Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Смешанные культуры микроорганизмов для кормопроизводства

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Смешанные культуры микроорганизмов для кормопроизводства"

ri 0 VH

î g ДПР 1393

академия наук республики казахстан ИНСШГ/Т шкрошшми и вирусологии

На правах рукошса

КОНУСШЕВА ШЬЯН ШОДАЯОВЯА

смнпаиннв кулыуш шшштшшов для к0ршр0йзв0дсш

03,00.07. - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наув

Алматн ~ - 1993

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии Академии наук Республика Казахстан.

Научный руководитель: доктор биологических наук

САУБЕНОВА М.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор НИКИТИНА Е.Т.

кандидат биологических наук, доцент ЖУЩНОВА А.А.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии. Российской Академии с/х наук

Защита диссертации состоится " зО" 1993 г.

в /У часов на заседании специализированного совета К.008.01.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ярд Институте 'микробиологии и вирусологии АН РК по адресу: 480100, Алматы , ул.Богенбай-батыра,103.

С диссертацией _йогно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии а вирусологии АН РК»

Автореферат разослан "_"_ .1993 г.

Учений секретарь специализированного совета, ' л

кандидат биологических наук ,({( ..г Г.С.Махмудова

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБ01Ы

Актуальность проблем. В решения ряда вопросов кормопроизводства большая роль принадлежит микробиологической промышленности. Это, прежде всего, производство богатых полноценным протеином, незаменимыми аминокислотами, штанинами и другими биологичесяа активными веществами микробных биомасс. Прогнозируется, что в связи с невозможностью дальнейшего расширения посевных площадей и несбалансированностью белка растительного происхождения,быка одноклеточных будут иметь все возрастающее значение как з кормления сельскохозяйственных киеотных, так а в питании человека (Пронин, 1985; Безруков, Градова, 1987; Скрябин, Головиев, IS87; Сас-сон, 1987), тем более, что по данным специалистов, дефицит белка в шре к концу XX века составит ш менее 30-35 ыпн.т в год (Баков, Маяаков и др.,1987).

Не менее важной дробленой является недостаточное содержание з кортах каротина, что отрицательно сказывается на продуктивности сельскохозяйственных животных а птицы.

В настоящее время уже организовано крупнотоннажное дроша-ленное производство кормовых дрозсаэй, но по ряду причин оно нэ удовлетворяет постоянно растущие потребности животноводства и потому существует практика получения их непосредственно в хозяйствах. Процесс выращивания дрожжей достаточно энергоемок. Однако вред, наносимый хроническим дефицитом белка сельскохозяйственный животным, в особенности голодаяку^оправдывает эта затраты. Для повышения экономической эффективности необходимо исследование" возможности увеличения выхода искомого продукта а повышения его кормовой ценности при снижении затрат на производство.

В связи с нестерильностью процесса и необходим» стыэ предотвращения попадания в производственные емкости нежелательной шкрофгоры необходимы также исследования приемов защиты ферментации.

Как показывают многочисленные данные (Пзчуркиа и др.,I981) реальным путем в решении этих вопросов является использование смешанных культур микроорганизмов. В случае выращивания дробей оптимальными спутниками, стимулируэдаш ах фазаологичесгузс активность и повышащима биологическую ценность полученного продукта, являются молочнокислые бактерии (Саубенова, I9S0). Z -р.- --

том сказанного представляется перспективным исследование возможности применения смешанных культур дрожжей и молочнокислых бактерий в кормоцроизводстве.

Дель работы: Целью работы является интенсификация процесса выращивания кормовых и каротивсантезирувдих дрожжей и обеспечение защиты ферментации.

Поставленная цель достигалась:

- подбором дрогкей - продуцентов белка, каротина и амилолити-ческих ферментов,

- использованием смешанных культур дроааей с молочнокислыми бактериями,

- усиленней положительного взаимодействия микроорганизмов в смешанной культуре,

- повышением кормовой и биологической ценности полученного продукта. _

Научная новизна. ; Созданы продуктивные и устойчивые смешанные культуры дрожжей и молочнокислых бактерий для биоконверсии крзхмал содержащих сред и молочной сыворотки в коршвне протеин-каротиповые препараты, полученные путем их адаптации друг к другу на уровне метаболитов.

Практическая ценность. Разработан.<:способ обогащения протеином крахмалсодержащих сред (¿.о. £ 167477. 1991; Рекомендации, 19Э2), не требувдий предварительного осахаривания субстрата, а также способ получения белково-каротаового препарата на основе ' шлочной сыворотки. Использование в составе ассоциации молочнокислых бактерий не только способствует накоплению дрожжевой биомассы, но в силу наличия у них антагонистической активности*, препятствуют развитию в производственных емкостях нежелательной' микрофлоры.

Основнне положения, выносимые на защиту. I. Продуктивность процесса биоконверсии крахмал содержащих сред может быть- повышена путем использования сметанной культуры кормовых дрогней Св том числе амилолитических) с гетероферментативнши шлочнокислнми бактериями.

2. Создана ассоциация дрожжей - продуцентов кормового бедка и кароиша-с молочнокислыми бактериями для получения протеия-каротвновэго препарата на основе молочной сыворотки.

