Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрофизиологические ауксинзависимые реакции клеток колекоптилей кукурузы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Электрофизиологические ауксинзависимые реакции клеток колекоптилей кукурузы"

ЛЕНИНГРАДСКИЙ

ОРДЕНА ЛЕНИНА. И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО SBáKSEZ ГОСУДШГШЕНШЯ УНИНЕРСШЗТ

На ггр^ет. ртлслгоп

ШШЮВА марзя Федоровна

ЭЛЕ5Т?05ЙЗЙ010ГЯЧЕСКЯВ МЛШВШХЯВШ РЕАКШИ КЛЕТОК КСШ01ШШЕЯ ШлШ2Ы

'i Е Т О ? S 5 3 Р I ?

дассэр?адяи sa сопс'СЕнпе ученой стэпанг яагдздата бзологическгх лаут:

Лешигрзд- ISB0

Работа выполнена на кафедре физиологщ и биохимии' растений. Ленинградского государственного университета. .

Научный руководитель: доктор биологических наук

" • , профессор B.B. ПОЛЕВОЙ

Официальные оппоненты,'. доктор биологических наук

профессор Г.Б. МАКСИМОВ

кандидат биологических наук H.H., ЕГОРОВА

Ведущее учреждение: 'Агрошизическит; научно-исследовательский институт

;татут j

»80« ф^глф/

Защита состоится 1990 г

на заседании Спедаализиров.ашого-с<эвета--К-.*063.- 57.12 но присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Ленинградском государственном университете по адресу:

199034 Ленинград , Университетская наб., 7/9, биоаого-почвенкш! фшсультет ЛГУ.

О диссертацией модно ознакомиться в аиодиотеке шл. Горького Ленинградского университета. "

»//» Шеф

Автореферат разослан "«г? " ил/^^и^ 13Э0 г.

Ученый секретарь Специализированного.совета кандидат, биологических наук

И.В. Евдокимова

Актуальность проблемы. Из всего спектра реакций растительных клеток в ответ на гормональное ауксиновое воздействие э последнее время все большее внимание уделяется изучению его действия на процессы, связанные с функциональной активностью мембран.

Хорошо известно, что ауксин вызывает развитие позитивацш тканевого и гиперполяризации мембранного потенциалов. Считается доказанным, что изменения электрофизиологических параметров клеток и тканей непосредственно связаны с ауксин-индуцированной активацией работы Н^помпы, локализованной на плазмалемме. Изучение динамики ионных потоков через плазмалемму в такой сложной . системе как растительная ткань весьма затруднительно, поэтому в последнее время все чаще используют.модельные системы для изучения влияния гормонов на активный и пассивный транспорт ионов.

К настоящему времени имеются многочисленные свидетельства об участии в ИУК-индуцированных реакциях растительных клеток ионов проявляющееся как на уровне транспорта гормона по растению, так и непосредственно в механизме его действия.

Несмотря на длительную историю изучения, до сих пор не получено однозначного ответа, какие механизмы участвуют в первичных ответах растительных клеток на ауксиновое воздействие. ¡Имеется очень мало работ, в которых бы проводилось сравнительное изучение ИУК-индуцированных электрофизиологических реакций,, изменений динамики ионных потоков на тканевом и меш5ранном уровне, Еюгочая использование модельных систем.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы было изучение электрофизиологических реакций растительных меток на воздействие ауксина. В связи с этим поставлены следующие задачи: I) исследовать причины возникновения первичных этапов ИУК-индуциро-ванной биоэлектрической реакции отрезков колеоптилей кукурузы; 2) изучить в сравнительном аспекте ИУК-завксимые изменения тканевого потенциала и динамики выделения и поглощения ионов К+, Н*, Са2+, С1~ отрезками катеоптшгей кукурузы; 3) изучить влияние ИУК Шнную проницаемость мембран и.АЗФ-зависжый транспорт ионов водорода в модельной системе везикул плазмалемш клеток кодеопти-лей кукурузы.

