Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение киллерных токсинов дрожжей рода Williopsis и Hansenula anomala

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение киллерных токсинов дрожжей рода Williopsis и Hansenula anomala"

а з

од

Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова

На правах рукописи

Шемякина Татьяна Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ КИЛЛЕРНЫХ ТОКСИНОВ ДРОЖЖЕЙ рода Williopsis и Hansenula anómala

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994 год

Работа выполнена "во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научный руководитель: кандидат биологических наук М.М.Вустин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.Н.Даниленко, кандидат биологических наук Л.М.Захарчук

Ведущая организация: Институт биохимии и Физиологии микроорганизмов РАН

Зашита состоится ^¿¿¿¿'(УЛ 1994 г_ в часов на заседании Специализированного совета Д.053.05.66 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического Факультета МГУ.

Автореферат разослан 1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета л

кандидат биол. наук У?¿¿Су' Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Киллерный Феномен был впервые обнаружен у дрожжей Saccharomyces cerevisiae в 1963 году Malcover и Ве-van. Довольно скоро выяснилось, что кйллерные клетки секретируют белковые вещества, которые убивают чувствительные дрожжи. Чаще всего для обозначения этих веществ используют термин "кйллерные токсины", однако некоторые исследователи предпочитают называть их по-другому: антибиотиками, микоцинами, зимоцинами или зимоцидами. В этой работе используется наиболее распространенный термин "кйллерные токсины". В настояшее время во многих лабораториях мира ведутся интенсивные поиски киллерных штаммов среди представителей разных таксономических групп дрожжей. Сейчас известен достаточно широкий круг таких дрожжей и их список постоянно пополняется. Кйллерные токсины, продуцируемые различными дрожжами, отличаются по спектрам действия и Физико-химическим свойствам. Генетическая детерминация киллерных токсинов также различна у разных видов. Киллерный" Феномен интересен и" с точки зрения механизма действия' токсина на клетки чувствительных дрожжей. И, наконец, тот Факт, что некоторые кйллерные токсины способны воздействовать на патогенные дрожжи, открывает возможность эффективного лечения опасных микоэных заболеваний человека и животных.

3 работах ряда авторов описаны кйллерные свойства некоторых дрожжевых штаммов - представителей рода Williopsls и вида Hansenula anoraala. Род Williopsis лишь сравнительно недавно выделен как самостоятельная таксономическая единица. Ранее он относился к роду Hansenula. Поэтому представляется целесообразный параллельное изучение киллерных токсинов этих близкородственных таксонов.

цель работы. Выделение и характеристика киллернах токсинов, секретируемых дрожжами рода Williopsis и Hansenula anomale, а также разработка подходов к созданию лекарственного препарата на основе киллерного токсина Н.anomala для лечения каадидомикозов человека й животных.

Научная новизна и практическая ценность работы. Изучены свойства ранее не исследовавшихся штаммов киллерных дрожжей W.pratensis, W.subsufficiens, K.beijerinckii и H.anomla и продуцируемых ими токсинов. Показано, что данные дрожжи секретируют

ккллерные токсины с уникальными, отличными от других дрожжей, свойствам*. Эти токсины отличаются по спектрам действия, физико-химическим свойствам, характеру воздействия на чувствительные дрожжи. Вместе с тем они обладают рядом общих черт: все они являются белкали, в той или иной степени термостабильными; обладают широкими спектрами действия; активность их проявляется в широком диапазоне рп.

Разработаны подходы к созданию лекарственного препарата на основе кидяерного токсина Н.añónala для лечения кандидомикозов человека я животных. Препарат прошел успешные предварительные доклиничесхне испытания на лабораторных животных и пациентах-добровольцах и перспективен для применения в медицине и ветеринарии.

Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей и одна статья готовится к печати. Материалы диссертации докладывались на Международном специализированном симпозиуме по дроаиан (Рига, 1991 г.).

Структура и объем работы.. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованию: объектов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы; изложена на 106 страницах, содержит 17 рисунков и 17 таблиц, список литературы содержит 147 названий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Набор штаммов дрожжей, чувствительных к киллерам ' рода Williopsis и Н. anómala.

Прежде всего необходимо было выбрать тест-культуры с выраженной чувствительностью к киллерам рода Williopsis и Н.anómala. Руководствуясь литературными данными и собственными наблюдениями, мы отобрали два штамма, относящиеся к роду Candida: C.nitratophl-la ВКМ У-1300, как наиболее чувствительный к киллерам рода Williopsis, и С.tenuis ВКМ У-70, как наиболее чувствительный к киллерам Н.añónala. Именно эти два штамма к использовались нами при дальнейших исследованиях в качестве универсальных чувствительных культур для тестирования киллерной активности у дрожжей рода Williopsis и Е.añónala.

Следует отметить, что на начальных этапах работы был использован метод посева "культуры на культуру". В. дальнейшем оказалось, что использование метода, при котором концентрат КЖ киллерных дрожжей, раскапывался в лунки на агаре с газоном» является более надежным, поскольку при этом зоны лизиса у тех же, тест-культур были шире. Кроме того, некоторые дрожжи были совершенно нечувствительными при посеве "культуры на культуру", но обнаруживали чувствительность к концентратам КЖ киллерных штаммов в лунках.

2. Скриннинг наиболее активных киллерных штампов

среди собранной коллекции дрожжей.