3. Продуктивность а устойчивость смешанной культуры дроетей и молочнокислых бактерий может быть повышена путем адаптации их клеток друг к другу.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждены на TL а УП съездах ВШ (Алма-Ата, 1985), на всесоюзных конференциях (Красноярск, 1987, Алма-Ата, 1990, 1991, Оренбург, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, одно авторское свидетельство, рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков а 23 таблицы, состоит из введения, 6 глав, выводов, списка использованной литературы, включающего 187 отечественных и иностранных наименований.

ОБЬШЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЕ

Объектом исследования служили дрожжи: Candida -tropicalis 36, Candida tropicalis 29Ю, Candida guilliersn-ndii 21, Trichosppron cutaneum 13, Endoojcopsia fibuligera й-547, Torulopsis pulcherima 39; молочнокислые бактерии: Iactobacterium pento-aceticun B(6)-23, Streptococcus lactia diastaticua; пропаоно-вокислые бактерии - Propionibacterium sheraani.i-, полученные из музея кивнх культур лаборатории.

Дрожяи выращивали на синтетической среде Ридер, в которую в качестве углеродного питания вносили глюкозу, сахарозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу, декстрин, нерастворимый крахмал ила мелассу. pH среды поддерживала з зависимости от поставленной задачи - на уровне 3,5-5,0, температуру 30-32°С. Молочнокислые бактерии (засевная культура) выращивала в травяном отваре с 1% глюкозы в стационарных условиях в течение 72 ч при температуре 28-30°С. Продаоновокислые бактерия вырандавала на элективной среде (72 ч) при температуре 30-32°С.

Кинетику роста микроорганизмов изучали в периодических условиях при полунепрерывном культивировании на качалке (160-180 об/мин), а таете при непрерывном культивировании в режиме р&-стата на ¿лалой лабораторной установке ЛУК-2 с рабочим обьедак ферментера 100 ш при pH 3,5-5,5 и температуре 30~32°С.

- Исследовали дЕшзнолого-биохшичзехае свойства дроягей и бактерий: биомассу ~ вефелометрическа на ФЖе -56 ПМ, выражали в единицах оптической плотности - ед. ОД л весовым методом с пересчетом на сухую массу, обдув кислотность (по молочной кислоте) -титрометричесхи с ОД я раствором квОН , редуцирухвдш вещества СРВ) - но Бертрану; белок - по макрометоду ш Биурету, pH среды -догенциометряческн.

Количество карохиноидов олределяли но методу В.АДевятнина с последующим пересчетом по формуле Т.С.Бобковой (1ЭБ5). ¡Мутагенный эффект учитывали по вкаиваеыостд, шрфологаческой изменчивости и синтезу каротивоидов.

РЕ37ЛЫА1Ы ИССДЩОВАНИЙ

Смешанные культуры дрожжей - продуцентов кормового белка

В Институте микробиологии и вирусологии АН Республики Казахстан был разработан способ протеанизадии грубых кормов путем запаривания их в смеси с выращенными в кормоцехе жидкими кормовыми дрожжами. (Реюжендацаи, 1930, IS83), В качестве продуцентов биомассы богатой белком цри атом используются дрожки с.tropicalis 3S, C.guilliermondii 21 И Trichosporon cuianeua 13. Необ-ходидасть применения смешанной культуры была обоснована возможностью значительных колебаний в структуре и биохимическом составе используешго сырья,, а также угрозой отклонения от заданных параметров культивирования.

Проведенное наш обследование показало, что совместное культивирование четырех штаммов в периодических условиях не отражается существенным образом на удельной скорости роста ассоциации и выходе биомассы с единицы использованного субстрата по сравнении с монокультурами тех se штаммов.

При изучении микрофлоры производственных емкостей оказалось, что в случае использования осахаренных крахмалсодержащих сред в ферментерах превалирует штамм с.-tropicalis 36 и его разновидности.

Таким образом, при использовании дрожжей рода с.tropicalis 36 в силу конкуренции за субстрат преимущества у смешанной

культуры по сравнению с монокультурами не наблюдается и хотя указанная смесь дрожжей а обеспечивает стабильность процесса при варьировании условий,' повышению эффективности процесса она не способствует.

Среди микроорганизмов имеется огромное число видов, активно синтезирующих ашлолитические ферменты. Использование их в качестве продуцентов биомассы в монокультурах или в сметанных культурах с другими продуцентами позволило бы упростить процесс и снизить себестоимость продукта за счет устранения стадии осахаривания крахмала. Поэтому в качестве продуцентов белка пошко ранее внедренных дрожжей были испытаны также используемые в кормопроизводстве ЛаТЕИИ. ДРОКЖИ EndoaycapBia fibuligera Н-547 , обладайте амклолнтической активности), любезно предоставленные нам В.ТДука.

Общеизвестно, что молочнокислые бактерии в определенных условиях шгут стимулировать процесс накопления биомассы дроззей а подавлять рост посторонних микроорганизмов. Представлялось перспективным введение их в смешанную культуру с дрожжами., с тем, чтобы не только стшзулировать их рост, но и занять свободную экологическуи нишу.

В связи с этим было исследовано влияние различных штаммов бактерий-продуцентов органических кислот ~ streptococcus lactis diaatatieus (АМС), Lactobacteriun pentoaceticum СПМБ) И Тго-pionibacterium shermanii (ПКБ)-на РОСТ И ЭКТИВНОСТЬ накопления биомассы дрожжей в смеиашюй культуре.

