Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное изучение условий, определяющих доминирование дрожжей P. Candida при непрерывном культивировании в незащищенных условиях

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стрельникова, Татьяна Львовна, Москва

£-/ : О а - Я / о а Г) - СЙ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОСИНТЕЗА БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ

На правах рукописи

СТРЕЛЬНИКОВА ТАТЬЯНА ЛЬВОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ДОМИНИРОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ Р.САЫОЮА ПРИ НЕПРЕРЫВНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В НЕЗАЩИЩЕННЫХ УСЛОВИЯХ.

( Специальность 03.00.23 — Биотехнология)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, член-корреспондент Технологической АН РФ профессор Н.Б.Градова

¡У

Москва 1998

—я

Содержание С/?г£>

Общая характеристика работы ^

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Требования к свойствам промышленных микроорганизмов и методологические подходы к оценке новых штаммов.

1.2. Микробные консорциумы и типы популяционных взаимодействий. 12.1. Популяционные взаимодействия микроорганизмов.

1.2.2. Влияние физиологических свойств и параметрических факторов на конкурентоспособность микроорганизмов.

1.2.3. Особенности культивирования и взаимодействия микроорганизмов при высокой плотности популяции.

1.2.4. Прогнозирование исхода конкуренции между популяциями микро- ^ £ организмов.

Глава 3. Метрологические исследования.

3.1. Метрологическая оценка методов определения концентрации биомассы дрожжей.

3.2. Метрологическая оценка метода идентификации штамма Candida maltosa ВСБ — 744 в смешанных культурах.

iO

ЛГУ 3Z

Глава 2. Объекты и методы исследования. Ч б

SO S3

Глава 4. Взаимосвязь кинетических характеристик роста и конкурентоспособности дрожжей р.Сапй1с1а.

4.1. Кинетика роста и конкурентоспособность углеводородокисляющих дрожжей.

4.1.1. Выбор вида зависимости между удельной скоростью роста дрожжей С.гидоэа и концентрацией субстрата.

4.1.2. Влияние температуры на рост дрожжей С.гидоэа и СЛго^сайв.

4.1.3. Прогнозирование исхода конкурентных взаимоотношений углеводородокисляющих дрожжей при разных температурных режимах.

6G

££

-б-

so

4.1.4. Влияние pH на рост термотолерантных парафинокисляющих дрожжей С.rugosa и C.tropicalis.

4.1.5. Прогнозирование исхода конкурентных взаимоотношений парафинокисляющих дрожжей С.rugosa и C.tropicalis при разных значениях $ pH среды.

4.1.6. Выбор оптимальной скорости протока среды для культивирования штамма С rugosa ВСБ — 925. 4.2. Кинетика роста и конкурентоспособность этанолусваивающих дрожжей.

4.2.1. Влияние температуры на рост этанолусваивающих дрожжей. 9 Ц

4.2.2. Определение кинетических характеристик роста. $ ^

4.2.3. Прогнозирование исхода конкурентных взаимоотношений этанолусваивающих дрожжей на основании анализа зависимости ц / S. ^f О3

Глава 5. Исследование физиологических свойств этанолусваивающих штаммов дрожжей p.Candida и условий их культивирования, влияющих на конкурентоспособность.

5.1. Влияние растворенного кислорода и концентрации остаточного Ц О субстрата.

5.2. Влияние изменений состава минеральной среды. ИЗ

5.3. Влияние продуктов метаболизма. -fi £

5.4. Особенности конкурентных взаимоотношений дрожжей при культивировании с высокой плотностью популяции. -iZ 1

Глава 6. Обсуждение результатов 7V) Ч

Выводы i 3

Список литературы. i ЧО Приложения

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Практическая деятельность человека в области прикладной микробиологии связана с использованием разнообразных консорциумов микроорганизмов, выделенных, как непосредственно из природных сред, так и искусственно созданных человеком.

