Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криорезистентность и вопросы консервации растений при низких температурах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Криорезистентность и вопросы консервации растений при низких температурах"

2 го с

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР

6

ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ и кшомщщщны

На правах рукописи

МАНУИЛЬСКИЙ Владимир Дмитриевич

УДК 57.043:581.1

КРИОРЕЗИСШТНОСТЬ И ВОПРОСЫ КОНСЕРВАЦИИ РАСТЕНИЙ ПРИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ

03.00.22 - криобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Харьков - 1989

Работа выполнена в Институте физиологии растений и генетики АН УССР и Институте ботаники им.Н.Г.Холодного АН УССР

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Н.Г.Бакрадзе, г.Тбилиси

доктор биологических наук 0.А.Красавцев, г.Москва

доктор медицинских наук, профессор Е.Я.Панков, г.Харьков

Ведущая организация - Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится "_" _1989 г. в "_" часов

на заседании Специализированного совета Д 016.60.01 при Институте проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (310015, г.Харьков, ул. Переяславская, 23).

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР.

Автореферат разослан "_"__1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

доктор медицинских наук А.Н.Гольцев

БФ - 16776 Зак. 19 1 Формат 60x90 Уч.изд.л.-2,0

Подписано к печати 9.06.89 г. Тираж 100

Полиграфический участок ИТФ АН УССР

Актуальность проблеш. Основной задачей работ, направленных на поддержание генетического разнообразия биосферы на современном этапе является разработка криобиологических методов длительного хранения инициирующих тканей. Для таких целей у растений в первую очередь должны быть использованы семена и вегетативно размножающиеся побеги, которые исходя из особенностей физиолого-биохимичес-кого и генетического строения являются наиболее приемлемыми объектами для осуществления длительного хранения генетических ресурсов растений (Вепринцев, 1984).

Развитие теоретических исследований в этой области связано с выяснением механизмов устойчивости к температурам, при которых проводится криоконсервация, а также с разработкой представлений о возникновении криоповревдений и реабилитацией биологических объектов. По имеющимся в криобиологической литературе представлениям, особенности действия низких температур на биологические объекты описываются несколькими гипотезами, в которых снижение устойчивости к замораживанию-отогреву связывают с эффектами денатурации макромолекул, гиперконцентрацией клеточного содержимого, температурными и осмотическими шоками, а также изменениями липидных и белковых взаимодействий компонентов мембран (Levitt, 1979; lovelock, 1957; Meryman, 1956; Mazur, 1966; Осташко, 1976; Белоус, 1982 и др.). Эти представления в настоящее время успешно развиваются в фундаментальных работах В.И.Грищенко (1987), В.А.Моисеева (1987), В.Й.Лугового (1986), В.А.Бондаренко, Л.Ф.Розанова (1987), Е.А.Гордиенко (1986) и др.

Однако, основная масса работ в области криобиологии описывает процессы, происходящие в тканях животных, специфика которых не позволяет объяснять особенности криоповревдений клеток растений, обладающих значительно большими, чем животные клетки интервалами устойчивости к изменениям оводненности, а также способностью без искусственных воздействий переходить в состояние криобиоза.

Как следует из данных опубликованных в литературе, криоповреж-дения, возникающие при криоконсервации, в большинстве случаев сводятся к процессам льдообразования и мало учитывается криолабиль-ность других клеточных систем. Несмотря на то, что адаптивной мишенью для животных и растительных клеток в формировании процессов устойчивости к низким температурам является мембрана (Крепе, 1981), специфика механизмов устойчивости растительных мембран все еще

требует детального и всестороннего исследования. Это вызвано тем, что у растений невыясненными остаются процессы устойчивости мембран к низкотемпературным стрессам, а также особенности структурно-функциональных изменений этих образований при переходе организмов в состояние криобиоза. Основной сложностью при решении этих вопросов является то, что механизш устойчивости растений в естественных условиях обитания (при температурах не ниже -50°С) не могут быть адекватно перенесены для условий, необходимых для осуществления длительного хранения генетических ресурсов (температуры не выше -120°С). Другой особенностью является то, что растения обладают значительно большими интервалами изменений функциональных состояний и соответственно более глубокими изменениями структурно-функциональной организации мембран, роль которых при формировании состояния криобиоза практически не исследована.

Цель и задача работы. В связи с изложенным выше, целью настоящей работы являлось изучение механизмов структурно-функциональных изменений субклеточных структур, включающих плазмалемму, элементы кортикального слоя цитоплазш, тилакоиды хлоропластов и клеток целых организмов, которые происходят при формировании состояния крио-резистентности (т.е. состояния, предшествующего возникновению устойчивости к низким температурам), а также разработка способов по-шшения криоустойчивости объектов, используешх для длительного хранения генетических ресурсов растений.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать механизш возникновения криоповревдений у различающихся по устойчивости к дегидратации растительных объектов при изменении функциональных состояний и выбрать модели для исследования модификаций мембранных структур при действии низких температур.

2. Установить основные эташ формирования состояния криоре-зистентности у устойчивых к действию низких температур растительных объектов и исследовать роль плазматических мембран в этих процессах.

3. Выявить генерализованные эффекты, возникающие при действии низких температур на криолабильные объекты и установить их принципиальные отличия от криорезистентных форы.

4. Исходя из специфики компенсаторных процессов у различающихся по устойчивости к низким температурам растительных объектов,

исследовать изменения структурообразующих элементов клетки в условиях криостресса и установить характер взаимосвязей мембран с цитоплазмой при возникновении или отсутствии криоповреждений.

5. На основании полученных экспериментальных данных разработать ноше способы криоконсервации растительных объектов, которые позволяют в стабильных условиях осуществлять длительное хранение генетических ресурсов растений.

Научная новизна работы. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция о формировании состояния криорезистентности для растительных организмов. Показано, что развитие состояния криобио-за определяется усилением процессов агрегации компонентов экзо-и эндоплазмы, выполняющих стабилизирующую функцию структурной организации клетки и препятствующих возникновению низкотемпературных стрессов. Предложена экспериментальная модель, позволяющая исследовать модификации плазматических мембран криорезистентных и криолабильных растительных клеток, основанная на эффектах криостресса (исключающая перемещение воды в гидратированных доменах), с помощью которой установлены отличия в топографии структурных и функциональных перестроек у различающихся по устойчивости к низким температурам растительных объектов.

Установлено, что начальными этапами криоповревдений низко-гидратированных тканей при криострессе являются нарушения взаимосвязей плазмалеммы и'клеточной стенки, в результате чего прекращается апопластный- транспорт корневой меристеш.

Впервые показано, что возникающая при небольших отрицательных температурах на поверхности плазмалеммы конденсация осмиофиль-ных компонентов способствует формированию состояния криорезистентности клеток паренхимы. На основании этих эффектов предложен способ пролонгированной субнулевой дегидратации растительных тканей, который позволяет ускорить переход гидратированных объектов в состояние криобиоза.

Показано, что наиболее устойчивыми к низкотемпературным стрессам у высокогидратированных объектов являются ткани, вымораживание воды у которых происходит в небольшом температурном интервале, сдвинутом в сторону низких температур. Обнаружены и изучены явления гистерезиса интенсивности сигнала ЯМР в цикле замо-ракивании-отогрева препаратов растительных мембран, существование которлх свидетельствует о большей лабильности этих структур.

Впервые выделен криолабильный., Са^+-эаЕИСимдй самособирающий-

ся компонент супернатанта (СКС), чувствительность которого к крио-стрессу выражается в перестройке процессов агрегации входящих в него компонентов.

Получены экспериментальные доказательства тому, что возникновение криоповревдений поверхностных структур плазматической мембраны клеток коры древесных в состоянии вынужденного покоя в первую очередь происходят в областях пошшенной подвижности бислоя, которые ассоциированы с фибриллярными элементами цитоскелета.

Разработаны биотехнологии криоконсервации растительных объектов для длительного хранения генетических ресурсов растений, которые защищены авторскими свидетельствами на изобретения СССР.

Исследования низкотемпературных модификаций мембран растительных объектов, отличающихся по уровню содержания воды в тканях, а также по устойчивости к низким температурам, и происходящих при этом процессов агрегации и дисперсии компонентов примембранных слоев цитоплазмы при криострессах положенные в основу концепции формирования состояния криорезистентности растений представляют собой новое направление в криобиологии - криофитофизиологию мембран.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований получены экспериментальные результаты, позволившие сформулировать концепцию о формировании состояния криорезистентности, а также выдвинуть гипотезу о криолабильном домене растительной мембраны, которая позволяет объяснять ранее не известный в криофитофизиологии принцип стабилизации клетки в результате низкотемпературной конденсации на поверхностях мембран цитоплазматических компонентов. Эти представления дополняют теорию криоповреждения и криозащиты биологических систем, обладающих различной устойчивостью к дегидратации. При этом обоснованы основные принципы формирования состояния криобиоза у растений переходящих из одного функционального состояния в другое. Выявленный при полимеризации компонентов супернатанта цитоплазматических мембран комплекс, обладающий одновременно чувствительностью к криострессу и к двувалентным катионам, дал возможность подтвердить общебиологический принцип об общности процессов устойчивости к низким тем- • пературам и объемным изменениям цитоплазмы в результате стрессовых воздействий.

