Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика возрастной структуры и развитие популяции дрожжей в управляемых условиях культивирования

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Динамика возрастной структуры и развитие популяции дрожжей в управляемых условиях культивирования"

РГ6 ОЛ \

8 О КТ '^ССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

ТУШКОВА ГАЛИНА ИОСИФОВНА

ДИНАМИКА ВОЗРАСТНОЙ СТРУКТУРЫ И РАЗВИТИЕ ПОПУЛЯЦИИ ДРОЖЖЕЙ В УПРАВЛЯЕМЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.02. -биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 1996

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

ТУШКОВА ГАЛИНА ИОСИФОВНА

ДИНАМИКА ВОЗРАСТНОЙ СТРУКТУРЫ И РАЗВИТИЕ ПОПУЛЯЦИИ ДРОЖЖЕЙ В УПРАВЛЯЕМЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.02. - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 1996

Работа выполнена в лаборатории Управления биосинтезом гетеротрофов Института биофизики СО РАН (Красноярск)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Н.С. Печуркин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Волова Т.Г. (Красноярск) кандидат биологических наук Межевикина Ю.В. (Красноярск)

Ведущая организация: Красноярский государственный университет

Защита состоится 0/С/??Лд/>Л 1996 г. в

часов

на заседании специализированного совета Д 003.45.01. при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, Институт биофизики СО РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института, биофизики СО РАН

Автореферат разослан

1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор технических наук

А.П. Шевырногов

-з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из важных проблем популяцион-ной биологии является изучение закономерностей развития микробных популяций, которое обусловлено как потребностями теории, так и практическими задачами современной экологии и микробиологической технологии. Однако, несмотря на важность проблемы, вопросы динамики микробных аопуляций в контролируемых условиях с учетом возрастного распределения шзработаны крайне недостаточно. Исследование закономерностей развития юпуляций микроорганизмов актуально и по отношению к сообществам шкрооргаиизмов, которые с возрастающей интенсивностью используются в »азлнчных отраслях микробиологической промышленности. Так как практически при любом управлении популяцией необходимо учитывать физиоло-нческое состояние клеток, то в настоящий момент возникла необходимость обавить к известным кинетическим характеристикам важные популяцион-ые характеристики - возрастную структуру популяции и продолжитель-ость клеточного цикла. В резулыате одновременного действия многих фак-оров, ограничивающих рост организмов в лабораторных и природных усло-иях трудно выделить лимитирующие параметры среды. Хемостатный ре-им культивирования, являясь достаточно хорошим аналогом природных гкрытых систем, позволяет определить закономерности развития популя-ш, оценить границы устойчивости к факторам воздействия и определить •алыю существующие в природных условиях механизмы регулирования гсленностн особен в популяции. С другой стороны, реальная сложность сплуатнруемых популяций требует разработки универсальных математи-скнх моделей с учетом динамики возрастной структуры. ' ■■'""

Иелыо настоящей работы являлось изучение общих закономерностей звнтня микробных популяцпц.р управляемых условиях культивирования, соответствии с этим были сформулированы следующие задачи: !

1. Изучить динамику возрастной структуры популяции дрожжей пр: ограничении роста внешними факторами в различных вариантах периодиче ского и непрерывного культивирования.

2Г Исследовать общие закономерности кинетики клеточного цикл: дрожжей в условиях хемостатного н рН-статного культивирования.

3. Оценить кинетические характеристики неизогенных гаплоидных I диплоидных штаммов дрожжей одного вида и определить механизмы их со существования при непрерывном культивировании.

Научная новизна. В настоящей работе впервые показана возможность оценки действия внешних факторов на определенные возрастные категории клеток популяции. Исследование закономерностей приспособления клеток разных возрастных групп позволило установить взаимосвязь между процессами репродукции, динамикой возрастного распределения и интенсивностью эндогенного метаболизма. Полученные результаты позволяют создать более информативное понятие "физиологического состояния популяции'". На основе аналнза кинетических характеристик неизогенных гаплоидных и диплоидных штаммов дрожжей одного вида показаны механизмы и условия их сосуществования в лабораторных системах при непрерывном культивировании.

Практическая ценность работы. Полученные в работе количественные характеристики внутрипопуляционных и внутриклеточных процессов целе-сообразно^мспользовать для разработ ки и интенсификации биотехнологических процессов и для построения математических моделей, необходимых при прогнозировании механизмов взаимодействия микробных сообществ в лабораторных, промышленных и природных условиях. Установленные закономерности развития микробных популяций позволили повысить продуктивность кормовых "дрожжей в режиме рН-стата. Получен устойчивый и продуктивный консорциум дрожжей и молочнокислых бактерий, способный с максимальной эффективностью перерабатывать пентозные гидролизаты. Результаты исследований подтверждаются а.с. 1585326 от 20.06. 1988 г.