Было показано, что в периодических условиях культивирования при росте на среде с глюкозой смешанная культура бактерий и дрожжей отличается от монокультуры дрожжей удлиненной лаг-фазой. Наибольшая даг-^аза отмечена при сошэстном культивировании дрожжей и АМС - 3-12 ч (рис,1, 2). Влияние других бактерий - ffiffi и ПКБ -на дрожжи избирательно. Следует отметить, что наименьшая лаг-фаза наблюдается цри выращивании в смешанной культуре ПМБ с дрожжами End. fibuligera R- 547 (рис.3).

Смешанная культура бактерий и дрожжей в периодических условиях культивирования также отличается пониженной удельной скорость а роста (табл.1). Наиболее выражено это у ассоциации c.guii-liermondii 21, T.cutaneum 13, G.tropiCalie 36 К ALiC, наименее - у ассоциации дрожжей и ПМБ.

- а -

/2

4

i,. 15

§

Ь 3 12 15 21 24 Время,*

Рис.1. Рост смешанной культуры дробей и бактерий на

глюкозе Ш) в периодических условиях куль и-вирования.

l.C.tropicalle 36 + АМС 2.C.guilliermondii 2'i + AMC

x.vutaneüa j. ДМЛ * ""»«"^J-J. CI + лми

^.End.fibulagera R-547 + MC

12 15

Время, ч

Рис.2. Рост смешанной культуры дрожжей и молочнокислых бактерий на среде с глюкозой (1%) в периодических условиях культивирования.

Таблица I

Совместное культивирование молочнокислых бактерий и дрожжей в периодических условиях

Компоненты смешанной культуры ! i/t*sax -1 ч-1

Дрожжи бактерии J

АСД, г/л

¡Выход на

¡един.

{субстрата,

I. С»guxlliermondii 21 0,42 3,23 41,4

2. С. +АШ 0,13 1,52 30,4

3. С. +ПМБ 0,32 1,33 30,4

4. С. -ШКБ 0,35 1,74 ■ 30,3

I. С.tropicalie 36 0,45 3,45 42,0

2. С. +AMC 0,27 2,01 32,4

3. С. +ДМБ 0,26 2,08 37,0

4. С. +ПКБ 0,28 2,22 39,6

I. Т.cutaneum 13 0,37 4,7 50,6

2. Т. +AMS 0,15 2,61 115,1

3. Т. •ШМБ 0,28 2,32 129,0

4. Т. +ПКБ 0,27 2,32 145,0

I. End. fibuligera R-547+AMC 0,27 1,46 97,3

2. +ПМБ 0,30 1,6 I6Q,0

3. -ШКБ 0,20 1,41 110,69

Таким образом, в болы®ястве вариантов смешанных культур бактерий и дрожжей в периодических условиях культивирования на легкогидролизуемом субстрате отмечено отрицательное нх взаимодействие, выразившееся в удлинении лаг-фазы, снижении уровня биомассы и удельной скорости роста. Исключение составляют ассоциации дрожжей End. fibuligera R-54? ИЛИ C.guilliemondii 21 С ШБ.

С целью углубленна положительного взаимодействия этих организмов в сметанной культуре проводила адаптации их друг к другу на уровне продуктов метаболизма.

Для этого проводили длительное культивирование сметанной культуры в условиях периодической подала питательной среды а слива отработанной среда т.е. в полунепрерывном режиме. Для вы-

явления концентрации источника углерода, которая бы не мешала использованию метаболитов, была использована среда Ридер с 0,5%, 1% и 2$ глюкозн. Длительность культивирования - 24 ч, засев составлял 1/20 часть первоначального объема, общая продолжительность наблюдений - 9 суток.

Для сравнения в полунепрерывных условиях культивировала также монокультуру c-suillieroondii 21 и ассоциации дрожжей с МБ и AMC.

Б условиях недостатка питательного субстрата (вариант с 0,5% глюкозы) цропионовокислые бактерии и стрептококки вымываются из смешанной культуры через 2-3 суток. Количество клеток лактобак-терий в первые 3 суток уменьшается с 33 до 22*Ю7 кл/мл, затем восстанавливается и возрастает до 40-43'Ю7 кл/мл. Число дрожжевых клеток в атой ассоциации такке уменьшается с 0 до ЗО'Ю6 кл/мл, затем возрастает до 47-49*10 кл/мл (рис.4 ). Соотношение дрожжей и молочнокислых бактерий в конечном счете устанавливается 1:1.

При наличии 10 г/л глюкозы, обеспечивающих рост дрожжевых клеток в течение 10-12 ч, появляется возможность для бактерии попользовать глюкозу дай своего роста. В ассоциации с пропионо-вокислыми бактериями в первые 3 суток наблвдается высокий прирост биомассы, но через 4 суток бактерии в культуре уже не было и восстановился контрольный уровень показателей. При этой повторяется ситуация со стрептококками и лактобактерияма. Первые вымываются через 2 суток, число вторых постепенно возрастает, соотношение дрожжей и бактерий 1:2.