Практическая значимость работы заключается в применении полученных представлений для повышения устойчивости растений к действию низких температур и различного рода стрессовых воздействий. Полученные данные о формировании состояния криорезистентности использованы для разработки биотехнологий криоконсервации растительных объектов с различным уровнем гидратации тканей и положены в основу метода пролонгированной субнулевой дегидратации тканей, защищенного авторскими свидетельствами на изобретения (A.c. СССР № 1243645, 1986, A.c. СССР !,'• 1386653, 1987), которые используются в исследованиях, проводимых во Всесоюзном НИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова, Агрофизическом институте, Институте физиолог;;;; растений и генетики АН УССР, учреждениях Госагропрома УССР и Институте физиологии и биохимии растений АН МССР.

Основные положения выносите на защиту:

1. В отличие от традиционных представлений о механизмах повышения устойчивости растений в естественных условиях обитания, процессы устойчивости к низким температурам, при которых осуществляется криоконсервация генетических ресурсов, обусловлены особым комплексом специализированных реакций, связанных с происходящей при небольших отрицательных температурах конденсацией диффузно расположенных в клетках компонентов. Для проховдения этих реакций необходимо изменить структурно-функциональную организацию клетки таким образом, чтобы миграция и подвижность лабильных доменов мембран и структурных элементов цитоплазмы не претерпевала существенных изменений при криострессах. Одновременно необходимо снизить реактивность организма и создать условия охлавдения, при которых скорости снижения температуры и кинетика изменения влажности объекта соответствовали бы скоростям эндогенных процессов, приводящих к формированию криорезистентности.

2. Устойчивость плазмалеммы клеток паренхимы к криоповревде-ниям и низкотемпературным стрессам, а также стабильность микроокружения мембран формируется при наличии жидкой фазы в клетке. Учитывая большую гетерогенность всей систеш и различную морфологию гидратированных макромолекул в плоскости бислоя, можно предполагать, что эффекта кристаллизации воды, вызывающие дегидратацию мембран, в первую очередь повреждают поверхностные компоненты мембран.

3. Наиболее устойчивой к действию низких температур является растительная клетка, которая в цикле замораживания-отогрева аналогично меристематической имеет сравнительно небольшие изменения объема, а следовательно термодинамически более устойчивые структурные элементы цитоплазмы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации в форме докладов и сообщений были представлены и обсуждены на Международном конгрессе по холоду (Венеция, 1979); П и Ш Мевдународной конференции "Вода и ионы в биологических системах" (Бухарест, 1980, 1984); заседаниях секций Научного совета по криобиологии и криоме-дицине АН УССР (Киев, 1981-1983, Харьков, 1985), УП и УШ Всесоюзных симпозиумах по водному режиму растений (Киев, 1981, Ташкент, 1984); Республиканских конференциях "Электронная микроскопия и вопросы диагностики" (кишинев, 1981, 1986); Всесоюзном совещании по вопросам адаптации древесных к экстремальным условиям среды (Петрозаводск, 1981, 1989); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Европейском криобиологическом обществе (Харьков, 1983) У и У1 Всесоюзных симпозиумах по ультраструктуре растений (Кишинев, 1983, Чернигов, 1989); Европейском конгрессе по электронной микроскопии (будапешт, 1984); II Всесоюзной конференции "Теоретические и прикладные вопросы криобиологии" (Харьков, 1984); Международном совещании ШЕСКО "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины" (Харьков, 1988); ХХУ Юбилейном совещании и симпозиуме "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата" (Болгария, 1988);.Всего по материалам диссертации опубликовано 39 научных работ, получено 2 авторских свидетельства на изобретение СССР.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двенадцати глав, заключения и выводов. Работа изложена на 226 страницах машинописи, иллюстрировала 42 рисунками, 2 схемами, 31 таблицей и содержит 26 страниц приложения. Библиография включает 410 источников.

Материалы и метода исследования. Для исследования механизмов формирования криорезистентности и выяснения возможности криокон-сервации были использованы ткани и клетки 35 видов растений. Из них для детальных исследований модельными объектами были выбраны:

I. Меристеш зародышевой оси фасоли (сорт Белозерная), обладающие при 12% влажности тканей устойчивостью к действию низких температур (выраженная криорезистенгность). Эти ткани имеют низку

фосфолипазную активность, что позволяет существенно снизить неспецифическую деградацию фосфолипидов на начальных этапах криодест-рукции. В этой группе объектов исследовалась также пыльца кукурузы (сорт Днепровская 270 МВ).

2. Клетки первичной кора побегов яблони (сорт Кальвиль снежный) , способные формировать устойчивость к низким температурам (индуцированная криорезистентность). В ряде случаев для сравнения использовали ткани других зимующих древесных.

3. Паренхимы листьев озимой пшеница (сорт Киянка), не обладающие способностью формировать состояние криорезистентности (криолабильные объекты).

Криоконсервация семян осуществлялась в сосудах Дьюара емкостью от 30 до 200 литров в пластмассовых и алюминиевых контейнерах при -196°С. Замораживание проводили со скоростью 1-0.5°С мин-* в парах жидкого азота, при помощи программного замораживателя, изготовленного 0ЭП Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР. Стрессовые режимы замораживания-отогрева создавали замораживанием со скоростью около 300°С мин--'- и отогрева - 180°С мин-*.

Изучение состояния воды в тканях растений проводили в Институте коллоидной химии и химии воды АН УССР на спектрометре ЯМР высокого разрешения JNH-4H-100 и прибора РЯ-2305 с рабочей частотой для протонов 100 мГц. Количество прочно- и слабосвязанной вода расчитывали по методу, предложенному В.В.Манком (Манк и др., 1975). Количественный и качественный состав полярных липидов во фракциях изолированных мембран анализировали по методу, описанному Г.М.Яко-венко и А.И.Михно (1971), определение фосфолипидов проводили по методу В.С.Родионова и Н.П.Холопцевой (1974), галактолипидов - по реакции галактозы с орцином ( Svermerholm, 1956). Идентификацию полярных липидов проводили с помощью маркеров (Кейтс, 1975). Мети-лоше эфиры жирных кислот разделяли на газожидкостном хроматографе. Белок в мембранах определяли по Лоури ( lowry et al., 1951). Фракцию плазматических мембран шделяли из измельченных тканей корт в трис-буфере СрН 7,2) дифференциальным центрифугированием при 28 и дванады с промывкой при 100 тыс. g . Хлоропласта шделяли э буфере 0,02 трис HCI, 0,33 М NaCl (рН 7,2) центрифугировали при 1,0 и 4,5 тыс. об/мин. Все фракции мембран контролировали электрон-номикроскопически. Фиксацию материала для электронномикроскопичес-ких исследований проводили по стандартной методике в 2,5%-ном глю-таровом альдегиде и I^-ном Оа04. Серийные срезы контрастировали

уранилацетагом и цитратом свинца. Просмотр срезов проводили на электронном микроскопе .ТЕМ-ЮОВ. В общей сложности было проанализировано 15 тыс. электронномикроскопических картин и негативов. Для сканирующей электронной микроскопии ткани фиксировали в 2,5%-ном глютаровом альдегиде и 0,1%-ном Оа04, в присутствии 1%-ной танниновой кислоты. Ткани обезвоживали в ацетонитриле, а затем нагилялк золотом в вакууме (Джунипер, Джеффри, 1986). Исследования проводили на сканирующем электронном ыикроскоее 03М-35с. Полипептидный спектр белков исследовали с помощью электрофореза в ПААГ (Остерман, 1981). Активной протонной АТФ-азы определяли в среде инкубации, содержащей 25 мМ трис-НС1 (рН буфера 6,5), 3 мМ АТФ,

3 мМ в указанных случаях добавляли 50 мМ КС1 (Палладина, 1983). Выделение самособирающегося компонента супернатанта (СКС) проводили в среде, содержащей 50 ¡Л имидазол-НС1, 0,45 М сахарозы,

4 мМ АТФ. 5 мМ ИаР и 4 мМ меркаптоэтанола (рН 7,8). Для этого измельченные ткани коры побегов центрифугировали аналогично процедурам выделения микросомальных фракций мембран, а затем проводили полимеризацию супернатанта при 37°С и образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 30 тыс. в- Все экспериментальные данные обрабатывали математически на ЕС 1010 с помощью программы для шчисления критерия Стьвдента. Были использованы также программы для оценок параметров распределений и доверительных интервалов этих оценок (Плохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУНЩЕНИЕ

Действие низкйх температур на объекты с выраженной криоре-зистентностью. Воздушно-сухие ткани зародыша большинства исследованных видов сохраняют жизнеспособность после погружения в жидкий азот. Однако, повышение влажности эмбриональных тканей свыше 2Ь% резко снижает их жизнеспособность. При исследовании ультраструктурной организации таких тканей на примере корневой меристемы зародышевой оси фасоли было показано, что гибель происходит в результате образования электронно-прозрачных зон мезду клеточной стенкой и плазмалеммой. В этих участках происходит разрыв плазма-лемш, в то время, как других каких-либо повреждений в клетке не наблюдается. После цикла замораживания-отогрева развитие описанных криоповреждений при культивировании тканей зародыша связано с выходом цитоплазматического материала в аполласт, а через 12 часов мембранные структура полностью распадались и исчезали ли-

- 9 -

пидные глобулы ассоциированные с плазмалеммой.

