Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совместное культивирование дрожжей родов Candida и Saccharomyces и бактерий Corynebacterium-продуцентов белка и лизина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совместное культивирование дрожжей родов Candida и Saccharomyces и бактерий Corynebacterium-продуцентов белка и лизина"

На правах рукописи

Р Г Б ОД

2 7 ЛИП «Q7

Садовникова Елена Анатольевна

Совместное культивирование дрожжей родов Candida и Saccharomyces и бактерий Corynebacterium - продуцентов белка и лизина

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена на кафедре промышленной биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор химических наук, профессор Маиаков Михаил Николаевич,

кандидат технических наук, доцент Марквичев Николай Семепович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор технических наук, профессор

Каптере Вилен Михайлович,

кандидат биологических наук, с.н.с. Гаязов Ренат Рашидович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГосНИИгенетики и селекции

за__„_________ , ... , Д 053.34.13 в Российском

химико-технологическом университете имени Д.М.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., 9.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им.Д.М.Менделеева.

Автореферат разослан " (0»(ШЫ1996г.

Ученый секретарь ,,,

диссертационного совета,

промышленных микроорганизмов, г.Москва . ^

ШИШ 1996г. в № час. на

г. Москва

кандидат биологических наук

И.И.ГУСЕВА

Актуальность работы.

Кормовые белковые добавки позволяют сбалансировать растительные корма, повышая их биологическую ценность.

Народу с использованием монокультур. в производстве кормовых добавок в последнее время интерес привлекают микробные сообщества. Они полнее усваивают сложные субстраты,уменьшая загрязненность производственных стоков, более стабильны, и позволяют получать продукты с более широким спектром свойств, чем монокультуры.

Поиск устойчивого консорциума микроорганизмов, являющихся продуцентами белка и лизина, управление его видовым составом путем регулирования условий культивирования и засевных доз разных видов микроорганизмов позволяет создавать кормовые препараты с заданными свойствами.

Большинство выпускаемых кормовых препаратов можно разбить на 2 * группы:

1. препараты, содержащие дрожжевую биомассу, богатые белком и витаминами;

2. кормовые концентраты лизина, содержащие биомассу бактерий, лизин и наполнитель.

Содержание лизина в дрожжевом белке составляет около 5X, 1/5 часть которого находится в неусваиваемой форме.

Использование сахарной свеклы в качестве доступного источника сахарозы дает возможность производить добавку в условиях мелкотоварных фермерских хозяйств.

Цель» данной работы явилось исследование процесса совместного, культивирования дрожжей и лизинсинтезирующих бактерий на сахарной свекле для создания кормовой добавки, содержащей биомассу дрожжей и бактерий и свободный лизин в виде монохлоргидрата.

В задачи работы входило:

- изучение процесса культивирования.бактерий и дрожжей на сахарной свекле .влияние содержания свекольной стружки (твердой фазы) и степени очистки свекольного сока на параметры ферментации;

- исследование взаимного влияния бактерий и дрожжей в ассоциации; .

- создание ассоциации бактерий и дрожжей,, оптимальной для получения кормовой добавки с заданными свойствами;

- разработка приемов, позволяющих управлять качестЕоы получаемого продукта;

Научная новизна.

Впервые в России использована пульпа сахарной сьеклы для получения жидкого кормового концентрата, обогащенного лигином.

- г -

. Кормовой концентрат содержит клетки коринебактерий. синтезирующих и выделяющих в среду лизин, дрожжевую биомассу и неиспользованную микроорганизмами свекольную клетчатку. .

Изучено взаимовлияние метаболитов бактерий и дрожжей на их рост в консорциуме. Выявлено, что подсев экспоненциально размножающихся дрожжей к бактериальной культуре необходимо проводить при нахождении последней в начале стационарной фазы роста. Это способствует повышенной утилизации редуцирующих веществ (РВ) из среды культивирования й увеличению накопления кормовой белковой массы.

Отработана такая длительность процесса выращивания смешанной культуры, которая гарантирует неиспользование дрожжами синтезированного и выделяемого из бактериальных клеток лизина.

Подобраны штаммы дрожжей для утилизации остаточных РВ из среды культивирования без потерь синтезируемого бактериями лизина.

Практическая значимость.

Показана возможность использования сахарной свеклы без предварительной очистки свекольного сока и отделения его от свекольной стружки. Определен интервал РВ. оптимальный для биосинтеза бактерий на сахарной свёкле. Подобраны дозы засева культур и фазы роста посевного материала, при использовании которых члены ассоциации проявляют максимальную активность.Определено оптимальное время для совместного культивирования бактерий с дрожжами.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Республиканской конференции "Биотрансформация вторичного растительного сырья в белковые кормовые продукты" (Тбилиси, 1987), Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино, 1989),на конференции молодых ученых МХТИ им.Д.И.Менделеева в 1994 г,

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы, получено 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации.Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов. Работа изложена на _ страницах машинописного текста и иллюстрирована

_ рисунками и _ таблицами. Библиография включает _ названий работ, из них _ на иностранных языках.

- 3 -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В качестве продуцента лизина использовали гомосеринзависимый промышленный штамм Corynebacterium glutamic™ 95 из коллекции Гос-НИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов.