"Сокращения, принятые в работе. БШ - биоэлектрический- тканевой потенциал; БЭР Ц биоалектричесзкая реакция; ИУК - индолил-3-уксусная кислота; ®К - нафтилфталамовая кислота; ЭДТА - этилен диаминтетра уксусная кисхлота......

Новизна и научно-тгоаатическое значение работы. В работе впервые проведено сравнительное изучение динамики ИУК-индуциро-ванного изменения ЕТП и поглощения и выделения ионов. Впервые продемонстрировано ИУК-ивдущруеыое поглощение кальция в ответ на действие ауксина на апикальный конец колеоптиля кукурузы, соответствующе первичной (2 мин) негативации тканевого потенциала. Показано на модельной системе, представленной замкнутыми везикулами плазмалеммы из клеток колеоптилей кукурузы с помощью дотенцаалчувствительного зонда ck^-Cg-(5), что ИУК индуцирует калиевую проницаемость плазмалеммы. Впервые разработана система оценки изменения внуТривезикулярного рН с помощью рН-зависимого . зонда' ИТС дня растительных клеток. Показано усиление проницаемости плазмалешы для протона при действии ИУК, что снижало величину обеих составляющих электрохимического потенциала, генерируемого при АТФ-зазисмком транспорте протонов. Введение в модельную систему везикул плазмалешы белков, обладающих высоким сродством к ЙУК, из колеоптилей кукурузы, усиливает, действие ИУК на проницаемость мембран везикул плазмалешы для протона. Впервые проведено- сравнительное изучение содержания эндогенного ауксина, транспорта гормона, ростовых.и биоэлектрических реакций, индуцированных ауксином у отрезков колеоптилей кукурузы и 2-х зон ме-зокоталей, в зависимости от присутствия проводящей системы. Работа вносит вклад в углубление представлений о мембранном механизме действия ауксина. В ходе работы один из методов (регистрация тканевого потенциала) бил применен -для тестирования ток. ,14-настп загрязнений, присутствующих в водной среде (Заявка на .:зо-бретениэ "Способ оценки токсичности жидкостей" 4858551/26 86Э50. • от 10 августа 1990).

Аптюбастя работы. .Материалы диссертации доложены на школе молодых ученых "Биомембраны-89", Звенигород, 1989; на Всесоюзной конференции "Физиолого-генетнческие аспекты минерального питания растений", Киев, 4-9 июня 1990; на 2-м Всесоюзном съезде физиологов растений, ¿атак, 23-27 сентября 1990.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит.из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключений и выводов. Список литературы включает 188 наименований. Работа изложена на IS4 станицах, содержит • 34 рисунка и. 2 таблицы.

- 3 -

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали проростки кукурузы 0десская-80, вы- '-...-ращиваемне 4 суток в темноте при 27° С. Измерение продольного БШ между концами 20-шл отрезка колеоптиля кукурузы, ш мезо-котшш проводилось в специальной камере'(из трех ячеек) с помощью неполяризующихся хлорсеребряных электродов типа ЭВЛ-IM и усилителя постоянного тока pH-34Q. Контакт электродов с инкубационной средой производился'через стеклянные капилляры, заполненные агаром, приготовленном на 0,1 "Л KCl и переходные муфты с 0,1 М KCli Измеряющий электрод всегда находился у конца отрезка, на который оказывалось воздействие ауксина. Изоляция;концов отрезка осуществлялась с помощью капли ланолина с вазелиновым маслом в'полости колеоптиля и капля вазелинового масла в полости мезонотнля, лишенного проводящего пучка. .

Концентрация ионов а инкубационной среде у апикального-кон-, ца 13-мм отрезков колеоптилей кукурузы (40 отрезков на 4 шг среды) определялась потенцнометрическим методом с использованием стеклянных Н4"- и КГ1", мембранного Са2+- и хлорсеребряного селективных электродов. Активная поверхность электродов 2,5-3 ым в диаметре. В качестве электрода сравнения использовали хлорсереб-■ряный электрод типа ЭМ-1ы, контакт которого осуществлялся через электролитический мостик (стеклянный капилляр, заполненный 2-% агаром, приготовленным на 0,1 KOI).

