Киллерная активность клинически значимых дрожжей Malassezia и Candida albicans

Ожован, Ирина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Киллерная активность клинически значимых дрожжей Malassezia и Candida albicans
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Киллерная активность клинически значимых дрожжей Malassezia и Candida albicans"

На правах рукописи

Ожован Ирина Михайловна

Киллерная активность клинически значимых дрожжей Malassezia и С, albicans

Специальность 03.02.03 — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

60]

029

Москва-2010

004601029

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Арзуманян Вера Георгиевна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Блинкова Лариса Петровна

Доктор биологических наук Мысякина Ирина Сергеевна

Ведущее учреждение: кафедра микробиологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Защита состоится » сил^и./иг 2010г. в часов на заседании диссертационного совета Д'001.035.01 при НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: г.Москва, Малый Казенный пер., 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Автореферат разослан « » 20 Юг.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Антагонизм широко распространен среди различных групп микроорганизмов и обусловлен продукцией различных антимикробных веществ. Образование антимикробных веществ, в частности белков, токсичных для других организмов, известно у головневых [Koltin Y., 1988], плесневых и других групп грибов [Mizutani M. et al., 1982], a также y бактерий [Konisky J., 1982; Блинкова Л.П., 2007]. Подобные антагонистические взаимоотношения обнаружены и у дрожжей [Bevan Е.А. et al., 1963; Comitini F. et al., 2004; Paluszynski J.P. et al., 2007; Wang X., et al., 2007]. Белоксодержащие вещества с молекулярной массой от 10 кДа до 160 кДа, синтезируемые дрожжами и угнетающие или полностью подавляющие развитие штаммов других видов и даже родов, принято называть киллерными токсинами или микоциналш [Golubev W., 1998].

Так называемые штаммы-убийцы (киллеры) дрожжей, продуцирующие белковые токсины фунгицидного или фунгистатического действия, известны уже более 40 лет и особенно детально исследованы у сахаромицетов [Голубев В.И. и Чуркина Л.Г., 1990; Наумов Г.И. с соавт., 2005]. Штаммы, образующие микоцины, обнаружены среди многих родов клинически значимых дрожжей, в том числе Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Kluyveromyces, Debaryomyces, Hansenula [Young T.W., 1987; Starmer W.T. et al., 1987; Magliani W. et al., 1997; Golubev W., 1998; Schmitt M.J., 2002]. Наиболее распространенными в клинической практике являются дрожжи Candida albicans и Malasseziaspp.

Дрожжи рода Malassezia относятся к представителям нормальной микрофлоры кожи человека и теплокровных животных. В человеческой популяции от 74 до 93% здоровых индивидуумов в возрасте от 14 до 60 лет являются носителями Malassezia spp. [Faergemann J., Fredriksson T., 1980; Арзуманян В.Г. с соавт., 2002; Zargari A. et al., 1994]. Однако у иммунокомпрометированных носителей дрожжи Malassezia ассоциированы с целым рядом заболеваний, таких как пестрый лишай [Faergemann J., 1979], атонический дерматит [Broberg А., 1995], фолликулит и другие. Есть данные о наличии антагонистической активности Malassezia spp. против дерматофитных грибов [Weary P.E., 1967]. Однако до сих пор не было установлено, являются ли Malassezia продуцентами киллерных токсинов и, если да, то каков их спектр действия и другие свойства.

Дрожжи С. albicans в норме населяют некоторые эпителиальные ткани человека - кишечник, вагинальный тракт [Seebacher S. et al, 1971; Анкирская A.C., 2001]. При снижении иммунитета популяция С. albicans значительно увеличивается и распространяется в нехарактерные локусы - ротовую полость, кожу, респираторный тракт [Нобл У.К., 1986, Арзуманян В.Г. с соавт., 2002]. Несмотря на высокую частоту встречаемости С. albicans в клинической практике, данные об антагонистической активности, сведения о распространенности явления, природе антагонистических субстанций и спектре их действия у этих дрожжей весьма немногочисленны [Philliskirk G. et al., 1975].