Проведенный анализ доказал, что потребление дрожжевых метаболитов молочнокислы?,® бактериями начинается после полного ис-' черпания глюкозы и замедления их роста. Приблизительно 20-часовае культивирование в таких условиях обеспечивает восстановление походного числа клеток молочнокислых бактерий, в результате чего создаются условия для дополнительного прироста биомассы дрожжей за счет органических кислот^ продуцируемых бактериями. В случае уменьшения времена культивирования (10 ч) число меток бактерий ШБ восстанавливается наполовину, но и при этом соотношении сме-ванная культура Lact. pentoaceticum В(б)-23 И C.guilliermondii 21 остается жизнеспособной.

В условиях производства кормовых дрожжей используется 1,0%-

Рис.4. Полунепрерывный процесс культивирования

моно- и смешанных культур на глюкозе (0,5^) 1.с.еит1вгшопаи 21 П. + ПКБ

Ш. + ДМБ

1У. + АХ

1 - АОД,

2 - число клеток дрояжей,

3 - число клеток бактерий.

ная конце нотация легкоусвояемых Сахаров, но длительность процесс; ограничена 6-8 ч. Этого достаточно для поддержания минимального уровня шлочнокаслнх бактерий в смэишшой культуре, однако в данных условиях их роль по-видимому не цроявдяется полностью. Удлинение же процесса нежелательно из экономических соображений.

Как ухе говорили, подбор шкробного консорциума, способного утилизировать крахмал без предварительного осолаживания^ позволил бы существенно сократить' и упростить технологию выращивания дрожжей. Кроме того, как известно, использование трудаогидролизуемого субстрата создает более подходящие условия для развития смешанной культуры, так как в процессе роста появляются промежуточные продукты распада, которые могут стать субстратом для микроорганизмов -спутников. Таким образом, с одной стороны снижается конкуренция за субстрат, с другой - устраняется ингибирование конечным продуктом.

Для осуществления этой цели была отобрана смешанная культура ИЗ молочнокислых бактерий Lactobacterium pentoaceticum Ш5, аыалолитических дрожжей End. fibuligera R -547 и применяемых ранее для обогащения кормов протеином c.guiiliermondii 21. • Дрокяи были выбраны с учетом каилэньшего иигибирования их роста молочнокислыми бактериями по результатам исследований, представленным выше. ДЛЯ сравнения йСЕОЛЬЗОВаЛИ МОНОКУЛЬТУРУ End. fibuligera r -547, а также её" ассоциацию с ДМБ. Кривые роста трех вариантов смешанных культур, выращенных на забуференной среде СрН - 5,8) Рвдер с крахмалом (10 г/л), изображены на рис.5,

Использование ассоциации End. fibuligera й-547 и ПМБ с начальным соотношением клеток дрожжей а бактерий 1:20 стимулировало процесс накопления биомассы в первые 9 ч и в результате к концу наблюдения (36 ч) позволило несколько увеличить прирост биомассы.

У ассоциации End. fibuligera В-547,C.guiliermondii 21 и ШБ кривая показывает постепенное накопление биомассы до 30 ч наблюдения и в результате - более высокий по сравнению с остальные вариантами ее выход. Прирост биошссы, как видно из рас. обеспечивается в основном дрожжами C.guiiiiermondii 21.

Для расчета кинетических характеристик микроорганизмов в грех вариантах использовали данные накопления их биомассы при росте на забуференной среде Ридер (рН 5,8) с нерастворимым крахмалом в концентрации 2,0; 4,0; 10,0; 15,0 г/л. Рассчитывали мак-

и

(75 О

О о

ы в

О Ф

I /

/La

IQ 20 30 10 Я] 30 10 20 30

Время,час

Рис.5. Рост моно- и смешанных культур дрожхей на нерастворимом крахмале (10 г/л) I - АСД, II, III, 1У - число клеток 1 .End.fibuligexa R-547 2.End.fibuligera R-547 + ПМБ 3.Eod.fiBuXigera R-547 + C.guilliermcmdii 21 + ffiE

0,4

0,2 ОД

I 2 3 4 5 в 7 8 9 10 г/л

Рис.6. Зависимость удельной скорости роста моно- и смешанных культур от концентрации субстрата 1.End.fibuligera R-547 - 2.End.fibuligera R-547 + 3»Bnd fibuligera + C.guillieraondii + ffi¿B

стильную удельную с короста {/о мах) а сродство к субстрату ( кБ ).

Максимальная удельная скорость роста End. fibuligera r -547 составила 0,17 ч , кБ - 2,1 г/л; у смешанной культуры End. fibuligera й-547 + ШБ^ ма* - 0,28 ч"1, кв - 1,5 г/л, a End. fibuligera S -547 + C.guilliermondii 21 + ШБy/i- мах - 0,20 4 , Kg - 1,5 г/л (рис.6). Введение же в смешанную культуру дополнительно c.guilliermondii 21 не снижает ее конкурентноспособности (к8 также остается на уровне 1,5 г/л - рис.6), но способствует более высокому накоплении биомассы.

Так при 2 г/л крахмала в среде накопленная биомасса за 24 ч у варианта End. fibuligera R -547 + C.guilliermondii 21 + ПЫБ составляет 1,73 г/л

Соотношение числа клеток на среде с 2 г/л в период максимальной скорости роста в ассоциации End. fibuligera R -547 + ДМБ -1:100, В ассоциации End. fibuligera R-547 C.guilliermondii 21 + ПМБ - 1:4:-100. К ковпу опыта это соотношение изменилось: у первого варианта оно стало 1:10, у второго - 1:4:60.