В качестве продуцента белка применяли штамм Candida tropicalis СК-4, полученный с Береговского завода сухих кормовых дрожжей.

В ходе скрининга дрожжей для совместного культивирования с бактериями исследовали 16 штаммов дрожжей (любезно предоставленных из коллекции ГосНИИсинтезбелок), принадлежащих к видам Candida scottii, Candida utilis,Saccharomyces cerevlslae.

Посевной материал дрожжей получали на среде Ридера.

Посевной материал бактерий выращивали на среде, содержащей 10% кукурузного экстракта, 3% мелассы, 0,456 хлористого натрия.

Для культивирования бактерий на гомогенизате сахарной свеклы была подобрана среда следующего состава: (NH4)2S04 - 0,8% ; К2НР04 - 0.1%;КН2Р04 - 0,05%: MgS04*7H20 - 0,05%; гидролизат' БВК - 1%. ку- . курузный экстракт - 0,5%; рН=7,0-7,2.

Для удаления примесей свекольный сок очищали по схеме, принятой в сахарной промышленности. Мытую свеклу измельчали на терке, получая стружку, аналогичную получаемой на свеклорезке центробежного типа, добавляли воду и после нагрева отжимали, получая клеточный сок и мякоть свеклы. Клеточный сок обрабатывали 0.25-0,3% СаО" к массе исходной свеклы (предварительная дефекация), осаждая комплексы несахаров с ионами кальция.

Более жесткая обработка СаО 2, 5% (основная дефекация) приводила к осаждению Са-солей кислот. При продуве раствора С02 при температуре 90° С и рН=10,8-11,2 (первая сатурация) в осадок выпадали СаС03 и нерастворимые несахара.

После второй сатурации (совместная обработка 0,25% СаО и СОг) получали Ьсветленный сок.

Влияние твердой фазы на параметры культивирования изучали, добавляя в среду свекольную стружку (клетчатку), промытую трижды горячей водой от остатков сахарозы.

Периодическое культивирование вели при температуре 28-32°С в колбах Эрлонмейера на качалке при перемешивании со скоростью 220 об/мин и на ферментере "Анкум"(у=3 л). При культивировании на колбах pH поддерживали добавлением мела , при культивировании в ферментере - добавлением 5% раствора NaOH.

Концентрацию клеток микроорганизмов в среде определяли нефело-мотрически, либо подсчетом клеток в камере Горяева. Концентрацию

лизина определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах "БИиГоГ', РВ - эбулиостатически по Низовкину и Емельяновой (1976), сырой протеин - по Кьельдалю (микрометод), нуклеиновые кислоты - по Спирину, общий фосфор - по Бриггсу. Аммонийный азот определяли методом отгонки с паром. Выход лизина У1уз определяли как отношение концентрации синтезированного лизина к величине потребленных РВ. Выход дрожжевой биомассы Удр определяли как отношение числа образовавшихся клеток дрожжей в единице объема среды к количеству потребленных РВ в том же объеме.

Углеводный корм, содержащий дрожжевой белок, клетчатку свекль и синтезированный бактериями лизин,можно получить тремя способами:

- раздельным культивированием бактерий и дрожжей с последующим соединением потоков;

- последовательным культивированием,когда дрожжи подсевают ь бактериям через некоторое время после начала роста бактерий;

- совместным культивированием двух видов в одном аппарате пр1 одновременном засеоо обеих культур.

Поэтому исследование проводилось по трем направлениям.

1. РАЗДЕЛЬНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ.

Достоинством раздельного культивирования является возможност] создания в каждом ферментере оптимальных условий для данного вид; микроорганизма, недостатком - использование двойного количеств; производственных мощностей, сырья, очистка большего количества воз душных и водных выбросов.

На первом этапе мы провели изучение процесса культивировали; бактерий на сахарной свекле.

1.1. Биосинтез лизина культурой СогупеЬа^ег1ит ^1иЬат1сит 95 н углеводах сахарной свеклы.

Сахарную свеклу в качестве источника углерода можно использо вать в виде гомогенизированной пульпы без отделения твердой фаз либо в виде водного экстракта,полученного после отделения свеколь ной стружки от горячего водного раствора, куда перешла сахароза другие растворимые в воде вещества.

Для определения оптимальных начальных значений РВ для биосин теза лизина на сахарной свекле бактерии СогупеЬас1ег1ип1 в^аписи 95 культивировали на гомогенизате сахарной свеклы в интервале Р 13-60 г/л. Все остальные компоненты среды соответствовали регла

ментному составу для биосинтеза лизина.

Накопление бактериальной биомассы на гомогенизате описывалось экспоненциальной кривой, аналогичной кривой на сахарозе (рис.1)..

• Накопление лизина в зависимости от начальной концентрации РВ на гомогенизате и сахарозе различалось. С увеличением концентрации РВнач в в гомогенизате до 34-36 г/л максимальное накопление лизина достигало 8-11 г/л и при дальнейшем увеличении концентрации РВнач накопление лизина не превышало 9-11 г/л. При этом получался продукт с содержанием истинного белка 34-37Ж от АСВ. На сахарозе с увеличением концентрации РВ от 10 до 55г/л конечная концентрация лизина возрастала от 4 до 15 г/л.

