Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТРАНСПОРТ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ ЧЕРЕЗ ПЛАЗМАТИЧЕСКУЮ МЕМБРАНУ ИЗ КЛЕТОК КОЛЕОПТИЛЕЙ КУКУРУЗЫ И ПШЕНИЦЫ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ТРАНСПОРТ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ ЧЕРЕЗ ПЛАЗМАТИЧЕСКУЮ МЕМБРАНУ ИЗ КЛЕТОК КОЛЕОПТИЛЕЙ КУКУРУЗЫ И ПШЕНИЦЫ"



СЛНКТ-П ЕТЕРБУРГСКИ Й ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

мошков

Алексей Владимирович

Транспорт ионов кальция через плазматическую мембрану из клеток колеоптилей кукурузы и пшеницы

03.00. ] 2 • физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург • 1997

Ср Ш-иЛ? и '-У /¿и (ї;

Работа выполнена в лаборатории биофизики растений Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

С.С. Медведев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М.В.Архипов

доктор биологических наук O.E. Лебедев

Ведущее учреждение; Московский государственный университет им. М .В, Л омоносова.

Защита состоится С^,1997 года в час. на заседании Диссертаци-

онного Совета К 063.57.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском госуарственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, а уд. ^ 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Горького Санкт-Петербургского государственного университета по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9,

Автореферат разослан: Штгл 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат биологических наук В.В.Ермилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования.

Особое внимание ученых привлекает участие ионов кальция в передаче внешних сигналов внутрь клетки [Маше, 1985; Rasmussen et al., 1990]. Ключевую роль в этом процессе занимает цитоплазматическая мембрана, поскольку под действием внешних стимулов концентрация кальция в цитоплазме увеличивается за счет пассивного поступления конов кальция в основном, из внешней среды. Показано, что электрохимический градиент этих ионов на плазмалем-ме может достигать 4 порядков. На основании электрофизиологических экспериментов с клетками харовых водорослей было сделано предположение о том, что основная роль в увеличении внутриклеточной концентрации ионов кальция при физиологических реакциях растений на действие факторов внешней среды принадлежит потенциалзависимым Са-каналам плазмалеммы, через которые кальций входит в клетку [Hepler, Wayne, 1985]- Это предположение подтверждается тем,' что Са-проннцаемосгь плазмалеммы клеток высших растений, в частности колеоптилей кукурузы, также чувствительна к ингибиторам Са-каналов [Медведев и др„ 1989]. В работе, выполненной на встроенных в искусственную мембрану фрагментах плазмалеммы из корней пшеницы электрофизиологическим методом показано, что Са-каналы открываются при потенциалах, намного более отрицательных, чем пороговый потенциал по-тенциалзависнмых Са-каналов животных клеток [Pineros, Tester, 1995]. Однако эти данные носят единичный характер. С помощью определения Са-зависимоЙ АТФ-гидролизующей активности и изотопных методов' показано, что на плазматической мембране имеются Са-АТФазы, споообные осуществлять тонкую коррекцию уровня ионов кальция в клетке [KLubowjcz et al., 1982; Dieter, Marme, 1983; Robinson et al., 1988; Graf, Weller, 1989; Zocchi, Rabotti, 1993]. Высказано также предположение о том, что удаление кальция из цитоплазмы клеток растений с помощью Са-АТФаз плазмалеммы осуществляется непрерывно [Briskin

сияния о Са-каналах и Са-

АТФазах плазм а лем ръНрАСЧ ь 0MS ЛИвГСВДАм фо щиеся в литературе, промоет. -•■•лы.'о академии и.л. ií. Л, I имирнзезд .

wo АгЧ-ябЯЯ

тнворечивы, а участие систем мембранного транспорта ионов кальция в реализации гормонального сигнала до сих пореще не выяснено. Дел^ ц ?адачц доследования . Целью данной работы было оценить участие Са-АТФаз и различных типов кальциевых каналов плазматической мембраны клеток высших растений в мембранном транспорте ионов кальция. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. На основе мебранных везикул н флуоресцентных кальциевых зондов разработать модельную систему, позволяющую анализировать процессы активного и пассивного транспорта ионов кальция через клеточные мембраны растений.

2. Изучить АТФ-зависимый транспорт ионов кальция в мембранных везикулах колеоптилей кукурузы. -

3. Выяснить зависимость транспорта ионов кальция в мембранных везикулах от величины мембранного потенциала.

4. Исследовать действие ионофоров, ингибиторов транспортных АТФаз, и блокаторов ионных каналов на транспорт нонов кальция в везикулах плазма-леммы из клеток растений. . . /

5. Изучить влияние И УК и механических воздействий на нонную проницаемость плазмалеммы колеоптилей кукурузы.

Научная новизна. Впервые на одной модельной системе - загруженных флуоресцентным зондом везикулах плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы • показано функционирование двух типов , мембранного транспорта ионов кальция. Проанализирована зависимость работы Са-каналов от мембранного потенциала. Установлено, что система пассивного транспорта нонов кальция плазмалеммы колеоптилей кукурузы представлена потенцналзавнеимыми Са-каналами, аналогичными потенциалзависимым Са-каналам Ь-типа животных клеток, а также рецептор управляемым и и механочувсгвнтельными каналами. Система активного транспорта ионов кальция представлена Са-АТФазоЙ.