Ни в природных условиях, ни в биотехнологических процессах микроорганизмы не развиваются в чистой культуре [55,102]. Исключение составляют небольшие по объему производства вакцин, сывороток, а также некоторых продуктов микробиологического синтеза, осуществляемыеУсгерильных условиях.

Эффективность биотехнологических процессов ( получение молочнокислых заквасок, биологическая очистка сточных вод, биоремедиация природных сред, получение микробной биомассы для разных целей ), основанных на использовании микробных консорциумов зависит от способов управления их формированием и развитием. Эти Способы в свою очередь основаны на изучении структуры биоценозов, функций отдельных-их компонентов и взаимоотношений между ними. В незащищенных условиях эффективность стадии выращивания любого микробиологического производства, в том числе основанного на монокультурах, будет определяться возможностью обеспечения доминирования популяции селекционированного штамма.

Затруднения вызывают вопросы формирования устойчивых микробных ассоциаций в условиях длительного непрерывного культивирования. Это связано с тем, что процесс непрерывного культйвирования микроорганизмов с одной стороны является своеобразным "автоселектором" быстрорастущих форм микроорганизмов с определенными параметрическими характеристиками, а с другой стороны, требуется глубокое знание механизмов взаимодействия культур внутри сформировавшегося консорциума для исключения нежелательных перестроек видового состава, сопровождающихся изменением спектра образующих метаболитов, окислительной активности и выхода биомассы.

В последние годы интерес к жизнедеятельности сложных микробных комплексов в проточных системах усилился и со стороны экологов разных

профилей. Это связано с повышением уровня загрязнения водных стоков, почв и окружающей среды в целом [8, .99]. Нарастающее действие токсических и прочих загрязнителей вызывает периодические вспышки ( флуктуации ) нежелательных видов и угнетает развитие полезных форм. В отдельных случаях влияние техногенных выбросов приводит к полному разрушению естественно-сложившихся микробных комплексов. Особая сложность при биологической деструкции токсических веществ возникает при внесении в сточные воды и почвы новых химических соединении. При деструкции веществ ранее не существовавших в природе ( ксенобиотических веществ ), на месте старых формируются новые ¿.микробные консорциумы^закономерности их образования в очагах природных гомо и гетерогенных субстратов, как и в промышленной микробиологии, не достаточно изучены[18,31,76]. Поэтому исследования в области управления микробными консорциумами актуальны и необходимы как для рационального использования искусственных и природных систем, так и для понимания фундаментальных закономерностей динамики популяций разной степени сложности.

Первые отечественные и зарубежные разработки по формированию и управлению консорциумов необходимого видового состава относятся к концу 60-х годов. Большинство этих работ затрагивают вопросы получения продуктов микробного происхождения в периодических процессах. Проблемы доминирования нужных видов и стабильности процесса в условиях длительного непрерывного культивирования решались преимущественно с использованием эмпирически накопленного опыта конкретного микробиологического производства [168,173,159].

К началу выполнения данных исследований вопросы прогнозирования исхода конкурентных взаимоотношений микроорганизмов на основе предварительной оценки кинетических характеристик, а также формирования устойчивых популяций в хемостате рассматривались в Красноярском институте биофизики. Группой ученых под руководством Н.С.Печуркина, Ю.Л.Гуревича, Н.С.Абросова, А.Г. Дегермеднджи и др. выполнен большой объем фундаментальных исследований в области динамики микробных популяций [1,2,36,43,110,111,112]. Было показано, что наиболее важным параметром, определяющим исход конкуренции при проточном культивировании, является скорость роста : незначительное ее изменение, даже на 0,01 %, может привести к изменению структуры биоценоза.