Популяции дрожжей родов Malassezia и Candida зачастую встречаются в одной и той же экосистеме - на коже человека. Так, например, порядка 20% больных атопическим дерматитом являются одновременно носителями дрожжей Malassezia и Candida на коже [Арзуманян В.Г. с соавт., 2002]. Как эти два рода дрожжей взаимодействуют между собой в реальных условиях, можно узнать, если смоделировать эту ситуацию в эксперименте.

Цель исследования:

Исследование способности продукции киллерных токсинов штаммами клинически значимых дрожжей Malassezia и С. albicans.

Задачи исследования:

1. Оценить наличие и спектр киллерной активности у штаммов дрожжей Malassezia и С. albicans из лабораторной коллекции НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН и выбрать штаммы-продуценты.

2. Изучить свойства киллерных токсинов наиболее активных штаммов.

3. Установить локализацию генетических детерминант киллерной активности у штаммов дрожжей Malassezia.

Научная новизна

Впервые показано наличие киллерной активности и спектра ее действия у дрожжей Malassezia. Установлено, что антагонистическая активность обусловлена комплексом, состоящим из гликолипидной и белковой (33 и 35 кДа) частей, каждая из которых активна против определенных видов дрожжей. Показано, что киллерная активность у дрожжей рода Malassezia детерминирована хромосомой.

Впервые оценен спектр киллерной активности у дрожжей С. albicans, которая обусловлена термолабильными и чувствительными к протеиназе белками с молекулярными массами 118 и 130 кДа.

Впервые выявлена взаимная фунгистатическая активность при одновременном заселении экспериментальной экосистемы равными по плотности популяциями дрожжей С. albicans и Malassezia.

Практическая значимость

В результате проведенных исследований были выявлены наиболее активные штаммы-продуценты киллерных токсинов среди дрожжей С. albicans и дрожжей рода Malassezia.

Разработана модификация метода оценки целостности цитоплазматической мембраны, позволяющая обойтись без микроскопии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изученные штаммы С. albicans в 100% случаев и 90% штаммов дрожжей рода Malassezia обладают киллерной активностью, направленной против дрожжей аско- и базидиомицетного аффинитета. Наиболее антагонистически активные штаммы-продуценты: М. furfur № 607 и С. albicans№927.

2. Свойства токсинов штаммов-продуцентов сводятся к следующим:

• Киллерный токсин М. furfur № 607 - комплекс, состоящий из термостабильной, нечувствительной к протеиназе гликолипидной и термолабильной, чувствительной к протеиназе белковой (33 кДа и 35 кДа) фракций и оказывающий дозозависимое воздействие.

• Киллерный токсин С. albicans N2 927- термолабильные, чувствительные к протеиназе белки с молекулярными массами 118 кДа и 130 кДа, оказывающие дозозависимое воздействие.

3. Генетическая детерминанта, ответственная за киллерную активность дрожжей рода Malassezia, локализована в хромосомных генах.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (Москва, ноябрь 2001); на I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (2003); на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (Москва, ноябрь 2009); на VIII всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002). Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН 11 декабря 2009 года.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения,

выводов, списка литературы. Материалы диссертации изложены на 113 страницах машинописного текста, включают 16 рисунков и 14 таблиц, список литературы содержит 168 наименований, из них отечественных - 28, зарубежных -140.

Собственные исследования

Объекты и методы исследования

Культуры дрожжей взяты из коллекции лаборатории клинической микробиологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Использованы 11 штаммов дрожжей С. albicans, 10 штаммов дрожжей М. sympodialis, М. furfur, М. globosa, 8 штаммов дрожжей родов Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon, Geotrichum. Штаммы дрожжей С. albicans поддерживали на глюкозо-пептон-дрожжевой среде с антибиотиком [Бабьева И.П., 1979], а дрожжи рода Malassezia - на модифицированной среде Диксона (mD) [Guillot J., 1996].