О ю го 30 50 во тсчаа

Рис.1 Сравнительное культивирование СогупеЬас1сг1ит §1и1ат1сит 95 на гомогенизате сахарной свеклы (1) и сахарозе (2).

Рис.2. Зависимость выхода лизина У]уз и его конечной концентрации С1уз от РВнач при росте на гомогенизате (1) и сахарозе (2).

Анализ рис.2 показывает, что с увеличением концентрации РВяач от 13 до 45 г/л в соеде с гоыогенизатом свеклы выход лизина У1уз уменьшается с 0,57 до 0, 32. На сахарозе в исследуемом диапазоне РВ У1у5 растет с 0,35 до 0,44, Такш образом, при культивировании на гомогенизате свеклы оптимальной является концентрация

50 Т1МС)

ДО 25-30 г/л по РВ.

1.2. Влияние твердой фазы на биосинтез лизина'бактериями. Можно предположить, что при повышенных концентрациях свеклы в среде изменяется массообмен. Поэтому при найденных оптимальных значениях РВ мы исследовали влияние концентрации твердой фазы на накопление лизина бактериями. Твердая фаза вводилась в питательную среду на основе сока в концентрациях 0-20 г АСВ/л. Результаты экспериментов представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Влияние твердой фазы на биосинтез лизина бактериями СогупеЬасЬеНшп glutamícuпl 95 в средах с сахарной свеклой.

N Содержа- РВ нач РВ кон Конц-я Выход

ние тв.фа- г/л г/л лизина лизина

зы, АСЕ г/л г/л у 3

1. 3,1 • 37,0 10,0 4,8 0,17

2. 6,2 47,2 30,4 4,6 0,28

3. 9,3 50,0 30,6 4.7 0.25

4. 12,2 54,0 26,0 1,8 0.06

5. 18,6 57,4 28,6 1,7 0,06

Введение твердой фазы в среду в концентрациях 3,1-9,3 г АСВ/л не изменяет накопления лизина бактериями.

При увеличении концентрации клетчатки свыше 9,3 г АСВ/л накопление лизина снижается, выход лизина падает до 6%, в КЖ увеличивается содержание побочных аминокислот.

Для достижения оптимальной концентрации РВ в среду необходимо внести 100-120 г/л свеклы естественной влажности, что соответствует 6,3-8,6 г АСВ/л твердой фазы.Следовательно вносимое количество клетчатки не оказывает отрицательного влияния на накопление лизина.

Одной из причин низкого выхода лизина могут быть растворимые в воде вещества, переходящие в среду из свеклы.

1.3. Влияние степени очистки свекольного сока на биосинтез лизинабактериями.

Для проверки влияния растворимых компонентов свеклы на биосинтез лизина были проведены эксперименты по культивированию бакте-

рий на свекольном соке разной степени очистки согласно схеме, описанной выше,в присутствии и в отсутствии твердой фазы.

Таблица 2.

Влияние стадии обработки свекольного сока на биосинтез лизина культурой СогупеЬас1ег1шп glutamicum 95.

IN Стадия обработки Среда с тв.фазой!Среда 1 без тв. фазы 1

1 1 сока РВ 10Тр, % С]уs г/л Yj уз IPBdqtp ,% С] у s .г/л Ylys 1

1 Ii. Неочищ.сок 81 6.3 0, 341 75 6,0 0,26 1

1?. Предв.дефекация 92 8,5 0.361 92 8,3 0,33 1

13. Осн.дефекация 90 4,5 0,181 91 5.0 . 0.24 1

14. Первая сатурация 90 5.8 0,201 90 5.1 0,22 1

15. Вторая сатурация 91 1.1 0.161 90 1.1 0.19 1

16. Сахароза(контр. 1) 92 7.1 0, 301 93 7,5 0,26 1

17. i Меласса (контр.2) 81 5,5 0.211 83 7,0 0.24 1 |

Результаты культивирования (табл. 2) показывают, что максимальный выход лизина наблюдается после обработки сока на стадии предварительной дефекации, и последующая обработка сока нецелесообразна; часть РВ бактериями не утилизируется,и следовательно может быть использована другими микроорганизмами.

Поэтому далее мы изучали культивирование дрожжей Candida tropicalis CK-4, усваивающих широкий спектр источников углерода при высокой скорости роста биомассы.

1.4. Культивирование дрожжей на гомогенизате сахарной свеклы.

Поскольку для дрожжей оптимальной считается концентрация РВ,,ач 10-20 г/л и после культивирования бактерий в среде остается примерно такое же количество сахара, мы сравнили рост дроажей на сахарозе и гомогенизате сахарной свеклы в этих пределах концентраций.

При культивировании дрожжей на гомогенизатах сахарной свеклы выход дрожжевой бисмассы, скорость роста грокжей и полнота потребления РВ из ферментационной среды выше, чем на сахарозе, скорость роста дро;»жей на гомогенизатах составляет (в зависимости от начальных доз засеза дрожжей и концентрации РВ) 0,01-0,59 1/час против 0,31-0,33 Чг.с"1 в контроле. Накопление дрожжевой биоиасси н на гомогенизате и на сахарозе максимально при начальниц РВнач 13-18 г/л.