На среде с 10 г/л крахмала на протяжении 24 ч соотношение . клеток дрсгкзй и бактерий оставалось практически неизменным: в ассоциации End. fibuligtra R-547 + C.guillieraondii 21 + ПМБ оно было 1:2:4.

. После определения кинетических характеристик роста у полученных ассоциаций была проверена в оэлунепрерывных условиях их популяцаонная устойчивость. Опыты проводили на забуференной (рН 5,8) и обычной среде Ридер с 0,5$ крахмала. Длительность опыта 24ч. По кривой роста этот период соответствует фазе замедленного роста и переходу к ставдонарной фаза. Общая продолжительность наблвде-вий 10 суток. Помимо описанных выше трех вариантов культур были использованы также ассоциации с амилолитическим стрептококком (АМС) и только дрожжевые.

Наибольшее накопление биомассы в условиях постоянного значения рН среды отмечено в вариантах End. fibuligera R-547 + ШБ И End« fibuligera R-547 + C.guilliermondii 21 + ПЫБ - 3,25 И 3,61 г/л соответственно (табл.2). Этот уровень поддерживался в течение 10 пересевов. Соотношение клеток дрожжей и бактерий в начале опыта было 1:1 и 1:1:3, до истечении 10 суток оно стало 1:15 и 1:10:20, т.е. произошло возрастание числа клеток бактерий, а также дрожжей c.guilliermondii 21. В случае использования клеток дрожжей и бактерий в соотношении 1:20 появляется воз-

Таблица 2

Показатели полунепрерывного процесса культишровшшя различных ассоциаций микроорганизмов на крахмале (5 г/л) в условиях постоянного рН (5,8) среды

, Компоненты смешанной культуры J I сутки ' 10 суток

И пп ! дрожжи ! шлочнокислые ! АС ! 1 бактерии . ! г/ ! ! ■!• 1 ! ! ¡5- ! i ' i Вы^од, /0 !Соотношо- 1 !ш1э клеток! |др.:бакт. ! АСЦ, г/л ! Выход,Юоотноше-! % !ние клеток ! ¡дрожжей й ! 'бактешй

I. End. fibuligera R-W-^ Affi 2,12 92,2 1:6 1,36 97,1 1:30

2. - » - + ПМБ 3,25 116,1 1:1 3,0 130,4 1:15

3. End. fibuligera R-547+

C.guilliermondii 21 1,92 64,0 1:1 2,5 106,7 1:4

4. - " - +AMC 2,34 83,6 1:1:6 1,94 97,6 1:1:200

5. - f - +ПМБ 3,61 157,0 1:1:3 '3,43 149,0 1:1:20

6. - <• ~ +АМС+ПМБ 2,0 87,0 1:1:60:10 3,19 68,6 1:7:5:10

можность дочти наполовину сократить длительность процесса, получив при этом достаточный прирост биомассы и конкурентноспособную ассоциацию.

Для автоселекцаи адаптированных друг к другу клеток дрожжей и молочнокислых бактерий в условиях протонного культивирования был использован рН-стат. Культивировали как мэнокулыуру End. fibuligera r-547, так и ее ассоциацию с молочнокислыми бактериями (1ЫБ) на синтетической среде с крахмала СрН на входе 7,0; в ферментере 7,0), При культивировании шнокультуры стационарное состояние отмечали через 40 ч, скорость протока в этот период составляла 0,18 (табл.3). При подсеве молочнокислых бактерий наблюдали постепенное повышение показателей скорости протока и накопления биомассы, более полную утилизацию субстрата. Устойчивого состояния совместная культура достигла через 28 ч. Соотношение количества дрожжевых и бактериальных клеток при этом составило 1:20. При соблюдении условий культивирования оно сохранялось неопределенно долго.

Таблица 3

Показатели рй-статндго культивирования юно- и смешанной культуры дрожжей и шлочнокислых бактерий на нерастворимом крахмале (стационарное состояние)

Вариант ! Показатели процесса

! FH •! РН ! Д т! X ! У !Пг/л !%т.!Гнач. _! ! t ч1; г/л I (%) 1 ч !г/л !г/л

1. End. fibuli-

eexa R-547 5,0 4,34 0,18 . 0,21 17,5 0,04 1,8 1,2

2. End. fibuli-gera R-547

+ ПМБ 5,0 4,34 0,2 0,28 15,1 0,06 0,18 2,32

В результате автоселекции дрожжей и бактерий продуктивность процесса по сравнению с юнокультурой возросла на 47,4$.

Ассоциация Endomycopsis fibuligera R- 547 + Candida guil-liermondii 21 + ШБ была опробирозана и внедрена в совхозе "Энтузиаст" Акмолинской области в качестве еакваски для выращивания дроньевой биомассы на краиллсодорнащеы сырье дальнейшей протеи-Екзации грубых кормов. Процесс проводится без предварительного

осолаяявания крахмала зернофуража ферментами проросшего зорна ячмевд.

Исследование каротинобразования у дрояжей

Для получения комплексного каротинпротеянового препарата исследовали возкокность применения смешанных культур микроорганизмов. Из лабораторной коллекции живых культур были отобраны дрозсяа Тоги1орз!в ри1спег1иа 39, отличающиеся наиболее высо-куг.гл показателями синтеза каротиноидов.