Мембранную' оракцио, обогащенную' (Г-рашентами плазмалеммы.по-' лучала-.' дий^еренциальнш ^атрибутированием с очисткой в градиенте плотности' сахарозы по методу Леонарда и Ходаеса с модификациями (Йнге-Зечтомова и др., 1987).. Все процедуры проводили в хо- . лодкой комнате при температуре 6- +до3^ва$и изучения транспорта ионов на мембранах полученных зезикули градиенты концентраций ионов с помощью осмотического пока сахарозы.и дополнительного пе-реосаядения при 995Q0 в течение I ч. Аналогично осуществлялась нагрузка везикул з зависимости от цели эксперимента.флуоресцент- . ным зондом PITC, ИУК, индолом, А1® и AI»®. Полученный осадок ре-суспендировали в среде-переосааденая. Часть ресуспендата использовала для работы с флуоресцентными зондами, другую - для определения АТ5азной активности. Активность фермента определяли по количеству неорганического фосфора, отщепленного от АТФ'за ед. времени. .;.,;.

Проницаемость мембран везикул плазмадеммы и возможность генерации трансмембранного потенциала изучали спектрофлуориыетри-ческг с помощью потенциалчувствительного положительно1 зарязен-кого карбоцпанпнового зонда (3,3-дипропил-2,2-тиоди-

карбоцзанин иодид) при /возС<=570, А ^ =668 нм (Йнге-Вечтомова и др.-, 1586). Для определения изменения рН внутри везикул разработана система с использованием рН-эависимого зонда IIТС - флуо-ресцеинизоционат, присоединенного в "молекуле декстрана при /}„ б=480, Л'^520 нм. Интенсивность флуоресценции зондов измеряв на флуориметре (Вкхвалов ц др., 1982). Измерения проводила з кБэрцззой кювете (объем 0,3 т) под углом 90° к напразле-ше возбужденного света.

Белка, специфичные к ЛУК, получала методом аффинной хрома-тографяг на колонке с эпоксиактизированноц 3,5-даЁодсададило-г-й золотой сефарозы 6 3, по методике Тадпесера л сотрудников с модифлкашшми ( Таррезеъ Л а£ , 1981).

Определение содержания эндогенного ауксина проводили по методу' твердофазного ашуноферменгного анализа (Кудоярова я др.,

Изучение транспорта ЛУК.по'отрезкам растительных тканей про-вохш1 с -помощью 14С-ИУК,- Щ!',:з1шкальный конец отрезка накосили блок, содержащий

и через 40 глин ■ (колготили) л дзет -(мазокотали) определялось содерганае 14С -И7К по сег-

Все опкты проводили 5-10 раз, в 3-5 повторностях. Ег -рафиках и тайлипахцризедены средние ари^тнчесние значения е.лгчин и озшбкя среднего арифметического. На графиках представлены значения опытных величин, из которых вычтены изменения контрольных В работе сбсузщаются различия, достоверные при 95 % уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И СБСШЕНИЕ

И7?^:н~1т1ГРованЕая первичная нэгативапия;. зканавогр потеншг-зла. Дооаэденке ЯУК к апикальному концу отрезка кодеоптиря кукурузы вызывает волнообразное изменение разности электрических потенциалов между Физиологически верхним (апикальным) и нианш

- b

80

Рис. I- ЗУК-зависимая БЭР отрезков колеоптютей кукурузы. Отрезка 2 ч предобрабатывали: I - дастмвшоованной водой; 2 и 4 - растворами СаС19, Ю-11 М; 3 - MgCI?; М-5 М. Ьвоздействие: 1,2 и 3 -2 ьт/л; 4 - ИУК + -Э^ТЛIО-3 ?,!.

!