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 36 печатных работах.

Лппробацня работы. Результаты исследований доложены на 3 Всесоюзно»! совещании "Управляемый биосинтез и биофизика", популяций"" (Красноярск, 1973); на Всесоюзной конференции "Теория и практика непрерывною культивирования" (Пущине, 1973); на Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингнбирование процессов роста и микробиологического синтеза" (Пушимо, 1975); на 2 Всесоюзной конференции "Теория и практика управляемого культивирования микроорганизмов" (Пущине, 1978); на 7-м съезде ВМО (Алма-Ата, 1985) на 3 и 4-й Всесоюзной конференции Теория и практика управляемого культивирования микроорганизмов1" (Киев, 1981; Путине, 1986); на Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск, 1987); на Всесоюзной конференции "Биотехнология и биофизика микробных популяций'" (Алма-Ата, 1991); на 15-м международном симпозиуме по дрожжам (Рига, 1991).

С'чруктура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, включения, основных результант к выводов и списка цитируемой литера пры. Работа содержит 205 страниц машинописного текста, включая 45 рисунков п 4 таблицы. Список литературы содержит 180 названий . из них 79 иностранных работ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы микроорганизмов. В работе использовали Асимметрично почкующиеся спорогенные дрожжи Saccharomyces и Candida, штаммы: S. cerevisiae Meyes XI1 раса ( из Всесоюзной коллекции микроорганизмов), S. cerevisiae Томская 7, S. vini, S. cerevisiae 211 а а - гаплоидный штамм, S.cerevisiae ПГС-60 - диплоидный штамм из коллекции микроорганизмов Института ядерной физики им. Б. П. Константинова АН СССР (г. Ленинград), мутантная форма дрожжей Candida tropicalis 29-10, полученная в лабо-

- б -

ратории управления биосинтезом гетеротрофов Института биофизики СС РАН, г. Красноярск.

; Культивирование исследуемых микроорганизмов проводили в перио дическйх условиях роста на качалке при 30 об/мин в 250 мл колбах Эрлен-мейера, при 30°С. Непрерывное культивирование проводили в лабораторных ферментерах объемом 100-250 мл в режиме рН-стата и хемостата. Основной средой для культивирования являлась среда Ридер и ее модификации.

Методы исследования. Концентрацию биомассы определяли на нефелометре ФЭК - 56 (кювета с оптическим шагом 1 см, при красном светофильтре) и по сухому весу (культуру отмывали от среды и сушили на фильтрах или в бюксах до постоянного веса при 105°С). Для определения скорости потребления кислорода клетками дрожжей использовали термостабнлнзи-рованную ячейку с датчиком рОг гальванического типа. Определение исходных и остаточных концентраций Сахаров в растворах проводили методами: Бертрана - по модификации прямого и обратного титрования; Дюбуа, Ханда - с фенолом и солянокислым гидразином. Для определения относительного возраста клетки дрожжевую суспензию отмывали водопроводной водой , помотали в физиологический раствор и окрашивали ирнмулином (1:50000), затем просматривали под люминесцентным микроскопом МЛ -2 (окуляр х 20, объектив х90). По количеству ярко люминесцирующих родовых шрамов определяли принадлежность клеток к определенным возрастным категориям. Выделение одинаковых по относительному возрасту клеток проводили после фракционирования суспензии дрожжей в декстрановом градиенте плотности. При оценке качественного и количественного содержания ДНК в дрожжевой клетке использовали люминесцентный метод Зеленина, реакцию Фельгена, спектрофотометрический метод Спирина и Со-куровой. Определение периодов клеточного цикла дрожжей расчитывали по формулам, предварительно определив процент почкующихся клеток в каждой возрастной категории. Нами предложен метод ультразвуковой обработки агглютинирующих гаплоидных штаммов дрожжей для контроля видового

состава в смешанно» культуре. Одновременно оценивали соотношение гаплоидных и диплоидных дрожжей в смешанной культуре по размерам. Измерения проводились в трех и более повторностях, коэффициент вариации результатов не превышал 8%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование динамик» возрастной структуры популяции дрожжей ■»аесЬаготусеч сегеу|$1ае в периодическом процессе культивирования.