Практическая значимость. Проведенные исследования вносят существенный вклад в понимание функционирования ионтранспортнрующих систем (Са-

каналов и Са-АТФаз), локализованных в плазм алемме клеток растений. Разработанный экономичный метод загрузки везикул кальциевым зондом с использованием малых объемов среды загрузки может быть использован при спектрофлуорнметрическом изучении мембранного транспорта ионов в различных объектах. , Апробация работы. Результаты работы были доложены на Третьем Съезде Всесоюзного общества физиологов растений (С.-Петербург, 1993 г.), Втором Съезде Украинского Общества физиологов растений {Киев, 1993), чтениях, посвященных 160-летию И.А.Стебута (С.-Петербург, Пушкин, 1994), Девятом и Десятом Съездах Федерации Европейских обществ физиологов растений (FESPP) (Брно, 1994 г.; Флоренция, 1996), Международном Симпозиуме по биологии мембран растений (Лунд, 1994 г.), Десятой международной школе по биологии мембран растений (Регензбург, 1995 г.), ГордоновскоЙ научной конференции по гравитационной биологии (Нью-Лондон, 1996). По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Струутурд и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 109 стр. машинописного текста, содержит 20 рисунков н 1 таблицу. Список цитированной литературы включает 220 наименований, в том числе 180 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ' MayepHajppi и методы- ;

В работе использовали декалитированные на 4 мм' колеопткли 4-х дневных проростков кукурузы {Zea mays L.) сорта "Краснодарский-235" и 3-х Дневных пшеницы (Tr(itcum aestivvm L.) сорта "Аркус", выращенных в темноте при 27й С на разбавленном в 10 раз растворе Чеснокова [Чесноков н др., 1968} с добавлением 0.25 мМ сульфата кальция. Гомогенизацию растительного материала проводили при соотношении' среда гомогенизации/навеска, равном 0.4. Клеточные стенки и ядра осаждали при 8000 g в течение 5 мин., затем при 18000 g в течение 15 мин. осаждали более.мелкие органеллы (пластиды, митохондрии).

ПолученныЯ супернатант снова центрифугировали (80000 30 мин.) для получения оссдка грубой микросомальной фракции, который ресуспендировали 2 мл среды выделения, наслаивали на ступенчатый градиент плотности сахарозы, состоящий из 25 мл раствора сахарозы с плотностью 1,17 г/см$ (нижний слой) и 7 мл раствора сахарозы с плотностью 1.13 г/см* (верхний спой) и центрифугировали при 101000 £ 2 часа [Тихая, Максимов, 1936]. При фракционировании мембран колеоптилей кукурузы по модифицированной методике осадок грубой микросомальной фракции ресуспендироваяи в 0,2 мя среды выделения, наносили на ступенчатый сахарозный градиент, состоящий из 1,5 мл раствора сахарозы с плотностью 1.17 г/см* (нижний слой) и 3 мл раствора сахарозы с плотностью 1.13 г/см* (верхний слой) и центрифугировали (153000 g, 60 мин.) для очистки от фрагментов эндомембран, При фракционировании мембран из колеопти-

... |

лей пшеницы плотности растворов сахарозы для двух слоев составляли 1.15 г/см3 и 1.11 г/смсоответственно. Фракцию, обогащенную фрагментами плаэмалеммы, отбирали пастеровской пипеткой с границы раздела слоев ступенчатого градиента. Загрузку везикул плаэмалеммы средой заданного состава проводили с помощью осмотического шока. Везикулы концентрировали с помощью осаждения (101000 1 час). Осадок ресуспендироваяи в среде А (100 мкл) и использовали для работы с зондами ХТЦ н <ЦЗ-Сз-(5). Для работы с зондом нндо-1 сначала проводили концентрирование везикул плаэмалеммы (153000 1 час), а затем осмотический шок средой А1 в том же объеме. Потенциал на мембране везикул плазм ал ем мы различной величины задавали как К-диффузионный с помощью валиномнцнна при варьировании концентрации ионов калия в инкубационной среде. Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре СФР-1 в стандартной кварцевой кювете (А/=0.6 мл) и на модифицированном микроскопе ЛЮМАМ-ИЗ (У=0.3 мл). Величину мембранного потенциала определяли с помощью флуоресцентного зонда <И£>-Сэ-(5) при длине волны возбуждения 570 нм н флуоресценции - 663 нм. Анализ потоков ионов кальция проводили зондом индо-1 при длине волны возбуждения 334 нм и флуоресценции - 405 нм и ХТЦ (70 мкМ) - при 380 и 520 нм, соответственно.