3 начале работы была собрана коллекция из 34 штампов Н.ano-mala, 16 штаммов W.pratensis, 1 штамма W.subsufficiens и 1 штамма W.beijerinckii (последние два штамма были взяты на основании результатов работ Вустина с соавт., как обладающие выраженной киллерной активность»!. Проведя скриннинг представителей этой коллекции, мы отобрали четыре наиболее активных штамма: Н.anómala ВКМ У-151, W.pratensis КВП 2679, W.subsufficiens CBS 5763 и W.beijerinckii CBS 4549. Необходимо отметить, что и скриннинг, и выбор тест-культуры проводился при pH 4,5, поскольку из литературы известно, что именно это значение pH среды является оптимальным для проявления киллерной активности W.mrakii и W.satunras.

3. Оптимальные условия для проявления активности

изучаемых киллерных дрожжей.

Отобранные в результате скриннинга киллерные дрсяжи хорошо росли и секретировали киллерные токсины на полной и иинимальной ростовых средах. В качестве источников углерода в минимальной среде использовались"глюкоза и этанол.

При определении киллерной активности изучаемых дрожжей в зависимости от pH среды с использованием в качестве тест-культур C.nitratophila и С.tenuis выяснилось,что активность проявляется в широком интервале pH (табл. 1). При этом для каждого из изучаемых штаммов было характерно оптимальное значение pH среды, при котором проявлялась максимальная киллерная активность.

Таблица 1.

Активность киллерных штаммов при различных значениях рН среды. Штаммы Интервал рН Оптимум рН

Н. anómala 2,2 - 7,0 2,2 - 4,0

W. pratensis 2,6 - 7,0 „ 6,0

И. subsufficiens 2,2-6,5 4,0

W. beijerincm 2,2 - 7,0 4,0

Широкий интервал значений pH, при которых проявляется кил-лерная активность изучаемых в этой работе штаммов дрожжей, отличает. их от других, ранее изученных киллеров, для которых характерен более узкий интервал значений pH. Однако следует подчеркнуть, что все киллеры активны при низких значениях pH.

Для определения времени, необходимого для максимального накопления изучаемых киллерных tqkchhob в культуральной жидкости при росте дрожжей в жидкой среде, были определены кривые роста и токсинообразования культур Н.anómala, «.pratensis, W.subsuffIciens h W.beiáerinclíii.

Из сопоставления кривых роста и токсинообразования видно, что начало синтеза киллерных токсинов S.anómala, W.subsufficiens и W.beijerinckii относится к середина экспоненциальной Фазы роста. Затем синтез токсинов резко возрастает и стабилизируете? в начале стационарной Фазы роста. Секреция киллерного токсина ^.pratensis начинается лишь в последней трети экспоненциальной Фазы, затем она так же, как и у других дрожжей, возрастает, достигает своего максимума и стабилизируется в стационарной Фазе роста.

Из литературы известно, что осмотическое давление в среде оказывает положительный эффект на токсинообразование у дрожжей рода Williopsis. В аналогичных наших опытах культуры Н.añónala ВКМ У-151 и W.pratensis КБП 2679 хотя и оказались осмотолерантны-ми, но не увеличивали секрецию киллерных токсинов при повышении концентрация в .среде NaCl, глюкозы, сахарозы и сорбита.

- s -

4; Спектры действия киллерных дрожжей Williopsis и Н.anómala на различные микроорганизмы.

Спектры,действия дрожжей Williopsis и Н.anómala на различные дрожжи приведены в Таблицах 2 и 3. Общей характерной особенностью всех четырех изучаемых киллеров оказалось то, что они обладают широким спектром действия на дрожжи различных таксономических групп. Культура Н.anómala действовала на представителей 9 родов из проверенных 17. Культура ».pratensis подавляла рост представителей 6 родов из проверенных 16. Культуры W.subsufficiens и W.be-ijerinckii убивали представителей 9 и 10 родов (соответственно) из проверенных 13 родов. Спектры действия культур,посеянных на газоны дрожжей, оказались уже, чем спектры действия концентратов КЖ.

Для сравнения спектров действия изучаемых в данной работе киллерных дрожжей с другими представителями рода Williopsis, нами были изучены спектры действия двух других видов, относящихся к этому роду - W.mrakii и W.saturnus, и обладающих киллерной активностью. Оказалось, что спектры действия киллерных токсинов W. pratensis, . W.subsufficiens и W_be¿jeriii.ck.ii отличаются друг от друга, а также от других представителей этого рода, что подтверждает их уникальность. Спектр действия Н. anómala тоже уникален.

В литературе есть данные о внутриродовок иммунитете у дрожжей рода Williopsis. При посеве изучаемых культур на газоны представителей рода Williopsis мы отмечали такую же закономерность. Однако при действии 100-кратного концентрата КЖ оказалось, что концентрат W.beijerinckii образует зоны лизиса на газонах других видов этого рода. Такой же эффект наблюдался и при действии концентрата КЖ W.saturnus на газон W. pratensis.

При изучении взаимодействия между 34 штаммами Н.anómala оказалось, что все они иммунны к действию собственных токсинов. Полученные данные свидетельствуют о внутривидовом имнунитете у штаммов Н.anómala, что согласуется с литературными данными.

5. Использование чувствительности базидиомицетовых . дрожжей к киллерному токсину W.pratensis для таксономической дифференциации.

В литературе чописаны подходы к таксономической дифференциации дрожжей ка основании их чувствительности к киллерным токсинам. Авторы предлагают применять этот критерий в качестве дополнительного таксономического признака.

Таблица 2.

Спектр, действия-Н.anómala на различные виды, дрожжей.