Оценку киллерной активности дрожжей проверяли двумя количественными методами. Один из них заключался в оценке жизнеспособности тест-культур, выращиваемых на плотной среде, на которой предварительно культивировали штаммы, изучаемые на активность [Арзуманян В.Г. с соавт., 2005].

Активные штаммы дрожжей засевали газоном (106 КОЕ) в чашки Петри (диаметр 4 см), содержащие агар Диксона, и культивировали в течение 7 суток при температуре 32 0 С (Malassezia) и при температуре 20 0 С (С. albicans). Затем тонким металлическим шпателем агар переворачивали, и на обратную поверхность засевали свежую исследуемую культуру в дозе 50150 КОЕ на чашку. В качестве контроля брали чистый агар без первичного засева.

Для проверки термолабильности в отдельной серии опытов перед засевом тест-культур клетки дрожжей снимали с помощью стерильного покровного стекла, агар промывали стерильной водой, переносили в стерильный флакон и кипятили на водяной бане в течение 20 минут. Учет результатов проводили в течение 20 суток после засева культур дрожжей. Далее данный способ оценки обозначен как метод I.

Другой метод позволяет не только оценить киллерную активность, но и определить механизм действия токсина. Клетки чувствительных культур дрожжей обрабатывали 10-кратным концентратом культуральной жидкости (ККЖ), полученной в результате культивирования активного штамма, а затем - красителем бромкрезоловым пурпурным, который проникает через

образовавшиеся в цитоплазматической мембране поры и задерживается внутри клетки [Kurzweilova Н., Sigler К., 1993]. Подсчет живых (белых) и мертвых (желтых) клеток проводили путем микроскопирования при увеличении X 1750.

Культивирование дрожжей для получения культуральной жидкости, проводили во флаконах объемом 500 мл в стационарном режиме. Отношение объема среды к объему флакона составляло 1/5. Наработку препарата осуществляли путем выращивания самого активного штамма дрожжей при температуре 25 0 С до стационарной фазы. Для культивирования М. furfur использовали синтетическую среду, содержащую Твин 40, бычью желчь и аспарагин [Арзуманян В.Г., 1999]. Для культивирования С. albicans использовали синтетическую среду с глюкозой в качестве единственного источника углерода и энергии [Yarrow D., 1998].

Через 7 суток инкубирования клетки дрожжей осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут, супернатант фильтровали через фильтры Millipore (0.22 мкм), лиофилизировали и хранили при температуре минус 100 С.

Обработку проводили следующим способом: три петли (диаметр 3 мм) испытуемой 1-2 суточной культуры дрожжей суспендировали в 0.6 мл 0.5 М фосфатного буфера с рН 4.6. Затем 100 мкл суспензии инкубировали с 200 мкл ККЖ в течение часа и 24 часов. В качестве контроля использовали суспензию клеток с 200 мкл среды. После инкубации 100 мкл смеси переносили в пробирку Эппендорфа и обрабатывали 1 мл 2 мМ раствором бромкрезолового пурпурного в том же буфере. Пробирки инкубировали в течение часа при температуре 32 0 С, затем центрифугировали с угловой скоростью 5000 об/мин, осадки микроскопировали при увеличении X 1750.

В качестве контроля принимали количество живых клеток соответствующей суспензии, не подвергшейся обработке ККЖ, а инкубированной в буфере. Результатом явилась устойчивость, выраженная в процентах по отношению к контролю. Далее данный способ оценки обозначен как метод II.

Устойчивость ККЖ к воздействию протеиназы оценивали следующим способом: к 200 мкл ККЖ добавляли протеиназу К до конечной концентрации 1 мг/мл; смесь инкубировали при 50°С в течение 5 часов, процесс останавливали с помощью двукратного кипячения в течение 20 секунд, затем данной смесью обрабатывали клетки двухсуточной культуры дрожжей (режим выбран в соответствии с инструкцией к протеиназе).

Устойчивость ККЖ к влиянию высокой температуры оценивали следующим образом: ККЖ термообрабатывали путем автоклавирования при 0.5 атм в течение 30 минут, затем клетки двухсуточной культуры обрабатывали в течение 24 часов 200 мкл термообработанной ККЖ.