Сосггав сред (конечные концентрации, мМ): I) среда гомогенизации: сахароза -250, трис - 35, ЭДТА - 10, аскорбиновая кислота - 4; 2) растворы для градиентов: сахароза, трис-мэс (рН 7.2) - 1, плотность 1.11, 1.13, 1.15 н 1.17 г/см1; 3) среда A: KjSCU - 150, сахароза - 150, трис-мэс (рН 7.2) - 1; 4) среда Al: K2SO4 ■ 150, сахароза - 150, ЭГТА - 0,67, индо-1 - 0.017, трис-мэс - 10, рН доводили до 12,0 с помощью КОН; 5) среда Б: NaiSO«- 150, сахароза - 150, трис-мэс (рН 7,2) -I; б) среда Б!: NaiSO* - 150, сахароза - 150, трис-мэс буфер (рН 7,2) - 10. В некоторых случаях рИ доводили до 12,0 с помощью КОН. Опыты проводили в 4-5 биологических и 3-4 аналитических повторностях. На гистограммах показаны стандартные ошибки. Кривые динамики флуоресценции приведены для одного из наиболее характерных экспериментов. Резулугатц ц обсуждение

Установлено, что везикулы плазмалеммы обладают слабой ионной проницаемостью рЗатов, Максимов, 1985; Инге-Вечтомова н др., 1987; Максимов, Батов, 1989]. Поэтому, индукция кальциевой проницаемости везикул плазмалеммы из клеток колеоптнлей, загруженных зондом кндо-l, с помощью ионофора A231S7 позволит ответить'одновременно на два вопроса: 1) насколько успешно прошла загрузка везикул зондом и 2) как зонд индо-I реагирует на увеличение концентрации Са1* внутри везикул. При обработке Са-ионофором A231S7 (10 нМ) везикул плазмалеммы из колеолтшгей пшеницы в среде с низкой концентрацией кальция существенных изменений интенсивности флуоресценции индо-1 не наблюдалось (pnc.l.a). В кальций содержащей среде (30 мкМ) наблюдалось увеличение флуоресценции зонда (рис. 1,6). Титрование везикул ионами кальция в присутствии Са-нонофора А23187 увеличивало флуоресценцию нндо-1 до максимального уровня (рис. 1, а). При наведении мембранного потенциала с помощью валиномицнна (так называемый "калий-валнномициновый клямп") на мембране везикул плазмалеммы из клеток колептилей пшеницы наблюдалось увеличение флуоресценции индо-1 (рис.1,в), аналогичное таковому при действии А23187, что свидетельствовало об увеличении концентрации Caí* внутри везикул. Аналогичные данные получены и для везикул плазмалеммы из

клеток колеоптнлей кукурузы (рис,1 д). Таким образом,изменения флуоресценции нндо-l свидетельствуют о пассивном поступлении ионов Cal* во внутреннее пространство везикул. Ранее была показана пассивная Са-проннцае-мость плазмалеммы колеоптнлей кукурузы,активируемая напряжением на мембране н чувствительная к двум ингибиторам Са-ханалов, верапамилу и рутениевому красному [Медведев и др., 1989]. Действие ингибитора оценивалось в момент создания потенциала ло изменению интенсивности флуоресценции Са-чувствительного зонда ХТЦ.

3

Рис. I. Изучение кальциевой проницаемости везикул ллаэмалеммИ клеток колсоптидей пшеницы (а-г) н кукурузы Сд-ж) .Внутри везикул: среда А1; снаружи - БІ. Стрелками обозначены моменты добавления: 1 * А2Э187 (10 нМ). 2 - СаС1з(1 икМ), 3 - в&жнномнцн-на (8 нМ) и 4 • вераламнла (300 мкМ). За 100% принята интенсивность флуоресценции зонда (ИФ) после добавлення 20 мкл везикул, а, б - изменения флуоресценции загруженного внутрь везикул зонда индо-1 под влиянием А23187 и ионов кальцій; в, д - индукция пассивной кальциевой проницаемости прин введении на мембране везикул плаз-ыалемны клеток колеогпилей пшеницы (в), к кукурузы (д) калиевого диффузионного потенциала с помощью валнномнинна; г» с - влияние верапамнла (30 ыкМ) на потенцкял-зависимый транспорт ионов кальция; ж • влияние яндокаина (50 мкМ) иа потеициалзависим ый транспорт ионов кальция.