Под "физиологическим состоянием " микробной популяции подразуме-(ается суммарное течение биохимических, морфологических и, главным об-1азом, физиологических процессов, которые и представляют собой важные юказатели размножения или активности организмов. Информативно точ-!ыми показателями состояния популяции могут служить возрастная струк-ура и длительность периодов клеточного цикла дрожжей. Популяция рожжей ЯассЬаготусеь сегелт$1'ае состоит из нескольких возрастных групп леток ^геНИоуа, Вегап, 1%3). Процессы размножения и гибели особей дога! очно четко отражаются в динамике численности и возрастной структуре опуляции. Численность групп, составляющих популяцию, может меняться од действием целого ряда факторов. Сочетание разных факторов, в свою «ередь, обуславливает различие приспособительного механизма у разных гзрастных групп микробной популяции, а цикличность биохимических юцессов определяет фазность развития отдельной клетки. В связи с этим »зникает вопрос о приспособленности клеток каждой возрастной категории условиям культивирования. По п ому изучение отклика от дельно выделен->й возрастной'категории клеток на внешние воздействия позволяет полу-ть качественные и количественные оценки процесса.

Для оценки индивидуальной приспособленности клеток разных воз-стных категорий к различны*! условиям среды использовали производ-аенный хлебопекарный штамм ЯассЬаготусе* сегеуЫае Томская 7. Анализ измики возрастной структуры популяции дрожжей в периодическом про-

цессе роста показал, что в логарифмической фазе роста распределение клеток по возрастным категориям подчиняется экспоненциальному закону, где50 'М клеток составляет 0-й класс, 25 %- 1-й класс, 12 % - 2-й класс и т. д., т.е. дол« особей каждого класса равна половине численности предыдущего. С увеличением времени культивирования доля особей 0-го класса из-за повышенной чувствительности к недостатку энергетического субстрата и угнетающему действию продуктов метаболизма, а так же ионов |Н+| в среде снижается с 50% до 23 % (¡рисЛ). При этом сумма клетр{С 0-1-го классов уменьшается в 2 раза, а 4- 6- го-двеличиваетсяр.4 раза. Популяция прекращает рост с измененной возрастной структурой^ По. ¡физиологическим признакам культура "стареет", возрастает процент мертвых клеток. ,

Ограничение роста популяции дрожжей энергетическим субстратом. С учетом возрастного распределения клеток в дрожжевой популяции появилась возможность оценки субстратного ингнбирования особей отдельных возрастных категорий в периодических условиях (рис.2). Повышение концентрации субстрата в среде (от 10 до 50 г/л глюкозы) снижает процесс репродукции у клеток 1, 2,3- го классов. При этом доля клеток 0-н категории в популяции остается на прежнем уровне (50%), но не осуществляются переходы в последующие возрастные.категории. Сопоставление возрастного распределения в исследуемых, вариантах экспериментов показало, что большая половина клеток.(особи 0-1- го классов) определяет физиологическое состояние популяции, и концентрация субстрата в среде отражается на кинетике клеточного деления..При эуом в популяции происходит существенное изменение распределения клеток по возрастным категориям.. • > Исследование одно- и двухфакторного 01раиичения роста. дрожжей внешними факторами в периодических условиях. , ; ,, Зависимость константы ингнбирования (Кр) медью от концентрации субстрата и фазы культивирования, а также вопросы устойчивости ¿слеток разных возрастных категорий к действию внешних факторов (фурфурол) из-

г а'----'

учались на примере 4-х штаммов дрожжей: С. 1гор'|са1Ь 29-10; С. и^Ня

. г t \ 1 ' ! '

- э -

36 48

время, час

Рис.1. Динамика возрастной структуры популяции дрожкей в периодическом..процессе: кривые 0-4 -- классы; вертикальные штриховые линии - Лазы роста культуры. Кривая I - биомасса; 2 - процент мертвых клеток.

г

ег

■ «=! >. е о с

<в я о ,о о

0 класс

1 класс

2 класс

3 класс

остальные клетки мертвые клетки

20 30 40 50 Концентрация субстрата, г/л

Рис.2. Динамика возрастной структуры популяции дрожжей б.сегеУ1в1ае Томская-7 при разных концентрациях субстрата.

