Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение криорезистентности дрожжей в зависимости от основных параметров культивирования

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изменение криорезистентности дрожжей в зависимости от основных параметров культивирования"

11а правах рукописи

ИВАНОВА ВИКТОРИЯ ЮРЬЕВНА

ИЗМЕНЕНИЕ КРИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ДРОЖЖЕЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОСНОВНЫХ ПАРАМЕТРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Специальность 03.00.23 — Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва — 1996

Работа выполнена на кафедре биотехники Московской Государственной академии химического машиностроения.

Научный руководитель: кандидат технических наук, доцент Белуков Сергей Владимирович.

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Волынец Анатолий Захарович, кандидат технических наук Крашенинникова Татьяна Константиновна.

Ведущая организация: ОАО «Биотехнология».

Защита состоится ^199-7^- г. вчасов на заседании диссертационного Совета Д 053 34 13 в Российском химико-технологическом университете имени Д. И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., 9).

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук ^ ^ ГУСЕВА

/

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В основе технологических процессов низкотемпературной обработки сырья, получающих все большее распространение в последнее время в силу важных преимуществ, таких, как высокое качество конечного продукта, эко-логичиость процесса и других, ясязгг ггронссс замораживания сырья. Низкотемпературные процессы обработки м i пгр о б и о л о п п еско го сырья имеют резкое отличие or аналогичных процессов в химической технологии. что обусловлено самоа природой обрабатываемого матернхча, поскольку, помимо общих характеристик качества готового продукта, особое значение имеет сохранение высокой жизнеспособности обрабатываемой суспензии микроорганизмов как в конце процесса, так и при храненнн.

Актуальной проблемой является также обеспечение консервации культур с сохранением их полезных свойств. Перспективы развития биотехнологии тесным образом связаны с irpiiotrorK-cpiiaimcíí микроорганизмов с целью их mpaimrpo-b:uhioio хранения [Сидякина, 19(12]. Для решения целого ряда научно-практических задач, связанных с использованием культур микроорганизмов, необходима надежная система поддержания и защиты штаммов-продуцентов в условиях научных организации и промышленных предприятий. Полом) особое значение прн-обрегаirr повышение крнорезнсгапносзн культур микроорганизмов уже в процессе их к> льтивировмння. что представляет большой интерес как в практическом, таг п п теоретическом отиошеннн. поскольку ведет за собой упрощение последующих процессов замораживания и низкотемпературного обезвоживания клеток без снижения их жизнеспособности и потери ими полезных свойств и в то же время нозво.тяет пз\ч1иь пиишшровапне защитных щюцессов в клетке еще на стаднн к>.'Ц>швпровапш1. чю яв;шс1ся одним in наиболее иерендгишных иаираьленнн |1>екер. 1987].

I) некоторых работах указывается прннпнпшшьная возможность повышения крнорезнстентностн культур при различных режимах культивирования ( Ку-локопнева. Н'ХЛ: Ney, Araki, Matsusaka, 1969; Morris, Clark. 1978; Lewis et al.. 1993 и др.]. Тем не менее анализ влияния факторов культивирования на последующую ■.кпзпесиосоОноеть микроорганизмов проводился лишь качественно. Попытки количественной оценки влияния различных параметров к\льтнпировапня, а также их взаимосвязи на криорсзпстсптносп. микроорганизмов до сих пор ис (гроаодн-лпсь.

Таким образом, исследования по разработке методов культивирования штаммов микроорганизмов с целыо повышения резистентности клеток к повреждающим воздействиям низких температур являются шсгуштьнымн и ощечшот потребностям дальнейшего развития биотехнологии.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось изучение основных параметров культивирования микроорганизмов на их последующую криорезнстентность. а также их взаимосвязи с основными параметрами замораживания п определение оптимальных ре:кнмов культивирования клеток.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1) определение криорезнстснпюстн как неотъемлемого свойства различных штаммов микроорганизмов, в частности, штаммои дрожжей;

2) исследование влияния интенсивности аэрации на криорезнстентность различных штаммов пекарских дрожжей:

3) изучение влияния величины рП культуральной среды на крнореппегент-пость штаммов пекарских дро;кжсп;

4) исследование влияния температуры культивирования па криорс шетепт-пос1Ъ штаммов пекарских дро;кксй;

