Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повышение криорезистентности пекарских дрожжей на основе температурной и осмотической адаптации

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Повышение криорезистентности пекарских дрожжей на основе температурной и осмотической адаптации"

на правах рукописи

Платов Алексей Владимирович

ПОВЫШЕНИЕ КРИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ НА ОСНОВЕ ТЕМПЕРАТУРНОЙ И ОСМОТИЧЕСКОЙ АДАПТАЦИИ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-1997

Работ выполнена на кафедре "Биотехника" Московском Государственной академии .химического машиностроения.

Научный руководи гель: кандидат технических наук, доцент Бслуков Сергей Владимирович.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Позмогова Ирина Николаевна, кандидат технических наук Игонин Юрнй Борисович.

Ведущая организация ОАО "Биотехнология".

¿о

Зцщии шниикя 1997 г. в ! часов на

заседании диссертационного Совета Д 053 34 13 в Российском химико-технологическом университете имени Д.И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., 9).

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан Штг.

Ученый секретарь диссертационного совета кандитагбиологических наук 7 П.П.ГУСЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время низкотемпературные процессы широко используются в различных областях биотехнологии. На стадиях постферментационной обработки нашли применение такие процессы как замораживание, сублимационная сушка, концентрирование вымораживанием, криогрануляция. Несмотря на несколько большую стоимость по сравнению с другими методами, данные технологии обеспечивают очень высокое качество конечного продукта, а в некоторых случаях являются единственно возможными.

Для коллекции культур, как больших, так и малых локальных блоков, наиболее эффективным и перспективным признан метод криоконсервирова-ния [Неск1у, 1978], при котором коллекционные штаммы хранятся при температуре жидкого азота весьма длительное время, сохраняя свои специфические свойства. В отличие от других способов хранения, в условиях долгосрочного хранения при низких температурах не происходит нарушений на генетическом уровне.

Однако, с началом использования низких температур в биотехнологии, возник ряд проблем, связанных с частичной утратой жизнеспособности и функциональных свойств различных микроорганизмов. Известно, что при замораживании реализуются различные процессы, имеющие неблагоприятное или летальное воздействие на клетки [Пушкарь, 1975]. К ним относятся концентрация электролитов, кристаллообразование, изменение кислотности, а также непосредственное действие самих низких температур. Методы, позволяющие компенсировать эти повреждающие факторы, основаны на результатах исследований, носящих, главным образом, эмпирический характер, и заключаются в использовании определенных криопротекторов с оптимальной концентрацией. Но зачастую использование криопротекторов бывает нежелательно по причине их токсичности или исключено вовсе из-за невозможности их сепарации в конце процесса, как при сублимационной сушке. По своей природе большинство криопротекторов являются чуждыми веществами для живых клеток. При помещении клеток в растворы криопротекторов происходит обезвоживание, наблюдаются химические реакции криопротекторов с составляющими клеток с образованием различных комплексов. изменяются физические свойства как суспензионной, так и внутриклеточной сред.

Несмотря на бесспорную практическую значимость традиционных методов зашиты, по нашему мнению, перспективы дальнейшего развития они не имеют. Назрела необходимость в разработке качественно нового метода

РДуцаева, 1987] решения задачи по поддержанию сохранности биоматериала в низкотемпературных процессах . Такой метод мог бы заключаться в получении культуры, устойчивой к неблагоприятным факторам замораживания, за счет адаптации к ним на этапе культивирования. В природе каждый биологический организм обладает большей или меньшей степенью адаптабельности к изменению условий окружающей среды. Чем выше эта степень, тем больше шанс выжить в неблагоприятных условиях и сохранить свои специфические свойства. Дрожжевые клетки обладают целым рядом механизмов адаптации к изменениям условий роста. Учитывая также их большую практическую значимость, дрожжи можно считать наиболее интересным объектом исследования в данном направлении._

Ц*яь-рабвил.Эмт.рим1НЫЛЫ10 Изучить влияние температурной и ос-мотичской адаптации дрожжей на их криорезистентность, определить пути интенсификации массопереноса воды из клетки при замораживании.

Для выполнения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

- изучить влияние температуры роста на температурный диапазон фазовых переходов липидов в мембранах и криорезистентность клеток;

- изучить реакцию дрожжевых клеток на повышение осмолярности среды роста различными добавками;

• -■¡изучить влияние внутриклеточных веществ-осморегуляторов на криорезистентность осмоадаптированных клеток;

- исследовать сохранность ферментативной и генеративной активности замороженных-отогретых клеток;

-. исследовать процесс льдообразования в клетках с различным биохимическим составом.