Проводили разделение культуральной жидкости, полученной в результате выращивания активного штамма Malassezia, на липидную и водную фазы. Удаляли Tween 40 путем растворения лиофилизованной ККЖ в дистиллированной воде (100 мг/1.25 мл) и последующей экстракцией Tween 40 смесью н-бутанола и хлороформа (1:3) из расчета 1 часть ККЖ и 5 частей смеси. В качестве контроля брали экстрагированную тем же способом концентрированную питательную среду. Антагонистическая активность полученных липидной и водной фаз была определена вышеописанным способом в отношении различных штаммов дрожжей.

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на базе Института биоорганической химии РАН совместно с к.б.н. Козловым С.А. были исследованы фракции культуральной жидкости, полученной при выращивании Malassezia. В 100 мкл 0.1% трифторуксусной кислоты суспендировали по 3 мкл аликвот. Затем образцы вводили непосредственно в хроматографическую колонку (С5 150x2мм), заполненную тонкодисперсным (5 мкм) сорбентом. Процедуру хроматографического разделения проводили на приборе Jupiter (Phenomenex). Элюирование проходило при комнатной температуре в линейном градиенте 0.1% трифторуксусной кислоты - ацетонитрила при скорости потока 0.3 мл/мин. Прохождение веществ регистрировал самописец при длине волны 210 нм.

Плазмидный анализ подготовленных нами культур Malassezia проводили на базе Венгерской Национальной Коллекции Микроорганизмов при Университете св. Иштвана (Будапешт, Венгрия) совместно с сотрудниками: проф. Ю. Торнай-Ляхоцки и ассистентами Г. Петером и Д. Длохи. Кариотипирование ядерной ДНК дрожжей рода Malassezia проводили стандартным методом [Johnston J.R., 1986; Boekhout T. et al, 1993]. Использовали 3-х суточные культуры дрожжей, выращенных в жидкой модифицированной среде Диксона (mD) при температуре 32 0 С в колбах Эрленмейера (20/50 мл). Клетки осаждали, промывали дистиллированной водой и ресуспендировапи в ЭДТА. К суспензии клеток добавляли зимолазу и высокоочищенную агарозу. Смесь заливали в пластиковый контейнер для полимеризации на 20 мин при температуре 4 0 С.

Образцы геля помещали в буфер (0.5 М ЭДТА, 0.01 М трис-HCL, 7.5% меркаптоэтанола рН 7.5) и инкубировали 16 часов. Затем образцы промывали трижды и инкубировали 16 часов при температуре 50 0 С в буфере (0.01 М трис-HCL, 0.5 М ЭДТА, 1% лаурилсаркозина, протеиназа К (1 мг/мл) рН 7.5). После 15 мин отмывки в ЭДТА образцы хранили при температуре 4 °С.

Присутствие плазмидного материала выявляли с помощью пульсэлектрофореза в агарозном геле [Oakley-Gutowski et al., 1992]. Процедуру выполняли на приборе ROTAPHOR R22 (BIOMETRA, Germany). Образцы, содержащие интактную ДНК, заливали 1% агарозой для фиксации в новом геле.

Затем после застывания геля проводили форез в пульсирующем электрическом поле в буфере. Гели окрашивали бромистым этидием (0.5 мкг/мл) и отмывали дистиллированной водой. ДНК выявляли путем облучения УФ-светом. В качестве маркеров использовали стандартные наборы фирмы «Biorad».

Гель-электрофорез белков проводили на базе Института диагностики и профилактики социально значимых заболеваний (Москва) под руководством к.б.н. Сердюк О.А. Форетическое разделение в градиенте 5-20 % полиакриламида с 3 %-ным концентрирующим гелем в присутствии додецилсульфата натрия проводили методом Леммли [Laemmli, 1970]. Для электрофореза препаратов, полученных при выращивании дрожжей М. furfur, готовили образцы из лиофилизированной верхней фазы, полученной из 200 мг концентрированной культуральной жидкости в невосстанавливающих условиях (без меркаптоэтанола и без нагревания).