Bhä

Культура Концентрат

Arthroascus schoenii BKM y-1073 C. boiabii BKM y-1436 C. nitratophlla BKM y-1300 C. podzolica KBU 1582 C. tenuis BKM H-70 Cryptococcus laurentli BKM y-1291 C. luteolus BKM y-1596 Debariomyces hansenli CBS 6456 Hansenula alnii BKUM E-577 K.petersonii BKuM y-555 KXuyveromyces fragllis BKM y-2727 Leucosporidluir, skotti HIB 11.24 Lipomyces starkeyi BKM y-2559 Metshnikowia pulherrima KUB 586 Pichia trehalopiiila BKUM y-118 Khoöosporiäium diobovatum CBS 6084 Rhodotorula rubra BKM y-691 Saccharoayces cerevisiae BKM y-381 Tremeila foliaceae BKM y-2680 Schwannioayces occidentalis BKM y-1166 Williopsis beijerinckii CBS 4649 W. rorakii CBS 1707 W. saturnus BKM y-176 V. suaveolens CBS 1725 W. subsufficlens CBS 5763 W. pratensis HEU 2679 Zygo.williopsis californica BKM y-8028

+

+

+

+

+

+

+

Примечание: Плюс - чувствительность, минус - устоПчивость,

Таблица 3.

Спектр действия видов рода Williopsis ка различные виды дрожжей.

W.beije- : W.rara-: W.pratensis : W.sa- : W.subsuf-

Вид, штамм rinckii 1 : : kii : : turmis: ficiens

куль- : кон- : : кон- : куль- : кон- кон- : кон-

тура :центрат: ¡центрат: тура :центрат :центрат: центрат

Arthroascus javanensls ВКМ У-1069 н н н _ _ н +

Artttroascus schoenii ВКМ У-13 - + + - - + +

Candida bombii ВКМ У-1436 - - - - - - _

С. nitratofila ВКМ У-1300 + + + + + + +

С. tenuis ВКМ Н-70 + + + + + - +

Dsbariomyces hansenii CBS 6456 - + + + + + +

D. vanrlj ВКМ У-2591 н н н + + н -

Hansemila alnil ВКПМ E-577 - + + - - + +

H. anomale ВКМ Y-151 - + - - - - -

H.petersonii ВКПМ У-555 - + + - - + +

Kluyveromyces fraailis ВКМ У-2727 - + + - - + +

Lipomyces starkeyi ВKM У-2559 + + + - - + +

Metshtilkowia pulherrima КПБ 586 - - - - - - -

Plchia trehalophlla ВКПМ У-118 - + + - - + +

Rhodotorula rubra ВКМ У-691 - - - + + - -

Saccharoroyces cerevisiae ВКМ У-ЗВ1 - + - - - + +

Sciiwanniomyces occidentalis ВКМ У-1166 — t - + + + - -

Williopsis beijerinckii CBS 4649 - - - - - - -

«. mrafcii CBS 1707 - + - - - - -

W. pratensis КБП 2679 - + - - - + -

W. saturnus ВKM У-176 - + - - - • -

W. suaveolens CBS 1725 - + - - - - _

W. subsufflclene CBS 5763 - ( + - - -

Zygowllliopsis californica В KM У-8038 — + + , + +

Примечание: (см. примечание к табл. 2)

О чувствительности дрожжей базидиомицетового аффинитета к киллерным токсинам аскоспоровых дрожжей ранее не сообщалось. При .изучении спектра киллерного действия W.pratensis нами был обнаружен интересный Факт - подавление роста одного штамма базидиоми-цетных дрожжей из рода Rhodotorula (см. Табл. 3). Проверка действия этого киллерного организма на представителей разных Филогенетических групп дрожжей-базидиомицетов с целью выявления возможной таксономической значимости этого признака составила предмет этого раздела работы.

Было проверено 114 штаммов дрожжей из 13 родов, представленных 48 видами. Все исследованные дрожжи по проявлению чувствительности к киллерному токсину W.pratensis разделились на две большие группы.

Подавление роста наблюдали у всех штаммов так называемых красных дрожжей, относящихся к родам Rhodotorula, Rhodosporidium и Sporoboloayces. В эту же группу отнесены: один штамм черных дрожжей Phaeococcus exophiala КБП 2940 и один штамм слабо пигментированных, баллистрспоровух дрожжей Tilletiopsis -vas{nnatO!\ensis.. КБП 2642 со слабой реакцией подавления роста. Штаммы, представляющие разные типы спаривания и отличающиеся по своему происхождению, а также штаммы разных видов одного рода проявляли сходную реакцию на киллерный токсин W.pratensis.

Большинство проверенных базидиомицетных дрожжей {80 штаммов, или 70%) были устойчивы к киллерному токсину W. pratensis. Б этой группе - все криптококки, представленные 14 видами, и близкие к ним трк вида Candida, баялистоспоровые дрожжи рода Bullera, все виды дрожалковых грибов рода Tremella в дрожжевой стадии, оранжевые 'дрожжи Phaffia rhodozyma и представители двух родов телиоспо-ровых дрожжей (Cystofilobasidium, Leucosporidiuia). К этой же группе можно отнести и вид Fellonyces penicillatus, так как для рода Felloayces предположительно может быть совершенной стадией Sterigmatoayces, также имеющий телиоспоры.

Наблюдаемое разделение базидиомицетных. дрожжей., i)o чувствительности к киллерному токсину W.pratensis коррелирует с некоторыми литературными данными из области биохимии дрожжей, например, с данными по углеводному составу клеточных стенок, по нуклеотид-ным последовательностям рибосомных 18S- и 26S-PHK.