;■. Научная новизна работы. В результате исследования определен каче-ственношовый подход к решению задачи повышения сохранности дрожжевых культур в низкотемпературных процессах. Намечено два пути увеличения криорезистентности клеток: адаптация к пониженным температурам и адаптация к осмотическому фактору при культивировании.

Показано, что клетки, выращенные при субоптимальной температуре и имеющие температурный диапазон фазового перехода липидов в отрицательной области, были значительно устойчивее к низким температурам, чем клетки, выращенные при оптимальных температурах.

Установлена корреляционная зависимость между содержанием трега-лозы иполиолов в клетках и их выживаемостью после замораживания.

■ Исследована зависимость эвтектических температур и динамики льдообразования от биохимического состава клеток.

Практическая -значимость. Проведенное исследование представляет практический интерес, так как определенные в работе условия культивирования и оптимально соответствующие им режимы замораживания позволяют достичь высокой сохранности клеток без использования криопротекто-ров. Результаты и выводы работы могут быть использованы в практике криоконсервирования как в коллекциях культур, так и в производственных криобанках маточных культур, для выращивания высококачественных дрожжей, предназначенных для сублимационной сушки, в справочной литературе. Разработанная математическая модель позволит прогнозировать устойчивость дрожжевых клеток к замораживанию в зависимости от их морфологических и биохимических свойств.

Теоретическое значение представляют результаты исследований по влиянию температуры роста на температурный диапазон фазовых переходов в мембранах и криорезистентность дрожжей, по влиянию биохимического состава дрожжей на их криорезистентность и процесс льдообразования.

Апробация работы.

Результаты исследований докладывались и обсуждались на:

-ХЬУ1 научно-технической конференции МГАХМа(Москва, 1995г.);

- .Международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (Москва, 1995г.);

- Международном научном симпозиуме ЮНЕСКО "Техника и технология экологически чистых химических производств" (Москва, 21-23 октября 1996г.),

- Научных чтениях "Теоретические/фактические основы расчета термической обработки пищевых продуктов" (Москва, 1997г.).

Структура и объем работы.

Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов экспериментов, изложения и анализа полученных результатов, выводов, списка литературы, приложений. Работа изложена на 122 страницах, содержит 24 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает 171 источник, из них 107 опубликованных в зарубежных изданиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась производственным штаммом дрожжей ЗассЬаготусея сегеутае, полученным с Московского дрожжевого завода. Посевным материалом служила двадцатичетырехчасовая культура дрожжей, выращенная в синтетической жидкой среде в колбах Эрленмейера на

качалке при температуре 33°С и находящаяся в стационарной фазе развития. Основной средой для культивирования во всех экспериментах являлась глюкозо-аммонийная среда. Для обогащения среды факторами роста добавлялся дрожжевой автолнзат.

В первом комплексе экспериментов дрожжи выращивались аэробно в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл среды на качалке (180-200 оборотов в минуту) при температурах 40°С, 35°С, 25сС и 15°С и анаэробно в колбах, содержащих 50 мл среды с сернокислотными затворами при температурах 35°С и 15°С и с добавлением в среду твина-80 как источника ненасыщенной жирной кислоты.

Во втором комплексе экспериментов дрожжи выращивались аэробно на качалке в колбах Эрленмейера при температуре 35°С. В среду производились осмолитические добавки: хлористый натрий и сахароза в различных концентрациях. Клеточная суспензия в стационарной фазе роста сепарировалась от среды либо центрифугированием либо фильтрацией на воронке Бюхнера. В обоих методах производилась двухкратная промывка клеток дистиллированной водой, затем клетки суспендировали в дистиллированную воду до концентрации 1 > 10 8 ч-1 х 109 кл/мл. Динамика процесса культивирования контролировалась нефелометрически при помощи фотоэлек-троколориметра, рН среды определялась потенциометрически.

Изменения морфологических особенностей в зависимости от условий культивирования изучались микроскопически. Размеры клеток определяли с помощью окуляра-микрометра. Для изучения морфологических изменений после замораживания-отогрева использовался иммерсионный объектив. Для определения количества свободной воды в клетках использовали плаз-молитический метод Калюжного. Общее влагосодержание определяли стандартным методом (сушкой при 120°С). Количество связанной воды определяли как разность общего влагосодержания и количества свободной воды.