Изучение динамики синтеза каротиноидов в процессе роста дроясгей Тог. ри1сп»г1иа 39 в периодических условиях культивирования позволило сделать заключение, что максимальное их накопление имеет место через 48 ч.

Каротинсянтезируицие дрояжи характеризуется сравнительно низкой скоростью роста, поэтому вопрос их селекции представляется актуальным.

В настоящем разделе работы поставлена задача изучить рост и биосинтез каротина в условиях непрерывного культивирования и провести автоселекцию более продуктивного варианта.

Культивирование проводили в рёаше рН-стага на синтетической среде Радер с глюкозой, рН среды на входе был 6,0, рН среды в ферментере - 4,8. Поскольку при периодическом культивировании максимальное накопление каротиноидов отмечено в стационарной фазе роста, а в непрерывных условиях с целью получения максимального выхода биокассы культура поддерживалась в экспоненциальной фазе, полученные метки оставляла на доращиванае в условиях периодического культивирования на 24,ч; после чего определяли содержание каротиноидов в них.

_На рис.7 показан процесс адаптации дрозшей Тог. ри1сЬег1иа.._

39 в условиях рН-стата. Определение скорости роста дрожаей л синтеза каротиноидов показало, что максимумы этих показателей не совпадают - биомасса дрожжей через 24 ч (конец логарифмической фазы), синтез каротиноидов через 48 ч (в стационарной фазе роста).

Выращивание каротянспнтезирувдих дрояяей в непрерывном режиме в условиях рН-стата при скорости ¿<,- - 0,1 ч~ в течение 72 ч способствует увеличению накопления в их клетках каротиноидов до 780 мкг/г сух.в-ва, т.е. почта в два раза. При доращава-

нии в периодических условиях культивирования наблюдается постепенное снижение активности накопления каротиноидов, но содержание его вше чем в том случае, когда дрокжи росли только в периодических условиях.

оь ,2В

о с

о

Е й к о

0,4

0,2

40 30

20

10

Адаптация дрожжей Тог. ри1еЬег1та 39" в условиях непрерывного кульгавированпя в рекиме рН-стата

о

ей

0,2

0,1

14 16 18 36 38 42 48 56 62 70 78

время, часы

Рес.7

1 - удельная скорость роста

2 - каротин

3 - оптическая плотность

На основании полученных данных шано заключить, что закономерности роста биомассы и синтеза жаройшоид<}в у дрояжей тог. риХс'псгхла 39, установленные в опытах по периодическому куль-тавировашш, подтверждаются данными, полученными при непрерывном культивировании в условиях рй-стата.

Штамм, полученный в результате автоселекции, в значительной степени превышает исходный со уровню накопления каротиноидов, т.е. активность повысилась в два раза.

Конверсия молочной сыворотка сметанной культурой дрожжей Tor. pulcberima ЗЭ а бактерий lacto-bacteriun pentoaceticuab(ö)—23

Известно, что смешанное культивирование дрожжей и гомофермен-тативных молочнокислых бактерий, применяемых в молочной промышленности, способствует повышению выхода дрожжевой биомассы и увеличении синтеза каротинавдов на молочной сыворотке (Залашко, Залашко, 1Э76). Перевод лактозы в молочную кислоту с помощью далочкокислнх бактерий позшляет культивировать на сыворотке те расы дрожжей, которые не способны ее ассимилировать, во хорош усваивают молочную кислоту.

Изучение динамаки накопления биокассы дрожжей Тог. pulcherima 39 на молочной сыворотке (содержание лактозы 3,0-5,0$)показало, что она активно возрастает до 6 суток культивирования и составляет 14,6 г/л (рис.8). Параллельное накопление каротиневдов при этом наблюдается в течение 48 ч, когда максимальное содержание его составляет 605,0 мкг/г сух.в-ва. В дальнейшем по мере роста дрожжевой биомассы синтез каротиноидов замедляется и вновь активизируется, когда активность накопления биомассы дрожжей начинает снижаться.

На рис.Э представлены кривые^ отражающие динамику накопления биомассы и синтеза каротиноидов в смешанной культуре дрожжей Тог. pulcherina 39 и'ЛМБ шт. В(б)-23 при тех же условиях культивирования. Показано, что в смешанной культуре при почти том же уровне биомассы что и у монокультуры дрожжей количество каротиноидов увеличивается более чем в два раза и составляет 1450 мкг/г сух.в-ва.

Следовательно, ге.тероферментативные молочнокислые бактерии lact. pentoaceticun В(б)-23, не стимулируя роста этого штамма дрожжей, оказывают положительное влияние на их каротинсинтезирую-щую активность.

Исследование потребления субстрата показало, что при 4,8£ концентрации лактозы в молочной сыворотке в монокультура дрожжей почти половина ее остается неиспользованной, в то же время как в сметанной культуре содержание субстрата снижается до 1,3$, т.е. на 63£.

Таким образом, совместное выращивание дрожжей Tor. pulcherina 39 и мэлочновислых бактерий приводит к более полной конверсии

НРЧ А М 2 о

1500 '

1400 ' 1300 1200 1100 ■ 1000 -

900 • 800700

400 300 200 100

•

X (н о с-

№

Ш

15 15

14 13

13

12

II II-

10 • 10

9 - 9

8 8

7 7

6 6

5 5.

4 . 4.