Состав полярных липидов исследуемых тканей непосредственно после отогрева несколько изменялся за счет снижения содержания фосфатидилхолина (ФХ), но при дальнейшем культивировании, через 12 часов преобладало снижение содержания фосфатидилэтаноламина (ФЭ). Исходя из этого можно предположить, что криолабильными компонентами мембран являются сайты, включающие ФХ и ФЭ.

Использование меченых предшественников фосфолипидов, специфически связывающихся с полярными головками фосфолипидов (метил-Н -холинхлорид) и с жирнокислотными цепями фосфолипидов (^С-ацетил-холинхлорид) свидетельствует о том, что деградация мембранных липидов у низкогидратированных тканей происходит в два этапа, первым из которых является периферическая структурная деградация гидрати-рованных компартментов, включающих ФХ и ФЭ (рис. I), а затем после увеличения доступности жирных кислот для ферментативного гидролиза происходит их количественное снижение (рис. 1,6).

I,

1,С. 0,8 0,6 0,4 0,2

1,0

0,8 0,6 0,4 0,2

лфх фх фг фэ фк

ФИ ЛФХ ФХ фг фэ фк

Рис. I. Включение метил-Н -холинхлорида (а) и С-ацетил-

холинхлорида в фосфолипады корневой меристемы фасоли. Сбозначения:с I - контроль, без обработки;

- после быстрого замораживания и отогрева; 1п -■ импульсы в минуту (относительные единицы); ЛФХ - ли'зофосфатидилхолин; ФИ - фосфатидилинозитол; ФХ - фосфатидилхолин, ФГ - йосфатидилглпцерин; ФЭ - фссфатид'ллатанолаыин; ФК - фосфатидная кислота.

В условиях отсутствия апопластного транспорта, на примере гылыде кукурузы, гидратация вызывала перемещение липидных капель, ассоциированных на плазмалемме, внутрь цитоплазмы, и клетка сразу насыщалась водой. Быстрое замораживание в этом случае приводило к внутриклеточной кристаллизации и гибели в результате разрушения мембран. Важно отметить, что при замораживании гидратированной гыльиу, также как и у семян, происходило снижение содержания ФХ, однако, при сравнении ненасыщенности полярных липидов, экстрагированных из пыльцы и семян оказывается, что индекс деойных связей у первой составлял 3,1, тогда как у семян только 2,1. Стабильность мембран меристематических тканей семян в условиях криостресса вероятно обусловлена низкой ненасыщенностыо фосфолипидов, в то время как у мембран шлыр она может (мть обусловлена также и высоким содержанием холестерина, который обладает способностью препятствовать развитию структурных повреждений бислся (Белоус, Бондаренко, 1982).

Модификации структурно-функциональной организации мембран при формировании состояния криооезистентности. Для сохранения жизнеспособности в условиях,при которых осуществляется криоконсерва-ция, растения должны приобрести более высокую устойчивость, чем та, которую они формируют в естественных условиях обитания в зимни} период (Красавцев, 1959; Туманов, 1979; Эака!, 1959; 31л1поу1сЬ, 1978). При замораживании высокогидратированных клеток основным отличием от низкогдцратированных является кристаллизация слабосвязанной вода. Однако криоповревдения клеток носят гораздо более сложный характер и далеко не во всех случаях может быть объяснено только процессами льдообразования.

При установлении причин, определяющих повышение устойчивости к низким температурам, исследовали ультраструктурную организацию клеток камбиальной зоны и паренхимы в различных функциональных состояниях. В период максимальной устойчивости, во второй половине зимы субмикроскопическая организация меристематических клеток была типична для невегетирующих объектов. Важно отметить, что вакуоляр-ный компартмент у них представлен рядом небольших образований, в периферическом слое цитоплазмы расположены пузырьки, а на плазма-лемме существуют инвагинации.

Характерной особенностью клеток паренхиш в состоянии вынужденного покоя является наличие структур, обладающих высокой элект-

ронной плотностью, которые в вакуолярном компартменте представлены полифенолами (Лукнер, 1979). Помимо крупных включений могут встречаться и мелкие образования. При этом на внутренней поверхности тонопласта существует осмиофильный слой, который по представлениям В.П.Холодовой и Ю.П.Болякиной (1974), может свидетельствовать о повышении стабильности клетки.

Рассматривая особенности криоповреядений высокогидратирован-кых клеток можно выделить два типа деструкции - агрегацию либо дисперсию их компонентов. В связи с тем, что эти процессы носят как правило неспецифический характер, в наших экспериментах для установления первичных механизмов повреждений мембран были использованы быстрое замораживание и отогрев (криостресс). Детальный анализ ультраструктуры камбиальных клеток после криостресса показал, что наиболее лабильными структурами оказались каналы эндоплазмати-ческого ретикулума, которые распадались на небольшие везикулярные образования. В клетках паренхимы устойчивыми оказались хлоропласты с конденсированным матриксом. Существенным моментом является то, что при деструкции цитоплазмы слабогидратированных клеток происходило сжатие составляющих ее компонентов, а у шсокогидратированных клеток - дисперсия всего содержимого клетки.

Для индуцирования криорезистентности использовали метод постепенной дегидратации тканей при субнулешх температурах. В этом случае существенно менялась ультраструктура клеток паренхимы. В них увеличивалось содержание осмиофильных веществ в вакуолях и возрастала плотность цитоплазмы. Такие клетки были значительно более устойчивы к стрессовым режимам замораживания. Но некоторые крио-повреждения все же отмечены. Они выражались в латеральной гипертрофии каналов эндоплазматического ретикулума в пристенном слое цитоплазма, а также образовании электроннопрозрачных зон вокруг крахмальных зерен, что вероятно вызвано кристаллизацией находящихся в этих участках цитоплазмы обособленных компартментов слабосвязанной воды. '

Возникновение крупных конгломератов в вакуолях может быть объяснено конденсацией диффузно расположенных компонентов, происходящей при низкотемпературной дегидратации клетки. Такой процесс имеет важное значение, поскольку помимо декорирования мембран, он шполняет функцию торможения сократительных движений вакуолей. В результате этого вакуоли обладают значительно меньшими объемными изменениями, что при замораживании уменьшает деформацию всей клетки. Для исследования роли полифенолов в процессах стабилизации

мембран и повышении их устойчивости к стрессам, были проведены модельные эксперименты по экзогенному введению танниновой кислоты. Эксперименты показали, что распределение танниновой кислоты в клетке имеет свою специфику. При проведении фиксации с низким содержанием осмиевой кислоты (0,1%) наблюдалось декорирование танином плазмалеммы, что указывает на участие полифенолов в стабилизации плазматических мембран. При фиксации материала в присутствии 1% осмиевой кислоты и Тритона Х-100 матрикс цитоплазмы становился практически полностью электронноплотным. Исключение составляли диктиосош аппарата Гольдки, а также фибриллярные структуры цито-плазш, которые могут быть отнесены к элементам цитоскелета. Эти данные дополняют представления о влиянии полифенолов на подвижность и функциональную активность белков, стабилизирующих мембранные структуры.