ТТри анализе влияния верапамила- на кальциевую проницаемость везикул плазм алеммы корней пшеницы его ингибирующее действие проявлялось только в концентрации 0.5 мМ, а при более низкой наблюдалось усиление работы Са-каналов [Huang et al., 1994]. Концентрация кальция в этих опытах составляла 100-200 мкМ, что возможно, понижало сродство канала к вераламилу. В аналогичной работе, выполненной на каналах гшазмалеммы из клеток корней кукурузы, не было получено доказательств чувствительности каналов к какому-либо органическому блокатору Са-каналов мембран за исключением рутениевого красного [Marshall et al., 1994]. В наших опытах верапамил использовался в концентрации (30 мкМ), при которой он специфически подавляет токи через потенциалзависимые Са-каналы растительных клеток [Pantoj a et al., 1992; Allen, Sanders, 1994; Gelli, BlumwaId, 1993; Pineros, Tester, 1995; Klusener et al., 1995]. Верапамил и лндоканн добавляли к везикулам перед внесением во внешнюю среду ионов кальция, так как известно, что связывание верапамила наиболее эффективно при низком содержании Са1* [Kostyuk et al., 1983]. Бло-катор фенилалкиламинового ряда верапамил на 30% по сравнению с контролем подавлял вход Са2+ в везикулы плазм алеммы из клеток колеоптилей пшеницы (рис.1,в,г) и на 50% - кукурузы (рис.1 д,е). Местный анестетик лндоканн на 35% уменьшал транспорт Са** на везикулах колеоптилей кукурузы (рис.1,ж). Неполное ннгнбирование Са-проницаемости (рис.1,г,е,ж) может объясняться тем, что, с одной стороны, для данных объектов концентрация блокаторов мала, а с другой - подавлялась только активность Са-каналов нормально ориентированных везикул- Таким образом, результаты ингибитор-ного анализа пассивной Са-проницаемости плазм алеммы колеоптилей кукурузы согласуются с данными о влиянии верапамила на Са-каналы растительных объектов [Ketchum, Poole, 1991; Findley et al., 1991; Pineros, Tester, 1995; Klusener et al., 1995]. Изданных, представленных на рис.2.a, видно, *что в том случае, когда мембранный потенциал везикул был близок к нулю, наблюдалось минимальное изменение флуоресценции ХТЦ. При создании на мембране градиента электрического потенциала (знак "минус" внутри везикул), флуо-

ресценция зонда усиливалась, <гго можно объяснить появлением мембранного потока кальция. Наиболее интенсивным» изменения флуоресценции были при величине мембранного потенциала от. -50 мВ до -70 мВ и уменьшались при создании на мембране везикул более отрицательных потенциалов. Аналогичные результаты получены также с помощью зонда, индо-1 (рис.2,6), который в отличие от ХТД находится практически целиком в водной фазе внутри везикул и регистрирует только ионизированный кальций [Grynkiewicz et al., 1985]. Следовательно, на основании флуоресцентных ответов обоих зондов можно утверждать, что под действием наведенного мембранного потенциала происходит транспорт ионов Cafi* внутрь везикул, В зависимости от состава инкубационного раствора потенциал клетки находится в пределах -100 + -140 мВ [Maller, Melles, 1986].

Рис. 2. Зависимость транспорта ионов кальция через мембрану везн-куп лаэмалеммы колеоппілей кукурузы от величины К-диффузионного потенциала (Е(Ц,

а • изменения флуоресценции зонда ХТЦ после генерации с помощью валнноинщша (8 нМ) на мембране везикул Е<1. Внутри везикул: среда Л, снаружи ■ среда Б, с добавлением ХТЦ (70 мкМ) и СаС1г(ЮймкК0-

Є - изменения флуоресценции зонда нядо-1 после генерации с помощью ваяиноышшна (3 кМ) на мембране везикул Е<1. Внутри везикул: среда А1, снаружи - среда БI.

Отсюда следует, что потенциал, при котором наблюдался минимальный транспорт ионов кальция (-100 мВ) соответствовал мембранному потенциалу клеток колеоптиля в покое. Полученные результаты хорошо согласуются с данными, полученными на Са-каналах харовых водорослей рКерелова, Грищенко, 1988] и каналах высших растений, встроенных в билипидную мембрану [Pineros, Tester, 1995], а также о том, что пассивная проницаемость везикул плазмалем-

мы из корней проростков пшеницы и кукурузы максимальна при -100 и -80 мВ, соответственно [Marshall et al„ 1994; Huang et al., 1994]. Таким образом, пассивная проницаемость плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы зависит от величины мембранного потенциала в широком диапазоне потенциалов (от 0 до -120 мВ) и обеспечивается работой Са-каналов, по-видимому, L-тнпа. Активность многих ион-транспортирующих систем в условиях целого растения и, в том числе, Са-каналов зависит от различных факторов (гормональный баланс, энергетика клетки) [Saunders, 1990]. В работе Максимова [1989] с использованием зонда diS-Ci-{5) было показано, что изменения натриевой проницаемости плазмалеммы из клеток корней и колеоптилей кукурузы под действием гормонов зависели от физиологического состояния мембран растений перед обработкой фитогормонами. Для плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы показано, что обработка ауксином (I мкМ) приводила к увеличению пассивной калиевой проницаемости [Шншова, 1990]. Можно предположить, что изменение пассивной проницаемости мембраны для одновалентных катионов под влиянием фитогормонов обусловлено их влиянием на работу ионных каналов. В нашей работе для оценки влияния фитогормонов на пассивную проницаемость плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы в условиях предложенной модельной системы также использовался зонд diS-Ci-(5). В опытном варианте перед индукцией потенциала вали ном нцном в среду вносили ИУК в концентрации S мкМ. (рис.3,а). В качестве контроля аналогичным образом добавляли дистиллированную воду. Внесение ИУК в виде водного раствора вызывало значительно большее тушение флуоресценции зонда diS-C3-(5) , чем добавление воды. Эти результаты согласуются с данными ШишовоЙ [Шишова , 1990] и могут быть объяснены повышением калиевой проницаемости везюсул под действием гормона. Абсолютное изменение флуоресценции красителя при добавлении моненснна в варианте с добавлением дистиллированной воды, было выше, чем в случае добавления раствора ПУК, но ниже, чем в варианте без добавок (рис.3,6). При этом проценты возврата (отношение величины абсолютного увеличения