5) аихшз шанмосвязн параметров культивирования с целыо определения ошнмши.ных областей их значении:

6) исследование изменения подпои проницаемости клеток дрожжей, выращенных при различной пнтспсппностн аэрашш, величине рН срсд;.! н температуре культивирования н анализ ее г.запмосвязн с крнорсзнстснтностыо клеток:

7) изучение влияния скорости охлаждения в широком диапазоне се значении па к-рпорезнстецпюсгь клею к", выращенных при различных ре-.кнмах культивирования;

8) изучение влияния конечной температуры охлаадеппя па криорезнстентность клеток дрожжей при различных режимах культивирования;

9) определение начальной крноскопнческон. эвтектической температур и продолжительности эвтектической зоны для штаммов дрожкей, выращенных при различных условиях культивирования;

10) исследование изменения крнорезистентпостн штаммов дрожжей в зависимости от фазы роста при различных режимах кульпшнрованпя;

11) определение оптимальных режимов культивирования штаммов пекарских дрожжей для достижения их наибольшей криорсзистспшостп.

Научная новизна.

Проведены количественные исследования влияния уровня аэрации при культивировании штаммов пекарских дрожжей Эпссаготусез сеггУ1з1ае МДЗ н Зассагогоусез сегсУ151ае № 273 на их крнореэнстентность; показало, что зависимость криорезнстигпюсгн от уровня аэрашш является неотъемлемым свойством штамма.

Проанализирована взаимосвязь различных факторов культивироваиия (интенсивности аэрашш, величины рН культур пльноЛ среды, температуры культивирования^ и замораживания (скорости н конечной температуры охлаждения) при изучении крнорсзнстеитностн штаммов пекарских дрожжей, а также определена область их оптимальных значений.

Определены начальная криоскопнческая, эвтектическая температуры и эвтектическая зона для данных нгглммов дрожжей.

Установлена корреляционная зависимость между крнорсзистситиостмо клеток дрожжей, выращенных в различных условиях, и фнзнко-хпмнчсскнми факторами замораживания.

Пра>т1чеа<ая^сппостъ_^абрть1 определяется тем, что разработаны оптимальные режимы кульгивпропопня производственно важных рас пскдрских и пивных дрожжей с целью повышения их крнорсзнстснтносп! при низкотемпературном консервнровпннн, оггределены оптимальные значения параметров процесса замораживания. Определены начальная криоскопнческая и эвтектическая температуры для данных штаммов дрожжей. Разработаны практические рекомендации для культивирования дрожжей, подвергаемых в дальнейшем низкотемпературной обработке.

Теоретическое значение представляют результаты нсследова1и1Й по влиянию аэрации, температуры культивирования, величины рН среды культивирования, возрасга культуры на криореэпстснтносгь клеток без крнопро гскторов; обобщены зависимости крнорезнстентностн клеток от скорости охлаждения, исследованы эвтектические зоны дрожжевых клеток.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих научно-технических конференциях:

- XI.VI научно-технической конференции МГАХМа (Москва, 1995 г.);

- Международно« научно-техинческон конференции "Пиша. Экология. Человек" (Москва, 1995 г.);

- Международном научном симпозиуме ЮНЕСКО "Техника н технология экологически чистых химических производств" (Москва, 21 - 23 октября 1996 г.).

По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора шггературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложения н анализа полученных результатов, выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 68 рисунков и 23 табшты. Библиография включает 178 источников, опубликованных в отечественных н зарубежных изданиях.

2. ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Объектом исследований служили дпе расы дрожжей Бассаготусез ссгсу151ае - пекарские дрожжи Зассаготусеэ ceгcvis¡ae МДЗ, полученные на Московском дрожжевом заноде, и пивные дрожжи Бассагошусез сегсушае ЛА 273, получешше на Московском пшюппренном заводе. Полученный материал хранился в пробирках на поверхности скошенного МИД. Пересев материала осуществлялся периодически через 2 недели. При проведении экспериментов посевной материал вначале выращивали в посевных колбах с синтетической питательной средой (глюкоза - 60,0 г/л; (ШиьЧО«. 4,0 г/л; КП21'0« . 1,00 г/л; К.С1 - 0,15 г/л: 7Н2О - 0,20 г/л: СаСЬ безподи.- 0,05 г/л: дрожжеиой автолизах • 50 мл/л). При проведении анаэробного культивирования клетки выращивались в конических колбах с рабочим объемом заполнения среды 50 мл, закрытых резиновыми пробками с сернокислотным затвором. При проведении аэробного культивирования клетки выращивали на качхтке в колбах Эрленмсйсра объемом 750 мл с рабочим объемом заполнения среды 50, 100 и 150 мл, чго обеспечивало различную интенсивность аэрации Кл, оценивавшуюся в сульфитных числах по методике Мсниелл и Меннслл н составившую 2,2. 1,1 н 0.43 гО>/л ч соответственно (при анаэробном культивировании значение Ка было принято равным 0). В этих опытах культивирование осуществлялось при темнерат>рах 15, 20, 25 и 30 "С . Для достижения более высоких эначенш1 сульфитных чисел - 8 г Ог/лч - проводит!

кулътшшровшшс клеток дрожжей в лабораторном ферментере объемом 1 л с рабочим объемом заполнения среды 0,5 л при температуре 30 "С . Регуляцию величины рН культуральнон среды осуществляли с помощью фосфатно-шлратного буфера. Исследуемы/! диапазон вегарпшы рН составил 3-6 едшпш, что соответствует физиологическим значениям рН для пекарских дрожжей. Постоянное значите рН поддерживали путем добавления 10% раствора КОН. Контроль кислотности осуществлялся на рН-мегре фирмы Sony (Япония). Культивирование клеток осуществляли до начала стационарной фазы роста, которую контролировали нефеломстрическнм методом на фотоспектрометре ФЭК-2.

По окончании культивировании суспензию клеток дрожжей центрифугировали на лабораторной центрифуге Т-34 при скорости 6000 об/мин в течение 10 мин и затем рссуснснднровали в дистиллированной воде либо в растворе хлорида натрия (при нзучетгн водной проницаемости) до Koimeinpainm Ю'-Ю" кл/мл. Конечную концентрацию клеточной суспензии контролировали нефсломстрнче-скнм методом.

Приготовленную клеточную суспензию разливали по 2 мл в пробирки из термостойкого стекля и замораживали до конечной температуры -70°С или до требуемой конечной температуры, помещая гтроб1гркп в морозильный шкаф фирмы Sanyo (Япония) с различными скоростями охлаждения (0,5; 1; 5; 10 °С /мин). Скорость замораживания определяли по скорости понижения температуры в замораживаемом объеме суспензии, используя показания погруженной в нее медь-константановон термопары. Для получения высоких скоростей замораживания суспензию в пластиковых контейнерах объемом 0,1 и 0,3 мл погружали в жидкий азот с температурой -196 °С . После выдержки при конечной температуре охлаждения в течение 30 мин суспензию размораживали на водяной бане со встряхиванием при температуре + 37 °С .

Опредслате жизнеспособности размороженных клеток производили по двум методикам: в качестве калибровочного использовался метод мнкрокультур по Лусга, основанный на репродуктивных способностях клеток; основшлм был экспресс-метод дифференцированного окрашивания живых и мертвых клеток витальным красителем мстнлсновым синим. В качестве контрольных использовали дрожжевые суспензии, суспендированные в дистиллированной воде и не подвергаемые воздействию замораживания. Морфологическую характеристику клеток

дрожжей до и после холодового воздействия изучали с помощью световой микроскопии.

Водную проницаемость клеток оценивали по методике осмотического шока (ЬГеу, Агак|, Ма15и5ака) при резком или постепенном экспонировашш клеток к растворам хлорида натрия различных концентраций и последующем измерении оптической плотности раствора нефслометричсским методом, а также оценке жизнеспособности клеток.

Измерение начальной крносконической н эвтектической температ>р дрожжевой суспензии производит калориметрическим методом.