В данном исследовании можно выделить результаты, которые свидетельствуют о необходимости пересмотра . положения отдельных родовых таксонов в системе базидиомицетовых дрожжей. Например, дрожжи, образующие телиоспоры в онтогенетическом цикле, не составляют, по-видимому, единой филогенетической линии: род Rhodos-poridium и морфологически сходные с ним Cystofilobasidiim и Leu-cosporidium оказываются в разных группах. Дрожжи рода Phaffia, образующие пигменты, не объединяются с остальными красными дрожжами. Баллкстоспоровые дрожжи Tllletiopsis и Sporoboloayces проявили одинаковую реакцию на киллерный токсин, а все виды Bullera были нечувствительны к нему. Два исследованных штамма Fellomyces penicillatus дали отрицательный результат на воздействие киллер-ного токсина, что обособляет этот вид от "устиляговых" дрожжей, с которыми до сих пор.объединяли род Fellomyces.

Таким образом, новые обнаруженные свойства дрожжей базидио-мицетов, определяющие разную чувствительность к киллерному токсину, _могут быть использованы при решении спорных таксономических вопросов, особенно, в случае разграничения морфологически близких таксонов, как, например, в группе баллистоспоровых или телиоспо-ровых дрожжей.

Учитывая существенные различия в углеводном составе чувствительных и устойчивых к килллерному токсину родов дрожжей, можно предположить, что разная реакция дрожжей на токсии связана с полисахаридами клеточной стенки.

6. Физико-химические свойства киллерных токсинов Wllliopsis и Н. anomala.

Данные литературы свидетельствуют о том, что все известные в «стоящее время киллерные токсины являются белками. Естественно 5ыло предположить, что токсины изучаемых нами штаммов дрожжей то-se белки. Для подтверждения этого, КЖ киллерных дрожжей обрабаты-¡алась различными протеолитическими Ферментами перед тестировани-!м. В результате было показано, что киллерная активность КЖ пол-юстыо исчезает после обработки трипсином, тернолизииом. проназой [ли протеиназой К. 'Это несомненно свидетельствует о белковой при-юде активного начала, придающего киллерные свойства КЗ.

Другим свойством, помимо чувствительности к действии протеи-аз, подтверждающим белковую природу киллерных Факторов, является

потеря активности в результате денатурации белковой молекулы при действии повышенных температур. В наших опытах исследуемые кил-лерные токсины теряли свою активность, но лишь при сравнительно длительном кипячении.

Выделение и очистку киллерных токсинов проводили традиционными методами с помощью микро-.и ультрафильтрации КК, осаждения сульфатом.аммония, гельфильтрации и ионобменной хроматографии.

Молекулярные массы изучаемых киллерных токсинов определяли после хроматографирования концентратов КК дрожжей во фракциях, обладавших киллерной активностью, электрофоретически (по Лэммли) по репернын белкам. Активный белок, полученный при гельфильтраци-онном Фракционировании КЖ W.pratensis, обладал молекулярной массой 23000 Да. При электрофоретическом исследовании активных фракций, полученных после гельфильтрации КЖ H.anomala, оказалось, что одна из них содержит единственный белок, молекулярная масса которого составляет 43000 Да.

Очищенный с помощью ионобменной хроматографии киллерный бедок W.beijerinckii имел молекулярную массу „около 120D0. Да ..При гельфильтрации концентрата КЖ W. subsufficiens были получены две активные Фракции с молекулярными массами приблизительно 17000 и 32000 Да. Вместе с тем при электрофорезе в денатурирующих условиях обе эти Фракции движутся как одна белковая полоса с молекулярной массой 15800 Да. Следовательно, можно предположить, что в ацетатном буфере, в котором велась гельфильтрация, данный белок существует в димерной- и в мономерной Формах.

Сравнивая киллерные токсины, секретируемые W. pratensis, W.-subsufficiens и W.beijerinckii, с токсинами, продуцируемыми другими видами рода Hilliopsis, можно отметить, что все они имеют небольшую молекулярную массу: от 8500 Да (W.saturnus) и 8900 Да (W. arakil) до 23000 Да ( «.pratensis).

Молекулярная масса киллерного токсина, образуемого H.anomala ВКК У-151 составила 43000 Да. Из литературы известны молекулярные массы токсинов, продуцируемых другими штаммами Н. anomala и отличавшихся от подученного нами значения. Они составляют 83300 и около 300000 Да. Этот Факт позволяет сделать предположение о неоднородности вида H.anoaala, по крайней мере, по способности разных итаммов этого вида образовывать разные киллерные токсины.

Аминокислотный состав изучаемых киллерных белков приведен в таблице 4. Из этих данных видно, что, несмотря на некоторые различия в аминокислотном составе, все четыре белка содержат большое количество остатков глицина, а также ■ кислых аминокислот, что характерно для многих других киллерных токсинов.

Тгблица 4.

Аминокислотный состав киллерных токсинов W. beijerincJcii.

W. pratensis,' W. subsufficiens и Н. anonala.

Аминокислота число остатков

R.beije- W.praten - W.subsuf- H. ai

rinckii sis ficiens male

Аспарагиновая кислота 8 25 8 15

Треонин 4 18 3 10

Серин 6 27 5 20

Глутаминовая кислота 11 23 14 23

Пролин 19 15 23 59

Оксипррлин _ . - . . - . 57.