а • 3

2 ■ 2

I 1

Рис.8. Динамика накопления биомассы, кислотности, синтеза кароти-воидов у монокультуры дрож-кей шт.39 при культивировании на молочной сыворотке.

1 - абсолютно сухая биомасса

(АСБ),

2 - содержание каротиноидов,

3 - кислотность.

123456789

время,сут.

|

г «в

я ш

я >>

£н О

О

в»

Я «

1500

1300

1100 1000 900 800 J 700 600 500400 ^

300 200' 100-

£ г» у

Сч сд О

§ О £

15 • 15

13 13

II 10 II 10

9 ■ 9

8 8

7 • 7

6 6

5 5

4 3 2 I ' 4 - 3 2 I

Л-1

Рис.9. Динамика накопления биомассы, кислотности, синтеза каротиноидов дрожжей шт. 39 В(б)-23 при культивировании на молочной сыворотке

1 - абсолютно сухая биомасса

(АСБ),

2 - содержание каротиноидов,

3 - кислотность.

123456 7 89 время, сут.

сыворотки, так как дрожжи хотя и слабо ассимилируют лактозу,'но хорошо усваивают молочную кислоту.

Следует оплетать, что после &-суточного культа ей роваяия как у монокультуры дрожжей, так и смешанной культуры прирост биомассы практически заканчивается и рН среды устанавливается на одном уровне (от 6,0 до 8,2). Повышение значения рН среди свидетельствует о ток, что в ней почти не остается лактозы л дрожжами в качестве источника углерода потребляются лактаты (Залашко, Залаш-ко, 1976). Кислотность среды к этому периоду резко снижается и составляет 3,0-9,0°Т против 68°Т в исходной сыворотке.

Таким образом, на основании проведенных ьсследований можно сделать вывод о том, что использование сметанной культуры дрожжей и гетерофермантатавных бактерий способствует больше;^ синтезу каротиноидов, а также раскислению галочной сыворотки.

4. ЭФФЕКТИВНОЙТЬ ИЗ/ДЕЛЕНИЯ КАРОШСЖОЖЕУЩИХ ДНЫШ В КОВШЕШИ ДВЩЫ (производственные опыты)

Эксперимента по изучению влияния каротинсинтезируыцих п белковых дрожжей проведены на утятах кросса "Медео". Для этой цели молодняк в суточном возрасте был сформирован .. в десять опытных групп по 100 голов в каждой и выращивался до 49-дневного возраста по схеме, представленной вине: "

--[ - ■ -.,-..

Группы } Особенности кормления

I - контроль ' Основной рацион (ОР)

2-опытная ОР + 2,5 мл/сол.биомассы к-дрожки

3-опытная ОР + 5 мл/гол,

4-опытная ОР + 7 мл/гол.

5-опытная ОР + 2,5 мл/гол. биомассы Б-дрожжи

6-опытная ОР + 5 мл/гол.

7-опытная ОР + 7 мл/гол,

8-опытная ОР + 2,5 мл/гол. КД +2,5 мл/гол. ДЦ

9-опытная ОР + 5 мл/год. ВД + 5 мл/гол,ВД

10-опытная ОР +• 7 мл/гол. КД +■ 7 мл/гол,Щ

Кормление утат производилось сухими-кормосмесяма, сбалансированными по нормам КЗОСЛ (1Э83).

Опыты на курах-несушках класса "Алатау" проводили в возрасте 120 дяе£ в четырех опытных группах по 36 голов курочек и 4 петуха в каздой. Птица содержалась в двухярусных клетках типа Л-112.

Падкие каротинсодержащие дроажа выпаивались в отдельных поилках со 150 дневного возраста по схеме, представленной ниже

Группа , Особенности кормления

I - контроль . Основной рацион (ОР)

2 -опытная ОР + 10 мл/гол, биомассы К-дрожаей

3 -опытная ОР + 15 мл/гол.

4 -опытная ОР +• 20 мл/гол.

Результаты исследований

Как видно из приведенных в таблице '4 данных! сохранность утят находилась в пределах 94-100$. Отход утят наблюдался в основном по причинам травматических повреждений.'

Анализ результатов индивидуального взвешивания показал, что наиболее высокая живая масса утят (3460 г) была отмечена в 10 группа, утята которой получали 7 мл на I голову в сутки белково-каротиноюй смеси. Ее .прирост на период откорма (49 дней) составил 200 г, что на 625ь вше контроля.

Как видно из табл.4, сохранность поголовья несушек была высокая и составляла 95-97^. Отход несушек (в основном браковка) происходил за счет слабых особей,

В результате проведенных исследований можно сделать выводы;

1. Оптимальной дозой каротинсодержащих дрожжей для утят является доза 5-7 шгна I голову в сутки.

2. Совместное выпаивание каротин и белонсодержащих дрожжей в количестве по 7 мл/гол каждого вида благоприятно влияет как на прирост живой массы, так и на затраты дарма на единицу прироста. . .', -

3. У кур оптимальной дозой выпойки бао;.ассы каротинсодераащих дрожжей является доза 15-20 мл/гол в сутки.

Таблица 4'

Основаые показатели опыта

ГРУППЫ

Показатели ! 1 * i 2 i з ! 4

Сохранность поголовья, % 97,5 97,5 95,0 97,5

Яйценоскость на первоначальную 74,5 74,7 74,8 75,0

несушку, шт.