Однако, выявленные закономерности не всегда объясняли отдельные специфические взаимодействия, наблюдаемые в реальных биотехнологических процессах, например, высокую

конкурентоспособность дрожжей С. tropicalis при культивировании видов р. Candida на углеводородах и этаноле в незащищенных условиях. Развитие работ в этом направлении сдерживалось, а интерпретация полученных результатов затруднялась тем, что методы определения концентрации биомассы, основного показателя, используемого для расчета кинетических параметров роста имеют большую погрешность. Контроль за динамикой развития популяций дрожжей разных видов и штаммов осложняется отсутствием надежных экспресс-методов их идентификации в проточной культуре.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование закономерностей конкурентных взаимоотношений разных видов дрожжей p&^&s (р.) Candida в условиях непрерывного культивирования. В качестве модели исследовали бинарные системы разных видов углеводород - и этанолокисляющих дрожжей рода Candida с дрожжами С. tropicalis.

Цель работы определила следующие основные задачи исследований:

— проведение метрологической оценки методов определения концентрации биомассы микроорганизмов (весового и нефелометрического) и разработка методических подходов, обеспечивающих повышение их точности;

— разработка и метрологическая оценка метода идентификации штамма дрожжей С. maltosa ВСБ - 744;

— изучение кинетических закономерностей роста исследуемых штаммов при изменении параметров культивирования: температуры, pH, МИНералЬНОГО СОСТава СреДЫ, fCOM¿je-W?jé>Ct¿.¿¿¿¿¿. , /уг^ру/о^;^

— * апробация использования экспериментально-аналитического метода анализа микробиологических процессов для прогнозирования исхода конкурентных взаимоотношений в изучаемых системах;

проверка адекватности прогноза в экспериментальных условиях;

— разработка условий культивирования, обеспечивающих доминирование заданного штамма дрожжей.

Научная новизна полученных результатов. Впервые показана возможность использования экспериментально-аналитического метода анализа микробиологических процессов для прогнозирования исхода конкурентных взаимоотношений разных видов дрожжей. Достоверность прогноза экспериментально подтверждена на модельных системах дрожжей С. tropicalis с другими видами p. Candida в

условиях длительного непрерывного культивирования.

Показана эффективность применения анализа кинетических

закономерностей роста дрожжей для определения экологических ниш и

а,

специализации видов.

Установлены:

— факторы селективного преимущества исследуемых дрожжей при культивировании на средах с углеводородами и этанолом;

— параметры культивирования, позволяющие разделить экологические ниши С. tropicalis и других видов дрожжей р. Candida.

Впервые среди этанолусваивающих штаммов разных видов дрожжей р. Candida выявлены культуры, отличающиеся по типу экологической стратегии. Показано, что дрожжи с признаками К-стратегов обеспечивают при культивировании в условиях глубокого лимитирования кислородом и при отсутствии дополнительных методов удаления продуктов метаболизма большую (120 - 125 г/л) по сравнению с г-стратегами (80 - 85 г\л ) плотность популяции.

Практическая значимость полученных результатов.

Проведена метрологическая оценка методов определения концентрации биомассы микроорганизмов, весового и нефелометрического, и разработаны методические подходы, обеспечивающие повышение их точности. Предложенные рекомендации могут найти применение в самых широких направлениях биотехнологии.

Разработан метод идентификации штамма дрожжей C.maltosa ВСБ - 744, проведены метрологическая оценка, аттестация и апробация при

контроле техногенных потоков и объектов окружающей среды (акты испытаний).

Разработаны режимы культивирования, обеспечивающие устойчивое доминирование штаммов дрожжей С.rugosa ВСБ - 925, C.utilis ВСБ - 814, С.valida ВСБ - 825 по отношению к дрожжам C.tropicalis в условиях непрерывного культивирования (Авт. св-во СССР № 1609134, Авт. св-во СССР № 1540266, Авт. св-во СССР № 1577352, Авт. св-во № 1817471, Патент РФ № 2061751 ).

Показана принципиальная возможность получения высокой плотности (до 120-125 г/л АСВ) популяции дрожжей в условиях лимитирования кислородом и отсутствии дополнительных методов удаления продуктов метаболизма.