Глицин 49 19 53 153

Алании 17 26 19 48

Полуцистеин - 1 - -

Валин 6 12 3 52

Метионин - 1 -

Изолейцин 3 9 . 1 7

Лейцин 5 11 3 9

Тирозин 1 7 - 2

Фенияаланин 2 6 1 4

Гистидин 4 12 1 7

Лизин 3 7 4 8

Аргинин 4 3 2 8

Триптофан - - 2 -

Общее число остатков 142 222 147 482

Изоэлектрические точки киллерных белков W.subsufficiens и W.beijerinckii были близки по значению и находились в пределах между 4,00 и 4,50. Данные по величинам изоэлектрических точек токсинов, секретируемых дрожжами H.anomala и К.pratensis, у нас

отсутствуют. Значения pl, лежащие в кислой области, характерны для многих киллерных белков. Исключение составляет токсин W.mra-kii, pl которого лежит при pH 9,1.

7. Локализация генов токсинообразования.

.Из литературы известно, что генетическая детерминация генов токсинообразования различна у разных видов киллерных дрожжей. Так, у S.cerevisiae эти гены локализованы на РНК-содержащих вирусоподобных частицах. У Kl.lactis эти свойства^кодируются ДНК-со-держащими плазмидаыи. У некоторых других киллерных дрожжей кнл-лерность определяется ядерными генами.

Известно, что обработка дрожжевых клеток цитомутагенами приводит к элиминации цитоплазматических Факторов наследственности. С целью выеснения локализации генов, осуществлявших контроль образования киллерных токсинов, изучаемые дрожжи были высеяны на среды, содержащие цитомутагены: Н. anomala, W.pratensis, W.beijerinckii - бромистый этидий, акрифлавин или акридиновый оранжевый, W.subsufficiens - бромистый этидий или циклогексимид. Отобрав по 100 клонов с чашек с каждым из мутагенов и посеяв их на газоны чувствительных тест-культур, мы наблюдали образование зон лизиса вокруг всех клонов. Зоны были такого же диаметра, как у исходных, необработанных цитомутагенами культур. Таким образом, киллерная активность пе терялась у всех клонов независимого происхождения.

Из приведенных данных можно заключить) что гены, ответственные за образование киллерных токсинов у W.pratensis, W. subsuffi-ciens, W.beijerinckii и H.anomale, локализованы на хромосомах и не связана с цитоплазматическими элементами наследственности. Из литературы известно; что у близкородственных этим дрожжам организмов - Uilliopsis saturnus и галотолеранткых штаммов Hansemila anonala - образование киллерных токсинов также обусловлено ядерными генами. Таким образом, это свойство присуще всем .представителям рода Gilliopsis и Н.anonala.

8. Хянзника подавления роста чувствительных дрожжей киддерными токсинами рода Wllllopsls и H. anonala.

Для изучения динамики подавления роста чувствительных дрожжей киллерцыми токсинами Williopsis и H.anoiaala были выбрани культуры C.nitratoAyla, C.tenuis, H.alriii и D.hansenii как наиболее чувстеитедьшо ко всем этим токекчам.

Из результатов, приведенных в Таблице 5, следует, что в большинстве случаев происходит уменьшение числа жизнеспособных клеток чувствительных культур под действием киллерных токсинов рода Williopsis и Н.añónala

Таблица 5.

Подавление роста чувствительных дрожжей киллерными токсинами Williopsis и Н. anómala.

Чувствительная- С .nitrato- С. te- H.al- D.han-

культура phila nnis nii senii

Исходный титр, кл/мл 3 3X10 3 2x10 2 8X10 3 1x10

контроль(конечный титр), кл/мл 2x1 С? 6 1X10 1) 2X10 8x1 í

Токсин W.mrakii 0 2 3,6X10 2X10 0

Токсин W.saturnus 0 ЗхЮ2 1, 7x103 3,6xlC?

Токсин W.subsufficiens 0 2,7xl02 1, 7X103 4,8x103

Токсин W.beijerinckii 0 3 1,5x10 3x10 0

Токсин ».pratensis 0 H H H

Токсин H.anomala 0 0 2, 2 6X10 2 1,3X10

Примечание: н - действие не изучали; Особенно ясно это видно в случае действия всех шести токсинов, на С. пИга1;ор11у1а и при действии токсинов V?. тгаИ! и И. Ье-1Эег1пс)с11 на В. йапэепН, когда после 24 часов инкубации погибают Есе чувствительные клетки. В других случаях полной гибели

чувствительных клеток не происходило,, однако титр жизнеспособных клеток в инкубационной смеси падал. Несомненно можно говорить о Фунгииидном действии изучаемых киллерных токсинов на данные чувствительные дрожжи. И, наконец, в пяти случаях - при действии токсинов w. subsufficiens и W. saturnus на Н. alnii и D. hansenii, и при действии токсина Н. beijerinckii на С. tenuis - титр клеток не падал, а оставался на исходном уровне или даже возрастал. Правда, возрастание это было незначительным по сравнению с ростом титра клеток в контроле, в котором клетки чувствительных культур инкубировались с инактивированными токсинами. Поэтому в пяти последних случаях можно рассматривать действие киллерных тосинов на дрожки, как фунгистатическое.

Необходимо подчеркнуть, что если одни киллерные токсины (W. mrakli и К. anomale) действовали на все чувствительные дрожжи только как фунгицидные агенты, то другие (W.beijerinckii, W.saturnus и W. subsufficiens) обладали как фунгицидным, т.ак и фунгис-татическим действием в зависимости от чувствительности культуры.