Причиной усиленного роста дродаей на сахарно.-; свеиле могут

быть биологически активные вещества, присутствующие в свекле, либо наличие твердой фазы.

1.5. Влияние степени очистки свекольного сока на параметры

культивирования дрожжей. Влияние биологически активных веществ свеклы на рост дрожжей изучали, культивируя дрожжи на соке разной степени очистки.

Таблица 3.

Влияние степени очистки свекольного сока на параметры культивирования дрожжей.Candida tropicalis СК-4.

N Стадия очистки сока РВП0Тр', Прирост био- УдрЧО"9. Сырой

п/п • % массы, млн. кл/мл кл/г протеин,%

1. Неочищенный сок 90 633 32,1 58,5

2. Предв. дефекация 95 620 20,3 53.3

3. Осн.дефекация 77 230 8,5 53,3

4. Первая сатурация 61 555 25,6 48,9

5. Вторая сатурация 73 ' 458 20 i 9 52,1

6. Сульфатация 61 266 14,8 51,2

Результаты экспериментов, представленные в табл.3, показывают, что процесс очистки сока отрицательно сказывается на приросте дрожжевой биомассы и выходе дрожжевых клеток, Таким образом для культивирования дрожжей на гомогенизате свеклы стадия очистки сока не требуется.

1.5. Влияние твердой фазы на рост дрожжевой биомассы.

На следующем этапе экспериментов изучалось влияние твердой фазы на параметры роста дрожжей при внесении в среду с соком клетчатки в концентрациях 0-100 г АСВ/л.

Эффективность использования субстрата мы определяли по выходу биомассы дрожжей Удр.

Было показано, (табл.4) что введение твердой фазы в питательную среду в концентрации до 45 г АСВ/л увеличивает прирост биомассы и выход дрожжей.' Дальнейшее увеличение концентрации клетчатки снижает эффективность использования субстрата на рост б/и, полноту потребления РВ из среды, не изменяя скорости роста дрожжей.

Проведенные эксперименты. показали возможность раздельного культивирования бактерий и дрожжей на гомогенизате сахарной свеклы. Путем смешения потоков можно получить продукт с содержанием истин-

Таблица 4.

Влияние содержания твердой фазы в среде на параметры культивирования дрожжей Candida tropicalis СК-4 при росте на сахарной свекле.

N Содержание тв. фазы, г АСВ/л РВнач Р^кон М шах час"1 Прирост 'V Выход б/м, б/и, МЛН. КЛ/МЛ Удр»10~9КЛ/Г

1. 0 15,4 0,8 0,33 158,0 10.82

2. . 24,25 20,0 2.4 0,40 222,7 12. 75

3. 48.50 19,2 5.7 0,31 149,2 11.05

4. 72.75 19,3 7.7 0, 37 90.0 7.75

5. 97,00 23,5 8,4 0,_32 ' 45.1 7.04

ного белка 31-37%. Но т. к. бактерии не усваивают часть питательных веществ, перспективным представляется последовательное культивиро- ■ ваше. Подсев бактерий.к дрожжам нецелесообразен, т.к. дрожжи,, потребляя сахарозу, оставляют в среде РВ, из которых лизин бактериями не синтезируется. Поэтому далее мы изучали подсев дрожжей к бактериям в разные фазы роста бактерий.

2. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ.

Одной из целей было получение продукта с повышенной концентрацией лизина, поэтому важно, чтобы в консорциуме синтезируемый бактериями лизин не потреблялся дрожжами.

2.1.Изучение ассимиляции лизина дрожжами.

Для определения возможной ассимиляции лизина дрожжами были поставлены эксперименты по культивированию дрожжей в присутствии лизина. На разных стадиях развития дрожжей в среду культивирования добавляли лизин: в начале культивирования (лаг-фаза), на стадии экспоненциального роста, в начале стационарной стадии роста дрожжей. Результаты эксперимента представлены' в табл. 5.

Так как концентрация лизина при культивировании дрожжей в течение 24 часов не изменяется, динамика накопления дрожжевой биомассы и скорости роста дрожжей в средах с добавлением лизина и без него аналогичны, можно сделать вывод о принципиальной возможности культивирования дрожжей на лизинсодержащей среде в течение суток без изменения концентрации лизина. Дальнейшие эксперименты показа-

Таблица 5.

Изучение ассимиляции лизина дрожжами С. tropicalis СК-4.

|N Фаза роста дрожжей Конц-я лизина в среде, I жей при внесении LYS нач., г/л кон., г/л

Мдрох-час"

Лд Р, к о н млн.кл/ыл

1 ...... 11.лаг-фаза 3,4+0,3 3, 8+0,3 0,55 185*14,4 I

12.экспоненциальная 5, 0+0, 5 5,0+0, 2 0,51 220±8,6 1

13.стационарная 4, 0+0.5 4,1+0.4 0, 62 172±11,4 1

14.контр.(без лизина) | ' 0 0 0, 53 170±15,4 1

ли, что лизин используется дрожжами после исчерпания из среды источника углерода.

В предварительных опытах скорость роста дрожжей в консорциуме с бактериями была ниже (м=0,1 час"1), чем в монокультуре.Это может быть вызвано либо лимитированием компонентами питания, либо влиянием метаболитов бактерий.