Экспериментальные данные обрабатывали методами математической ста-

тисп001.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нссладппа1М1с_цпмс|1с^ц1ХЬТ!!Щ^Н 1стситности дрожжевых клеток 1фи раз: личных условиях культниироваиия с различными скоростями замораживания проводили в три этана: для клеток, выращенных в анаэробных условиях, в колбах на качалке н в ферментере. Во всех экспериментах варьировали значения величины рП и температуру культивирования. Зависимость крнорсзнстеншостн от скорости охлаждения имела ¡¡-образный характер, аналогичный представленному на рис. I и 2. Все графические зависимости показали наличие максимума жизнеспособности п области низких скоростей охлаждения, причем для культур дрожжей, пырашспнмх в .пробных условиях, он составляет 0.5 - I "С /мни, а дня культуры, выращенной в анаэробных условиях, максимум смсшсн вправо и составляет I - 10 °С /мин.. По мере увеличения скорости охлаждения жизнеспособность клеток падает и стабилизируется в области значений скорости охлаждения 1000 °С /мин. Эти результаты хорошо согласуются с теорией о механизмах повреждения клеток при замораживании, учитывающей в качестве повреждающих факторов повыше-, ннс концентрации растворенных электролитов в клетках прп вымерзании внутриклеточной воды , что имеет место прп низких скоростях охлаждения, и механические повреждения клеток образующимися кристаллами внутриклеточного льда. В соответствии с этой теорией наибольшая криорезнстентность клеток наблюдается при наименьшем суммарном воздействии обоих факторов, что по полученным

100;

2 3

1д VI„„ "С/мин

2 3

1д \Л/,„, *С/мин

Рис. I. Или чипе скороспг охллжлсния //./ криорстасптость анаэробно пыратснних культур 5. сг; сунис Л /, 13 и Л". 1'г/сI Лл/с ЛГ127.7.

1 - \ г М.11 /•// Л<-1. - 15 "С

2 - 5. с.№ -?7_?: рЧ 5.4; г, - ГУ "С

3 - 5. с А1ДЗ: ГИ 3.О: г, - ."У "С

4 - V е МДТрИ 4.2: I, ~ 20 "С

5 - 54-.л:' 273: рП 4.2:1. - 25 °С

6 - Ь'.С.М'273:р! 13.0:1. =30 "С

Рис.2. Влияние скорости охлаждения пи криорсзиаснтносп, аэрированных культур З.есгс\-!51ас МДЗ исас\¡.■нас Л'.- 273.

1 -рН 5. 4: 1. - 20 "С KJ - 2.2 г О/л- ч

2 - рН 4,2:!. - 20 "С: KJ = 1.1 г О/л-ч

3 - рН 4.2: г, - 20 "С: /О -- 1.1 гО/лч

4 -рПЗ.О: "С: К., = 1.1 гО/лч

5 - рН 4.2л, - 30 'С: KJ - и. 43 г О/л ч

1.2.4 -5.С.ЛШ; 3.5

экспериментальным данным должно иметь место при низких скоростях охлаждения порядка 1-10 °С/мин.

При згом у шсюк, выращенных в анаэробных условиях, жизнеспособность после спаивания значительно шгже, чем у клеток, пмрашеппмх при наличии аэрации, во всем диапазоне скоростей охлаждения и максимальное ее значение составляет 30 - 40 % от контрольной при температуре культивирования 30 °С ,45 -60°о от контрольной при температуре культивирования 20 °С и Л0-Я0°'о от контрольной при температуре культивирования 15 °С , в то время как ахя культуры, выращенной при наличии аэрации, соответствующие значения жизнеспособности составляют 70 - 80%, 80 - 90% и У0 - 100% от контрольной соответственно. При сверхвысоких скоростях охлаждения рпзшша в крпорс*шс1ен I ностн аэрированных и анаэробно выращенных клеток менее заметна и составляет 5 - 10%.

При исследовании криорезпстагтностн клеток дрожжей, пыращенных в условиях высоких сульфитных чисел, кроме того, было подтверждено, что крио-рсзнстситность дрожжевых клеток штаммов МДЗ и № 273 зависела от фазы роста при всех режимах культивирования и была наибольшей в конце периода активного деления клеток (рис.3 и 4). При этом отмечена обратная зависимость между скоростью роста клеток и нх крпорезнетентностыо: при значении рН среды культивирования 4,2, наиболее благоприятном для роста клеток, нх устойчивость к воздействию низких температур понижалась. При более щелочном значениях рН, рапном 5,4, крнорсзпстентность составила 99% при замораживании в дистиллированной поде со скоростью 1 °С /мин II 72% при замораживании со скоростью 1500 °С/мнн.