ВКМУ-756; S. vini и Rhodotorula AK-1 (рис. 3). Экспериментальные данные свидетельствуют, что варьирование условий обеспечения культуры глюкозой существенно влияет на величину константы ингибирования. При низких концентрациях глюкозы, обеспечивающей окислительный обмен (вариант А, So - 3-5 г/л ) устойчивость к действию меди (CuSOj'S Н2О) выше у всех исследованных культур, чем при концентрациях глюкозы (вариант Б, So - 10; 20 г/л ) обеспечивающей гликолизный обмен. Константы ингибирования, в пересчете на ноны меди у С.tropicalis 29-10 в 2 раза выше (Кр - 60 мг/л) в варианте А, чем в варианте Б (Кр - 27 мг/л) и в логарифмической, и в лог- фазе развития. Найдено существенное различие констант ингибирования медью у разных форм дрожжей. Большая устойчивость к нонам меди в варианте Б обнаружена у дрожжей Rhodotorula (Кр -116 мг/л), меньшая у С. utilis ВКМУ -756 н S. vini (Кр - 70 мг/л), а более низкая у C.tropicalis 29-10. Как видно из результатов, представленных на графике, в условиях лимитирования по углероду константа ингнбнровання ионами меди для исследуемых штаммов выше, чем в условиях гликолизного обмена при So -10 г/л. При этом меняются не только кннсшческие характеристики клеток, но и свойства клеточных оболочек. В связи с сорбцией ионов меди на поверхности клеточной стенки провести анализ действия меди на отдельные возрастные категории клеток оказалось невозможным. Поэтому рассматривали действие фурфурола ( ог 0,16 до 12 г/л) на возрастную структуру популяции дрожжей S.vini при окислительном обмене (So - 3 г/л глюкозы), представленное на рис.4. При концентрации в среде 160 мг/л фурфурола удельная скорость роста популяции :нижается, уменьшаются доли клеток во всех возрастных категориях. По-:ледующее повышение концентрации фурфурола в среде блокирует процесс )тделения дочерних клеток Особи 1-3-го классов имеют по 2-3 неотделив-ниеся почки. За счет этого доля клеток 0- го класса находится на одном уровне, но переход клеток этой группы в последующие категории не происходит. При одновременном двухфакторном ограничении роста (тех же кон-

Рис.,.3. Зависимость констант ингибирования (Кр) медью

у разных форм дрожжей от условий культивирования в острых'опытах (заштрихованный участок- .определение констант в лаг-фазе роста, незаштрихованный участок - определение констант в лог-фазе)> 1- С. 1гор1са1 29-10, 2- С.иШ1з ВКМУ-756, 3- ЗассЬагошусез у1Ш, 4- Rhodotoгula АК-1, А - Б о~5 г/л, Б - Бо -10 г/л

60.00 —

40.00 —

20.001

ООО

0.03

4.00 8.00:

Концентрация фурфурола, г/л

1200

Рис.4. Возрастная структура попудяции дрожжей Б. VIш в периодическом процессе культивирования с однофак— торным ингибированием, Зо - 3 г/л глюкозы

центрациях фурфурола и повышенной температуре + 40 ° С ) процесс отделения дочерних почек блокируется при более низких концентрациях фурфурола, а удельная скорость роста популяции, в этом случае, вдвое ниже,;чем при однофакторном ограничении. Следовательно, фурфурол в условиях лимита по субстрату является специфическим ингибитором деления для почкующихся дрожжей.

2. Изучение динамики возрастной структуры популяции дрожжей в условиях непрерывного культнвирования.

В отличие от периодического культивирования непрерывный режим роста позволяет достаточно долго поддерживать культуру в стабильном физиологическом состоянии, на определенном уровне биохимической активности. Исходное неэкспоненцйальное распределение клеток популяции по возрастным категориям (создаваемое путем добавления отдельно выделенных фракций клеток разных возрастов) через 10 генераций культивирования сменяется экспоненциальным распределением и стабильно сохраняется на протяжении 84- х часов роста. В результате повышения Скорости протока среды меняется характер возрастного распределения клеток популяции в сторону снижения доли особей 0-го класса от 60 до 40 % (рис. 5). Значительное снижение доли клеток 0- и категории свидетельствует о высокой удельной скорости роста 10 % клеток этой категории в результате чего пополняется количество особей 1-го класса. Повышение численности 2-й возрастной группы происходит за счет высокой удельной скорости клеток 1-го класса.

Полученные результаты показали, что повышение скорости протока среды от !)= 0,05 ч до 0= 0,7 ч положительно отражается на физиологическом состоянии популяции, при этом существенно возрастают удельные скорости роста клеток О, I, и 2-й возрастных категорий.

Возрастная структура популяции при суперскорости протока.

Имеющихся литературных данных о динамике ^физиолого-биохимических параметров популяции дрожжей при суперскорости протока недостаточно для четкого представления о внутрипопуляционных изменен»-

-\ъ -

60 50

V

0 класс

1 класс

2 класс

3 класс

а« « 40

к ег

к

£ 30

с о с

(I) СО н о о о

20

10

I

0,2

~т

0,4

г

0,6

~г

0,8

скорость протока, час

-1

•Рис. 5.

Зависимость возрастного распределения популяции дрожжей 5.сегеу!з1ае Томская-7 от скорости протока при Бе=20 г/л

ях (Vrana, 1972; Шкидченко и др., 1978; Орлова и др., 1981). И в этом случае возрастная структура популяции является одним из значимых показателей внутриклеточных, а следовательно и внутринопуляциоиных перестроек. Рост микроорганизмов со скоростью превышающей ц „Ых периодического процесса называется гипертрофическим. При скорости протока среды D = 0,90 ч в популяции появляются гипертрофированные клетки, которые не содержат ядерного материала, т.е. безъядерные. Наличие безъядерных клеток в популяции доказывает, что процесс синтеза ДИК протекает в строго определенный промежуток времени и не все клетки при ном успевают синтезировать и передать дочернюю ДНК в почку. В режиме рН-стата при скорости протока D= 1,4 ч 1 и одностадийном культивировании Candida tropicalis 29-10 нами показано, что в популяции образуется 20% безъядерных клеток (рнс.6). Отметим, что штамм C.tropicalis 29-10 уже является быстрорастущей мутантной формой, т.о. этим мы исключаем версию о замещении исходной формы быстрорастущим штаммом.