2.2. Изучение влияние внеклеточных метаболитов бактерий на рост дрожжей при последовательном культивировании.

Влияние внеклеточных метаболитов бактерий на рост дрожжей изучали вначале на бесклеточной ЮК, взятой с различных стадий роста бактерий и отделенной от их клеток центрифугированием. В отцентрифу-

замедленного роста, стационарной и фазы отмирания бактерий доводили рН до 5,0, РВ - до 18-20 г\л и засевали дрожжами так, чтобы начальный титр дрожжей составлял 3-4 млн. кл\мл.

Результаты культивирования представлены на рис.3.

Рис.3. Рост дрожжей на фильтратах ЮК бактерий с разных стадий роста последних

тированной КЖ со стадий лаг-фазы.

Т[ЧПС\

- с лаг-фазы бактерий,

- со стадии замедл. роста,

- со стационарной стадии,

- со стадии отмирания. Было установлено, что в

зависимости от фазы роста бактерий, с которой был взят фугат, изменяется продолжительность экспоненциальной фазы роста дрожжей и максимальная скорость их роста. При засеве дрожжей в среду с лаг-фазы бактерий у дрожжей лаг-фаза отсутствовала, экспоненциальная фаза роста дрожжей длилась около 8 часов, титр клеток к моменту выхода на стационарную фазу составил около 136 млн.кл/мл. При использовании фугата с фазы замедленного роста у дрожжей наблюдалась лаг-фаза около 4' часов. Время выхода на стационар для дрожжей составило 45 часов, причем за это время потребилось всего 47-50% введенных РВ. Характер кривых роста дрожжей в случае использования фуггга со стационарной и фазы отмирания бактерий примерно одинаковый, стационарной фазы дрожжи достигают за 22 часа культивирования, титр клеток-1; скорости роста составляют соответственно 230 (м=0,56 час" ) и 260 млн. кл/мл (м=0,48 час"1).

Дальнейшее изучение влияния метаболитов бактерий на рост дрожжей проводили в смешанной культуре, выращивая дрожжи в присутствии бактерий. Дрожжи вносились на разных стадиях роста бактерий, аналогично указанным выше для фильтратов. Перед засевом дрожжей среда также доводилась до рН=5,0 и РВ=30-40 г/л. Результаты культивирования представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Зависимость параметров культивирования дрожжей в консорциуме с бактериями от фазы роста бактерий в момент подсева дрожжей.

N Фаза роста Лаг-фаза Скорость Конечн. конц-я С1уз, п/п бактерий дрожжей, ч роста Мдр, ч"1 дрожжей, млн. кл/мл г/л

1.лаг-фаза, рН=7

2. лаг-фаза, рН=5

3. фаза зам.роста

4. стационарная

5. фаза отмирания

0,5 0,13 25-31 3.8

0,0 0.18 17-20 2.5

1.3 0,25 .120-145 5,3

8,0 0,01 13-15 7.3

11,0 0,06 5-3 9.1

Как видно из табл. 6, с увеличением времени культивирования бактерий увеличивается лаг-фаза роста дрожжей. Ингибирование роста дрожжей метаболитами бактерий минимально при внесении дрожжей в смешанную культуру в фазе замедленного роста бактерий. Подсев дрожжей в стационарной фазе бактерий ведет к наличию длительной (8 час) лаг-фазы на кривой роста дрожжей, за 30 часов последовательного

культивирования прирост дрожжей составляет 13-15 млн.кл-мл. Подсев дрожжей после 72 часов культивирования бактерий неэффективен: прирост дрожжей в консорциуме составляет за 24 часа 5-3 млн. кл/мл. Дальнейшее выращивание ведет к уменьшению концентрации лизина, РВ остаются на уровне 0, 5-1,2 г/л.

Таким образом, дрожжи целесообразно подсевать к бактериям, когда те еще растут (стадия замедленного роста). При этом метаболиты дрожжей могут влиять на рост и продуктивность бактерий по лизину.

СОВМЕСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ.

3.1. Изучение влияние внеклеточных метаболитов дрожжей на параметры совместного культивирования.

С целью выявления влияния внеклеточных метаболитов дрожжжей на рост бактериальной биомассы и биосинтез ею лизина дрожжевая биомасса вводилась к бактериям, находящимся в стадии замедленного роста, на разных стадиях роста дрожжей: в начале экспоненциальной фазы (5 час), в фазе замедленного роста(20 час) и в стационарной фазе (30 час).При этом для выявления влияния внеклеточных метаболитов дрожжей посевной материал делили на 2 части: одну центрифугировали, отделяя дрожжевую биомассу от культуральной жидкости и находящихся в ней метаболитов, а другую (контроль) вводили в среду культивирования вместе с метаболитами, присутствующими в объеме жидкости посевного материала. Результаты эксперимента представлены на рис. 4.

Рис. 4. Влияние внеклеточных метаболитов дрожжей на параметры

где А - дрожжи в момент подсева находятся в экспоненциальной ' фазе роста , Б - в фазе замедленного роста, В - в.стационарной фазе. Индекс "н" относится к вариантам, в которых дрожжи вносились в среду вместе с метаболитами, находящимися в объеме посевного материала дрожжей.