Для выяснения особенностей модификаций внешней и внутренней поверхностей плазмалемш, специфика изменений которой в значительной степени характеризует функциональное состояние клетки, методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) исследовались изолированные протопласты, а также участки ткани коры яблони, срезанные на криоультрамикротоме. Протопласты паренхиш, изолированные в начале зимнего периода, на внешней поверхности плазмалеммы имели несколько типов выпуклых образований, варьирующих по размерам. Наиболее часто встречались образования, имеющие в диаметре 15-30 нм. По своим размерам и форме они напоминают структуры, описанные Р.Степонкусом с соавт. (Згеропкиа et а1., 1983). Проведение стрессовых режимов замораживания продемонстрировало, что изолированные протопласты непригодны для установления мест локализации криопов-ревдений. В связи с этим была предпринята попытка проанализировать с помощью СЭМ текстуру внешней и внутренней поверхностей плазмалем-ш путем криомикротомирования тканей коры. Стрессовые режимы замораживания в этом случае вы швали разрывы плазмалемш в местах, где она контактирует с выпуклыми образованиями. Использование непродолжительных воздействий Тритоном Х-ЮО (1%-ный раствор) дало возможность выявить ассоциированную с выпуклыми образованиями сложную сеть фибриллярных структур. По мнению С.Блекмора и др. ( В1ектог et а1., 1984) эти структуры напоминают элементы цитоскелета, расположенные в кортикальном слое цитоплазш. Следует отметить, что при криоповревдениях плазмалемш фибриллы частично сохраняют свою целостность и контакты с выпуклыми образованиями. Природа этих образований плазмалемш во многом еще не ясна, однако, вполне

вероятно, что они возникают в участках латеральной подвижности би-слоя, включающих фосфолипиды с ненасыщенными жирными кислотами ( Реагсе, Willison, 1985). Кроме того, как было показано ранее, аналогичные структуры обнаруживаются на плазмалемме у семян и галь-щ при сжатии протопласта в результате дегидратации.

В состоянии вынужденного покоя после субнулевой дегидратации внешняя поверхность плаэмалеммы клеток паренхиш имела мало выпуклых образований, а при обработке Тритоном Х-100 происходила ее избирательная деструкция с образованием мелких и крупных углублений в мембране. Увеличение продолжительности действия детергента на мембрану приводило к полной ее деструкции с сохранением только плотных участков цитоплазмы, представляющих структурные белки ци-тоскелета.

Перечисленные реакции плаэмалеммы на стрессоше режиш замораживания согласуются с данными, полученными Красавцешм, Турке-вич (IS7I) о формировании устойчивости клеток древесных к низким температурам. Наряду с этим, пошшение устойчивости мембран к криострессу в значительной степени определяется низкотемпературной конденсацией осмиофильных веществ полифенольной природы, снижением подвижности лабильных компонентов бислоя и увеличением общей стабильности клетки. Исходя из этого следует, что для ускорения формирования состояния криореэистентности, возникновение которого необходимо для перехода клетки в состояние криобиоза, необходимо дополнительно проводить низкотемпературную дегидратацию тканей, стимулирующую конденсацию компонентов цитоплазмы.

Липидные и белковые компонента мембран при криострессе. Исходя из концепции, предложенной A.M.Белоусом с соавт. (1982), структурные изменения компонентов мембран при криоповреждениях включают такие фазы, как инициацию, стабилизацию, увеличение размеров и репарацию трансмембранных дефектов (ТМД). Описанные явления характерны для мембранных структур, неустойчивых к дегидратации. Реакция мембран растительных объектов с индуцированной крио-резистентностью на криостресс была неадекватной в разные периода вегетации. В состоянии вынужденного покоя преобладали процессы агрегации содержимого цитоплазш, в то время, как при аналогичных воздействиях в период активной вегетации мембраны распадались на везикулярные образования.

Исследования изолированной из ткани коры яблони микросомаль-ной фракции мембран показали, что стрессовые режиш замораживания

в период активной вегетации снижали содержание ФХ и ФЭ. Для оценки изменений белкошх компонентов микросомальной фракции мембран с помощью электрофореза в ПМГ исследовали спектр низкомолекулярных белков - олигомеров. Оказалось, что белки с массой до 100 кДа только в период интенсивной вегетации после криостресса теряют структурную целостность, что выражается в уменьшении их молекулярной массы.

Важным показателем изменения состояния мембрансвязанных белков может служить активность специфической для плазмалеммы протонной АТ5-азы (Палладина, 1983). При исследовании микросомальной фракции мембран оказалось, что в период вынувденного покоя активность этой АТФ-азы в 2,5 раза ниже, чем у активно вегетирующих растений. Такие данные могут объясняться тем, что в условиях вынужденного покоя при конденсации осмиофильных веществ полифеноль-ной природы на поверхности бислоя, вероятно, происходит экранирование белков и таким образом уменьшение их чувствительности к различного рода стрессам, связанных с кристаллизацией воды.

Таблица I

Количественный состав самособирающегося компонента супернатанта микросомальной фракции мембран коры яблони (СКС)

Состав СКС

•_СКС_ СКС + 2мМ ЭГТА

• контроль:криостресс• контроль:криостресс

Масса СКС в % 100 76,5 71,7 92,6

Белок в мкм/мг 35,4±1,8 21,8±2,3 36,4±3,1 22,0±1,6

Липидо в мкг/мг 14,7±1,7 5,0±р,4 4,1±0,5 3,3+0,5

Полисахариды в мкг/мг 58,2+3,8 64,8t,3,7 67,9+4,6 71,9+5,2

Другим важным критерием структурно-функциональной организации мембран является соотношение входящих в нее липидных и белкошх компонентов. Д.Барбер с сотр. (Barber et al., 1984) связывает увеличение этого соотношения с возрастанием текучести мембран, что имеет важное значение при активном функционировании, либо при повышении устойчивости зимующих растений в период закалки. В наших экспериментах это соотношение для микросомальной фракции мембран коры яблони имеет максиы<ум в конце вегетации (около единицы) и практически не изменяется в состоянии покоя. При выходе из покоя и распускании почек оно резко падает, что свидетельствует об увеличении нестабильности бислоя. Следует также отметить, что в

конце вегетации мембраны клеток имели максимальное количество белка и липидов, в то время как в период распускания почек их количество резко снижалось.

Самособирающийся компонент супернатанта (СКС) микросомальной фракции мембран. Приведенные выше данные о реакции микросомальной фракции мембран на криостресс, в отличие от представлений Р.Сте-понкуса с соавт. (Stepon¡cuз et а1., 1983), объясняющих модификации мембран только внутримембранными взаимодействиями, позволяют предполагать особую роль поверхностных взаимодействий в формировании устойчивости мембран к низким температурам. Для проверки таких предположений исследовался самособирающийся компонент супернатанта, полученный после полимеризации легких фракций микросом. Как показано в табл. I, СКС включает 35% белка, до 14% липидов и около 60% полисахаридов. Компонентный состав СКС изменялся после криостресса. При этом снижалось количество белка и липидов. Практически не изменялось количество полисахаридов. Введение в среду полимеризации хелатора Са^+, который по мнению ряда авторов ( йошс et а1., 1982; Магте, 1983) существенно влияет на межмембранные взаимодействия, уменьшало массу СКС. Этот эффект напоминает действие криостресса с той только разницей, что не снижается количество белка. Замораживание супернатанта в присутствии ЭГГА изменяло компонентный состав СКС аналогично действию криостресса без хелатора (табл. I).

Для установления характера изменений мембрансвязанных комплексов в микросомальной фракции мембран и в СКС в обоих случаях исследовали активность протонной АТФ-азы. Как показано на рис. 2, после- замораживания-отогрева микросомальной фракции мембран происходила активизация протонной АТФ-азы при добавлении ионов 1С1", Са^+ и ме2+ причем в последнем случае ее активность возрастала более значительно. Аналогичная АТФ-аза в СКС при криострессе менее стимулировалась К4", в то время как Са^+ и Mg2+ ее активировал на 100-150%. Такие данные могут свидетельствовать о том, что в СКС кальций и магний-зависимее центры протонной АТФ-азы более чувствительны к криострессу. Вероятно после замораживания увеличивается доступность этих центров для ионов двувалентных металлов. В присутствии ЭГТА стрессовые режимы замораживания значительно меньше активизировали протонную АТФ-азу, что исходя из данных, приведенных в табл. I о резком снижении липидов, может свидетельствовать

о непосредственном влиянии на липид-белковую компоненту протонной АТ£-азы.

1.0

а ЕГ

со к а) х I £ «I >4 £-1 О)

д л Е* к

О ф

о в К 22

« О

х о (г1 Я

к в

о «

л

л

0.5

i*

с»

1.0

л

г}

о. ч

гь

I 2

|ь

i

*

Г* с»7*

7Г

Рис. 2. Влияние ионов К^, Са +, на активность протон-

ной АТ£-аэы микросомгшьной фракции мембран (А) и самособирающегося компонента супернатанта (СКС)- (Б), изолированных из коры побегов яблони. Обозначения: 1,3 - контроль без обработки; 2,4 - после замораживания до -196°С и быстрого отогрева; 3,4 - с добавлением в среду выделения 2 мМ ЭГТА.

Полученные данные предполагают однотипность действия хелато-ров и криостресса, однако каждый из факторов имеет свою специфику. Она заключается в том, что при криострессе происходит менее значительный выброс кальция, чем при действии ЭГГА. При этом СКС более чувствителен к действию криостресса и ЭГТА по сравнению с микросомальной фракцией мембран.