Трегалоза экстрагировалась по методу Тревельяна и Харрисона и определялась антроновым методом методом. Полиспирты определялись методом хромотографии на бумаге экстрактов дрожжей в растворителях: н-бутанол-уксусная кислота, с применением проявителя-реагента диолов: перйодат натрия, марганцевокислый калий и бензидин. Для количественного анализа содержания полиолов использовали метод титрования после элюирования с хромотограмм по Гирсту и Джонсу. Результаты выражали в процентах сухого вещества.

Дезинтеграцию промытых дрожжевых клеток проводили в 0.01 М трис-НС1 буфере рН 7.5 с 0.1 М МцС1 . Использовалась планетарная мельница с частотой 1000 об/мин.Дечинтеграция проходила в течение 3 минут

при 0.5'С. Как абразивный материал использовались стеклянные микрошарики диаметром 0.1 мм, которые добавлялись к суспензии в объемном соотношении 1:1. Мембраны разделяли в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы.

Для замораживания суспензия объемом 2 мл помещалась в трубочки (диаметр 1мм), сделанные из биологически инертного пластика удовлетворительно выдерживающего действие низких температур. Перед замораживанием трубочки запаивались горячим пинцетом.

Замораживание производили в морозильном шкафу 8апуо(Япония) до температуры -95-С. Применялись следующие скорости замораживания: 0.5\ >"', 50°, 100°С/мин. Для получения различных скоростей замораживания в рабочий объем морозильной камеры были установлены два вентилятора с электродвигателями постоянного тока.Подбирая соответствующие частоты вращения крыльчатки при помощи изменения подаваемого напряжения получали необходимые скорости потока воздуха, обеспечивающие соответствующую скорость охлаждения.Образцы хранились при температуре -95°С в течение 20 часов.

Изменение температуры регистрировалось при помощи медь-константановой термопары. Показания фиксировал вольтметр. Отогрев образцов производился на водяной бане при температуре 35°С.

Количество сохранных клеток определяли по окрашиванию клеток раствором метиленового синего (1:1 ООО).Окрашенный препарат рассматривался под микроскопом. Подсчет процента мертвых дрожжей производился после трехминутной экспозиции.

О генеративной активности судили по удельной скорости роста клеток. О ферментативной активности судили по подъемной силе клеток, которая определялась стандартным методом.

Исследование процессов фазовых переходов и льдообразования проводилось с помощью калориметрического устройства. В основу работы устройства положены две известные закономерности: процесс кристаллизации сопровождается значительными тепловыделениями(теплота фазового превращения), во время кристаллизации изменяется удельное сопротивле-ниезамораживаемогоматернала. При определении верхней эвтектической точки дрожжевых клеток, а также при измерении температуры фазового перехода в мембранах в целях исключения нуклеации в суспензионной среде применялся раствор непроникающего протектора ПУО-400, не оказывающего действия на биологические структуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании влияния темпертурной адаптации на криорези-стентность дрожжи культивировали при температурах 1>С, 25°С, 35°С и 40°С. Динамика накопления биомассы при разных температурах роста была различной. Оптимальной температурой для накопления биомассы и скорости роста является 35°С. Лаг-фаза при этой температуре составляет 2 часа, экспоненциальная фаза - 8 часов, а накопление биомассы было максимальным. Как при снижении, так и при повышении температуры наблюдалось замедление скорости размножения, длительность лаг-фазы составляла в среднем 2.5 часа, экспоненциальная фаза также увеличивалась. Накопление биомассы было снижено, особенно при температуре 15°С.

С помощью калориметрического метода были определены температурные диапазоны фазовых переходов липидов в мембранах. Ранее, методом дифференциально-сканирующей калориметрии, было установлено, что температурные границы фазовых переходов мембран и экстрагированных из них липидов совпадают. Поэтому, в калориметрическую ячейку была помещена суспензия мембран в растворе ПЭО-400.

Резкий скачок теплового потока соответствовал начальной температуре фазового перехода, возвращение теплового потока к постоянному зна

н

о 5 я 15 20 25 т

Рисунок 2. Зависимость оптической плотности суспензий дрожжей, выращенных при температурах 1?С( а). 25'С(6), 3?С(в). '4&С-(г) от температуры раствора хлористого калия.