Лю, 3. Влнвме аукоиа на паоавкуга цккиинмост» »ОЕвуяплазмалси« клеток

кшкопгалей кукурузы

а - х»рактерные кдоые юмененш фдуоресцещщ зонда (ЕЭС 3^(5), Стрелками показано добашение: 1 - вепвсул (I мкп); Г - в »»суя, цждобработынх 10 мкМ ИУК1 - ВОДЫ (5 ни); Т - ИУК (5 мкМ); 3 - валиномирна (3 нМ); 4-ыгаенсша(30нМ). б - кшенеиа жкнсивностн фпуорвешштэоаза < • Л5-С*<5) теш дсбааламз »«откинал г^оценгы возврата, Внутри везжуя; среда А, снаружи - среда Б.

контроль

флуоресценции зонда сКЭ-Сз-(5) при добавлении моненси-на к абсолютной величине тушения под влиянием вали-номнцина) в обоих контрольных вариантах были сравнимы, но превосходили процент возврата в опытном варианте (рис. 3,6). Таким образом процент возврата,

1. е. отношение величин флуоресцентных ответов зонда при создании и сня-

тин потенциала под действием валиномицина и моненсииа, в наибольшей степени отражает увеличение пассивной проницаемости мембраны везикул, обусловленное действием ауксина. Осмотнчески-индуцироваиные изменения объема везикул могут изменять поверхностное натяжение, структуру мембранного биспоя [Могте, Bracker, 1976; Маркин, Козлов, 1986] и проницае-

h J

мость мембран [Hoffman, 1958; Johnson, Miller, 1975; Taupin, 1975]. На рис.4,а показаны ответы зонда при снятии потенциала моненсином, подученные на везикулах, загруженных средой А, добавленных в натриевую среду с различным содержанием сахарозы. Величина абсолютного увеличения флуоресценции зонда diS-Cj-(5) при добавлении моненсииа не изменялась, если везикулы помещали в среду, содержащую 100 мМ сахарозы по сравнению со средой, содержавшей 150 мМ, следовательно; понижение осмолярности внешней среды не вызывало существенных изменений в пассивной проницаемости везикул. Повышение осмолярности до 200 мМ понижало на 34 *Л флуоресцентный ответ зонда, вызванный моненсином, что свидетельствует об увеличении пассивной проницаемости везикул для ионов натрия При отклонении от изоосмо-тичности в сторону гипертоничности наружной среды.' Таким образом, везикулы, помешенные в среды с различной концентрацией сахарозы, неодинаково реагировали на добавление моненсииа, что свидетельствовало о том, что натриевая проницаемость везикул зависит от осмотически-индуцированных изменений объема везикул. Возникает вопрос, какое действие оказывает ауксин на проницаемость мембраны везикул плазмалеммы в различных осмотических условиях. Поскольку в условиях пшертоннчностн наружной среды натриевая проницаемость мембраны была повышена, необходимо было, проверить действие гормона именно в этих условиях. При этом наблюдалось уменьшение процента возврата в варианте с добавлением ИУК в кювету по сравнению с контролем, что. свидетельствовало об увеличении натриевой проницаемости везикул (рис.4,б). При предобработке везикул ауксином наг-рневая проницаемость мембраны также увеличивалась. Обнаруженный эф- ; фект ауксина можно считать специфичным, так как предобработка не прнво-

tftiliiHi'