Рассматривая особенности криодеструкции, входящих в СКС компонентов можно предполагать, что криолабильность плазмалеммы как систеш доменов, определяется с одной стороны криолабильностью всего бислоя, связанной с объемными изменениями, приводящими к трансформациям липид-липидных, липид-белковых и липид-полисахарид-ных взаимодействий. С другой стороны - это криолабильность самих доменов, которая определяется "выбросом" Са^+.

I

г

1

I

2

3

3

«

Модификации структурно-функциональной организации тилакоидов хлоропластов озимой тденииц при криострессе. Исследования ультраструктуры клеток паренхимы листьев озимой пшеницы в период вынужденного покоя показали, что наиболее устойчивыми к криострессу являются тилакоидо хлоропластов в конце зимнего периода. Такие хлоропласта имеют плотный матрикс, выраженную агранальную структуру и небольшие размеры. Их возникновение вероятно связано с адаптивными процессами в период закалки растений.

При замораживании клеток паренхимы в период активной вегетации отмечен факт слияния отдельных тилакоидов хлоропластов. Гра-нальные тилакоиды, если они не сливались в липидные капли, набухали за счет увеличения межмембранного пространства. Другие мембраны клетки в период активной вегетации после криостресса полностью распадались на везикулярные образования.

Описанная неадекватная реакция мембран хлоропластов в разные периоды вегетации на криостресс была проанализирована путем сравнения деградации полярных липидов у описанных двух видов мембран. Как оказалось, в состоянии вынужденного покоя замораживание практически не изменяло содержание галакто- и сульфолипидов, в то время как в период активной вегетации криостресс вызывал деградацию ДГДГ и СЛ. Такая же картина наблюдалась и для фосфолипидов в разные периоды вегетации

Различные реакции на криостресс у мембран хлоропластов могут объясняться более высоким содержанием полярных липвдов в мембранах тилакоидов в период вынужденного покоя, в то время как у активно вегетирующих листьев их количество снижалось. Важным показателем в данном случае может являться соотношение МГДГ и ДГДГ, которое характеризует функциональную устойчивость хлоропластов ( КиАрег, 1985), а в некоторых случаях служит показателем морозоустойчивости растений. Это соотношение несколько снижалось у мембран в состоянии вынужденного покоя, в первую очередь за счет МГДГ, что подтверждает мнение о том, что адаптационные изменения в мембранах хлоропластов происходят за счет пула МГДГ. Представляют интерес также данные о том, что в мембранах активно вегетирующих растений снижается содержание сульфолипидов. Как известно, сульфоли-пиды относятся к заряженным фосфолипидам, поэтому различия их реакций на криостресс в разные периоды вегетации могут определяться изменением поверхностных взаимодействий мембран.

Другим объяснением полученных данных служат представления об изменении текучести мембран при увеличении ненасыщенности полярных липидов.

Таблица 2

Индекс двойных связей галактолипидов мембран хлоропластов озимой пшеницы в разные периоды вегетации

Галактолипнвд ; Контроль • Криостресс _• ВП • АВ • ВП • АВ

Моногалактозилдиацил-

глицерид (МГДГ) 2,4 2,8 2,4 2,1

Дигалактозилдиацил-

глицерид (ДГДГ) 1,9 2,5 2,1 1,2

Примечание: ВП - хлоропласты в период вынужденного покоя АВ - хлоропласты в период активной вегетации

Исследования содержания жирных кислот в полярных липидах хлоропластов показали, что в период вынувденного покоя происходит снижение степени ненасыщенности галактолипидов за счет увеличения количества насыщенных короткоцепочечных жирных кислот. Это обуславливает большую стабильность компонентов бислоя и меньшую чувствительность к криострессу. В период интенсивной вегетации значительно преобладают полиненасышенные длинноцепочечные жирные кислоты, что обусловливает возрастание ненасыщенности галакто- и фосфолипидов мембран хлоропластов. Расчет индексов двойных связей (табл. 2) свидетельствует о том, что изменения реакции хлоропластов озимой пшеницы на криостресс в значительной степени связаны с изменениями текучести мембран в разные периоды вегетации.

Для выяснения роли объемных и межмембранных взаимодействий в развитии криоповреждений, были исследованы процессы катион-ин-дуцируемой сборки тилакоидов хлоропластов в разные периоды вегетации (рис. 3). Как оказалось, скорость фотовосстановления ферри-цианида в состоянии вынужденного покоя имеет иную кинетику по сравнению с аналогичными мембранами, изолированными в период активной вегетации. При этом, введение в среду инкубации магния стимулирует активность фотосистемы П только в период активной ве-

гетации. Влияние стрессовых режимов замораживания проявлялось в более резкой форме в период интенсивной вегетации, что соответствует более сильной деструкции хлоропластов, показанной при электронномикроскопических исследованиях мембран.

Действие стрессовых режимов замораживания оказывало специфическое влияние на агрегационную способность мембран. Так, протон-зависимая агрегация мало меняющаяся в разные периоды вегетации, после криостресса резко снижалась только в период вынужденного покоя. Эти данные позволяют предполагать, что на поверхности мембран хлоропластов в период вынужденного покоя и у активно ве-гетирунлцих растений находится примерно одинаковое количество заряженных групп взаимодействующих с двувалентными металлами, но одновременно они отличаются по числу компонентов, которые взаимодействуют с протонами. После криостресса в состоянии вынужденного

нкМ восстанов.

НИН.

Рис. 3,а. Активность фотофосфорилирования хлоропластов озимой пшенищ, выделенных из растений, находящихся в состоянии вынужденного покоя и активной вегетации. Обозначения: —о— - контрольные хлоропласта; —о — - после стрессовых режимов замораживания; --А— - при добавлении в" среду ионов Ые2+.

а инн.

Рис. 3,6. Агрегационная способность тилакоидов хлоропластов озимой гпденицы, выделенных из растений, находящихся в состоянии шнувденного покоя и активной вегетации. Обозначения: —•— - контрольные хлоро-

пласты;—«--- после стрессовых режимов замора- 2+

живания;--х- - при добавлении в среду-ионов м^ ;

покоя на поверхности мембран хлоропластов сохраняются главным образом заряженные групш, взаимодействующие с двувалентными катионами, что возможно сохраняет в этом случае гранальную структуру хлоропластов.

Образование липидных капель у активно вегетирующих растений после криостресса может объясняться латеральным смещением липидов в криолабнльных доменах мембран хлоропластов. Такое предположение согласуется с более высоким содержанием в этот период МГДГ и его высокой ненасыщенностью. Исходя из полученных данных можно .резюмировать, что деструкция мембран криолабильных объектов при крио-стрессе в значительной степени определяется подвижностью их ком-

понентов.

»

Гидратационные параметры растительных объектов при переходе в состояние криобиоза. Подвижность компонентов мембран при замораживании в значительной степени определяется интенсивностью миграции жидкой фазы. Применение метода ЯМР-спектроскопии высокого разрешения позволяет прижизненно определять состояние воды, что представляет интерес для количественного определения различающихся по прочности связей с макромолекулами компартментов воды. В литературе нет единого мнения о соотношении различных компартментов воды у растительных объектов, переходящих в состояние криобиоза. В экспериментах с тканями зародышей семян фасоли оыло показано, что только при увеличении влажности до 2Ь% появляется слабосвязанная вода, которая вымораживается в интервале температур от 0 до -5°С. Следует отметить, что после вымораживания слабосвязанной воды остается около Ъ% прочносвязанной воды, объем которой не изменяется вплоть до -60°С. Быстрое вымораживание слабосвязанной воды происходит и у пыльцы кукурузы, однако при температурах -3...-50 переход воды в лед более плавный по сравнению с семенами, что может указывать на образование у пыльцы растворов, обладающих слабым криопротекторным действием.

Зимующие древесные, как считает М.Барке (1982), обладают значительно более широким интервалом изменения оводненности тканей в процессе адаптации к низким температурам по сравнению с лис^ями. Как показано на рис. 4, в состоянии вынужденного покоя при формировании криорезистентности шмораживание воды у тканей побегов яблони происходит по довольно пологой кривой и в основном прекращается при -25...30°С. В этих интервалах температур при вымораживании слабосвязанной вода важную роль играют протекторные вещества, которые в клеточном соке растений чаще всего представлены полисахаридами либо другими гидрофильными веществами.

Сравнение данных, полученных для побегов яблони и березы (кривые 1,3), показало, что у первых в условиях повышения устойчивости к низким температурам вода практически не вымораживалась до -7°С, в то время, как у березы интенсивность сигнала ЯМР не менялась вплоть до -14°С. При дальнейшем снижении температуры у побегов березы основная масса вода шмерзала в интервале температур от -14 до -25°С, а у яблони - в интервале от -7 до -30°С. Такие отличия могут свидетельствовать о том, что в жидкой фазе клетки яблони существуют отличающиеся от березы вещества криопротекторно-

Рис. 4. Изменения интенсивности сигнала ЯМР при вымораживании вода из побегов березы и яблони. Обозначения: 1,2 - побеги береги, взятые непосредственно с дерева (I - охлаждение, 2 - отогрев); 3.4 - побеги яблони, взятые непосредственно с дерева (3 - охлаждение, 4 - отогрев); 5,6 - побеги березы после отращивания в комнатных условиях в течение 7 дней (5 - охлаждение, 6 - отогрев).