чению соответствует температуре завершения фазового перехода.

Т

х

В

■о

о

-10 ■го ■38

-*

*

1 ■г у \

/ с

10 т?

-тн

Рисунок I. Зависимость температур фазового перехода от температуры роста Тр (Тк - конечные температуры, Тн-начальные температуры).

На рисунке 1 показана зависимость температурного диапазона фазового перехода от температуры культивирования. С понижением температуры роста температурное поле фазового перехода смещается в зону субнулевых температур. Если температуре культивирования 40°С соответствует температурный диапазон фазового перехода 3°Ст 22°С, то снижение температуры роста на 5°С дает в результате смешение нижней границы фазового перехода в отрицательную область. Субоптимальная температура роста !5°С обеспечивает полностью отрицательный диапазон фазового перехода.Как при повышении, так и при снижении температуры роста от оптимального диапазона 25° + 35°. температурное поле фазового перехода сужается.

Для исследования изменения осмотической активности при снижении температуры изучалась зависимость оптической плотности суспензий дрожжевых клеток в растворе КС1 от температуры (рисунок 2). У суспензий дрожжей, выращенных при температурах 40°, 35°, 25°С, оптическая плотность возрастала при достижении температур начала фазового перехода в мембранах. До достижения этих температур оптическая плотность не проявляет температурозависимого характера, оставаясь неизменной. Это говорит о том, что проницаемость мембраны для воды до начала фазового перехода остается постоянной. С началом фазового перехода водная проницаемость резко уменьшается, причем для данных клеток это происходит еще при положительных температурах.

Оптическая плотность суспензии дрожжей, выращенных при 15°С, оставалась постоянной во всем диапазоне положительных температур. Исходя из полученных результатов можно предположить, что и при отрицательных температурах водная проницаемость таких дрожжей будет достаточно высокой.

При изучении влияния температурной адаптации на криорезистентность было найдено, что наиболее губительной для всех культур является скорость замораживания 100°/мин (рисунок 3). При этом выживаемость не превышала 17%, хотя при микроскопированпи эти клетки почти не имели отличий от нативных. Оптимальными скоростями замораживания оказались 0.5" и 5°/мин. У каждой культуры имелся свой скоростной оптимум. С понижением температуры роста скоростной максимум смещается в сторону увеличения. Так при увеличении скорости на порядок с 0.5°С/мнн до 5°С/мин выживаемость дрожжей, выращенных при 25°С, возрастает с 62% до 68%, а дрожжей, выращенных при 15°С с 47% до 92%.

v. те а) «с аз.

40

Ж, Ж •с

ч

-- /

ч \ .....V ч

г—^

»0 и

Рисунок 3. Зависимость выживаемости от скорости замораживания дпя дрожжей, выращенных при температурах: 4(¥С(а), 3?С(б), 2? С (в), 1?С(г).

Рисунок 4. Зависимость выживаемости от скорости замораживания дпя дрожжей, выра щенных при температурах: 3?С (а,б) и 1?С (в,г) с добавками твина-80 в среду роста (б,г).

Была исследована криорезистентность дрожжей, выращенных анаэробно в обычной среде и в среде с добавлением твина-80 как источника ненасыщенной жирной кислоты. Анаэробно выращенные клетки имели во всем диапазоне скоростей замораживания низкую выживаемость, которая уменьшалась с увеличением скоростей (рисунок 4). Снижение температуры культивирования до 15°С лишь немного повышало резистентность клеток. Добавки в среду твина-80 привели к некоторому повышению выживаемости. Сочетание добавки твина-80 и снижения температуры роста обеспечило максимальную выживаемость при всех скоростях замораживания. На основании этого можно предположить, что инкорпорация жирной кислоты из среды имеет температурозависимыи характер.

В исследовании осмотической адаптации наличие в среде хлорида натрия увеличивало лаг-фазу и сокращало период интенсивного роста. Так при 3%-иой добавке соли замедление роста происходило на 6 часу культивирования, в то время как в контроле замедление имело место на 14 часу. Наличие 10% хлорида натрия в среде значительно угнетало рост дрожжей, фаза экспоненциального роста была выражена слабо, накопление биомассы составило всего 32% от контроля . Будучи потребляемым субстратом, другой оемолитик - сахароза оказывает на процесс роста меньшее влияние. Даже при концентрации сахарозы 10% накопление биомассы составило 89% от контроля.