Следует также отмстить, что при замораживании в среде культивиропання крнорезнстентиость гасток оказалась иышс в среднем на 5 - 12%, чем при замораживании и дистиллированной иоде, что связано с наличием п куш.туршп.ной среде

I

V,% X, г/л V,% X, г/л

Рис.3. Влияние фазы роста и скорости заморажипання на криорапаагпюсгъ 5. сегсп'м'ле МДЗ при культипнроианин а ферментере.

1 - количество биомассы

2 и 3 - крпорсаистентность при = ¡Т/мии и 15(Ю*СЛшн соответственно

Рис.4. Влияние фазы роста и скорости замораживания на крпорезнстентностъ S. cerevisiae ЛЬ 273 при кулмнвнрова-ннн о ферментере.

1 - количество биомассы

2 ;/ 3 - крпорсзистсптиостъ при 11V, = 1°С/мнн и 1300°С/мнн соответственно

веществ, оказывающих защитное действие на клетки при замораживании и оттан-вшшн.

На рис. 5 и 6 приведены обобщенные данные по влиянию температуры культивирования на крнорезистентность обоих исследованных штаммов. Наибольшая выживаемость была отменена при температуре культивирования 15 °С и составила при оптимальной скорости охлаждения 95 - 100% от контрольной для аэрированных культур и в среднем 80 - 85% от контрольной для анаэробно выращенных культур, а при сверхвысоких скоростях охлаждения - 35 - 45% и 40 - 52% соответственно. Наименьшая выживаемость Сила отмечена при тсмпср-иуре культивирования 30 °С и составила при оптимальной скорости охлаждения у анаэробных культур 25 - 40% от контрольной и 55 - 75% от контрольной у аэрированных культур, л при сверхвысоких скоростях охлаждения, - 5 - 15% и 10 - 40% от кон (рольной соответственно.

V,0; V,0/«

«„ *С ~ V,

Рис.5. Влияние температуры ЛТ.7Ь тнвиров.шня на крнорезисюгт-пость 5, ccre4.si.ie МД1.

1 -рН 5.4;^ - 1.1 гО/лч

2 -рН 4,2; KJ ~ 2.2 г О/л ч

3 - рН 3.0: К! -0,43 г О/лч

4 -р115,4; К ^ = О

5 -рЧ 3.0; KJ - О

Рнс.6. Влияние температуры культпвпроиапня на крнорезистентность 5. тсУК1асЛ'.' 273.

1 -рН4,2;КЛ= 2,2 г О/л-7

2 - рН 3,0; АО = 0,43 гО/лч

3 - рН 5,4; К<1 -0,43 г О/л-ч

4 -рИ 3.0; К., ~ О

5 -рИ4.2;^=0

На рис. 7 п 8 приведены обобщенные данные но влиянию величины рН на крнорезнстентность обоих нсследуемых штаммов. При изучении крнореэнстект-ности дрожжей и области значений рН 3-6, соответствующей физиологическим значениям рП для пекарских дронокей, максимальный рост клеток у обоих штаммов был отмечен при рН 4,2 ±0,1.

У,'/о

1« = 20 °С: Км = 1.1 г О./л ч I, = 20 °С

Гис.7. Влияние величины рИ срс.чы ку.чь птпрошшия ни крнорезн-пептнот Я. саепнле :\//{3.

1 - и <>1.7 = 0.5 'С/мин 1 - И ох/ = I -С/мин

3 - Н»х/ -г Ю 'С/мин

4 - И 'охл = 1000 'С/мни

5 - \Уохл ~ 1500 -С/мин

Рис.3. Влияние величины рН среды кулыиаиротшия ни крнорези-аетноегь Я. еегсуш/ле .Л:' 273.