g * S а^з i CD

s S a* reL» s|5 & І|

її* • § ä I^llili-i і h

S H I 11 > £ =

S"S3 ¡r|I SiÄgilP1

процркг возврата, %

интенсивность флуоресценции,*/«

I-

г

с I

w

5

3

•a

£ s

Ю

I

tu

4

s

cr

■•s

шгшсивносгь флуоресценции,0/

дила к увеличению пассивом проницаемости везикул. В гппоосмотическнх условиях (100 мМ сахарозы в инкубационной среде) обработка ИУК вызывала уменьшение флуоресцентного ответа зонда Л5-Сз-(5) на добавление аламетицина (рис.5,б), что может быть связано с увеличением проницаемости мембраны. При более детальном рассмотрении характерных кривых оказалось, что уровень флуоресценции зонда сНЗ-Сз-(5) после добавления везикул, предобработанных ауксином, был ниже, чем в контроле, которым служили необработанные ауксином везикулы. Минимальный уровень флуоресценции в опытном варианте оказался также ниже, чем в контроле. При этом суммарное тушение флуоресценции красителя, вызванное добавлением ИУК и валино-мицина в опытном варианте, соответствовало ответу зонда при добавлении валиномицина в контрольном варианте (рис,4,в). Поскольку тушение флуоресценции зонда сИ1>-Сз-(5). вызванное добавлением валиномицина, объясняется генерацией Ес1 на мембране везикул можно полагать, что ауксин вызывал выход ионов калия из везикул и вносил вклад в генерацию Е<1, ие изменяя его конечную величину. Эти данные аналогичны результатам, приведенным на рисЗ, и согласуются с данными, которые были получены на везикулах из колеоптилей кукурузы [Шишова, 1990). Кроме того, под действием ПУК уменьшался как абсолютный флуоресцентный ответ зонда при добавлении аламетицина, так н процент возврата, что свидетельствовало об индукции гормоном проницаемости мембраны н для других катионов, в том числе и натрия. Таким образом, действие ауксина на увеличение пассивной проницаемости везикул плазм алем мы из клеток колеоптилей кукурузы было обнаружено в широком диапазоне осмотических свойств инкубационной среды. Поскольку транспорт ионов Са2+ внутрь везикул плазмалеммы ингибнровался \

верапамилом (рнс.1), необходимо было проверить действие этого блокатора кальциевых каналов на проницаемость мембраны для одновалентных катионов при действии ауксина. Как видно на рис.5,а, верапаммл увеличивая процент возврата флуоресцентного ответа зонда, вызванного добавлением

і сз

Cu 20 т

s

ta

I

10

контроль ауксин

1 2

20

£

яГ '

.& -

6 '

&10

без ингпбит Верапамил,-, 0

контроль" ауксин

моненсина как при действии ауксина, так и в контрольном варианте на 32,3% и 20,2%, соответственно. Это свидетельствует о том, что под действием верапамн-ла Не-

проницаемость понижалась, что

без ингибнт СИ3* ■ а .6

Рис. 5. Влияние верапамила, гвдолинад н аужснна на пассивную проницаемость мембраны иезюсуя ппазмшвммы - кпггок кожоппскй кукурузы.

а - (вменение пробита возврата под д ействием ауксина (5 мкМ) ' f может бьггь свя-иверапамнла(30 нМ), добавленных вереду инвубацнн. Внутри везикул; среда А, снаружи- среда Б рООиМ сахарозы).

1 • контроль, 2 - ИУК (5 мкМ). За 100% приняты (вменения флуоресценции d¡S-C3-{5) при добавлении валиномицина (8 ни).

С • изменения фпуоресцешентых.ответов, зонда, вызванные добавлением аяаметицина ($3 иг/д), под дейегмеы ауксин» и ОЮЗ(ЮмкМ). ' ■ '

1 • контроль,. 2 - к везикулам, предобработанним ауксином (5 мкМ)втечение 15м>пц добавлена ИУК (5 miAQ. За 100% принята неяэдная интенсивность флуоресценции зоцда. Внутри везикул: среда А, снаружи-среда Е (100 мМ сахарозы).

зано с блокированием пассивного транспорта ионов Na+ через Са-каналы. Ауксин в присутствии

ингибитора по-

тенцналзависимых Са-каналов не оказывал активирующих» действия на нат-. риевую проницаемость мембран. В работе Авдонина и Ткачука [1994] показано, что верапамил и никардипин, напротив; усиливали Ыа-токи через рецептор управляем ые каналы кровяных пластинок. Эти каналы обладают меньшей селективностью для ионов Саї*, чем потенциала ависимы и могут пропускать ионы На* в присутствии веществ, понижающих сродство каналов к нонам Саі+. В нашей работе под действием верапамила наблюдалось не увеличение ионной проницаемости, а ее уменьшение, что свидетельствует о том, что ме-

ханизм действия верапамила на рецепторуправляемые и потенциалзависимые каналы в растительных клетках может быть сходным. В опытах, где осмоляр-ность во внешней среде задавалась концентрацией сахарозы 100 мМ, возннка-ло положительное осмотическое давление внутри везикул, что могло служить причиной открывания механочувсгвнтельных Са-каналов и увеличения проницаемости для ионов. Известно, что гадолиний подавляет активность меха-нечувствительных Са-каналов, обнаруженных в плазмалемме эпидермиса луке и других растительных объектов [Pickard, Ding, 1993]. В присутствии ионов гадолиния наблюдалось увеличение флуоресценции зонда diS-Cj-(5) при добавлении аламетнцина по сравнению с контролем, следовательно гадолиний, аналогично верапамилу, блокировал натриевую проницаемость. Обработка везикул 10 мкМ GdCh на фоне 5 мкМ ауксина (рис.5,б) приводила к повышению флуоресценции зонда в ответ на добавление аламетнцина. Таким обра-