Изучали также действие каждого из шести киллерных токсинов на клетки из культур C.nitratophlla разного возраста: находящиеся в фазах раннего и позднего экспоненциального роста и в стационарной Фазе роста. Оказалось, что три киллерных токсина (W.pratensis, K.nrakli и W.beijerlnckii) вызывали полную гибель клеток C.nitratophyla уже через 3 часа инкубации. Причем, полностью гибли клетки из культур всех трех возрастов. Два других токсина - W. subsufficiens и W. saturnus - при добавлении в инкубационную среду также вызывали уменьшение числа жизнеспособных клеток, однако, их действие было более медленным. Можно отметить, что клетки из культур, находящихся в стационарной Фазе роста, оказались более чувствительными к действию этих токсинов по сравнению с растущими (рис. 1),

При действии киллерного токсина ,Н.anomale на культуру С. nitratophyla можно было также наблюдать снижение титра живых клеток из культур всех возрастов. Однако в этом случае, в противоположность действию токсина Williopsis, клетки из молодых культур были более чувствительными, чем клетки из культур, находящихся в стационарной Фазе^рбста (Рис. 2).

!gT 4.0т

3,02,0-

6 время (час)

Рис. 1. Динамика подавления роста С. п!(:га1;орЬу1а киллерными токсинами И. зиЬэ^:£1с1еп5 и И. за^гпиэ. ... 1 .ранняя, экспоненциальная фаза роста .

2 - поздняя экспоненциальная Фаза роста

3 - стационарная Фаза роста

4 - контроль.

б время (час)

Рис. 2. Динамика подавления роста С. nitratophyia киллерным токсином Н. anómala (обозначения см.к рис. 1).

9. Зависимость чувствительности некоторых дрожжей к киллерным токсинам Williopsis и Н.anómala от рН среды.

Исследование активности киллеров при различных значениях . рН среды показали, что дрожжи рода Williopsis и Н. anómala активны в широком интервале рН - от низких до рН 7,0, и имеют свой оптимум действия. С другой стороны, при изучении спектров действия этих киллеров мы обнаружили существенные различия в размерах зон подавления роста чувствительных культур. Следует отметить, что изучение спектров действия проводились нами на среде с рН, соответствующим оптимуму действия, определенному для тест-культур. Выл поставлен вопрос: насколько зависит чувствительность тест-культуры к киллеру от рН среды и насколько стабильны оптимальные значения киллерной активности по отношению к различным чувствительным культурам?

На рисунках 3 - 8 приведена зависимость чувствительности разных дрожжей (C.nitratophila, С.tenuis, Debaryonyces hansenii, Arthoascus choenii, Hansenuia alnii и Rhodotorula rubra) к киллерным токсинамсекретируемым представителями ,рода Williopsis и Н.anómala.

По отношению к киллерным токсинам W. saturnus (рис. 3) и W. subsufficiens (рис. 3) дрожжи С. nitratophila, С. tenuis и D. hansenii обнаруживали сходную чувствительность с максимумом в кислой области и снижением чувствительности до нуля при повышении Ра среды. Однако, если пик чувствительности C.nitratophila приходился на рН 4,0, то пики чувствительности С.tenuis и D.hansenii лежали при рН 3,0 и 2,6, соответственно. В противоположность этим трем чувствительным культурам, дрожжи A.shoenii обладали минимальной чувствительностью при рН 2,2, однако, при приближении к значениям рН 7,0 их чувствительность сильно возрастала.

Таким образом, при действии киллерных токсинов, секретируе-мых дрожжами рода Williopsis и Н.anómala, уровень чувствительности тест-культур, принадлежащих к разным таксономическим группам, зависел от рН среды; Так, две или более культуры дрожжей имели пики чувствительности к одному и тому же токсину при разных значениях рН. Исходя из этого, вероятно, наиболее правильно следует говорить не о максимуме активности киллерного токсина при определенных значениях рН, а о максимуме чувствительности конк-

Рис. 3-8. Зависимость чувствительности дрожжей к киллерным токсинам рода Williopsis и Н.anómala от pH среды. Рис. 3 - W.saturnus, Рис. 4 - И. subsufficiens.

Рис. 5 - W. beijerinckii, Рис. 6 - W. mrakii. Рис. 7 - К. anómala, . , Рис. 3 - W, pratensis. Условные обозначения: 1-С. nltratophila 2 - С. tenuis

3-D. hansenii 4 - A. shoenii

5 - Н. alnii б - R. rubra

Ось ординат - диаметр зон подавления роста (мм)

ретной тест-культуры к данному киллерному токсину. Как известно, первым этапом взаимодействия киллерного токсина с чувствительным микрорганизмом является связывание токсина рецепторами, расположенными на поверхности клеточной стенки. Результат этого взаимодействия во многом определяется активность*! рецепторов, которая в свою очередь зависит от состава клеточной стенки, а также, вероятно. и от значений рН среды, в которой происходит это взаимодействие. Ионы Н+ и ОН-, взаимодействуя с полимерами клеточной стенки (также - имеющими свой заряд), определенным образом оказывают действенное влияние на активность рецепторов, что непременно отражается на взаимодействии киллерного белка с чувствительной культурой.

Основываясь на полученных результатах, а также на вышеприведенных рассуждениях, можно рекомендовать проводить поиск продуцентов новых киллерных токсинов при различных значениях рН среды и на нескольких потенциально чувствительных культурах. - Возможно, при таком подходе спектр, действия .уже известных килл.ерных токсинов значительно расширится.

