возникает вопрос, какое действие оказывает ауксин на проницаемость мембраны везикул плазмалеммы в различных осмотических условиях. Поскольку в условиях гипертоничности наружной среды натриевая проницаемость мембраны была повышена, необходимо было проверить действие гормона именно в этих условиях. При этом наблюдалось уменьшение процента возврата в варианте с добавлением ИУК в кювету по сравнению с контролем, что свидетельствовало об увеличении натриевой проницаемости везикул (рис.4,б). При предобработке везикул ауксином натриевая проницаемость мембраны также увеличивалась. Обнаруженный эффект ауксина можно считать специфичным, так как предобработка не приво-

Рис. 4. Влияние осмотичносги наружной среды и ауксина на индуцируемую валиномицином пассивную проницаемость везикул плазмалеммы клеток холеопти-яей кукурузы. Внутри везикул: среда А, снаружи • среда Б.

а - изменения интенсивности флуоресценции зонда diS-C3-(5) после добавления моненсина. Инкубационная среда содержит 100, 150,200 мМ сахарозы, б - влияние ауксина и триптофана на лроцент возврата.

1 - контроль, 2 и 3 - ИУК (5 мкМ), 4 - триптофан (5 мкМ). Везикулы в 3 и 4 вариантах, предобработаны в течение 15 мин. соответственно ауксином и триптофаном в концентрации S мкМ. Концентрация сахарозы в среде Б • 200 мМ. в • характерные кривые изменения флуоресценции зонда diS-C3-(5). Стрелками обозначено добавление: 1 - везикул (I мкл); 2 - ИУК (5 мкМ); 3 -валиномицнна (8 нМ); 4 • аламетнцина (S.3 мг/л). Везикулы предобработаны водой или ИУК (5 мкМ) в течение 15 мин. Концентрация сахарозы в среде Б -100 мМ.

дила к увеличению пассивой проницаемости везикул. В гипоосмотических условиях (100 мМ сахарозы в инкубационной среде) обработка ИУК вызывала уменьшение флуоресцентного ответа зонда сИ8-Сз-(5) на добавление аламетицина (рис.5,б), что можег быть связано с увеличением проницаемости мембраны. При более детальном рассмотрении характерных кривых оказалось, что уровень флуоресценции зонда Ш8-Сз-(5) после добавления везикул, предобработанных ауксином, был ниже, чем в контроле, которым служили необработанные ауксином везикулы. Минимальный уровень флуоресценции в опытном варианте оказался также ниже, чем в контроле. При этом суммарное тушение флуоресценции красителя, вызванное добавлением ИУК и валино-мицина в опытном варианте, соответствовало ответу зонда при добавлении валиномицина в контрольном варианте (рис.4,в). Поскольку тушение флуоресценции зонда сИ8-Сз-(5), вызванное добавлением валиномицина, объясняется генерацией Е<1 на мембране везикул можно полагать, что ауксин вызывал выход ионов калия из везикул и вносил вклад в генерацию Ей, не изменяя его конечную величину. Эти данные аналогичны результатам, приведенным на рис.3, и согласуются с данными, которые были получены на везикулах из колеоптилей кукурузы [Шишова, 1990]. Кроме того, под действием ИУК уменьшался как абсолютный флуоресцентный ответ зонда при добавлении аламетицина, так и процент возврата, что свидетельствовало об индукции гормоном проницаемости мембраны и для других катионов, в том числе и натрия. Таким образом, действие ауксина на увеличение пассивной проницаемости везикул плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы было обнаружено в широком диапазоне осмотических свойств инкубационной среды. Поскольку транспорт ионов Са2+ внутрь везикул плазмалеммы ингибировался верапамилом (рис.1), необходимо было проверить действие этого блокатора кальциевых каналов на проницаемость мембраны для одновалентных катионов при действии ауксина. Как видно на рис.5,а, верапамил увеличивал процент возврата флуоресцентного ответа зонда, вызванного добавлением

30-

ее Й ™ Р. 20

т

СО

О М

Э ю о

а с

о

контроль ауксин

1 2

20

х х

ЕГ Я

о*

Ч 10-1

контроль ауксин

Ш\ Ж

Ос33+

без ингибиг Верапамил 0 без ижи6ит а б

Рис. 5. Влияние верапамила, гадолиния и ауксина на пассивную проницаемость мембраны везикул плазм алвммы клеток кожоптилей кукурузы.