го действия, которые в итоге и определяют пределы температур, при которых жидкая фаза переходит в лед. Важно также отметить, что при температурах ниже -35°С у березы сохраняется больше проч-носвязанной невымерзшей вода, чем у яблони. Такой факт, исходя из представлений М.Барке (1983), указывает на высокую адаптивность тканей березы. Увеличение интенсивности сигнала ЯМР, полученное при 0°С после гидратации побегов при их проращивании (рис. 4, кривые 5 и 6) дает возможность судить о величине свободного пространства в тканях и его изменениях в процессе вегетации.

Для определения объема различных компартментов воды проведена аппроксимация с помощью ЭВМ нормированных кривых в условиях максимальной устойчивости и при регидратации побегов. Расчеты показали, что форма кривых у разных видов растений при вымораживании воды различается только на этапе снижения температуры. При отогреве тканей полученные кривые имели близкие описывающие ее параметры. Математическая обработка позволила установить 4 параметра, определяемых по экспериментальным данным. Один из них характеризует ширину полосы вдоль оси абсцисс, второй и третий параметр, характеризующие экспоненциальную часть кривой изменения интенсивности сигнала ЙМР при вымораживании воды, могут определяться содержанием криопротекторных веществ в высокогидратированных клетках и следовательно служить видоспецифическими показателями для различающихся по устойчивости к низким температурам тканям древесных.

0.6 0,6

ос

Рис.5.А.Интенсивность сигнала НМР при вымораживании воды из мембран хлоропластов озимой лшеницл, выделенных в период вынужденного покоя (I) и активной вегетации (2).

Рис.5.Б.Изменения интенсивности сигнала НМР при вымораживании води в период активной вегетации. I - замораживание, 2 - отогрев.

- 24 -

Исследования гидратационных параметров мембран растительных объектов проводили на изолированных хлоропластах озимой пшеницы. Как показано на рис. 5 А, характер вымораживания воды из мембран Сил неодинаков для разных периодов вегетации. Так у хлоропластов в период вынужденного покоя основная масса воды вымораживалась до -Ю°С, а в период активной вегетации практически вся вода превращалась в лед уже при -5°С. Более плавное снижение кривой интенсивности сигналов ЯМР при вымораживании волн из мембран в период вынужденного покоя свидетельствует о более прочной связи ее с компонентами бислоя. Кроме того, обнаруженный только у мембран интенсивно вегетирующих растений (рис. 5 Б), эффект гистерезиса вероятно свидетельствует об уплотнении структуры мембраны в цикле замораживания и может быть объяснен термоосмосом части воды, наблюдаемом при замораживании искусственных мембран (Запва1, 1982).

Возникновение генетических изменений при консервации растений в условиях низких температур. Разработка методов криоконсерва-ции генетических ресурсов растений в первую очередь базируется на том, что эти метода не должны вызывать каких-либо изменений генома растений. С целью выяснения возможностей возникновения генетических изменений в цикле замораживания-отогрева, в условиях, когда минимальная температура составляла -195°С была исследована частота возникновения хромосомных аберраций в инициирующих клетках. Цитологический анализ структуры хромосом проводили на семенах и пыльце кукурузы линия РЬЗ-72, чувствительной к различного рода мутаген-» ным воздействиям. В экспериментах исследовали действие стрессовых режимов замораживания на гидратированные до 20% семена кукурузы. Шло показано, что в этом случае частота хромосомных аберраций уве личивалась незначительно. Более высокий уровень аберраций наблюдал ся при действии стрессовых режимов замораживания на гыльцу кукурузы. Исследование наследственных изменений, вызванных действием низких температур, обнаружило во втором поколении, полученном после ошления растений замороженной шльцой, увеличение количества хлорофилльных мутаций. Их количество возрастало в 8-14 раз, хотя абсолютные величины были достаточно низкими (0,8-1,4). В то же время, погружение в жидкий азот семян кукурузы и отогрев их на воздухе не вызывал изменений, превышающих спонтанный мутагенный процесс. Исходя из полученных данных можно констатировать, что

криостресс вызывает слабые мутагенные изменения, которые проявляются, как правило, в первом поколении. В то же время проведение постепенного замораживания-отогрева растительных объектов практически не оказывает влияния на их геном.

Консервация генетических ресурсов растений и биотехнологические аспекты применения низких температур. Полученные нами данные о механизмах действия низких температур на растительные объекты, отличающиеся по устойчивости к дегидратации, и находящиеся в различных функциональных состояниях, а также изменения клеточных структур, еыдзлсп1ш1л не отпх объектов, при дсйстзнн тсрисстресса дали возможность создать интегральную концепцию возникновения криоповреждений растительной клетки при температурах, которые используются для криоконсервации генетических ресурсов растений. С учетом этого, для работ в области генной инженерии и клеточной селекции был разработан метод пролонгированной субнулевой дегидратации, который позволяет практически исключить вероятность возникновения криоповреждений и генетических изменений растительных объектов при их консервации при температурах жидкого азота. Метод защищен авторскими свидетельствами СССР (A.c. № 1243645, 1986 и A.c. № 1386653, 1987). При использовании этого метода для криоконсервации зародышей древесных, которые перед проращиванием должны проходить этап стратификации, семена проходили частичную стратификацию и медленное высушивание при субнулевых температурах. Затем зародыши криоконсервируют по двухэтапной программе при температуре жидкого азота. По мере необходимости зародыши отогревают и проращивают. Такой метод позволяет на 30-50 дней сократить период стратификации перед проращиванием семян и ускорить их использование в экспериментах по культивированию изолированных тканей.

Другой аспект применения разработанного нами метода заключается в осуществлении более простого способа криоконсервации вегетативного мицелия базидиальных грибов. Этот способ отличается от существующих тем, что не требует проведения эквилибрации в крио-протекторах и, следовательно, существенно упрощает процедуру длительного хранения макрогрибов в жизнеспособном состоянии.

Помимо описав'гых разработок предложен метод криоконсервации незрелых эмбрионов пшеницы. Необходимость длительного хранения этих эмбрионов вызвала тем, что при отделении от растения они

Систро теряют жизнеспособность, а вероятность их получения для работ в области клеточной селекции ограничена вегетационным периодом. Предложенный метод прошел исштание в Институте физиологии растений и генетики АН УССР и получил положительную оценку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные при изучении действия низких температур на растительные объекты, различающиеся по устойчивости к дегидратации, свидетельствуют о том, что криоповреждения мембран определяются не только процессами льдообразования, а в значительной степени связаны с физико-химическими и структурными модификациями их компонентов, которые главным образом выражаются в изменениях чувствительности к двувалентным катионам, плотности упаковки криолабильных доменов и усилении миграции подвижных компонентов. При этом формирование устойчивости к низким температурам связано с возникновением состояния криобиоза,в основе которого лежат структурно-функциональные изменения на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях, связанные с формированием состояния криорезис-тентности. Растительные объекты, используемые для консервации генетических ресурсов растений, разделены на группы (шраженная криорезистентность, индуцированная криорезистентность и криола-бильные), которые существенно отличаются по режимам длительного хранения. Исследования особенностей модификаций мембран этих групг показали, что концепции об устойчивости мембран к низким температурам, основанные на представлениях о криострессе и низкотемпературных повреждениях клеток у растительных объектов должны быть дополнены рядом специфических положений. В частности это относится к процессам агрегации и дисперсии в различной степени гидратиро-ванных компонентов мембран. Как показано на рисунках 6 и 7, предпосылкой для преобладания процессов дисперсии при криоповреждени-ях должна быть высокая оводненность компонентов мембран и их не-насышенность. В то же время при переходе в состояние вынужденного покоя и частичной дегидратации более выражены процессы агрегации мембранных компонентов цитоплазмы.

Отличительной особенностью реакции растительных мембран на криостресс у високогидратированных клеток является образование на мембранах липидных капель и слияние их в зоне криолабильных сайтов. Для слабогидратированных клеток при криострессе образуют-

i. дисперсия компонентов высокогидраткроеанных иемсрая

большой кошартиент слабосеязанноя о иакромолстулааи воды

[латеральная подвигаость анулярных лигшдов и их

большие звачеяия соотнооенйя" липид : белок при низкой исходной величине параметров

функциональная

активность

менб ралсвязанных

комплексов

интенсивные обыайые изменения клеточыцх [структур__

криострвсс

перераспределение ксмпартмевтов воды и возникновение гисткргаисшлс

ярлекий_

выброс двувалентных _ катионов / Саг* и

оалюБилизАШЯ КРИОЛАБИЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ

сегрегация 'Л деградация полярньц липидов, активизация «хжн1ипаз у переписного окисулезия

ркгазшнягйпгзташгшшг

структур на кецбранах включающих «Э я мгдг_

деструкция взаимосвязей цитоскелета с мембранами_

Рис. 6. Основные структурно-функциональные модификации мембран высокогидратированных клеток паренхимы растений в норме и при криострессе, приводящие к дисперсии компонентов бислоя.

2. АГРЕГАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ ИЕМБРАН ПРИ СНИЖЕНИИ ГИДРАТАЦИИ ТКАНЕЙ

ШПЩРШЦЯя-

ткали

НИЗКОЕ СООТНОШЕНИЕ ЛМПИД 1 БЕЛОК ПРИ высоких исходных

величинах _

КОНДЕНСАЦИЯ ПОЛИШЮЛОВ, ДЕКОРИРОВАНИЕ ЦИБРАН

УМЕНЬШЕНИЕ ИНДЕКСА ДВОЙНЫХ СВЯЗЕЙ ПОЛЯРНЫХ ЛИПИДОВ_

|адйнйу ашепоми

ПРОТОННОЙ АТО-»»«

¡гряоотрео^

И ПРИШЫВРАННЫХ УЧАСТКОВ ЦИТОПЛАЗМЫ_

I ВЫБРОС ДВУВАЛЕНТаПх (_ КАТИОНОВ (Ся2+п Нп2*/ Г

СЕГРЕГАЦИЯ БЕЛКОВ И ЛИПИДОВ

ОБРАЗОВАНИЕ КОНГДСШРАМВ ПИМШ1А38Ы С ПОЛЙФЕНОЛАКИ

ОБРАЗОВЛЯИВ литш ПОЛИФЕНОЛШЫХ СТРУКТУР

Рис. 7. Последовательность структурно-функциональных модификаций мембран низкогидратированных растительных клеток в норме и при криострессе, приводящие к агрегации ассоциированных с бислоем компонентов.

ся плотные конгламерата, состоящие из осмиофильных соединений полифенольной и углеводной природы.

Роль представленных схем заключается в том, что они позволяют подбирать условия, необходимые для криоконсервации различных типов клеток и препятствовать развитию криоповревдений, возникающих при действии низких температур. В частности, главным является еывод о том, что для сохранения структурно-функциональной организации клеток необходимо стабилизировать объемные деформации клетки и структур цитоскелета в процессе замораживания-отогрева. Важно также исключить солюбилизацию мембрансвязанных ферментативных комплексов и выброс двувалентных катионов, которые существенно влияют на функционирование и структурную организацию картикально-го слоя цитоплазмы.

Реализация предложенных в схемах теоретических представлений дает возможность не только пошшать устойчивость растительных клеток при действии низких температур, но и имеет общебиологическое значение для пошшения устойчивости организма к действию различных неблагоприятных факторов и стрессов.

ВЫВОДЫ

На основании изучения структурно-функциональной организации плазматических мембран и их реакции на криостресс у объектов с шраженной, индуцированной криорезистентностью и у криолабильных тканей сформулированы принципы устойчивости растений к низким температурам, которые дают возможность осуществлять криоконсервации генетических ресурсов растений. Они включают следующие положения:

1. При исследовании субмикроскопической структурной организации плазмалеммы у низкогидратированных тканей с выраженной криорезистентностью установлено, что реакция на криостресс связана с ее деформацией в результате кристаллизации слабосвязанной воды в апопласте. Необратимые повреждения плазмалеммы сопрововдаю-ся избирательной деградацией полярных липидов, из которых в первую очередь происходит уменьшение ФХ'и

2. Растительные объекты с индуцированной криорезистентностью повышают свою устойчивость к криострессу в результате низкотемпературной дегидратации, снижения активности протонной АТФ-азы, конденсации веществ полифенольной природы и декорирования поверхности плазмалеммы осмиофильными веществами, что в итоге препятст-

- 29 -

вует возникновению криоповревдений.

3. Экспериментально показано, что реакция высокогидратирован-ных криолабильных объектов на криостресс, в основном, выражается

в везикуляции мембранных структур и образовании дисперсной среды в цитоплазме. Такие изменения сопровождаются уменьшением содержания в мембранах §Х и ФЭ, степень деградации которых может свидетельствовать о нестабильности плазмалеммы. При исследовании текстуры плазмалеммы установлена топография зон криоповреждения мембран, криолабильные сайты которой связаны со структурными элементами цитоскелета встроенных в мембрану. Показано, что различная чувствительность плазмалеммы к детергенту позволяет характеризовать уровень стабильности бислоя и его отдельных компонентов к криострессу.

4. Выявлен криолабильный самособирающийся компонент суперна-танта (СКС) микросомальной фракции мембран тканей древесных. Показано, что этот компонент представляет собой полисахарид-белок-липэдный комплекс, который при стрессовых режимах замораживания обладает различной агрегационной способностью, зависящей от содержания экзогенного Са^+. Исходя из компонентного состава СКС, а также изменений активности чувствительной к катионам протонной АТФ-азы делается швод о том, что изменения характера взаимодействия плазмалеммы с цитоматриксом заключаются в деструкции Са^+-зависи-шх сайтов при криоповреждениях, что является одним из первых звеньев деструкции плазмалеммы в результате низкотемпературного стресса.

5. Установлена способность тилакоидов хлоропластов активно вегетирующих растений к пространственному перемещению полярных ли-пидоз, мембран и их слиянию при криострессе. Поскольку эта реакция определяется количественным содержанием в тилаковдах МГДГ, его ненасыщенностью и наличием двувалентных катионов, предполагается, что специфика деструкции мембран, в данном случае, выражается в модификациях липид-липидных и липид-белкошх взаимодействий и существенно отличается от реакций агрегации, наблодаешх у тканей в состоянии вынужденного покоя при низкотемпературной дегидратации.

6. Выявлена высокая устойчивость тилакоидов хлоропластов в период вынужденного покоя при низкой интенсивности света, имеющих пониженное содержание МГДГ и ДГДГ, низкую ненасыщенность полярных липидов и высокий уровень сульфолипидов. У этих хлоропластов более

шражена агранальная структура тилакоидов и электронноплотная строма. Кроме того, в отличие от интенсивно вегетирующих растений, мембраны хлоропластов имеют более плотную упаковку компонентов и менее чувствительные к криострессу реакции фотовосстановления феррицианида и комплексы <ЕС П. Такой тип хлоропластов составляет до 25% от общего их количества в клетке и, вероятно, является особой модификацией органелл, формирование которых происходит в условиях низкотемпературной адаптации.

7. Показано, что в результате структурных перестроек на плазмалемме возникают образования липидной природы, топография локализации которых соответствует сайтам нестабильности мембран. Снижение количества этих образований, возникающих при объемных сжатиях клетки, позволяет тестировать более высокую устойчивость мембран к криострессу.

8. При анализе с помощью метода ШР-спектроскопии высокого разрешения количественного распределения форм воды, отличающихся по прочности связи с макромолекулами, установлены оптимальные соотношения параметров, характеризующих процесс вымораживания воды (параметры и показаны отличия этого процесса у разных по устойчивости к криострессу растительных объектов. На основани] экспериментов сделаны выводы о том, что определяющей характеристикой устойчивости является торможение низкотемпературной миграции воды между гетерогенными компартментами клетки, что в итоге предохраняет ее мембраны от конформационных изменений и структурных модификаций.

9. На основании сформулированных представлений о криоповреж-дениях мембран при криострессе предложен способ пролонгированной субнулевой дегидратации, который позволяет снизить вероятность возникновения криоповревдений и повысить жизнеспособность материг ла при проведении низкотемпературной криоконсервации. Способ защищен авторскими свидетельствами на изобретения СССР.

10. Установлено, что стрессовые режиш замораживания обладают небольшим мутагенным действием, которое выражается в основном р возникновении летальных хлорофиллъных мутаций.

11. Таким образом, выдвинута и экспериментально обоснована на организменном, тканевом и субклеточном уровнях концепция формирования состояния криорезистентности растительных организмов, использование принципов которой позволяет повышать устойчивость

растений к низким температурам. Теоретическая значимость этой концепции заключается в том, что она обосновывает общебиологический принцип повышения устойчивости в условиях низких температур не только за счет предотвращения льдообразования, но и в результате структурных модификаций цитоплазмы, формирования стабильности мембран, снижения подвижности и торможения миграции жидкой фазы клетки. Такого рода подходы позволяют объяснить эффекты стрессовых реакций, возникающие в различные периоды вегетации растений при действии низких температур, а также разрабатывать мероприятия по повышению устойчивости растений к различного рода воздействиям, оказывающих непосредственное влияние на структурные взаимосвязи мембранных поверхностей с цитоскелетом. В результате про-зеденных исследований предложен новый метод "Пролонгированной субнулевой дегидратации", позволяющий повысить качество криокон-сервированных тканей растений при их длительном хранении. Этот летод нашел применение для сохранения генетических ресурсов биосферы , а также для биотехнологических работ по генной инженерии 1 клеточной селекции растений.