1 - Паи = О.УОмин: Ки=1.1 гОУлч

2 - Н'ол.7 = 10'С/мин: 1.1 гОУлч

3 - И'аг.7 = ГС/мпн: К^ 0.43 гОУлч

4 - » <>л'.7 = 10 "С/мин: А',, = 0

5 -Н'ох7- ПОО'С/мнн: К^0.43 г О./л ч

Криорезнстснтность клеток при значениях рН 3 - 4,2 оказалась меньшей, чем при более щелочных значениях рН. Так, при рП 5.4 ± 0,1 жизнеспособность анаэробно выращенных клеток оказалась в среднем па 10 - 12% выше, чем при рН 3.0 ± 0.1 п 4.2 г 0.1, а при лырашпваппн в ферментере с рП 5,4 т 0,1 жизнеспособность клеток составила ЮО^'о по сравнению с контрольной. При значении рН 4,2 в ряде опытов жизнеспособность оказхтась минимальной. составив па 2 - 6?'о шгже, чем при Солее кислом значении рН.

Табл.1.

Шшяипе 11НТСНСИШ10СТН аэрашш на крнорсзнстснтность 5.ссгс>15ше МДЗ и З.сегечтяьзе № 273 при различных скоростях замораживания.

Уровень ачрапин ка, гО> /л • ч 0 0,43 1,1 2,2 8,0

Скорость замораживания, "С/мпн 0",5 1 10 0,5 1 10 0,5 1 10 0,5 1 10 0,5 1 10

Криорсзнстслтнопь Я.сегеуЫас МДЗ , % 45+3 51±3 69^4 89±5 79гЗ 60+1 92±3 87±3 78±2 92±2 90±2 82±1 97±2 95+3 -

Крнорезистснтиость З.ссгсуыас N 273 , % 3914 48±3 5512 94+4 91 98+3 82±1 9014 9813 86+4 83±2 84+1 90+4 96±3 -

В результате проведенных экспериментов выявлено влияние аэрации на криорезнстснтность клеток дрожжей. Во всех случаях клетки, выращенные в условиях аэрации, оказались более устойчивыми к воздействию низких температур, чем анаэробно выращенные. При этом для штамма Зассагошусез сеге^ае МДЗ была выявлена четкая корреляционная зависимость между уровнем тратт и криорезнстсттюстью (см. рис. 9): при увеличении количества растворенного кислорода в культуральной среде крнорезнстентность клеток повышалась, наиболее резко это было выражено при увеличении значения сульфитного числа от 0 до 0,5 г Ог/л ч. Для культуры З.ссгегаЬе Ла 273 такой корреляции не обнаружено, хотя крнорезнстентность клеток, выращенных п условиях аэрации, также значительно превышает крнорезнстентность клеток, выращенных в анаэробных условиях (см. табл. 1).

С целью проверки гипотезы о том, что наличие аэрации влияет на волную проницаемость клеточных мембран дроисксн, были проведены эксперименты по оценке водной проницаемости клеточных мембран метолом осмотического шо-ка(\'су, 1969): клетки эксионнровалн к растворам хлорида натрия концентраций

1 - рН 5.4; Ип с7 =/ "С/мин

2 -рН4.2: »'<>1.7 -ГСЛпш

3 - рН3,0; И'ао -ГС/мни

4 - рН 5,4:Н-ам-!Ш'СЛ<ш1

5 -рИ4.2;\\о\.7 -1тХУм1ш

6 - рИ 5.4;\Уо\л -¡^Ш'С'мш:

]>ис.9. Влнянне тпен-сивносп! а эр.ниш на крнорезнстентность клеток Ял'сигоппссз ccrcyisi.iL- МДЗ.

0; 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 н 1М. Результаты эксперимента представлены на рис. 10 - 11. Как видно из дашпдх, прпведешплх на рис. 10, оптическая плотность

10О

О

1 1 т

3

/ д 5 ■—

/ У

ТгГ?

0 0,1 0.2 0.3 0,4 0.5 0,6 0,7 0,8

С,,^, м

Рис. 10. Изменение оптической ¡потностн н ж}пиеспособности клеток дрожжей пол воздействием осмотического шока. V: 1 - KJ = О. 43 гО/лч

1 -К<=2.2 гОУлч

3 = 1,1 гОУ.тч

1)1 О. 43 гОУлч

5 -Л',, = 1.1 гОУлч

6 -К4=2.2 гОУлч

1,08

А

V 1 _

0 ГУ

г У

\ С .л п >— —

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0.5 0,6 0,7 0,8

Рис. 11. Влияние осмотического

0 бсзвожишния ни крнорезнстент-иость клеток дрожжей.