i

зом, результаты по действию гадолиния в гипоосмотической среде на пассивную проницаемость везикул плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы свидетельствуют о возможности присутствия на цитоплазмати ческой мембране растительных клеток механочувствительных каналов. Исходя in задачи идентифицировать основные Са-транспортнрующие механизмы, локализованные на плазмалемме клеток колеоптилей кукурузы, АТФ-завнсимый транспорт ионов Са1+ оценивали в тех же условиях, при которых изучались Са-каналы плазмалеммы. Добавление к везикулам, загруженным индо-1, ионов Са1+ (10 мкМ) и комплекса Mg-АТФ (3 мМ) вызывало постепенное увеличение флуоресценции зонда, что свидетельствовало об увеличении концентрации ионов Са** внутри везикул. Использование в качестве субстрата комплекса МвАДФ приводило к снижению накопления Са*+ (рис.б.а). Эти результаты согласуются с данными (Butcher, Evans, 1987]. Можно предположить участие вторично-активных механизмов транспорта ионов Caí*, связанных с наличием Са/Н-обмеников и протонных АТФаз, в АТФ-зависимом транспорте ионов кальция черт мембрану везикул плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы.

й. ю-

а'

а?

15

-В"

10

контроль Ьа ** б

гЬ

контроль ДЦКД ДЭС ванадат контроль Со5* Аг1' в ера па мил

В г

Рис. 6. АТФ-зависимый транспорт ионов кальция через мембрану везикул гшазмалеыыы клеток колеоптилей кукурузы. Внутри везикул: среда А1, снаружи - среда Б1.

а - характерные кривые изменения интенсивности флуоресценции нндо-1. I - Мд-АТФ (3 мМ), 2 - Мв-АДФ (З мМ). Стрелками отмечено добавление СаСЬ (10 мкМ) в инкубационную среду, б - влияние ионов

в • Со1*, Ай' и вераламила (конечные концентрации 10 мкМ).

г- влияние ДЭС (50 ыкМ), ортованадата натрия (0,1 мМ) н ДЦКД (50 мкМ)

Однако функционирование Н-АТФаз плазмалеммы, в отличие от кальциевых АТФаз обладает более строгой специфичностью к АТФ р1аи-СаИо§по, 1989]. Кроме того, в наших экспериментах рН среды инкубации составлял 7.2, то

есть значение рН среды оо стороны активного центра фермента было опти-

мально именно для кальциевой, а не протонной АТФазы. Градиент нонов И+ на мембране везикул был направлен в ту же сторону, что н градиент нонов Са2+, что создавало условия, неблагоприятные для Са/Н-обмена. По данным Зочн и Работти наличие в плазм алеммс колеоптилей кукурузы обменннка исключается, так как мембранный транспорт ионов Са1* не зависел от искусственно созданного градиента ионов Н+ [Zocchi, Rabotti, 1993]. В подтверждение участия в транспорте ионов Cai+ через плазм алемму С а-АТФазы следует отметить тот факт, что п внесение ионов лантана в концентрации 10 мкМ в инкубационную среду на 90% ннгибировало АТФ-зависимое накопление ионов Caí* в везикулах плазмалеммы (рис.б.б). Известно, что лантан блокирует образование фосфорилированного интермедиата фермента (Ca-Mg)-АТФазы [Chen et al., 1992J и ингибирует осуществляемый им гидролиз АТФ [Rasi-Caidogno et al., 1995]. Са-АТФазы обладают большей чувствительностью к LaJ+, чем Mgi+-AT®a3a [Robinson et а!., 1988]. Грэф и Веллер при анализе работы Са-АТФазы плазмалеммы листьев Commeltna communis показали, что лантан специфично ингибирует транспорт ионов Cai+ [Graf, Weiler, 1989). Активный транспорт ионов Са обладал чувствительностью к ингибиторам мембраносвязанных АТФаз - ИазУСЦ ДЭС и ДЦКД (рис.б.в). Ортованадат (0,1 мМ) тормозил транспорт Саг* на 90%, ДЭС (50 мкМ) - на 80 %. Известно, что ДЦКД является эффективным ингибитором протонных АТФаз [Solioz, 1984]. Однако, имеются сведения, что и Са/Н-обменник подавляется ДЦКД и La3+ [Schumaker, Sze, 1989]. В работе Гванини и сотр. было показано, что ДЦКД подавлял (на 50%) накопление 45Са везикулами плазмалеммы клеток корня красной свеклы [Giannini et at., 1987]. В работе Пикка и Рэккера [Pick, Racker, 1979] было показано торможение АТФ-зависимого поглощения ионов Са*+, обусловленное работой Са-АТФазы саркоплазм этического ретнкулума в присутствии ДЦКД- Механизм ингибирования транспорта неизвестен, но можно предположить, что в состав Са-АТФазы входит Са-канал. Возможно, мишенью действия ДЦКД, который в наших опытах на 70% уменьшал АТФ-зависимое накопление Са1+ (рис.б.в), являлся трансмембранный канал внутри

6елка Са-АТФазы. Можно видеть (рис.6,г), что добавление в ереду инкубации везюсул ионов Со3* и Ag+ в концентрации 10 мкМ угнетало процесс активного транспорта кальция на 60% и 70%, .соответственно. Блокатор Са-каналов верапамил не оказывал влияния на активный транспорт Са'+ (рис.б,г). Таким образом, АТФ-зависимый транспорт ионов Са1+. через мембрану везикул плазм ал ем мы из клеток колеоптилей кукурузы обусловлен работой Са-АТФазы и, что процессы АТФ-завнсимого и пассивного мембранного транспорта кальция в данной модели разобщены. Выводы

1. Впервые с использованием Са-чувствнтельных флуоресцентных зондов на везикулах плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы и пшенницы установлено функционирование потенциал-зависимых Са-каналов и Са-АТФаз, обеспечивающих пассивный и активный мембранный транспорт ионов Са^*.