Зависимость скорости роста дрожжей от концентрации хлористого натрия в среде имеет довольно сложный характер . При малых концентрациях соли происходит ускорение роста, который достигал максимума 0.185 ч> при концентрации соли 1.5%. При 3%-ной добавке скорость роста резко падала до 0.13 ч1. При увеличении концентрации скорость роста уменьшалась почти линейно, достигая значения 0.05 ч 1 при 10%-ной добавке.

Сахароза также увеличивает скорость роста при нарастании концентрации до 5%, где она достигает 0.17 ч1. Дальнейшее повышение содержания сахарозы в среде снижает скорость роста до 0.115 ч-' при 10% сахарозы.

я. Y.CB

п. V,СЕ-

J

/

s

у

у

Г*

у

/

КУ.

I ВС. У»

Рисунок 5. Зависимость накопления полиолов от концентрации сахарозы в среде роста.

Рисунок 6. Зависимость накопления трегалозы от концентрации NaCl в среде роста.

Адаптационные реакции дрожжей на повышение осмотического давления среды роста оказались различными и зависимыми от природы осмолитика.

При использовании в качестве осмолитика сахарозы, функцию осм»регуляторов выполняли в основном полиолы. Как при росте на среде с сахарозой, так и при росте на среде с хлоридом натрия, полиолы были идентифицированы хроматографически как маннит и в меньшем количестве инозит. Содержание" полиолов в клетках в исследованном диапазоне концентраций сахарозы возрастает от 5%СВ при 1% сахара в среде до 19%СВ при максимальной концентрации 10% сахарафисунок 5). Синтез трегалозы при повышенном синтезе полиолов сильно снижен.

Данные по влиянию хлорида натрия на накопление трегалозы представлены на рисунке Максимальное накопление трегалозы происходит при росте на среде с концентрацией соли 1.5%. Дальнейшее увеличение концентрации этого осмолитика в среде вызывает уменьшение содержания трегалозы.

R. мкм

-п-

^— - -Q

Рисунок 7. Зависимость радиуса теток от концентрации NaCl (1) и сахарозы (2).

При микроскопировании дрожжей, выращенных на различных средах с повышенным осмотическим давлением, наблюдались значительные изменения морфологии клеток. Так, при увеличении концентрации хлорида натрия до 3% размер клеток уменьшается от 2.9 мкм у контрольных клеток до 2.3 мкм (рисунок 7).

Изменялся не только размер клеток: но и их форма. Если в контроле содержание эллипсовидных клеток составляло приблизительно треть от общего количества, то уже с увеличением концентрации соли до 1.5% таких клеток оставалось менее 5%. При более высокой концентрации соли эллипсовидных клеток обнаружено не было. В средах с сахарозой уменьшение размера клеток происходит постепенно, достигая минимального при 10%-ной концентрации сахарозы.

Изменение общего влагосодержания массы отфильтрованных дрожжей имело различный характер при добавках хлористого натрия и сахарозы (рисунок 8 ). Минимальное влагосодержание 55% наблюдалось при росте дрожжей на среде с 1.5% хлористого натрия. Дальнейшее повышение концентрации соли приводит к увеличению влагосодержания, хотя оно и меньше чем у контрольных дрожжей.

Pucvhok 8.

' 100".

80",. 60% 40% 20% 0%

"Т

<► <

■ 1 [ • 1

кштро/ъ 1.5% isba 3%№Q 5%

3% 5% 10% стороы с&ароэы сзороэы

□ свдер*»*« свободной В садерш« сисд+юй Ш содерюне сухого вэдь( % вод=1 % еахрсгтга, %

Зависимость сотояния внутриклеточ ной воды и содержания сухого вещества от концентрации оскю-питикоа в среде роста.

-е%се

-и •»%св

—Аг- -12%СВ

-"ВИСВ

—о— -Т2Т1СБ*

ЮЭ Ю

Рисунок 9. Зависимость выживаемости дрожжей от содержания трегалозы и скорости замораживания.

V.

в> те

ег> »

•М-

т

------, *--—» ——

I- *

—_____

*

\ «

4 ад »О

Рнсунок 10. Зависимость выживаемости дрожжей от содержания полио-пов и скорости замораживания.

При увеличении концентрации сахарозы общее влагосодержание снижалось. Тенденция изменения количества свободной воды аналогична тенденции именения общего содержания воды.