ЛИ

ij

-Ш

г^-лч- //Г

Лг/

¡г г « <

Lr*

о 20 4? io «л

о ■ го нз £ti ssmk

2Л kO SO SO

?яс, 2. Влияние ионов Са~+, Mq^IT, FT*", t(а"1 на ИУК-зависимую ЧЗР отрезков кояеоптилей кукуруз*., А: отрезки предобрабатывали: I и 3 - I^O, дистиллированная; 2 и 4 - раствором СаС12 10"° М; t- воздействие: 3 и 4 -H7KJ2 кг/л); 1,2 - ИУК 1- daCIg

М; Б - отрезки предобрабатывали 1,3,3 - Н20; 2 и 4 - MgCI2, 1СГ3 м, § - воздзйствиэ: Х^ы 3 - НТК ; 2 и 4 - Ш ч MqGIg, Ю-3 М; Б - воздействие: I - ЕГК + КСХ, 1СГ3 U, 2 - ИУК, ? - ИУК * /VaCI, 10-2,..4 „ bjyj, ^ У^т

приводило к уменьшению ИУК-индуцированного поглощения кальция и возникновению лаг-периода в выделении ионов К* (рис. 2Е). Ионы С1~ при"этом начали поглощаться растительными тканями. (5-10 глин).

Полученные наш и приведеннш в литературе сведения позволяют предложить следующий механизм действия ИУК. Ионы Са2+, с связываясь с отрицательно заряженными фосфолшщцаш мембран,

поддерживая ее структурную целостность резко снижает пассивную проницаемость плазмалешы, ИУК, взаимодействуя с компонентами мембран, меняет их электретеские характеристики, повышая проницаемость (Манусадданас, Воробьев," 1985.;Ляднженская, Кораб-лева, 1985). ИУК снилает количество связанного с мембранами кальция ( ñudebaut et а£ , 1981). :-то ведет к деполяризации мекб-ранного потенциала и открытию калиевых каналов. В дальнейшем НТК и Са2+ могут индуцировать открытие калиевых каналов и выход калия из клеток, с которым, по-видимому, связано развитие позити-зации БТП в условиях предобработки отрезков дистиллированной водой.

Следовательно, ИУК-ицдуцироваянзя негативация БТП является первичной физиологической реакцией метки на гормональное воздействие и опосредована проникновением в клетку EV совместно с ИУК и ионов

ИУК-индуцированная позитивация тканевого потенциала, связана с активацией работы Н^-пошы, с транспортом протонов из растительных клеток (Полевой и др., .гS89, Бумагина, т285). Ранее было показано, что интенсивность закисления инкубационной среды отрезками растительных тканей, индуцированного ИУК, зависит от присутствия в среде ионов калия и кальция. Показано, что введение в инкубационную среду у апикального конца отрезка KCI приводит к снижению амплитуды позитивации, усиливающемуся с повышением концентрации KCI. Ионы На+ ни в одной из использованных налог концентраций ХО-^ М) влияния на величину позитивации

не оказывали. Полученные результаты согласуются с точной зрения о существовании HVk* обмена, снижающего электрогенность работы' ЕТ^-помпЫ. . ' „

Прямо .противоположное действие оказывают ионы Сал'"г на Независимую позитивации БТП. Предобработка растительных тканей 2 ч раствором CaCI? (1(Г3 М) вызывала 3-х кратное увеличение амплитуды позитивации. Данный эффект устраняется внесением в среду

s?

*л

*

т. , «а

Ч.....-Г

Ott

60 80,

flf/ jv r

£

<5 f.D.

a V

ifl 52

Ц8 tf «fi

+

•t

<3

1,0. 0.3.

4

г

К

1У ч 1

11 ___11 NC

Лг-

0- АО SO

pü

5,2 .

Рйб. 3. Вляянив ИУК, .2 мг/л ца содержание ионов Са^, К4", Gl",

г *

3 инкубационной среде у апикального конца отрезков колеоптилей кукурузы. Состав среди: А - CaCi2, 1СГ3 И, KCl, Ю-4 М; Б - СаС12, tiT4 KCl 1СГ3 у. .

N8

а

•ш •ш

г»

за

f

—I к /К ч- ш-i

Йс. 4. Влияние ионов калия на ИУК-зависимую БЭР отрезков колеоптилей кукурузы, '♦-внесение . в'среду: I - ffift,' 2 *4г/л:+ KCl, • 10П М; 2 - ИУК; 3 - ИУК + KCl, 1СГ3 М; 4 - ИУК + KCl, 1СГ2 М.