1 - 2.2 гОУлч 1 -Кл = 1,1 гО/лч 3-Кл = 0

дрожжевой суспензии вначале падает с"увелнче1П1ем молярностн раствора ЫаС1, а затем увелзгчивается, что связано, вероятно, с нзменеш!ем оптической плотности самой суспендирующей среды. Наибольшее изменение оптической плотности суспензии отмечалось при максимальном значении сульфитного числа н свидетельствовало о наиболее высокой водной прошшаемостн мембран, наименьшее - у анаэробно выращенных клеток. При оценке жизнеспособности нанбога.шая выживаемость клеток была отмечена при значениях молярностн солевого раствора, близкой к изотонической (0,1 - 0,2 М).

При заморажпвашш суспензш! в солевом растворе с разлитыми конпент-рацпямп КаС1 при скорости замораживания 1 и 10 "С /мин, как представлено на

рис.11, криорезнстснтностъ клеток вначале резко падала с 80 - 90% до 30 - 40%, что было связано с добавлением в среду замораживания ионов С1-, обладающих умеренно летальным действием. При концентрациях хлорида натрия, превышающих изотоническую точку, крнорезнстс1ГГностъ клеток начинала возрастать и прн увеличении молярностн раствора выше 0,4 М становилась постояшюй, что свидетельствовало об осмотическом обезвоживании клеток и уменьшешш обра

1-рН 5,4; К,=2.2гО,/лч

2-рН 4,2; К,=1,1гСулч

-20 -150 -100 -50 Конечная температура охлаждения, °с

V,% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 0

1-рН 4,2; К„=1,1гО,/лч

2-рН 4,2, К,=0,43г0/лч

-230

V.% 100

90

80

70

60

50

40

30

20

0

Конечная температура охлаждения, "с

Рис. 12. Влияние конечной температуры охлажлення па крнорезпетепт-ность S. ceievisiae МДЗ.

Рнс. 13. Влияние конечной температуры о.хлажления на крнорезистатт-иостъ S. cerevisiae Л:' 273.

зовання внутриклеточного льда. Подобная кар nina была отмечена у клеток при различных режимах культивирования.

При изучении взаимосвязи конечной температуры охлаждения и крнорези-стеитностн клеток, представленной на рис. 12, наиболее летальным оказался диапазон температур от -5 °С до -50 °С, где наблюдалась наибольшая потеря жизнеспособности клеток дрожжей обоих штаммов. Было предположено, что это связано с низкими скоростями охлхкдения в эвтектической зоне. Ниже температуры -50 СС темны гибели клеток резко замедлял] 1сь. Для проверки этой гипотезы были проведены исследования по определению эвтектической зоны дрожжевых клеток, которые показали, что у клеток, обладавших наибольшей крнорезн-

стентностью, эвтектическая зона находилась в диапазоне температур от -1,5 "С до -45 "С, в то время как у клеток, более чувствительных к воздействию низких температур, эвтектическая зона находилась в диапазоне температур -1,5 °С до -60 °С.

клеток Басхииотусез сегетие МДЗ.

тя клеток дрожжей Биссатошусез сегеувме МДЗ.

Взаимосвязь параметров культивирования н определение их оптимальных значен)гй для лостижстш наибольшей криорезнстептностн клеток.

В результате проведенных экспериментов по влиянию параметров культивирования на крнорезнстентность клеток дрожжей проведена с помощью графического метода оценка н предложен графический метод, позволяющий выявить оплгмальные параметры культивирования с целью получмшя клеток с максн-