Лиофилизат растворяли в 200 мл дистиллированной воды, затем к раствору добавляли равный объем буферного раствора, образец наносили на гель в расчете примерно 20 мкл в лунку. Для электрофореза препаратов, полученных при выращивании С. albicans, таким же образом готовили образцы из 50-ти кратного концентрата культуральной жидкости в невосстанавливающих условиях, затем наносили на гель по 40 мкл в лунку.

В качестве стандартов молекулярных весов использовали маркеры молекулярной массы «Low Molecular Weight» (LMW) и «High Molecular Weights» (HMW) (фирма Amersham-Pharmacia, Швеция). Маркеры молекулярных масс HMW готовили в невосстанавливающих условиях; маркеры молекулярных масс LMW приготовлены в восстанавливающих условиях.

Разделенные в электрофорезе белковые фракции окрашивали с помощью раствора солей серебра по Merril [Merril C.R. et al. 1979]. Расчеты молекулярных масс неизвестных белков проводили по калибровочному графику, построенному на основании данных, полученных с маркерами.

Содержание белка определяли методом Лоури [Lowry О.Н. et al, 1951]. Коэффициенты корреляции, стандартное отклонение рассчитывали по программе, вложенной в Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение Один из использованных нами методов заключался в оценке жизнеспособности культур, выращиваемых на плотной среде, на которой предварительно культивировали антагонистические штаммы [Арзуманян В.Г. с соавт., 2005]. Для этого культивировали активные штаммы дрожжей на агаризованной среде, затем агар переворачивали и на обратную сторону засевали испытуемую культуру. Данным методом оценивали перекрестную антагонистическую активность культур дрожжей рода Malassezia, С.albicans и некоторых других клинически значимых дрожжей (табл. 1).

Таблица 1. Антагонистическая активность различных культур дрожжей ^1alassezia в опытах на «перевернутом агаре»_

Тест-штаммы дрожжей, вид, коллекционный №

Активные культуры, коллекционные № штаммов

У- устойчивость; АА - антагонистическая активность

За наибольшую степень чувствительности принимали отсутствие роста в течение 20 суток, а наибольшей степенью устойчивости (У) считали такой же рост, как и в контрольных чашках. Устойчивость культур выражали в процентах от общего количества штаммов, на рост которых не влияли метаболиты, выделяемые штаммами-антагонистами, а антагонистическую активность (АА) - в процентах от общего количества штаммов, метаболиты которых полностью подавляли рост культур.

Основываясь на полученных данных, можно заключить, что наиболее устойчивым и активным штаммом явился М. furfur № 607: к нему оказались чувствительны 90% культур изученных штаммов, и ни одна другая культура не проявила антагонистическую активность в отношении данного штамма, то есть у этого штамма выявлена 100% устойчивость к метаболитам других культур Malassezia. Наиболее чувствительным и наименее активным штаммом явился М. globosa № 9.

Свойства активности и чувствительности по-разному представлены у исследуемых штаммов дрожжей. Данные результаты подтвердились и тем, что М. furfur №607 быстрее всех остальных росла: экспоненциальная фаза на жидкой среде mD наступала через 17-24 часа, в то время как для всех М. sympodialis - через 36-48 часов, а для М. globosa № 9 — 72-96 часов. В результате термообработки агара, на котором рос самый антагонистически активный штамм М. furfur № 607, произошло уменьшение антагонистической активности с 90 до 10%.

Для последующей серии экспериментов выбрали наиболее активный штамм - М. furfur № 607. При помощи методики «перевернутого агара» проверили антагонистическую активность данной культуры в отношении различных штаммов дрожжей (табл.2).

Культура М. furfur № 607 воздействовала фунгистатически на штаммы культур С. albicans, так как лишь частично подавляла их рост. Влияние метаболитов проявлялось либо в уменьшении количества колоний, либо в уменьшении размеров колоний до микроколоний. Представители рода Rhodoíorula оказались высокочувствительными к метаболитам, выделяемым М. furfur № 607 - количество живых клеток уменьшалось более чем в 5 раз. В то время как на термообработанном агаре рост дрожжей не подавлялся.