Как видно из рис. 4А, дрожжи, внесенные к бактериям в фазе экспоненциального роста, активно растут в смешанной культуре со скоростью 0,65-0,69 час"1, потребляя за первые 5 часов культивирования до 65% РВ. Кривая накопления дрожжевой биомассы не имеет лаг-фазы. Максимум накопления лизина приходится на начало стационарной фазы роста бактерий.

При использовании дрожжей в фазе замедленного роста скорость их роста в консорциуме снижается до 0,20 час"1 (рис.4Б). Максимальная концентрация лизина совпадает по величине и по времени с первым вариантом. При подсеве к бактериям дрожжей, находящихся в стационарной фазе (рис.4В), в консорциуме на кривой роста дрожжей наблюдается лагфаза, скорость роста клеток дрожжей (0,12-0,15 час"1) минимальна. Накопления лизина в среде не происходит.

Анализ полученных'результатов показывает, что в отсутствии в среде метаболитов дрожжей в консорциуме уменьшается скорость роста дрожжей в экспоненциальной фазе, снижается полнота потребления РВ из среды, накапливается лизина в 1,2-2,5 раза больше. Максимальное влияние на биосинтез лизина проявляют метаболиты, выделяемые дрожжами к моменту выхода на стационар. С увеличением объема посевной дозы вносимых в среду дрожжей растет количество вносимых метаболитов дрожжей, что увеличивает степень утилизации РВ, однако уменьшает накопление лизина.

- Для успешного процесса совместного культивирования целесообразно использовать посевной материал дрожжей в фазе экспоненциального роста: при этом скорость роста дрожжей, накопле-

Рис.4В.Влияние внеклеточных метаболитов дрожжей на параметры ферментации смешанной культуры /дрожжи при засеве - в стационарной фазе/.

ние дрожжевой биомассы максимально, чем в чистой культуре бактерий.

а накопление лизина не ниже.

3.2. Управление процессом культивирования посредством варьирования засевных доз каждой культуры.

На следующем этапе мы варьировали засевные концентрации культур для подбора их оптимального соотношения, при котором бы бактерии синтезировали лизин, а дрожжи утилизировали непотребляемые бактериями РВ.

Была найдена пороговая засевная доза дрожжей -(0,8-1,0)»10 кл/мл, внесение ниже которой не приводило к приросту дрожжевой биомассы и дополнительному потреблению РВ из среды, и пороговая доза бактерий (2*108кл/мл), ниже которой развиваются преимущественно дрожжи. Внесение дрожжей в концентрации выше (5,0-6,0)»10° кл/мл приводит к подавляющему росту дрожжевой биомассы (Х=500-600 млн.кл/мл), лизин накапливается в незначительных количествах. Была определена область значений засевных концентраций дрожжей и бактерий, в которой возможно регулирование конечных характеристик КЖ.

При найденной выше оптимальной концентрации дрожжей в ассоциации культур варьировались засевные дозы бактерий. Результаты экспериментов представлены в табл.7.-

Таблица 7.

Влияние концентрации бактерий на параметры культивирования ассоциации бактерий и дрожжей.

№ Соотно- Конц-я клеток,млн.кл/мл Потребле- Лизин,М I шение дрожжей бактерий ние РВ из г/л

I Д: Б, / нач. кон. нач. кон. среды. %

1ДР

час

М

бак;

час

II. 1 1 2,6 250 420 8200 98,7 6,3 0.14 и, 11

12. 3 5 3.4 180 530 9354 98.1 6.9 0,13 0,09

13. 3 7 2,5 170 720 14600 91,0 9.3 0.11 0,09

1-. 0 ч - '- 716 37800 80,0 10,7 - 0.15

15. 1 п 4.0 460 - - 99,0 - 0,15 -

С увеличенной начальной концентрации бактерий при постоянной оптимальной концентрации дрожжей скорость роста дрожжей незначительно уненьшаетсп, стационарная концентрация дрожжевой биомассы в консорциуме пеньке, чем в контроле чистой культуры дрожжей. Накопление бактериальной биомассы с совместной культуре меньше, чем с

чистой, несколько уменьшается скорость роста бактерий; увеличивает-• ся содержание лизина в культуральной жидкости и полнота потребления РВ из среды культивирования.

3.3. Влияние очистки свекольного сока на параметры роста членов консорциума.

Для проверки влияния очистки свекольной пульпы на конечные характеристики КЖ консорциум засевали на сок, обработанный методом предварительной дефекации с добавлением и без добавления клетчатки.

Таблица 8.

Оценка эффективности предварительной дефекации свеклы для консорциума.

1 Вариант Р^П о т р % С) у 5, У1уэ X др. 1 Сырой 1

1 . 1 г/л млн.кл/мл протеин,% 1

1 11. неочищ. сок 92 5.4 0,19 531 68.1 1

12. неоч. сок+тв. ф. 93 6.6 0,23 458 48,7 1

13. преддеф. сок 92 6,7 0, 25 70 35,3 1

14. преддеф. сок+тв. ф 1 . 90 8.5 0,32 197 28,6. 1

Анализ результатов культивирования, представленных в табл.8,показывает, что обработка сока увеличивает выход лизина, однако уменьшает накопление дрожжевой биомассы. Добавление клетчатки в количестве, соответствующем РВ 18-25 г/л, увеличивает выход лизина и дрожжевой биомассы. Суммарный показатель качества - содержание сырого протеина, - выше на среде с неочищенной свеклой. Из чего следует бывод о нецелесообразности стадии очистки свекольного субстрата при использовании консорциума для получения белково-углевод-ной кормовой добавки.