Г

/К-иТ-*--

о 20 40 60 Юм*

\

' л

- 9 -

. ЭДТА (рис. 2). Ионы М<^2+ не оказывают влияния на величину йозктй- ' , вации и задерживайг ее развитие.

Можно. предположить несколько возмЬж^ых вариантов влияния Са2+ на ИУК-индуцированную позитивади? БТЙ: I - путем.снижения пассивной проницаемости, а следовательно, увеличении электрогенности работа" Н^-насоса; 2 - ЙУК-индуцированнсэ повышение'Концентрации . калыщя'В цитозоле непосредственно влияет на самые разнообразнее клеточные процессы. Например, образование Са2+-кальмодуйикового ¿омплека, повидимрму,. ведет к изменению активности ряда фёрментов. в том.числе и протеинкиназ, которые в сваю очередь, меняя уровень, фосгбориллирования суб*ьединиц, оказывают влияние на интенсивность работы Н^-АЙазы, локализованной йа^плазмалемме. ,

Изучение действия ИУК на транспорт ионов терез плазмал'ёмму везикул плазмалвшн клеток кодеоптзьдей кукурузы. Для изучения па- • ссивных и активных механизмов транспорта иоёов через плазмалемму в последнее время все чаще используют модельные системы. Наш' использовались шгатно заг.ткнутые везикулы ш&змалемш из клеток килеоптилей кукурузы, на мембранах которых предварительно создавали ^-диффузионный потенциал в присутствии валиношшина. Изда-■' нение флуоресценции зонда -Сд-(5) при внесении в реакционную среду Мо и АТФ свидетельствует о существовании АТФ-'заввсимого транспорта ионов у инвертированных везикул плазмалейады (рис. 5А). Аналогичная: реакция наблюдалась и у йормально ориентированных везикул, внутри которых находилась АТФ, запуск резкиии осуществлялся ионаяи Мд2+, транспорт которых внутрь везикул бал опосредован введение ионофора А-23187 5 инкубавдонйую среду.

Показано, что введение в реакционйую среду о. инвортированн^ т везикулами шгазыалекиы НТК вызывает тушение флуоресценции зонда, следовательно-индуцирует создайте на майоране везикул плаз-малешы потенциала. Последующее снижение флуоресцентного ответй на введение в реакциойную среду вадашоиищша, по^йидщкиу, указывает ¿а ЮТ-индуцированную кэдвявуа проницаемость неыбрвв. веди-кул шгазиалесты. Индол аналогичного действия не оказывал.

Рассматривая действие И7К на АТФ-зависиннй транспорт ионов ■ через мдабрану везикул плазкалэммы,, следует отметить, что она ушнйпает амплитуду флУорэсцйнтного ответа зонда на добавление М^2+ :и АТФ в реакционную сред? с ИЕВертзфованнши Евзикулаш.

Рис. 5. Действие ЯУК (Ю-6 М) на транспорт катионов через мембрану инвертированных (А) и нормально ориентированных (Б) везикул плазмалеммы клеток колеоптллей кукурузы по изменении шдуоресцен- . ции потанциалчувствитвльного зовда Сд-(5). } - Вве-

дение в реакционную среду: А - X: з - ИУК; I - индол; У - I и 2 -% 3 - АТФ; 4 - АН®. Внутривезикулярная сред!:" содержала: Б.'- 5- -АМФ; 3 - АТФ; I - И7К + АТФ, везикулы предобработаны СаС^, 2 -ин-ДРл + АТФ, 4 - ИУК + АТФ. Использованы концентрации: ИУК, индол - ТО"6 М; АТФ, АМФ, Мд 5" 04 - 3 мМ.