а-шменение процентавозврахапод действием ауксина (5 мкМ) и верапамила (30 нМ), добавленных в среду инкубации. Внутри везикул: среда А, снаружи - среда Б (200 мМ сахарозы). 1 - контроль, 2 - ИУК (5 мкМ). За 100% приняты изменения флуоресценции ёВ-СЗ-(5) при добавлении валиномицина (8 нм). б - шменения флуоресценценгных ответов зонда, вызванных добавлением аламетицина (8.3 иг/л), под действием ауксина и СИСВ(ЮмкМ).

моненсина как при действии ауксина, так и в контрольном варианте на 32,3% и 20,2%, соответственно. Это свидетельствует о том, что под действием верапамила Непроницаемость понижалась, что может быть связано с блокированием пассивного транспорта ионов Ыа+ через

1 - контроль,. 2 - к везикулам, предобрабоганным ауксином (5 Са-каналы А\к-мкМ) в течение 15 мин., добавленаИУК(5мкМ). За 100% принята '

исходная интенсивность флуоресценции зонда. Внутри везикул: среда А, снаружи - среда Б (100 мМ сахарозы).

син в присутствии ингибитора по-

тенциалзависимых Са-каналов не оказывал активирующего действия на натриевую проницаемость мембран. В работе Авдонина и Ткачука [1994] показано, что верапамил и никардипин, напротив, усиливали Иа-токи через рецеп-торуправляемые каналы кровяных пластинок. Эти каналы обладают меньшей селективностью для ионов Са2+, чем потенциалзависимы и могут пропускать ионы Ыа+ в присутствии веществ, понижающих сродство каналов к ионам Са2+. В нашей работе под действием верапамила наблюдалось не увеличение ионной проницаемости, а ее уменьшение, что свидетельствует о том, что ме-

ханизм действия верапамила на рецепторуправляемые и потенциалзависимые каналы в растительных клетках может быть сходным. В опытах, где осмоляр-ность во внешней среде задавалась концентрацией сахарозы 100 мМ, возникало положительное осмотическое давление внутри везикул, что могло служить причиной открывания механочувствительных Са-каналов и увеличения проницаемости для ионов. Известно, что гадолиний подавляет активность механочувствительных Са-каналов, обнаруженных в плазмалемме эпидермиса лука и других растительных объектов [Pickard, Ding, 1993]. В присутствии ионов гадолиния наблюдалось увеличение флуоресценции зонда diS-C3-(5) при добавлении аламетицина по сравнению с контролем, следовательно гадолиний, аналогично верапамилу, блокировал натриевую проницаемость. Обработка везикул 10 мкМ GdCb на фоне 5 мкМ ауксина (рис.5,б) приводила к повышению флуоресценции зонда в ответ на добавление аламетицина. Таким образом, результаты по действию гадолиния в гипоосмотической среде на пассивную проницаемость везикул плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы свидетельствуют о возможности присутствия на цитоплазматической мембране растительных клеток механочувствительных каналов. Исходя из задачи идентифицировать основные Са-транспортирующие механизмы, локализованные на плазмалемме клеток колеоптилей кукурузы, АТФ-зависимый транспорт ионов Са2+ оценивали в тех же условиях, при которых изучались Са-каналы плазмалеммы. Добавление к везикулам, загруженным индо-1, ионов Са2+ (10 мкМ) и комплекса Mg-АТФ (3 мМ) вызывало постепенное увеличение флуоресценции зонда, что свидетельствовало об увеличении концентрации ионов Са2+ внутри везикул. Использование в качестве субстрата комплекса MgAflC» приводило к снижению накопления Са2+ (рис.6,а). Эти результаты согласуются с данными [Butcher, Evans, 1987]. Можно предположить участие вторично-активных механизмов транспорта ионов Са2+, связанных с наличием Са/Н-обмеников и протонных АТФаз, в АТФ-зависимом транспорте ионов кальция черз мембрану везикул плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы.

□ □

15

Р, о

5 Ю-•е-

о £

Н К

К О-1

гЬ

гЬ

контроль ДЦКД ДЭС ванадат контроль Со 2+ Ag2* верапамил

5

В Г

Рис. 6. АТФ-зависимый транспорт ионов кальция через мембрану везикул плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы. Внутри везикул: среда А1, снаружи - среда Б1.