Распределение безъядерных -'¿гиперклеток" на графике представлено в процентах к количеству клеток в разных возрастных ipynnax. Численные доли безъядерных клеток в разных возрастных категориях мало отличаются между собой и в среднем равны 20 %. Равное содержание безъядерных клеток свидетельствует о том, что нарушение баланса между скоростью роста и скоростью синтеза ДНК и деления происходит независимо от относительного возраста особи. Согласно Johnston (1977) продолжительность фазы одиночной клетки, в течение которой она дорастает до критического размера, в свою очередь, не зависит от скорости синтеза ДНК. При суперскоростн протока субстрата продолжительность Gi периода (время подготовки к синтезу ДНК) может стать меньше длительности самого синтеза ДНК (S-период), что и является причиной гипертрофического роста клетки.

Клеточный цикл дрожжей в условиях непрерывного культивирования.

Прежде чем приступить к расчетам длительности периода деления для клеток каждой возрастной категории в отдельности, отметим, что среднее

s а er

R

>4

С

о с

60

50 -

k0

30

20

10 -

0,

-г-2

распределение клеток популяции по возрастной категориям

распределение гиперклеток по классам .

~1—;-1-

12 3 k... классы хлеток

Рис.б. Возрастная структура популяции дрожхей. Candida tropioalis 29-10 при скорости протока среды D = 1,4 час" .

время генерации (g) для популяции при непрерывном культивировании имеет вид: g = In2/p Ср, где д - средняя удельная скорость роста популяции. Среднее время генерации для клеток каждой возрастной категории уменьшается как с увеличением скорости протока, так и с увеличением относительного возраста клетки. Клеточный цикл дрожжей S. cerevisiae состоит из 2-х фаз : одиночная клетка (OK), которая включает G'i и G"i периоды и клетка с почкой (ДК), состоящая из S, Gj и М периодов. Продолжительность фазы одиночной клетки и фазы почкования у клеток i- го возраста определяли соотношениями предложенными в работе (Meyenburg, 1969):

DK i = g b i; OK i = g i - DK i, где g i - среднее время пребывания клетки в i- м возрастном классе, b i - доля почкующихся клеток в ¡- м возрастном классе. Появление почки является сигналом о начале синтеза ДНК (S- периода) (Williamson, 1966). По этому признаку можно четко определить длительность G'i и G" - периодов клеточного цикла. Длительность Ci -периода для клеток 1-3- й возрастных групп при протоках среды от D=0,11 ч до D=0,40 ч 1 значительно меньше, чем у клеток 0- й категории (рис.7) и зависит от скорости протока среды . Самое короткое время предсинтети-ческой подготовки 4,5 минуты у клеток 1- го класса при скорости протока D=0,40 ч . По-видимому, подготовка к следующему синтезу ДНК и сам синтез протекает в М- периоде при неотделившейея первой почке. Некоторые авторы предполагают, что в фазе Gi не происходит никаких специфических событий, необходимых для следующего цикла репликации ДНК (Singer, Johnston, 1981). Однако продолжительность G"i - периода чрезвычайно лабильна, как у клеток разных типов , так и внутри одной популяции между клетками разных возрастных групп, что и следует из графика. Продолжительность цикла почкования (ДК) имеет такой же характер зависимости, как и период одиночной клетки (OK), от скорости протока среды. Повышение концентрации субстрата с 5 г/л до 10 г/л существенно не отразилось на продолжительности цикла почкования для дрожжей S. cerevisiae при равных значениях протока среды. Значительное влияние на кинетику клеточного

Рис.7. Продолжительность фаз I - JD - 0,11 ч"1 ; 2 -

~ пеРиоды, ДК

- период,ОК , 2

3

клеточного цикла при разных скоростях протока.; - С -:0,22 ч"1 3 - В - 0,40 ч"*1.

цикла оказывает скорость протока субстрата. Для клеток 0-й категории ув личение протока среды в 20 раз (от D=0,02 ч_| до D=0,40 ч -'), по-видимом является максимально возможным пределом для того, чтобы 42% oco6i этой категории начали Процесс почкования. Добиваться более высоких зн чений скорости репликации в этой очень гетерогенной возрастной категор* клеток - задача нереальная.