10. Действие киллерных токсинов Williopsis и Н. anomala на патогенные дрожжи.

При изучении спектров действия изучаемых киллеров на дрожжи мы заметили, что они активно подавляют рост представителей рода Candida. Как известно, некоторые представители этого рода являются патогенными для человека и животных, вызывая кандидомикозы,для лечения которых необходимы эффективные лекарственные препараты.

В Таблице б приведены результаты действия изучаемых киллерных токсинов на патогенные дрожжи, выделенные у больных, страдающих различными формами микозов. Из Таблицы видно, что токсины W.saturnus, W.subsufficiens, W.nrakii и H.anoaala обладали высокой активностью по отношению к патогенным дрожжам рода Candida. Токсины W.saturnus, W.subsufficiens и W.mrakii воздействовали на большинство штаммов Candida, а токсин Н. anomala поражал все. использовавшиеся патогенные штаммы Candida. В данном опыте исследовалась также чувствительность к киллерам двух других видов патогенных для человека дрожжей Cryptococcus neoforaes и Rhodotorula rubra. По отношению к ним перечисленные выше токсины оказались неактивными. .Киллерный токсин W.pratensis проявлял активность

Таблица 6.

Киллерная активность дрожжей рода Williopsis и й. anonala по отношению к патогенным дрожжам.

Патогенные W. W. W. Н. амфотерицин кетоконазол

культуры sa- sub- ига- ano- i 10 100 lOOO ' l 10 100 lOOû

tur- suf- kii mala nus fici-ens

Candida albicans

ВцГМ 1087 +

2085 + 124.4 j +

1080 +

1990 +

3713 +

1999 +

3654 +

3682 +

C. krusei

ВПГМ 323 + 3791

3817 +

C. tropicalis

ВЦГМ 224

1246 + 598 +

325 +

326

С.' guillieriaondii ВцГМ 410

411 -

+ + + - - + + - + + -r

- - + - - + + + + + +

+ + + - - + + + + + +

- + + - + + ■ir - + + +

- + - - + + H H H H

+ + + - - + - + + +

+ + + - - + + - + + +

+ + + - + + + + + + +

+ + + - + + + H H H H

+ + + _ _ + + __ _ -t- +

+ - + - - + + H H H H

+ + + - - - + H H H H

+ - + - - + + - - + +

+ - + H H H H H H H H

+ + + - - + + H H H H

- + + - + + + - + + *

- + - + + — + + +

■ + + + + _ + + a.

- + + - + + + + + +

Cryptococcus neoformens

В2ГМ 342 - - - - - + ++ ___

341- - - - - -+ + ___

Rhodotorula rubra

ВПГМ 488 - - - H _ + ++ + + + 483 - - - H - + ++ + +

Примечание: "+" и обозначают чуствнтельность и устойчивость итаммов, соответственно;' "н" - данные отсутствуют.

только по отношению к дрожжам Rhodotorula rubra, а токсин W. bei-jerinckii вообще не действовал на использовавшиеся в данном опыте дрожжи. • • . .,...,

В настоящее время в медицинской практике для лечения микозов используется ряд препаратов, в том числе амфотерицин и кетокона-зол. Для сравнения действия киллерных токсинов с этими препаратами, последние также вносили в лунки на газонах патогенных штаммов в концентрации от 1 до 1000 мкг/мл. Активность киллерных токсинов .была сопоставима, а в ряде случаев и превышала активность препаратов амфотерицин и кетоконазол.

Исследовав действие киллерных токсинов Williopsis и Я.anómala на патогенные дрожжи, мы остановились на токсине, секретируе-мом Н.anómala, который обладал высокой активностью по отношению ко всем штаммам патогенных видов рода Candida, с целью создания на его основе лекарственного препарата. Подходам к созданию такого препарата посвящен заключительный раздел этой работы.

11. Подходы к созданию лекарственного препарата. на основе киллерного белка Н. anómala. 11.1. Выбор условий культивирования Н.anómala для получения киллерного токсина. Для получения киллерного токсина Н. anómala при создании на его основе лекарственного препарата необходимо было подобрать среду, компоненты которой не затрудняли бы процесс очистки токсина и были бы нетоксичными для человека и животных. Изучая рост и проявление киллерной активности у данных дрожжей на различных средах, мы заметили, что хорошие показатели можно получить на минимальной солевой среде с этанолом в качестве единственного источника углерода, без внесения витаминов и микроэлементов. Этанол является простым органическим соединением, полностью удовлетворяющим перечисленным выше требованиям. Кроме того, этанол является достаточно дешевым сырьем, что немаловажно

г *'

при промышленном производстве.

Для культивирования Н. anómala на среде с-этанолом мы остановились на использовании метода дробных добавок субстрата (по сигналу кислородного датчика) в процессе экспоненциального роста культуры. При таком способе культивирования величина удельного выхода токсина была приблизительно постоянной. Именно этот метод и использовался нами для наработки больших объемов КЖ.

11.2. Получение КЖ. очистка и концентрирование киллерного токсина Н. anómala в полупроизводственных условиях. Культивирова-. ние . дрожжей проводили в ферментере "Maribushl laboratory Equipment Со" с рабочим объемом 250 литров в 150 мл среды при 28" С и .значениях рН 3,5-4,0.. Исходная концентрация этанола в среде составляла 500 мг/л. Ферментацию заканчивали, когда концентрация би-- омассы достигала 20-40 г/л, т.е. через 24-30 часов. Киллерная активность полученной таким образом КЖ, измеренная как зона лизиса чувствительной культуры С. tenuis, составляла 25-30 мм.