а - характерные кривые изменения интенсивности флуоресценции индо-1. 1 ■ К^-АТФ (3 мМ), 2 - Мз-АДФ (3 мМ). Стрелками отмечено добавление СаСЬ (10 мкМ) в инкубационную среду, б - влияние ионов Ьа3+,

в - Со2+, Ag+ и верапамила (конечные концентрации 10 мкМ). г - влияние ДЭС (50 мкМ), ортованадата натрия (0,1 мМ) и ДЦКД (50 мкМ)

Однако функционирование Н-АТФаз плазмалеммы, в отличие от кальциевых АТФаз обладает более строгой специфичностью к АТФ [Да81-СаИо2ПО, 1989]. Кроме того, в наших экспериментах рН среды инкубации составлял 7.2, то есть значение рН среды со стороны активного центра фермента было опти-

мально именно для кальциевой, а не протонной АТФазы. Градиент ионов Н+ на мембране везикул был направлен в ту же сторону, что и градиент ионов Са2+, что создавало условия, неблагоприятные для Са/Н-обмена. По данным Зочи и Рабогти наличие в плазмалемме колеоптилей кукурузы обменника исключается, так как мембранный транспорт ионов Са2+ не зависел от искусственно созданного градиента ионов Н+ [Zocchi, Rabotti, 1993]. В подтверждение участия в транспорте ионов Са2+ через плазмалемму Са-АТФазы следует отметить тот факт, что п внесение ионов лантана в концентрации 10 мкМ в инкубационную среду на 90% ингибировало АТФ-зависимое накопление ионов Са2+ в везикулах плазмалеммы (рис.6,6). Известно, что лантан блокирует образование фосфорилированного интермедиата фермента (Ca-Mg)-АТФазы [Chen et al., 1992] и ингибируег осуществляемый им гидролиз АТФ [Rasi-Caldogno et al., 1995]. Са-АТФазы обладают большей чувствительностью к La3+, чем М§2+-АТФаза [Robinson et al., 1988]. Грэф и Веллер при анализе работы Са-АТФазы плазмалеммы листьев Commelina communis показали, что лантан специфично ингибирует транспорт ионов Са2+ [Graf, Weller, 1989]. Активный транспорт ионов Ca обладал чувствительностью к ингибиторам мембраносвязанных АТФаз - Na3V04, ДЭС и ДЦКД (рис.6,в). Ортованадат (0,1 мМ) тормозил транспорт Са2+ на 90%, ДЭС (50 мкМ) - на 80 %. Известно, что ДЦКД является эффективным ингибитором протонных АТФаз [Solioz, 1984]. Однако, имеются сведения, что и Са/Н-обмекник подавляется ДЦКД и La3+ [Schumaker, Sze, 1989]. В работе Гванини и сотр. было показано, что ДЦКД подавлял (на 50%) накопление 45Са везикулами плазмалеммы клеток корня красной свеклы [Giannini et al., 1987]. В работе Пикка и Рэккера [Pick, Racker, 1979] было показано торможение АТФ-зависимого поглощения ионов Са2+, обусловленное работой Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума в присутствии ДЦКД. Механизм ингибироваиия транспорта неизвестен, но можно предположить, что в состав Са-АТФазы входит Са-канал. Возможно, мишенью действия ДЦКД, который в наших опытах на 70% уменьшал АТФ-зависимое накопление Са2+ (рис.6,в), являлся трансмембранный канал внутри

белка Са-АТФазы. Можно видеть (рис.6,г), что добавление в среду инкубации везикул ионов Со2+ и Ag* в концентрации 10 мкМ угнетало процесс активного транспорта кальция на 60% и 70%, соответственно. Блокатор Са-каналов верапамил не оказывал влияния на активный транспорт Са2+ (рис.6,г). Таким образом, АТФ-зависимый транспорт ионов Са2+ через мембрану везикул плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы обусловлен работой Са-АТФазы и, что процессы АТФ-зависимого и пассивного мембранного транспорта кальция в данной модели разобщены. Выводы

1. Впервые с использованием Са-чувствительных флуоресцентных зондов на везикулах плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы и пшенницы установлено функционирование потенциал-зависимых Са-каналов и Са-АТФаз, обеспечивающих пассивный и активный мембранный транспорт ионов Са2+.