: " 3. Механизмы устойчивого сосуществования гаплоидных и диплои, •иых штаммов:дрожжей в проточных системах роста.

Развитие микробных популяций в природных условиях происходи-

как правило, в тесном взаимодействии друг с другом. Провести точный к<

i

личественный анализ типов взаимодействия и механизмов сосуществовани

видов из-за их_бодьщого разнообразия практически невозможно. Изучен»!

v Х-?,!

механизмов сосуществования неизогенных разноплоидных дрожже Saccharoniyces is^reyisiae.начинали с измерения кинетических характеристи монокультур в осгрых опытах. Максимальная скорость роста и К* диплош ного штамма (fi »мГ-0,45 ч"*1 ; К»"-"280 мг/л) существенно отличается от га плоидного (ц uav =0,24 ч 1; Ks - 80 мг/л). На основании полученных данны можно предположить, что при скорости протока D = 0,22 ч_| гаплоидна форма дрожжей будет элиминировать из ферментера, а при D = 12 ч1 доми пировать будет диплоидная форма. Смешанное непрерывное культивирова ние гаплоидных и диплоидных штаммов подтвердило высказанное предпо ложение: без внешней подтитровки активной кислотности среды гаплоидны дрожжи вымываются из ферментера как при скорости протока D=0.22 ч~' так и при скорости D= 0,12 ч-'. Снижение скорости подачи среды до D = 0,0: ч приводит к устойчивому сосуществованию этих штаммов (рис. 8). Дол! гаплоидной формы дрожжей в полученной ассоциации составляет 40% - ди плоидной 60% и на протяжении 13 суток соотношение штаммов в культур» не меняется. Анализ механизмов сосуществования штаммов показал, что на ряду с лимитированием по субстрату без подтитровки активной кислотност»

- 2-Г-

...Рис.8. Динамика соотношения видов в проточных_ экспериментах при 5 о = 5 г/л.

а) Д = 0,22 ч"1, рН°= 6,3; б) Д = 0,12 ч-1, рН°= 6,3; в) Д = 0,05 ч"1, рН = 5,5; I - биомасса; 2 - процент клеток гаплоида; 3 - остаточный сахар.

среды извне происходит ограничение роста ионами водорода. В монокультуре диплоидного штамма уровень ионов [Н+1 стабилизируется в зоне рН=3.0, а у гаплоидного при рН=3.4. Следовательно, гаплоидные дрожжи более чувствительные к токсическому действию |Н+] ионов, чем диплоидные. Эти результаты указывают на наличие в смешанной культуре дрожжей двух ограничивающих рост факторов - лимитирование субстратом и ингибирование ионами водорода. При исходной концентрации гаплоидных клеток 18%; 30% и 98%. в смешанной культуре в течение 5-ти суток устанавливается стабильное соотношение видов - 40 % гаплоидных и 60% диплоидных, которое сохраняется на протяжении 7-и суток. В условиях ограничения роста субстратом ( Яп - 200 - 500 мг/л и 1 г/л глюкозы) в смешанной культуре гаплоидных и диплоидных дрожжей доминирует гаплоидный штамм.

Математический анализ механизмов сосуществования неизогенных гаплоидных и диплоидных штаммов дрожжей приведен в работе (Дегерменджи и др., 1979). В основе сосуществования исследуемых дрожжей одного вида в непрерывных условиях культивирования лежит разная зависимость скоростей роста каждого штамма от рН среды и концентрации входного субстрата.

Энергетические траты на поддержание жизненных процессов у гаплоидных и диплоидных организмов.

Микроорганизмы так же как и все живые существа нуждаются в энергии не только для роста, но и для поддержания активной жизнедеятельности, поэтому поступающий в культуру субстрат расходуется на рост популяции и на процессы, связанные с поддержанием жизненных процессов, организма. Интенсивность "суммарных затрат; субстрата на рост и поддержание".определяли по формуле: <\ — 0 (8() - 8 о,-, ) / ■Х. Величину затрат определяют внеш-пне условия среды: концентрация энергетического субстрата, кислорода, величина рН, температура и пр. Тот факт, что эмпирическая кривая зависимости интенсивносги потребления субстрата от удельной скорости роста культуры не проходит через начало координат является подтверждением на-