По окончании процесса Ферментации КЖ отделяли от' клеток с помощью микрофильтрации с использованием керамической мембраны Фирмы "Millipore" с диаметром пор 0,22 мкм. Далее полученный таким образом Фильтрат подвергали ультрафильтрайии через полисуль-Фоновую мембрану РТ С 10000 ("MilliporeT'; Ультраконцентрат лио-Фильно высушивали и хранили при +4° С.

В результате описанных процедур из 150 литров ЖЖ в среднем удавалось получить 57 г сухого концентрата, в котором содержалось 1,250 г общего белка. Потери при фильтрации составляли приблизительно 5-10% (по активности)..

Для определения минимального количества концентрата, способного образовывать зоны лизиса чувствительной культуры С. tenuis, был сделан ряд последовательных разведений концентрата, которые испытывались на активность по отношению к С. tenuis. Оказалось, что слабой активностью обладают 0,011 мкг обшего-белка. Ранее говорилось, что при грубой оценке содержания киллерного токсина в концентрате по результатам электрофореза токсин составляет около 10% от общего белка. Следовательно, слабая активность соответствует приблизительно 0,001 мкг киллерного токсина К. anómala.

В заключение необходимо отметить, что полученный нами концентрат киллерного токсина Н. anómala был нетоксичным для лабораторных животных. При прохождении в дальнейшем предварительных доклинических испытаниях в Ивановском медицинском институте он дал хорошие результаты по излечиванию лабораторных животных и пациентов-добровольцев от кожных кандидомикозов.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены, выделены и охарактеризованы киллерные токсины Williopsis pratensis КБН2679, W. subsufficiens CBS5763, W. bei-jerinckii CBS4549 и Hansenula anómala ВКМУ-151.'

2. Киллерные токсины обладают широким спектром действия против представителей различных таксономических групп дрожжей, но не действуют на мицелиальные грибы и бактерии.

3. Предложена таксономическая дифференциация ряда базидиоми-цетовых дрожжей на основании их чувствительности к киллеру W. pratensis.

4. Показано, что киллерные токсины Н.anómala, W.pratensis, К. subsufficiens и W.beijerinckii являются белками; определены их молекулярные массы, аминокислотный состав и изоэлектрические точки.

5. Установлено, что гены, ответственные за токсинообразова-ние у этих дрожжей, локализованы на хромосомах.

6. Киллерные _токсины дрожжей рода Williopsis и Н. anómala обладают Фунгшшдным или Фунгицидным и Фунгистатическим действием одновременно.

7. Чувствительность некоторых дрожжей к киллерным токсинам Williopsis и К.anómala существенно зависит от рН среды.

8. Киллерные токсины рода.Williopsis и Н.anómala эффективно воздействуют на патогенные для человека дрожжи рода Candida. Отобран наиболее активный штамм.

9. Разработаны подходы к созданию лекарственного препарата на основе киллерного белка Н. anómala. Данный препарат перспективен для применения при лечении ряда микозных заболеваний человека и животных.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Вустин М.Н., Шемякина Т.М., Бабьева И.П., Решетова И.С.. Тимохина Е.А., Синеокий С.П. "Новое антибиотическое вещество, об-

4

разуемое дрожжами Williopsis pratensis Babjeva et Reshetova". ДАН СССР, 1938, т. 303, N 3, с.724-727.

2. Вустин H.H., Шемякина Т.М., Ребентиш S.A., Бычкова H.A., Харитонов С.П., Тимохина Е.А., Синеокий С.П. "Киллерный белок, образуемый дрожжами Hansenula anómala (Hansen) Н. et P.Sydow". ДАК СССР, 1989,- т. 308, Н 5, с.1251-1255.

3. Вустин М.К., Бабьева И.П., Решетова И.С., Шемякина Т,М., Синеокий С.П. "Таксономическая дифференциация базидиомицетных дрожжей по чувствительности к киллерному токсину Williopsis pratensis". Микробиология, 1991, т.60, вып.2. с.345-349.

4. Шемякина Т.Н., Вустин М.М., лестеренко Н.В., Тимохина Е.А., Синеокий С.П. "Новые киллерные токсины, продуцируемые дрож-

. жами Williopsis subsufficiens и Williopsis beijerincícii", Микробиология, 1991, т. 60,- вып. 3, с.501-506.

5. Vustin М.М., Shemyakina Т.И. "Action of 'Killer toxins produced by genera Williopsis and Hansenula on some pathogenic yeast", 15th Int. Spec. Symp. on Yeast, Riga, Sept.30 - Oct.6, 1991, p. 154.

6. Аргунов C.B., Глазунов A.B.,Капульцевич Ю.Г.,Вустин М.М., Шемякина Т.М. "Культивирование клеток Hansenula anómala - продуцентов киллерного токсина - в периодическом режиме". Биотехнология, 1993, N 2, с.22-24.

7. Вустин H.H., Шемякина Т.Н., Синеокий С.П. "Зависимость чувствительности дрожжей к киллерным токсинам Williopsis и Hansenula от pH среды". Микробиология, 1993, т.62, с.147-150.

8«. Вустин М.М., Шемякина Т.М., Синеокий С.П. "Динамика подавления роста чувствительности дрожжей киллерными токсинами Williopsis и Н,anómala", Микробиология (в печати).