мольной крнорезистентпостыо. С этой целью были построены поверхности, являющиеся графическими зависимостями криорезистситиости от соответствующих параметров культивирования (рис.14 - 15). При сечении полученных поверхностей плоскостями, соответствующими заданным значениям крнорсэистентиости культуры, были получены следующие области значений параметров культивирования, обеспечивающие заданную криорезнстентность. Так, для штамма S. cerevisiae МДЗ нрн температуре культнвнровшшя 30 °С область значений сульфитных чисел, обеспечивающая криорезнстентность не ниже 90°,'о, составляет 6,3 - 8 г Ch/л ч и выше, при температуре культивировать, равной 15 °С , эта область состав1гт 0,6 - 8 г Oi/л-ч и выше, при 20 °С - 1,5 - 8 г Oj/л-ч, при 25 °С - 3,6 - 8 г Ол/л ч. В то же время при величине pli среды культнвнровшшя, раиной 4,2, температура культивирования не должна превышать 20 °С , a прн рН 5,4 - 25 °С . У штамма S. cerevisiae /А 273 для достижения криореэнстснтности не ниже 90% температура культивирования не дошкна превышать 20 °С , рП среды культивирования желательно поддерживать в диапазоне 4,8 - 5,4, культивирование должно проводиться в условиях аэрации.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Исследовано влияние параметров культпвпропання на криорезнстсит-пость клеток дрожжей S. cerevisiae МДЗ и S. cerevisiae Ni 273. Показано, что велн-4inia рН среды культивирования, температура культивирования и степень пасы-ШС1ШЯ культуральнон среды кислородом являются основными факторами, влияющими на последующую криорезнстентность клеток. .

2. Определена зона оптимальных значений рН, прн которых достигается наибольшая криорезнстентность клеток дрожжей.

3. Определена зона оптимальных значений температуры культивирования и при которых достигается наибольшая крнорезнстс!ГПЮсть клеток дрожжей.

4. Определена зона оптимальных значений интенсивности аэрашш, косвенно выраженная в сульфитных числах, прн которых достигается наибольшая криорезнстентность клеток дрожжей.

5. Показано, что конечная температура охлаждения суспензии клеток оказывает значительное влияние на криорезнстентность. С целью определения мини-

малыюй конечной температуры охлаждения определена эвтекттеская точка дрожжевой суспензии с помощью калориметрического метода, а также исследовано влияние параметров культивирования на положение эвтектической точки и дгпгтельность эвтектической зоны суспензии.

6. Методом математической статистики н корреляционного анализа определены оптимальные значения параметров культивирования и режимы замораживания суспензии дрожжей.

7. Определены характеристики культивиропания промышленных нгтаммов 5.сеге\ч51ас МДЗ и З.сегсуз51ае >А 273 для промышленного использования в низкотемпературных технологиях. Разработаны рекомендации по культивированию дрожжей, в дальнейшем подвергаемых низкотемпературным технологиям.

По теме диссертации опубликованы следующие работ:

1. Иванова В.Ю., Белуков C.B., Платов A.B. Влияние скорости охлаждения на сохранность пекарских дрожжей при низкотемпературном консч)Внрованин // В сб.: Материалы Международной научно-технической конференции "Пища. "Экология. Человек", Москва, 1995 г., с.44.

2. Платон A.B.. Пелуков C.B.. Иванова В.Ю. Повышение выживаемости пекарских „грожжеп в процессе замораживания посредством осмошггических добавок в среду культивирования II В сб.: Материалы Международной научио-технпчсской конференннп "Пиша. Экология. Человек", Москва, 1995 г.. с. 84.

3. Андреев Е.Ф.. Коршунов А.З., Платов A.B.. Белуков C.B., Иванова В.Ю. Oifpe-деленне эвтектических зон в процессах замораживания пекарских дрожжей II В сб.: Материалы Международной научно-технической конференции "Пиша. Экология. Человек", Москва, 1995 г., с. 169.

4. Белуков C.B.. Иванова В.Ю.. Платов A.B. Повышение выживаемости микроорганизмов после зпморажиппння-оттанпання при изменении условий культивирования II В сб.: Материалы Международной научно-технической конференции "Пиша. Экология. Человек", Москва, 1995 г., с. 210.

5. Андреев Е.Ф.. Белуков C.B.. Коршунов А.З., Иванова В.Ю. Определение эвтектических зон многокомпонентных ор|аннческнх и биологически активных растворов при охлаждении и оттаивании II Химическая пр-сть. 1996, 8, с.

6. Иванова В.Ю., Белуков C.B. Повышение криорезистектност пехараснх дрожжей как результат изменения условий их культивировашш II Биотехнология, 1996, № 8, стр. 50-52

7. Платов А.В., Бслуков C.B., Иванова В.Ю. Осмоадагтшня дрояокей к условиям осмотического шока//Биотехнология, 1996, M 8, стр. 53-54