Аналогичная реакция наблюдалась и при исследовании транспорта ионов у нормально ориентированных везикул плазмалеммы. Можно предположить , что ИУК индуцирует противонаправленный по отношению к -активному поток положительно заряженного иона, вероятно цротона, что приводит к снижению электрогенности АТФ-зависимого транспорта ионов. То есть можно предположить, что ИУК индуцирует усиление пассивной проницаемости плазмалеммы. Следовательно, введение в систему вещества, снижающего пассивную проницаемость мембран, приведет к предотвращению действия ИУК. В качестве такого агента наш были использованы ионы Са^+. На рис. 5А показано, что пред-

л

Рис.6. Действие ЯУК (1СГ° М) на транспорт протоков парез ну инвГзтарозанянз (А) и нереально ор-хеттнрозанных (Б) везикул пдагиалемаи клеток колеоптялей кукурузы по изменению флуоресценции рВ-зависигйого внутризезгкузягойого зонда FITO. I - Ззеденле з реакционную среду А: X - 2 - НТК; 4 - икдол; У - 2,3,4 - ffi, I - АШ. Б ~ внутри везикул: I - АТФ + ЙУК, везккуж прздобра-ботаны GaCIo; 2 - АТФ + лцпол; 3 - АТФ; : - АТФ + ЙУК: 5 - АМФ. Концентрации аналогична указанным на рис. 5..

обработка везикул раствором хлорида кальпия дагогозтелько лрзво -лит гс вое становлении исходной акшгатуцн г^луорескэнтного ответа зонда.

Снятие генерированного работой fF-АТФазы потенциала внесением в реакционную среду протонойюра - йЩ1 может служить косвенным доказательством существования АТФ-зависииого транспорта протоков. Для прямого доказательства данного прэяпояожеяия сб участии транспорта протонов в исследуемых нам:; реакциях, -гак" "бь-.г? разработана модельная система оценки изменения внутривезшеуляряо-го рН с помощью рН-зависямого зонда FITC, 'Ьлуоресценстт. ютрреге прямо пропорциональна величине рН. На ряс. 6А показано, что внесение и АТФ в реакционную среду с инвертированными везикула ш плазмалешн приводит к уменьшению свечения зонда, что ссстзе-.'-

' -12-

• » \

ствует закисданию вцутривезикулярного пространства. Данная реакция не' наблюдалась при внесении и АЩ. Прямо противоположное изменение флуоресценции зонда наблюдали у нормально ориенти-.роваЕных везикул плазмалеммн, через мембраны которых осуществлялся противонаправленный транспорт протонов. Введение в систему ИУК рак нормально ориентированных, так и инвертированных везикул шгазмздемыы уменьшало амплитуду изменения флуоресценции зонда ИТС, наблюдаемой в результате АТФ-зависшого транспорта протонов. Наблюдаемый зффект можно, повидимому, объяснить возникновением противонаправленного активному транспорта протонов, связанного с перемещением WS.. Предобработка везикул раствором СаС12 , 10"^ М,приводила к устранению "протонофор-подобного" действия ИУК.

В процессе! получения везикул неизбежно происходит нарушение натизноуо состояния^ мембран. По-видимому, этим можно объяснить не-обнаруданшз нами прямого активирующего действия ИУК на интенсивность АТФ-зависимого транспорта протонов. Для приближения системы к исходному состоянии, наш была предпринята попытка выделения с помощь® аффинной хроматографии и последующего введения в модельную систему везикул плазмалацмы бзлков:-, обладающих высоким сэд-ством к ИУК. Сложный характер изменения Флуоресценции потенциал-чувствительного зонда dlS -Сд-(5) при введении данных белков в реакционную среду с инвертированными везикулами плазмалеммн свидетельствовал, на наш взгляд, о взаимодействии белков с компонентами мембран. Однако, присутствие указанных белков лишь ус-лвало "протонофорподобное" действие ИУК , что позволяет сделать зед-аодояение, что полуденные наш баса облегчают перемещение ИУК через мембрану ' плазмалещы.

Вторичная негзтлвадкя тканевого потенциала отрезков колеоп-таяей кукурузы. Считалось, что реверсия БТП к исходному зг- ?киз непосредственно связана со способностью отрезков к росту, так как ' она отсутствовала у "старых" отрезков и в случае предобработки роотцодаадяющими ; концентрациями маннита (Штальберг, 1970) Полевой, 1286).

fia рис. 6А показано, что реверсия Ш к исходному значению отсутствует такае и при нанесении ИУК на базальный конец .отрезку. Ногно предположить, что втор§чная негативапия связана со способностью гормона перемещаться в базипетальном направлении.