Список публикаций по теме диссертаций

Влияние низких температур на бактерии Е. Coli (Соавт.: Т.С.Сафонова, В.М.Маркова).- Криобиология и криомедицина, 1978, вып.4, с. 66-68. !. Проблемы криофитофизиологии. (Украинский язык). (Соавт.:

K.M.Ситник).- Bïchhk АН УРСР, 1978, № 9, с. 22-23. i. Криорезистентность и ультраструктурная организация покоящейся и прорастающей пыльцы. (Соавт.: Г.И.Мартын).- В кн.: Применение электронной микроскопии в материаловедении, биологии и медицине, Киев, 1979, с. 69-70, :. Cryoresistance of plant pollen with different levels of humi-di«/. (Co-auth. with K.M.Sytnik, G.L.Martin, V.V.Mank).- In: XV Internation Congreaa of Refrigeration. Venezia, 1979,p.1-4.

. Cryoreaistance of plants with different levela of humidity. (Co-auth. With K.M.Sytnik, V.V.Mank).- In: Water and Ions.in Biologycal Systems. Abat. Bucharest, Romania, 1980, p. 68.

. Наследственные изменения растений при действии низких температур. (Украинский язык). (Соавт.: К.М.Сытник, В.В.Моргун, Е.А.Ларченко).- Допов д АН УРСР, 1980, сер. Б, № 9, с. 77-80.

7. Криорезистентность пыльцы растений при различной влажности. (Украинский язык). (Соавт.: Г.И.Мартын, К.М.Сытник).- Укра1н-ський ботан!чний журнал, 1980, 37, № 4, с. 14-15.

8. Ультраструктурная организация мембран хлоропластов озимой пшеницы при действии ультранизких температур. В кн.: Электронная микроскопия и вопросы прогнозирования. Тез. конф. Кишинев, 1981, с. 32-34.

9. Криорезистентность мембран при различном уровне гидратации клетки. (Соавт.: К.М.Сйтник).- В кг.: Всесоюзное совещание по вопросам адаптации древесных растений к экстремальным условиям среды. Тезисы. Петрозаводск, 1981.- с. 123-124.

10. Криорезистентность мембран при различном уровне гидратации растительной клетки.- В кн.: УП съезд УБО. Тезисы докладов. Наукова думка, 1982, с. 474-475.

11. Эффект термоосмоса при действии низких температур на мембраны хлоропластов. (Соавт.: В.В.Манк).- В кн.: I Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов, т.1, Москва, 1982, с. 245246.

12. Криорезистентность мембран при различном уровне гидратации и растительной клетки. (Украинский язык).- Допов д АН УPCP, сер. В., 1982, № 4, с. 60-63.

13. Криорезистентность мембран при различном функциональном состоянии клетки.- В кн.: Пошшение устойчивости растений к низким температурам. Киев : Наукова думка, 1982, с. 30-32.

14. Действие ультранизких температур на мембраны хлоропластов озимой пшеницы. (Украинский язык). (Соавт.: К.М.Сытник, Т.В.Сидоренко).- Укра1нський ботан±чний журнал, 1983, 40, в.4, с. 12-16.

15. Резистентность мембран к криострессам.- В кн.: Ультраструктурная организация растений. Кишинев, 1983, с. 99-100.

16. Криоконсервация и длительное хранение эмбриоидов и шльцы растений. (Соавт.:К.М.Сйтник)Информационный материал. Пущино, 1983, 31 с.

17. Cryoconservation and prologed Btorage of embryoids and plante pollen. (Co-auth. with: K.M.Sytnik).- News-letter, Puschino, 1983, 31 P.

18. Modification of intramemranous particles in oondition of de-gidration and hyperconoentration under freezing. (Co-auth. with: V.V.Mank, A.V.Tkachenko).- In: Water and lona in Biological Systems. Abat. Bucharest, Romania, 1984, p. 140.

19. Cytomatrix of plant protoplasts. (Co-auth. with: V.I.Mikchal-lov, A.V.Tkachenko, B.T.Matienko)In: 8 European Gongre3a on Electron Microscopy. Budapest, Hungary, 1984, p. 21032104.

20. Жидкокристаллическое состояние липидов зародыша фасоли. (Украинский язык). (Соавт.: М.В.Курик).-ДоповШ АН УРСР, сер. Б., 1984, с. 71-73.

21. Протонный резонанс воды клеток древесных растений в состоянии криорезистентности и при выходе из него. (Соавт.: В.В.Манк).-В кн.: II Всесоюзная конференция по теоретической и прикладной криобиологии. Тез., Харьков, 1984, с. 100.

12. Изменения организации цитоскелета растений при действии повреждающих режимов замораживания. (Соавт.: В.И.Михайлов, Т.М.Грищенко, Т.В.Сидоренко).- В кн.: II Всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии. Тез., Харьков, 1984, с. 102.

23. Влияние гидратации клетки на резистентность мембран к ультранизким температурам.- В кн.: Регуляция водного обмена растений. Киев: Наукова думка, 1984, с. I3I-I34.

24. Протонный магнитный резонанс тканей древесных в состоянии криорезистентности и при выходе из него. (Соавт.: В.В.Манк, Л.Е.Баршабова).- В кн.: УШ Всесоюзный симпозиум по водному режиму растений. Тез. Ташкент, £АН, 1984, с. II8-II9.

25. Криорезистентность мембран и вопросы консервации растений. (Соавт.: К.М.Сытник)Криобиология, 1985, № 2, с. 5-12.

26. Устойчивость тилакоидов хлоропластов к стрессовым режимам замораживания. (Соавт.: С.В.Мануильская, В.В.Манк).- Физиология растений, 1985, № 32, вып.4, с. 681-687.

27.' Первичные механизш деструкции семян фасоли при криоконсерва-ции. (Соавт.: Т.В.Сидоренко, Л.Е.Баршабова).- Бюллетень Всесоюзного НИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова, Ленинград, 1985, вып. 152, е..56-59.

28. Особенности морфологии контрактильных систем и формирование криорезистентности растений. (Соавт.: А.В.Ткаченко, В.И.Михайлов).- В кн.: Электронная микроскопия и вопросы диагностики. Тез. Кишинев, 1986, с. 35.

29. Проблемы консервации генетических ресурсов растений.- Криобиология, 1987, № 2, с. 11-16.

30. Криоконсервация высших растений при ультранизких температурах: ткани in vivo, клеточные культуры.(Соавт.: К.М.СЬшшк).-В кн.: Криобиология и биотехнология. Киев : Наукова думка, 1987, с. 140-159.

31. Использование ультранизких температур для длительного хранения генетических ресурсов растений,- В кн.: Генетические ресурсы растений и животных Украинской ССР, Киев: Наукова думка 1987, с. 138-143.

32. Модификации плазматических мембран при формировании устойчивости растений к низким температурам. (Соавт.: О.А.Закордонец Т.В.Сидоренко).- Физиология и биохимия культурных растений, 1987, 19, № б, с. 574-580.

33. Принципы структурно-функциональной организации плазматических мембран растений при криобиозе.- В кн.: Достижения и перспективы криобиологии и криомедицины, Международная конференция ШЭСКО, Харьков, 1988, с. 23-24.

34. Ультраструктурная организация плазмалеммы зимующих древесных в условиях криостресса.- В кн.: Ультраструктура растений,

У1 Всесоюзный симпозиум, Киев, 1988, с. 38.

35. Криоповреждения поверхностных мембран клеток паренхимы зимующих древесных при стрессовых режимах замораживания. (Соавт.: О.А.Закордонец, А.В.Ткаченко).- Физиология и биохимия культурных растений, 1988, 20, № 5, с. 472-477.

36. Модификация тилакоидов хлоропластов озимой пшеницы при действии стрессовых режимов замораживания. (Соавт.: Б.И.ГУляев).-В кн.: Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата. ХХУ Юбилейное совещание и симпозиум. Тез. Толбухин, Болгария, 1988, с. 68.

37. Криолабильный компонент клеток высших растений. (Соавт.: Т.В.Сидоренко).- Криобиология, 1988, № 4, с. 10-13.

Авторские свидетельства

1. Способ хранения семян косточковых растений. A.c. № 1243645 (СССР). (Соавт.: К.М.Сйтник, Н.И.Даниляк, Л.Е.Баршабова, С.А.Шевченко, В.И.Клименко). 1986.

2. Способ консервации мицелия макрогрибов. A.c. № 1386653 (СССР). (Соавт.: Э.Ф.Соломко, Н.И.Даниляк). 1987.

Ответственный за выпуск академик АН УССР В.И.Грищенко