Разработанные методические подходы к оценке конкурентоспособности дрожжей могут использоваться при изучении новых штаммов, рекомендуемых для биотехнологических процессов интродукции в природную среду, а также — процессов получения микробной биомассы и продуктов метаболизма разного целевого назначения.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции «Биофизика микробных популяций» (Красноярск, 1987), на 18 съезде FEBS (Любляна, 1987), на конференции «Актуальные проблемы биотехнологии» (Кольцово, Новосибирской обл., 1988), на Всесоюзной конференции «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов» (Пущино, 1989); на IX Всесоюзной конференции «Измерения в медицине и их метрологическое обеспечение» (Москва, 1989), на II Международном симпозиуме «Техника и технология экологически чистых производств» (Москва, 1998), на Московской региональной конференции «Инженерная экология» (Москва, 1998).

Публикации. Материалы диссертации нашли отражение в 10 научных публикациях в России и за рубежом, получено 4 авторских свидетельства и один патент на изобретение.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка литературы (211 наименований источников). Работа изложена на /^страницах, содержит 25 таблиц и £2 рисунксх. .

- -

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Требования к свойствам промышленных микроорганизмов и методологические подходы к оценке новых штаммов.

Эффективность микробиологических производств определяется главным образом свойствами культур микроорганизмов, используемых в конкретном процессе для получения целевого продукта.

Решение об использовании нового штамма в производстве определяется фи-зиолого-биохимическими свойствами штамма, а также соответствием этих свойств .. ряду требований, предъявляемых к промышленным микроорганизмам. Кроме того, необходимо учитывать специфику конкретного микробиологического производства.

В общих чертах такие требования, в частности, к микроорганизмам, используемым для получения дрожжевой биомассы ( БВК) были сформулированы в работах института ВНИИсинтезбелок в 60-70-ые годы {25,26,29,921.

В дальнейшем требования, как ключ для селекции промышленных штаммов микроорганизмов, были представлены Сузуки [26]. Однако японскими исследователями не учтен ряд специфических особенностей технологии производства в России, а также не показан характер взаимосвязи между свойствами.

На основании опыта работы института ВНИИсинтезбелок по селекции и отбору производственных штаммов, изучения их промышленноценных признаков и осуществления постоянного микробиологического контроля в производствах белково-витаминных концентратов Н.Б. Градовой с сотрудниками разработаны методологические подходы к испытаниям и оценке перспективности новых штаммов [31].

Главным критерием отбора промышленных штаммов микроорганизмов является продуктивность штамма по целевому продукту, а в процессах очистки сточных вод и утилизации органических отходов высокая окислительная способность, используемых микроорганизмов.

Для процессов получения микробной биомассы — таким основным критерием является способность накапливать максимальное количество биомассы из единицы сырья в единицу времени. Продуктивность штамма, определяется скоростью роста культуры и экономическим коэффициентом усвоения субстрата.

Существующие технологии получения биопрепаратов связаны со значительным потреблением свежей воды и соответствующим сбросом жидких отходов. Это повышает энергоемкость производства и обостряет экологическую проблему.

Если для решения этих проблем, в технологических схемах предусмотрен прием рециркуляции культуральной жидкости после отделения микробной биомассы, то производственную ценность приобретает признак — устойчивость штамма к продуктам метаболизма и способность накапливать в среде меньшее количество продуктов метаболизма.

Учитывая, что в производственных условиях могут наблюдаться некоторые отклонения от оптимальных значений ряда параметров культивирования, более широкий предел оптимальных значений параметров выращивания штамма, например, таких, как концентрация в среде элементов минерального и азотного питания, значение рН среды, температура выращивания и др. являются производственноцен-ными свойствами.

Определенные требования вьщвигаются к качеству получаемой биомассы : в зависимости от целей ее использования, в первую очередь, это максимально возможное содержание целевого продукта ( например, белка, незаменимых аминокислот, цитохрома С и т.п.).

Необходимыми свойствами являются непатогенность штаммов для человека и животных, отсутствие свойств аллеогенности и токсичности у готового пр