мд

-¡о

а--Ю -20-

о 20 40 60 80 ««*

,ч£

я-о--я-•20-

0 20 40 50 $0 »ам

нб

го-

ю. о-.10-

л& О .

-20

м8

о

-20; •10-

коАёоптшл

*тчок

О 20 40 60 80

мезоко/тль ты 6 г

20 ЦО 60 30 мин

мтколгтыоныЬ д

* пучок

„А

-лучок

о 20 40 ВО 80

Рис. 7. Влияние ИУК, 2 мг/л на БЭР отрезков колеоптилеЙ А,Б,В, и мезокотилей Г,Д проростков кукурузы. А - нанесение НТК на: I - базалзннй конец; 2 - на апикальный конец отрезка; Б'- от-'р-ззки предобрабатывали I - СаС12, Ю-4?,! + НФК, 2 мг/л; 2 -СаСЛ^, 3 ч. В: отрезки I - натнзаных колеоптилей; 2 - лишенных проводящих пучков., Г - мезокотилей прилежащих к узлу.: I - натившх; 2 — лишенных проводящего пучка; Д - мезокотиля, прилежащего к зерновке: I - нативного;,2 - без проводящего пучка.

Ч

Данное предположение подтверждается отсутствием третьей фазы ЙУК-индуцированной БЭР у отрезков колеоптилей, предобработанных 3 ч раствором ингибитора полярного транспорта ауксина - нафтилс&тала-мбвой килотой, 2 мг/л (рис. 6Б). • .

Известно, что все клетки колеоптаяей кукурузы способны как к ауксин-индуцированному росту - физиологическому ответу на гормональное воздействие, и к транспорту ИУК. Нами была предпринята попытка разделения, двух Зтих процессов. Б мезокотиле проростка кукурузы транспорт гормона осуществляется по живым клеткам проводящих пучков, следовательно, удаление проводящей системы приведет к снижению интенсивности■или полному отсутствию транспорта • ИУК. Кроме того, нами были выбраны две зонн мезокотиля: прилежащая к узлу, кедицфареншрованная и прилежащая к зерновке (В, рис. 7Д), дифференцированная.

На рис. 6В показано, что у отрезков колеоптилей кукурузы удаление проводящих пучков, несколько снижающее ИУК-индуцированный рост, в 2-раза снижающее содержание эндогенного гормона и не. влияющее Еатранспорт 14С-ИУК, не меняет ИУК-индуцированнок БЭР. • У мезокотилей, прилежащих к узлу (зона Б на рис. 7Г).удаление ' проводящего пучка, снижающего ИУК-индуцированный рост, содержание эндогенного фитогормойа и скорость транспорта /Цз-ИУК, также не оказывало значительного влияния на общий характер ЙУК-за-висимой БЭР. Удаление проводящего пучка из мезокотилей, прглежа-'щях к зерновке, зоны, не способной, к ИУК-ин^уцированкому росту, резко снижало содержание эндогенного ауксинад понизало скорость транспорта ^С-ИУК до'уровня дайфузии. 'Нанесение ОТ. на апикальный конец таких отрезков вызывало развитие только первичной не-гативации БТП (рис. 6Д). • ' • / '• - -

Предполагается',, что ИУК, обладая способностью к полярному перемещению в базипетальном направлении, способна.вызывать последовательно изменение величины тканевого потенциала у каждого нижележащего слоя клеток, что ведет к негативации участка, ИУК-индущфованная реакция в клетках которого ужэ завершилась, по с сравнении с участками, реагирующими на гормональное воздействие.

- 15: -ВЫВОДЫ..

1. Односторонняя обработка отрезков колеоптилей кукурузы ИУК

(2 мг/л) индуцирует развитие биоэлектрической реакции (БЭР), состоящей из трех фаз: немедленной негатизации, позитивации и реверсии тканевого потенциала. Для индукции ваяны тканевого потенциала достаточна импульсная 30-секундная обработка ИУК (100'мг/л) апикального конца отрезка.