3.4,Эффективностьиспользования субстрата в консорциумах.

Эффективность использования консорциума по сравнению с чистыми культурами определяли по эффективности потребления субстрата в сов-мгегной культуре, для чего сравнивали долю РВ. расходуемую на прирост биомассы в чистой и совместной культуре.

Расчеты проводили, сделав допущение, что выход по биомассе каждой из культур п консорциуме равен выходу в чистой культуре (по крайней море не меньше его).

Определив из вариантов чистых культур выход по биомассе как

Улр«дТдр/дРВдр, вычисляли расчетное количество РВ. необходимое для прироста образовавшейся в консорциуме дрожжевой биомассы: дРВЛр. коне. =дТДр.коне. ^ др. Аналогично определяли необходимое количество РВбак коне А™ роста бактериальной биомассы в консорциуме. Сложив обе величины, получили расчетное количество РВ, потребное для роста микроорганизмов в консорциуме: д8расч=дРВ др.коне.+дРВоак.коне.: д8факт- фактическое количество РВ, потребленное консорциумом в эксперименте.

Рис. 5. Зависимость эффективности потребления субстрата консорциумом от засевных доз бактерий и дрожжей.

Отношение расчетного потребления субстрата к фактическому (см.рис.5) возрастает с увеличением засевной дозы бактерий и почти не меняется с увеличением засевной дозы дрожжей в исследуемом интервале, откуда следует, что в консорциуме выход по биомассе каждой из культур выше, чем в монокультурах.

3.5. Скрининг дрожжей для совместного культивирования с лизннсинтезирующими бактериями.

С целью подбора дрожжей, оптимальных для культивирования в консорциуме с бактериями нами параллельно было проверено 16 штаммов дрожжей, имеющих широкий спектр потребления углеводов.

По результатам накопления биомассы и степени потребления РВ при культивировании на сахарной свекле при рН=7,0 для работы было отобрано 6 штаммов, принадлежащих к видам С.БСоШ1.С.иШ15, 8.се-геу1Б1ае, отличающиеся разной морфологией.

I условиях, оптимальных для биосинтеза лизина, все кривые роста чистых культур дрожжей имели лаг-фазу. Из-за сильных различий в размерах клеток сравнение роста дрожжей вели по содержанию истинно-

го белка. В чистых культурах в данных условиях максимальную концентрацию истинного белка накапливали дрожжи С.scottii 592, С.tropicalis СК-4 и S. cerevisiae 667, потребляя из среды 93-100% РВ.

Активный рост биомассы дрожжей в совместной культуре начинается по достижении стационарной концентрации бактерий, и почти во всех случаях слабее, чем в чистой культуре, за исключением С. scottii 666 и C.utilis 770, которые в чистой культуре росли медленно.

Результаты смешанного культивирования разных штаммов дрожжей по сравнению с монокультурами представлены в табл. 9.

Табл. 9.

Параметры культуральной жидкости для монокультур и консорциума бактерий и дрожжей.

1 1 IN 1 Культура 1 I i 1Монокультуры ! ........ " ...... — 1 1Консорциум бактерий и дрожжей!

1 1 1 1 I 1 IHCT. IPB„0TP. 1 Концен- 1 1 |РВП0Тр1Истин- 1 1 N своб. 1

1 1 1 белок 1 % трация 1 в см. fный лизина I

1 1 1 % 1 1 лизина, 1 культ. 1 белок. в N ист1

1 1 1 I 1 1 i i 1 г/л 1 % 1 % 1 I белка, % 1

1 1 И. IC.scotti 592 l l 1 37.71 92,7 1 8.1 1 1 1 93,7 152,71 6,8 1

12.1С.tropicalis СК-4 1 39,41 100,0 1 8,6 1 89,4 149,00 9,2 1

13.IS.cerevisiae 667 1 34,41 100,0 1 6,8 1 96,7 147,17 6,6 1

14.1С.utilis 297 1 26.41 17,0 1 10,8 1 90,0 156,22 9,1 1

15.1С.scottii 666 1 32,9l 33,0 1 8,6 1 49,0 149,16 7,5 1

16.1С.utilis 770 1 33, 41 20,0 1 9,5 1 83,8 149,70 8,4 1

17.1С. glutamicum 95 i i 1 37,21 82,6 i i 1 9.9 I 1 - 1 -1 1 11,5 1 1

В консорциуме с бактериями эффективность культивирования определяли по накоплению белка, лизина и потреблению РВ. Так максимальное количество белка накапливалось в консорциуме: бактерии - дрожжи С. scottii 592 и бактерии-дрожжи C.utilis 297.

Максимальная концентрация лизина была в парах бактерии-дрожжи С. uitilis 297, бактерии-С. utilis "70, и бактерии-С. tropicalis СК-4, составляя величину не ниже, чем в монокультуре бактерий.