Повышенное содержание трегалозы благоприятно сказывалось на криорези-стентность дрожжей (рисунок 9 ). У дрожжей с максимальным содержанием трегалозы выживаемость достигала 93% при медленном замораживании. При высоких скоростях замораживания трегалоза также оказывала защитный эффект, хотя и в несколько меньшей степени, чем полиолы. Интересно отметить, что дрожжи, имеющие одинаковую коцентрацию трегалозы 12%; но различные размеры клеток, различались по своей криоустойчивости. Наиболее устойчивыми к замораживанию оказались дрожжи с повышенным содержанием полиолов (рисунок 10). Увеличение концентрации полиолов способствовало повышению выживаемости как при медленном замораживании так и при быстром. Чем выше было содержание полиолов, тем меньше разница в выживаемости клеток, замороженных быстро или медленно.

При исследовании зависимости генеративной и ферментативной активности дрожжей от условий роста и скорости замораживания величина подъемной силы коррелировала с уровнем выживаемости, скорость роста, принятая за критерий генеративной активности, изменялась незначительно (таблица 1 ).

Изучение влияния биохимического состава на процесс льдообразования показало, что содержание резервного дисахарида трегалозы оказывает некоторое влияние на начальную температуру льдообразования . Так у контрольных дрожжей с содержанием трегалозы 6%СВ резкий скачок величины теплового потока, соответствующего началу кристаллизации, происходит при температуре -2.5°С, а у дрожжей с максимальным содержанием трегалозы 16% СВ - при-4°С. Полиолы оказались в большей степени способными понижать начальную температуру кристаллизации. Внутриклеточному содержанию полиолов 5%СВ соответствует температура нуклеации -3°С, а 19%СВ полиолов в клетке обеспечивает понижение этой температуры до -7°С.

Как полиолы, так и трегалоза оказывают заметное влияние на нижнюю эвтектическую температуру дрожжей. С увеличением содержания трегалозы темпе ратура полной кристаллизации снижалась. При повышении концентрации трегалозы от 6%СВ у контрольных дрожжей до 16%СВ нижняя эвтектическая точка сдвигалась с температуры - ЗЗ'С до -Зб'С . Наличие внутриклеточных полиолов еще более заметным образом влияет на снижение границ эвтектики. Так, при содержании полиолов!9% СВ в клетках, электрическое сопротивление суспензии достигло постоянного значения только при температуре -45°С. Характер льдообразования оказался зависимым от содержания внутриклеточных веществ.

Так при невысоком содержании полиолов и трегалозы в клетках имелась

Таблица I. Зависимость ферментативной и генеративной активности от условий роста и скорости замораживания.

скорость J выживаемость. I скорость роста. подоенная сила, 1

условия роста замораживания, % ч 1 мин

"С/мин

_ 1 100 0.14 65

температура рос- 0.5 65 014 88

та 35-С 5 44 0.12 110

50 14 0.08 отсутствует

_ 100 0.14 60

температура рос- 0.5 46 0.13 105

та 15С 5 96 0.14 71

50 42 0.12 112

_ 100 0.15 50

1.5%NaCl в сре- 0.5 93 0.14 Í8

дероста 5 91 0.14 70

50 87 С.Г2 77

— 100 0.15 58

10% сахарозы в 05 , 98 0.14 65

среде роста S 95 0.14 71

50 93 0.14 73 |

четко выраженная зона максимального льдообразования, лежащая в диапазоне -5 о с ^ -20"С. В таких клетках достаточно большой объем льда образуется уже на начальной стадии замораживания. При достижении 90% льда процесс льдообразования резко замедляется.Чем выше была концентрация полнолов и трегалозы в клетке,тем равномернее происходит льдообра-зование, зона максимального образования кристаллов была выражена не столь резко (таблица 2).

Таблица 2. Зависимость относительного объема льда от температуры и содержания трегалозы и полиолов.