2. Первичная ИУК-завясимая негативадая тканевого потенциала отрезков колеоптилей отсутствует или слабо выражена н случае предобработки отрезков дистиллированой В>0, при действии

на растительные ткани'хелатора двухвалентных ионов ЭДТА (Ю М) или тритона Х-100 ). Одним из механизмов действия кальция на первичную ИУК-зависимую вегативацию БТП является снижение пассивной проницаемости мембран в присутствии экзогенного кальция.

3. Внесение ИУК, 2 мг/л в инкубационную среду состава: СаЙ2 10~®М и КС1 вызывает немедленное поглощение отрезками ионов Са2+ и Н*, выделение К+. В среде: СаС^ КС1 10~®М наблюдалось снижение ИУК-индуцированного поглощения кальция и появление 2-х минутного лаг-периода в выделении калия. Таким образом, первичная ауксин-зависимая электроне-гативация может быть обусловлена проникновением в клетку Н* вместе с ИУК и ионов Са .

4. Амплитуда второй ¿азы ИУК-индуцированной БЗР - электропози-тивация БТП отрезков колеоптилей снижается в присутствии в инкубационной среде ионов К1", что указывает на существование К+/Н+-обмена, снижающего аяектрогенность выделения протонов растительными клетками. Предобработка отрезков раствором хлорида кальция резко усиливает НТК-зависимую позитивацно тканевого потенциала. Действие кальция снижают ЭДТА и тритон Х-100.

5. Взаимодействие ИУК (10~^<1) о мембранами везикул пяаймалеммы из клеток колеоптилей кукурузы приводит к генерации калиевого потенциала, регитрируемого по тушению флуоресценции потенциалчувствительного зонда (Из-с^-^).

6. ИУК способствует увеличению проницаемости мембран везикул плазмалеммы для протонов, что выражается в снижении величин обеих составляющих электрохимического потенциала, генерируе-

шго при АТФ-зависимом транспорте ионов водорода, регистрируемом с помощью зондов di5-c^-(5) и рН-зависимого внутри-везикулярного зонда им.

7« Введение в модельную систему, представленную везикулами плазмалеммы, белков, обладающих высоким сродством к ИУК, показано усиление действия ИУК на транспорт протонов. Эти

. белки, по-видимому, облегчают перенос ИУК через мембраны везикул.

8. Третья фаза ИУК-индуцированной-БЗР отрезков колеоптилей кукурузы связана со способностью ауксина полярно перемещаться по растительным тканям. Реверсия тканевого потенциала отсутствует при нанесении ШК на базальный конец отрезков, при

• обработке тканей ингибитором полярного транспорта ИУК -нзфтилфталамовой кислотой. Удаление проводящего пучка в зоне мезокоткяя,' прилежащего к зерновке, приводит к изменению. ИУК-индуцированной БЭР - отсутствию позитивации.

9. Сравнительный анализ-ИУК-иццуцированных БЗР отрезков колеоп-. тилей кукурузы, динамики поглощения и выделения ионов, АТФ-

' завясшого'транспорта протеков позволяют предположить, что ИУК, взаимодействуя. с мембранами растительных клеток, индуцирует поглощение ионов кальция; проникая в клетку, приводит к открытию калиевых каналов, усиливает пассивную проницаемость плазмалеммы дая протонов. Волнообразный характер изменения тканевого потенциала связан со способ;- оть ауксина к полярному базнпетальному транспорту.

Работы, опубликованные по теме диссертация.

1. Полевой В.В., Синатяна.К.в., Ишврва Сравнительный анализ действия ИУК на биоэлектрогенез у отрезков "олеоптдлей ' я ;лез окотил ей кукурузы // Биоэлектрогенез а мембранный транспорт !у растений. 1989. Горький, Изд-во Горьк. ун-та. С. 16-19. ■!" vV ' ' - - ' :

2. Медведев С.С,, Маркова И.Б., Шашова M.S., Conoi- Т.М. О полином транспорте кальцая в растительных тканях// Зестняк Ленангр. ун-та. 1989. Вып. I. Сер.З. С.79-63,