1ИЧНЯ затрат на поддержание жизнедеятельности у дрожжей. Исходя из это-о необходимо выяснить уровни энергетических трат неизогенных штаммов рожжей разной плоидности в условиях хемостата. Хемостатные харакгери-тики роста разноплоидных дрожжей представлены на рис 9. Как следует из кспериментальных данных, траты на поддержание жизненных процессов аплоидных и диплоидных штаммов дрожжей Я.сегеуЫае при концентрации сходног о субстрата 3 - 5 г/л глюкозы и скорости протока Ц - О,)5 ч 1 мало тличаются между собой и равны: т , =0,19 г/г час, т ., = 0,18 г/г час . При вухфакгорном ограничении роста дрожжей - лимитировании субстратом и ановремешюм тнн нб1фйванни транспорта субстрата в клетку |Н+| ионами, ронсходит значительное повышение непродуктивных трат глюкозы у обоих пгаммов. Граты на поддержание ясизнедеятелыюсти у диплоидного штамма, этом случае, в 2 раза превосходят энергетические затраты гаплоидных рожжей - гт1, = 0,5 г/г час; т ., = 1,0 г/г час. Полученные различия неросто->|\ трат на поддержание у нсизогенных разноплоидных штаммов дрожжей сегегЬЬи' хорошо согласуются с вышеизложенными результатами и лите-пурнымн да иными (Крнсс, 1976) в том, что гаплоидные дрожжи имеют го-идо меньшую сферу обитания,'чем диплоидные, чго обусловлено входными ншентраниями субстрата. Следовательно, преимущество диплоидных форм природных сообществах обусловлено как плоидностыо, так и концетраци-\ энергет ического субстрата.

Таким образом, в условиях лимитирования субстратом в ферментере и 1Сто наблюдаемых ограничениях в природных экосистемах, преимущество »лучают те клетки, которые способны потреблять субстрат в более низких шцен грациях, а не наиболее экономично. В тех случаях, где напряжение щкуреншш за субстраг снижено, преимущество сохранятся на стороне дн-юиди. Примером могут служить почвенные биогеоценозы и прибрежные ны морей. В средах обитания, где усиливается конкуренция за субстрат -минирует гаплоид. Такая ситуация складывается в открытой части еана. Это доминирование имеет свои экологические преимущества и свя-

-

Скорость протока, ч"1

Рис.9. Экспериментальное определение энергетических затрат на поддержание жизнедеятельности для диплоидных и гаплоидных.дрожжей. I , 2 - рН среды 6,8 ; 5о= I г/л глюкозы ; 1 ' 3 , 4 - рй среды 3,4, Бо - 3-5 г/л глюкозы.

зано прежде всего с тем, что океан является медленно изменяющейся на протяжении геологического времени экологической системой (Эрлих, Холм, 1966) и его условия могут быть промоделированы условиями хемостата.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Показаны определяющие факторы регуляции численности особей этдельных возрастных категории популяции дрожжей в периодических условиях роста. К ним относятся - концентрация субстрата в среде, раса дтамма и длительность культивирования (фаза роста).

2. Исследована динамика возрастной структуры популяции дрожжей >ри образной кривой роста. В логарифмической фазе роста периодическо-о процесса и диапазоне протока среды от В=0.10 ч -* до 0=0.50 ч непре-1ЫВН0Г0 процесса, возрастная структура популяции подчиняется жспонен-шалыюму закону распределения. Перестройка возрастной структуры попу-яцпи происходит при наличии в среде ограничивающих рост факторов и ысоких скоростях протока среды.

3. Исследована приспособленность клеток отдельных возрастных ка-егорнй при одно- и многофакторном ограничении роста внешними факто-ами (фурфурол, высокая температура, соли тяжелых металлов) показан ме-анизм изменения физиологического состояния дрожжей (блокируется про-есс отделения дочерних клеток). Константа ингибирования медью суше-гвенно зависит от фазы роста культуры, штамма дрожжей и концентрации гбстрата в среде.

4. Проведены исследования процессов кинетики клеточного деления южжей в непрерывных условиях культивирования. Показаны характер и шравление перестройки процессов репродукции при увеличении скорости ютока среды. Продолжительность контролируемых в 1 ; Си вг и М - пе-юдов клеточного цикла у особей 1 - 4 -й возрастных категорий сокращается » минимальных пределов. Процесс репродукции особей 0-й категории кон-юлируется критическим размером клетки.

5. Исследовано влияние суперскорости протока среды (D= 1.4 ч ■') на физиологическое состояние популяции. На примере роста штамма Candida tropicalis 29-10 показано, что при суперскорости протока происходит разбаланс процесса роста и процесса репликации ДНК клетки, в результате чего образуются "гипертрофированные", безъядерные почки во всех возрастных категориях популяции дрожжей.

6. Экспериментально установлена существенная разница кинетических характеристик цча.\ и К» нецзогенных гаплоидных и диплоидных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и показаны условия их сосуществования в непрерывном процессе культивирования. Критерием существования бинарной культуры дрожжей являются плотностнозависимые факторы - входная концентрация субстрата и активная кислотность среды.

7. Впервые получены численные значения энергетических трат на поддержание, жизненных процессов неизогенных дрожжей разных генотипов. Показано, что в оптимальных по субстрату условиях роста, неростовые траты исследуемых штаммов равны. Ограничение роста энергетическим субстратом сопровождается повышением трат на поддержание жизнедеятельности у диплоидного штамма в 2 раза больше, чем у гаплоидного.