-"- ца^среднюю несушку 76,7 74,9 77,2 76,9

Интенсивность яйценоскости, % 69,7 68,0 -70,0 69,9

Затраты корма на 10 шт. яиц, кг 1,84 1,86 1,83 1,83

Ошгодотворенносгь- яиц, % 95,5 ' 97,0 97,8 96,6

Выводимость, % 86,0 88,7 87,1 87,7

Процент вывода, % 82,0 86,1 85,2 87,7

4. К 71 дню выращивания в 3 группе не было практически расклеванных утят и почти 100% олеряемость.

ВЫВОДЫ

1. Показана возможность повышения эффективности биоконверсии крахмалсодержащих сред в кормовой продукт с повышенным содержанием протеина путем использования смешанных культур дрожжей - candida guiiiiermondii 21 - продуцентов протеина, ашло— литических дрожжей Bndomycopais fibuügera R-647 и гетерофермен-тативных пентозосбраживавдих молочнокислых бактерий Laetobacte-rium pentoaceticum В(б)—23.

2. Показана возможность повышения эффективности биоконверсии молочной сыворотки в кормовой белок-каротиновый продукт путем использования смешанной культуры дрожжей, синтезирущих каротиноиды Terulopsis pulcherima39f дрожжей - продуцентов ПротеинаГ Trichosporon pullulans 75 И бактерий Lactobacterium pentoaceticum BÍ6J-23, Cellulononas flavigena 22.

3. Установлено, что продуктивность смешанной культуры дрожжей и бактерий может быть повышена на 34,3-36,2$ предварительной адаптацией микроорганизмов друг к другу на уровне метаболитов, что достигается выращиванием их в полунепрерывных условиях.

»

4. Положительное взаимодействие дрожжей и бактерий в смешанных культурах может быть усилено автоселекцией адаптированных друг к другу клеток в условиях непрерывного культивирования, при этом скорость роста ассоциации повышается более чем в 2 раза.

5. При воздействии Е-нитрозо-н -метилмочевины получен мутант дрожжей тоги1орз1в ри1сЬеПта39. синтезирухций 834,0 мкг/г сух.в-ва (391,8 мкг/г сух.ь-ва у исходного).

6. Введение в рацион птицы (утята, куры) каротинпротеинового препарата позволило повысить их продуктивность. Так, прирост за период выпаивания на 6,2-12,7% вше контрольного, затраты корма на I кг прироста на 11,1-12,1 % ниже, чем в контрольной группе, во всех группах наблвдалась 100 оперяемость. Сохранность птицы повысилась до 94-100$.

7. Производственные опыты по цротеиназадаи кормов с использованием ассоциации дрожжей и бактерий показали, что ее устойчивость сохраняется неопределенно долго.

По теме диссертации опубликованы следующие работы

1. Саубенова М.Г., Конуспаева К.Ш., Хмелевская Л.К. Влияние источника углерода на синтез каротина дрокнаш // Сб. Технология получения продуктов микробиологического синтеза.-Алма-Ата,1988.-С.166-170.

2. Саубенова М.Г., Хмелевская Л.К., Конуспаева К.И. Обогащение молочной сыворотка белком и каротином // Сб. Технология получения продуктов микробиологического синтеза'- Алма-Ата, 1988.-С.161-165.

3. СаубеноЕа М.Г,, Семенченко Г.В., Конуспаева К.Ш. Кинетические характеристика юно- и смешанной кулыуры дрожжей, используемой для обогащения протеином крахмалсодержащего сырья // Труды ИМиВ АН КазССР. Использование новых микробных препаратов в народном хозяйстве: Алма-Ата, 1989.-С.134-140.

4. Конуспаева К.Ш., Семенченко Г.В., Попова Т.М. Утилизация нерастворимого крахмала смешанной популяцией микроорганизмов // Микроб, и бкотехн. основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства. Всесоюз. конф. Тез.докл.-Алма-Ата, 1990.-С.47-48.

5. Конуспаева К.Ш., Камардинова В.О., Толстова Н.И., Попова Т.М. Рост каротинобразухщих дрожжей и молочнокислых бактерий ва Люлечкой сыворотке / Биотехнология и биофизика микробных популяций. Всесош.конф. Тез.докл. и сообд.-Аша-Ата,1991.-С.58-59.

6. Конуспаева К.Ш., Толстова Н.И., Саубенова М.Г., Попова'Г.И. Исследование возможности получения каротинпротеинового препарата для птицеводства. Науч. конф. ВАСШ1Я КазССР, Тез .докл.-Алма-Ата, 1991.

7. Хмелевская Л.К,, Саубенова М.Г., Конуспаева Х.Ш., Утилизация молочной сыворотки в кормопроизводстве. Науч.конф.ВАСХНИЛ КазССР. Тез.докл.-Алиа-Ага, X99I.

8. A.c. № I67477I СССР "Способ получения белкового кормового продукта / Илялетдинов А.Н., Саубенова М.Г., Семенченко Т.В., Конуспаева К.Ш., Лука В.АДенисеако Л.Е. - Опубл. 07.09.91. Ens. Je 33.

Э.Илялетдинов А.Н., Саубенова М.Г., Конуспаева К.Ш. Выраяивание кормовых дрожжей на дрожжерасгильных установках.-Алма-Ата» 1992.