2. АТФ-зависнмое накопление ионов Caí* везикулами плазмалеммы подавлялось ортованадатом натрия (0,1 мМ) на 90%, диэтилстильбестролом (50 мкМ) - на 80% и днциклогексилкарбоднимидом (50 мкМ) на 70%. Ионы Со'*, Ag* н La1* в концентрации 10 мкМ угнетали активный транспорт кальция на 60%; 70% и 90%, соответственно. Верапамил (30 мкМ) не влиял на АТФ-зависимый транспорт ионов Саз*. <

3. Пассивная кальциевая проницаемость везикул плазмалеммы зависела от величины мембранного потенциала и была максимальной в области -60 мВ, что соответствует деполяризованному состоянию клеток. Блокаторы потен-циалзависнмых Са-каналов верапамил и лидоканн в концентрации 50 мкМ на 30-50% подавляли потенциал зависимый транспорт ионов Caí+ в везикулы плазмалеммы.

4. И УК в концентрации 5 мкМ на 22-25 % повышала пассивную ионную проницаемость везикул плазмалеммы нз клеток колеоптилей кукурузы. ^

5. Гадолиний (блокатор механочувсгвительных каналов) в концентрации 10 мкМ подавлял пассивную ноннную проницаемость везикул плазмалеммы колеоптилей кукурузы на 17-22 %.

-216. Предполагается, что система пассивного транспорта ионов кальция в плазмалемме клеток колеоптнлей кукурузы представлена потенциалзависи-мымн Са-каналами, аналогичными потенциалзависимым Са-каналам Ь-тнпа животных клеток, рецепторуправляеми Са-каналамии и механочувствитель-ными Са-каналами. '

* * г

Список работ* опубликованных по теме диссертации:

]. Мошков А. В. Влияние трансмембранного потенциала на кальциевую про-ницаемрсть везикул плазматической мембраны из клеток колеоптнлей кукурузы И III Съезд Всесоюзного общества физиологов растений. 1993 г., С.Петербург. С. 168.

2. Юрконене C.B., Батов А.Ю., Маркова И.В., Мошков A.B., Максимов Г.Б. Спектрофлуориметрнческий анализ транспорта CaJ* через плазматическую мембрану in vitro // Ш Съезд Всесоюзного общества физиологов растений. 1993 г., С.-Петербург. С, 240.

3. Медведев С.С., БатовА.Ю., Мошков A.B., Маркова И.В. Участие Ca-каналов плазм алеммы клеток высших растений в кальциевом гомеостазе // Второй Съезд украинского Общества физиологов растений. Киев, 1993. T. I. С. 150,

4. Moshkov А.V., Batov A.Y. Use of fluorescent probes to study the calcium ions transport across Plasmalemms. / Abstr.9th Congr. FESPP // Biología plant arum. 1994. V.36 (suppl), P.224.

5. Батов А.Ю., Юрконене C.B., Маркова И.В., Мошков A.B., Медведев С.С., Максимов Г.Б., Определение содержания ионов кальция с помощью флуоресцентного зонда Индо-1 в везикулах плазмалеммы, выделенных из растительных клеток// Физнол.растений. 1995. Т.42. Вып.1. С. 144-148.

6. Маркова И.В., Батов А.Ю., Мошков A.B., Максимов Г.Б., Медведев С.С. Кальций-транспортирующие системы плазм алем мы колеоптнлей кукурузы// Физиология растений. 1995. Т. 42. Вып. 2. С. 262-267.

-227, Markova I.V., Batov A.Y., Moshkov A.V., Medvedev S.S. Calcium transport through the plasmalemma of maize coleoptile cells // Proceedings of International Symposium on Plant Membane Biology 1994, Lund, P23,

8. Markova I.V., Batov A.Y., Katrichenko M.I., Moshkov A.V., Medvedev S.S. Participation of Ca-channels and Ca-ATPases in creating of polar calcium fluxes in plants it 10th International Workshop on Plant Membrane Biology. 1995, Regensburg. P 62.

9. Batov A.Y., Markova I.V., Moshkov A. V., Medvedev S.S. Ca-channels and Ca-ATPases are two membrane transport mechanisms involved into the hormone action / Proc.lOth FESPP Congress // Plant Physiology and Biochemistry 1996. Special issue. P, 173.

Подписано к печати 20.02,97 . Заказ 46 Тираж 100 Объем 1,25 п.л.. ЦОП СПГУ. 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова,6.