Внутриклеточное содержание полиолов и трега- Температура. °С

лозы,%СВ 20% 40% 60% 80% 100%

5 - 10 - 14 - 19 -25 -38

полиолы 9 - 10 - 16 - 22 -28 -42

19 - 13 - 18 -24 -31 -45

б - 12 - 16 -20 -25 -33

трегалоза 12 - 12 - 17 -21 -27 -34

16 - 13 - 18 -22 -28 -36

На основе обработки полученных результатов была создана математическая модель, описывающая влияние некоторых параметров клеток на их криоустойчивость при различных скоростях замораживания: 8

V = 477.2 - 0:002596Т2 - 74.33R - 1.000КР - К, - 0.1375RW

где Т - начальная температура фазового перехода в мембранах,Кр - содержание полиолов, Kt - содержание трегалозы, R - радиус клетки, W - скорость замораживания. Результативным признаком является выживаемость.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Было изучено влияние температуры культивирования на физические свойства клеточных мембран. Показано , что субоптимальные температуры-роста обеспечивают смещение температурного диапазона фазового перехода липидов в мембранах дрожжевых клеток в отрицательную область.

2. Показано .что дрожжевые клетки, выращенные при субоптимальных температурах, имеют высокую криорезистентность.

3. Определено , что при росте в среде с добавками хлористого натрия в дрожжевых клетках аккумулируется резервный дисахарид трегалоза, а при росте в среде с сахарозой - полиолы.

4. Изучено влияние осмотического давления среды роста на морфологические особенности дрожжевых клеток . Повышение осмотического давления среды приводит к уменьшению размера дрожжевых клеток и изменению их формы.

5.Показано , что дрожжи с высоким содержанием трегалозы и полно-лов имеют повышенную устойчивость к высоким концентрациям солей.

6.При исследовании влияния внутриклеточных веществ на криорези-стентность определено , что дрожжи с высоким содержанием трегалозы и полиолов имеют высокую резистентность к действию низких температур.

7.При исследовании ферментативной активности замороженных-ото1ретых клеток было найдено , что она находится в прямой зависимости от их выживаемости. . ,

8.Генеративная активность замороженных-отогретых клеток изменяется незначительно. , ...

9.Процесс внутриклеточного льдообразования зависит от концентрации трегалозы и полиолов.При повышении содержания полиолов и трегалозы в клетках их эвтектическая зона при замораживании сдвигается в отрицательном направлении.

10. Повышение содержания полиолов и трегалозы в клетках обеспечивает более равномерное протекание процесса льдообразования.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Иванова В.Ю., Белуков C.B., Платов A.B. Влияние скорости охлаждения на сохранность пекарских дрожжей при низкотемпературном консервации // В сб. Материалы Международной научно-технической конференции "Пиша.Экология. Человек", Москва 1995г., с.44.

2. Платов A.B., Белуков C.B., Иванова В.Ю. Повышение выживаемости пекарских дрожжей в процессе замораживания посредством осмолити-ческих добавок в среду культивирования // В сб. Материалы Международной научно-технической конференции "Пища.Экология. Человек", Москва 1995г., с. 84.

3. Андреев Б.Ф., Коршунов А.З., Платов A.B., Белуков C.B., Иванова В.К'. Определение эвтектических зон в процессах замораживания пекарских дрожжей // В сб. Материалы Международной научно-технической конференции "Пища.Экология. Человек". Москва 1995г., с. 169.

4. Белуков C.B., Иванова В.Ю., Платов A.B. Повышение выживаемости микроорганизмов после замораживания-оттаивания при изменении условий культивирования II В сб. Материалы Международной научно-технической конференции "Пища.Экология. Человек", Москва 1995г., с. 210.

5. Платов A.B., Белуков C.B., Иванова В.Ю. Осмоадаптация дрожжей к условиям осмотического шока // Биотехнология, 1996, N8, стр. 53-54.

6. Платов A.B.. Белуков C.B., Коршунов А.З. Определение эвтектических зон биоматериалов // Биотехнология, 1996, N11, с. 60-62.

7. Белуков C.B., Платов A.B. НефеломеТрический анализ температуро-и осмоадаптнрованных дрожжей Saccharomyces cercvisiae как предварительная оценка их криоустойчивости II Биотехнология, 1997, N3, с. 55-57.

., 8. Белуков C.B., Платов A.B., Лемеш Е.Ю., Шишкина Ю.И. Изменение водной активности среды культивирования как способ повышения криоре-зистентности микроорганизмов //Труды МГАХМ, вып. 2, М., 1997, с. 70-74.

9. Белуков C.B., Платов A.B., Шишкина Ю.И., Лемеш ЕЛО. Влияние внутриклеточного содержания полиолов и трегалозы на эвтектические зоны дрожжевых культур //Труды МГАХМ, вып. 2, М., 1997,с. 81-84.