Хотя чистые культуры дрожжей потребляли 98-100% РВ, в консорциумах 100%-ной полноты утилизации РВ не было. По-видимому, после потребления углеводов из среды дрожжи начинают потреблять лизин в качестве источника углерода, нежели другие углеродные вещества, вступающие d реакцию на РВ.Наиболее полно потребление РВ наблюда-

лось в парах бактерии-дрожжи S. cerevisiae 667, бактерии-С.scottii 592, бактерии-С.utilis 297. бактерии-С.tropicalis СК-4.

Во всех вариантах совместного культивирования величина белкового азота больше, чем в чистых культурах дрожжей и бактерий. Приняв за критерий качества продукта содержание белкового азота, лучшими можно считать варианты совместного культивирования бактерий с дрожжами C.utllis 297 или с дрожжами C.scottil 592. Наиболее богат лизином белок на основе предложенной нами ранее ассоциации культур С.glutamlcum 95 и С. tropicalis СК-4 (A.C.N 1748442).

Таким образом, в зависимости от требований к качеству кормовой добавки следует использовать консорциум бактерий с дрожжами С.scot-tli 592 для получения продукта, богатого белком с невысоким содержанием лизина.

Для получения добавки с повышенным содержанием лизина следует использовать консорциум бактерий с дрожжами С. tropicals СК-4 или C.utllis 297. В дальнейшем перспективным кажется изучение ассоциации из 3 и более членов.

По результатам работы наш были сделаны следующие выводы:

1. Изучено культивирование дрожжей родов Candida и Saccharomy-ces и лизинсинтезирующих бактерий Corynebacterium glutamlcum 95 с целью создания устойчивой ассоциации. Показана возможность управления процессом культивирования путем варьирования засевных доз каждой из культур.

Для получения продукта, обогащенного в первую очередь дрожжевым белком, следует использовать консорциум бактерии-дрожжи C.utllis 297 либо бактерии-дрожжи C.scottil 592, засевая в среду бактерии в концентрации (0,8-2,0)*108 кл/мл, а дрожжи - (5-15)«Ю6 кл/мл. Для получения продукта с повышенным содержанием лизина необходимо применять ассоциацию бактерии-дрожжи С. tropicalis СК-4, либо бактерии- дрожжи C.utllis 297, засевая дрожжи в концентрации (1-5) *106 кл/мл, бактерий - на уровне (5-8) * 108 кл/мл.

2. При исследовании влияния метаболитов бактерий и дрожжей друг на друга обнаружено, что бактерии в стационарной фазе-роста выделяют метаболиты, удлиняющие лаг-фазу роста дрожжей. Определено, что введение дрожжей в фазе экспоненциального роста в консорциум способствует повышению утилизации РВ. увеличивает накопление дрожжевого белка.

3. Исследован рост консорциума на свекольном субстрате различной степени очистки. Показано, что примеси, тормозящие биосинтез ли-

зина, удаляются на стадии предварительной дефекации. Скорость роста дрожжей и накопление дрожжевой биомассы снижается по мере углубления очистки свекольной пульпы. Содержание сырого протеина максимально в ферментациях консорциума на необработанном сырье и достигает 65-69%.

4. Подобраны штаммы дрожжей для утилизации остаточных РВ из среды культивирования без потерь синтезируемого бактериями лизина. Определено оптимальное время культивирования консорциума, составляющее 24-30 часов.

5. На основании исследований сделаны рекомендации по принципиальному оформлению процесса совместного культивирования, позволяющему получить продукт, преимущественно обогащенный лизином или дрожжевым белком.

Добавка, обогащенная лизином, содержит 49-56% истинного белка, доля лизина в котором составляет не менее 8-9,2%. Добавка с высоким содержанием истинного белка и пониженным содержанием лизина содержит 50-53% истинного белка, доля лизина в котором не менее 6,5-8,0%.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Е.А.Садовникова, С.Н.Спирина, Н.С.Марквичев, М.Н.Нанаков.

Последовательное культивирование микроорганизмов на сахарной

свекле для получения белково-углеводной кормовой добавки, обогащенной лизином.//Республиканская конференция "Биотрансформация вторичного растительного сырья в белковые кормовые продукты". Тезисы докл.. стр.51. (Тбилиси, декабрь 1987 г.)

2. Е. А.Садовникова. С.Н.Спирина, Н.С.Марквичев, М.Н.Манаков. Ингибирование роста дрожжей Candida tropicalis продуктами жизнедеятельности бактерий Corynebacteriura glutamicura. //Всесоюзная конференция "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", (12-14 декабря 1989 г.)Тезисы докл., стр.58. Пущино, 1989.

3. Е.А.Садовникова, М.Н.Манаков. Н.С.Марквичев. Способ получения кормовой белково-углеводной кормовой добавки". A.C. СССР N 1748442 от 15.03.92 г.

4. Е. А.Садовникова, Н. С.Марквичев, Я. Ю. Безлюдова, М.Н.Манаков. Новая кормовая добавка, обогащенная лизином, - продукт совместного культивирования бактерий и дрожжей.//Всероссийская конференция "Химия и технология лекарственных средств". Тезисы докл.,стр.53-55, С.-Петербург, 1994 г.