2. АТФ-зависимое накопление ионов Са2+ везикулами плазмалеммы подавлялось ортованадатом натрия (0,1 мМ) на 90%, диэтилстильбестролом (50 мкМ) - на 80% и дициклогексилкарбодиимидом (50 мкМ) на 70%. Ионы Со2+, А§+ и Ьа3+ в концентрации 10 мкМ угнетали активный транспорт кальция на 60%; 70% и 90%, соответственно. Верапамил (30 мкМ) не влиял на АТФ-зависимый транспорт ионов Са2+.

3. Пассивная кальциевая проницаемость везикул плазмалеммы зависела от величины мембранного потенциала и была максимальной в области -60 мВ, что соответствует деполяризованному состоянию клеток. Блокаторы потен-циалзависимых Са-каналов верапамил и лидокаин в концентрации 50 мкМ на 30-50% подавляли потенциалзависимый транспорт ионов Са2+ в везикулы плазмалеммы.

4. ИУК в концентрации 5 мкМ на 22-25 % повышала пассивную ионную проницаемость везикул плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы. ^

5. Гадолиний (блокатор механочувствительных каналов) в концентрации 10 мкМ подавлял пассивную ионнную проницаемость везикул плазмалеммы колеоптилей кукурузы на 17-22 %.

-216. Предполагается, что система пассивного транспорта ионов кальция в плазмалемме клеток колеоптилей кукурузы представлена потенциалзависи-мыми Са-каналами, аналогичными потенциалзависимым Са-каналам L-типа животных клеток, рецепторуправляеми Са-каналамии и механочувсгвитель-ными Са-каналами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мошков А. В. Влияние трансмембранного потенциала на кальциевую про-ницаемрсть везикул плазматической мембраны из клеток колеоптилей кукурузы // III Съезд Всесоюзного общества физиологов растений. 1993 г., С.Петербург. С. 168.

2. Юрконене C.B., Батов А.Ю., Маркова И.В., Мошков A.B., Максимов Г.Б. Спектрофлуориметрический анализ транспорта Са2+ через плазматическую мембрану in vitro // III Съезд Всесоюзного общества физиологов растений. 1993 г., С.-Петербург. С. 240.

3. Медведев С.С., Батов А.Ю., Мошков A.B., Маркова И.В. Участие Са-каналов плазмалеммы клеток высших растений в кальциевом гомеостазе II Второй Съезд украинского Общества физиологов растений. Киев, 1993. T. I. С. 150.

4. Moshkov A.Y., Batov A.Y. Use of fluorescent probes to study the calcium ions transport across plasmalemma. / Abstr.9th Congr. FESPP // Biología plantarum. 1994. V.36 (suppl), P.224.

5. Батов А.Ю., Юрконене C.B., Маркова И.В., Мошков A.B., Медведев С.С., Максимов Г.Б., Определение содержания ионов кальция с помощью флуоресцентного зонда Индо-1 в везикулах плазмалеммы, выделенных из растительных клеток // Физиол.растений. 1995. Т.42. Вып.!. С. 144-148.

6. Маркова И.В., Батов А.Ю., Мошков A.B., Максимов Г.Б., Медведев С.С. Кальций-транспортирующне системы плазмалеммы колеоптилей кукурузы// Физиология растений. 1995. Т. 42. Вып. 2. С. 262-267.

7. Markova I.V., Batov A.Y., Moshkov A.V., Medvedev S.S. Calcium transport through the plasmalemma of maize coleoptile cells // Proceedings of International Symposium on Plant Membane Biology 1994, Lund, P23.

8. Markova I.V., Batov A.Y., Katrichenko M.I., Moshkov A.V., Medvedev S.S. Participation of Ca-channels and Ca-ATPases in creating of polar calcium fluxes in plants // 10th International Workshop on Plant Membrane Biology. 1995, Regensburg. P 62.

9. Batov А.У., Markova I.V., Moshkov A.V., Medvedev S.S. Ca-channels and Ca-ATPases are two membrane transport mechanisms involved into the hormone action / Proc.lOth FESPP Congress // Plant Physiology and Biochemistry 1996. Special issue. P. 173.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант N 96-04-48987.

s