Основные публикации по теме диссертации

1. Тушкова Г.И. Экспериментальное исследование возрастной структуры популяции дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Управление биосинтезом микроорганизмов.- Красноярск, 1973. - С.'. 252-254.

2. Тушкова Г.И., Печуркин Н.С. Динамика возрастной структуры популяции дрожжей при различных условиях выращивания и хранения //Гетеротрофные микроорганизмы, их биология, практическое применение и культивирование, Красноярск, 1973. - С. 68-70.

3. Тушкова Г.И., Печуркин Н.С. Динамика возрастной структуры популяции дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Динамика микробных популяций в открытых системах. - Красноярск, 1975, С. 131-141.

4. Тушкова Г.И., Печуркин Н.С. Анализ возрастной структуры дрожжевой популяции // Анализ динамики роста биологических объектов.- М.: Наука, 1978.- С. 28-37. .

5. Тущкова Г.И., Ореховский З.Б. Возрастная структура и динамика

' • ' • ' ' ' • - i '» v"

развития популяции дрожжей Saccharomyces serevisiae при непрерывном культивировании //Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов. - Москва, 1978. - С. 50-52.

6. Тушкова Г.И., Фуряева A.B. Диализ возможности сосуществования гаплоидных и диплоидных дрожжей Saccharomyces cerevisiae при совместном длительном непрерывном культивировании //Смешанные проточные культуры микроорганизмов / Ред. Н.С.Печуркин. - Новосибирск: Наука . Сиб. отд-ние, 1981. - С. 144-153.

7. Дегерменджи А.Г., Печуркин Н.С, Тушкова Г.И., Фуряева A.B. Механизм устойчивого сосуществования диплоидных и гаплоидных дрожжей Saccharomyces cerevisiae в проточной культуре// Известия ,СО АН. Сер. бнол. - 1979. вып. 1.- С. 62-68. ; , v ,

8. Фуряева A.B., Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Мухамедиева У.С., Тушкова Г.И., Письман Т.П., Печуркин Н.С. Влияние ингибирующих концентраций хлористого натрия на рост Candida tropicalis в условиях непрерывного pH-статного культивирования II Микробиология. -1985. - Т. 54, вып. 6. - С. 893-898.

9. Фуряева A.B., Тушкова Г.И. Изучение кинетики роста дрожжей в рН-стате без лимитирования и с лимитированием при многофакторном ограничении скорости роста //Лимитирование и ингибированйё роСта "микроорганизмов.-Пущино, 1989 а. - С. 92. . лР

10. Фуряева A.B., Тушкова Г.И. Влияние ограничивающих рост факторов среды на изменение константы ингибирования медью у дрожжевых культур //Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов. - Пущи- ' но, 1989 б. - С. 93.

11. Саубенова М.Г., Мухамедиева У.С., Пузыревская О.М., Фуряева A.B., Письман Т.Й., Тушкова Г.И., Печуркин НС.' Физиолого-биохимические особенности дрожжей, адаптированных к хлористому натрию в условиях непрерывного культивирования //прикладная биохимия и микробиология. - 1989,- Т. 25, вып.1. - С. 91- 96. 1 :

12. Печуркин Й.'С Попова Л.Ю., Ту 1йковУТ.С Фурйёва AlBif Мар-ченкова Т.В., Лалетин А.И. Культивирование дрожжей на продуктах ¡переработки бурого угля с использованием ко<!убЙ-ратов и стимуляторов роста //Микробиология. - 1988.- Т. 57, вып. 5. - С. 892-894.

1'3" Фуряева A.B.', Тушкова Г.И., Шевченко В.Т., Трушина Н.В. Исследование действия вытяжки бурого угля в качестве стимулятора и ингибитора роста дрожжей в периодических условиях культивирован!» //Биотехнология и биофизика микробных популяций. - 1991.- Алма- Ата с.130. ■

Л! 14. tfuzmina R.I., T&hkova G.I., Gladun G.Ya., Rogozina I.A. Thenatun of physiological stability of yeasts II 15-th international specialized simposium or yeasts, Riga, 1991. - P. 35.

Подписано в печать 28.($,96. Формат 60x84 1/16. Печать — ризография. Усл.пл. 1,62. Тираж 100 экз. Заказ 96-380.

: " ' 1 ' / X. 11 е4 Е' <г ;> г 1 ■' - ; !

Издательство Алтайского государственного технического

< О М Ь- ^ "Ш '"НИ"*' ' " * : . ; - _ , I', Я .• - 1

университета им. И.И.Ползунова, 656099, г.Барнаул, пр-т Ленина, 46 Отпечатано в типографии АлтГТУ