Таблица 2. Антагонистическая активность М./иг/иг Ж°607 в отношении некоторых аско- и базидиомицетных дрожжей в опытах на «перевернутом агаре»

Дрожжи Род/вид/ номер штамма В ремя появления колоний, сутки

Контроль Термообработанный агар «Перевернутый агар»

Cr. albidus № 975 2 7 20

Cr. albidus №220 2 3 7

Rh. mucilaginosa № 132 3 2 7

Rh. aurantiacaNs 786 3 2 7

T. cutaneum № 566 1 2 7

T. ovoides M.? 18 1 3 20

G. sp. № 1206 1 2 20

G. sp. № M. 2 2

C. albicans № 628 1 2 4

C. albicans № 689 1 2 4

C. albicans № 735 1 2 4

C. albicans № 741 1 2 4

C. albicans №815 1 2 4

C. albicans № 820 1 2 4

C. albicans №860 1 2 4

C. albicans № 927 1 2 4

C. albicans №932 1 2 4

C. albicans № 934 1 2 4

C. albicans № 1135 1 2 4

К 14-ым суткам стали более очевидны различия между штаммами дрожжей. У 4 изолятов С. albicans из 11-ти, 2 штаммов Rhodotorula, 1 штамма Trichosporon и 1 штамма Geotrichum размер микроколоний остался на исходном уровне, тогда как у 7 изолятов С. albicans размер колоний сопоставимым с контрольным вариантом.

Помимо частичного подавления и замедления роста наблюдали также и фунгицидное действие метаболитов, выделенных культурой М. furfur № 607.

Данное явление наблюдалось в отношении только некоторых базидиомицетов и аскомицетов. Рост штаммов Trichosporon № 18, Geotrichum № 1206, Cryptococcus № 975 в опытных вариантах даже на 14 сутки не наблюдался (табл.3).

Таблица 3. Фуигицидная активность метаболитов М. furfur № 607 в отношении некоторых аско - и базидиомицетных дрожжей в опытах на «перевернутом агаре»

Дрожжи Род/вид/ номер штамма Результат на 7-е сутки, % живых клеток по отношению к контролю

Термообработанный агар «Перевернутый агар»

Cryptococcus albidus №975 25.9 0

Trichosporon ovoides № 18 30 0

Geotrichum sp. № 1206 100 0

С целью определения термочувствительности проводили термообработку агара, на котором рос исследуемый М. furfur № 607. Практически во всех случаях эта процедура приводила к снижению антагонистической активности метаболитов, что может свидетельствовать о частичной термолабильности активных веществ.

Другой метод по Курцвейловой [Kurzweilova Н. et al, 1993] позволял не только оценить киллерную активность, но и определить порообразующее действие киллерного токсина. Данный метод основан на обработке испытуемых культур ККЖ, полученной в результате культивирования активного штамма и последующем окрашивании клеток красителем ВСР, который проникает через образовавшиеся поры в цитоплазматической мембране.

Данным методом оценивали антагонистическую активность культуры М. furfur № 607 в отношении штаммов дрожжей рода Malassezia, С. albicans и некоторых других клинически значимых дрожжей. После обработки клеток культуральной жидкостью, полученной в результате культивирования активного штамма на синтетической среде, содержащей Твин 40, бычью желчь и аспарагин [Арзуманян В.Г., 1999], клетки обрабатывали красителем ВСР и подсчитывали процент окрашенных (убитых) клеток. Микроскопирование осадков показало, что окраска содержимого клеток в указанном диапазоне менялась от белой до интенсивно желто-коричневой.

Самыми чувствительными оказались базидиомицетные дрожжи Cr. albidus № 220 и Rh. mucilaginosa № 132: уже в течение первого часа инкубации культур, происходило разрушение клеточной мембраны и живых клеток оставалось 16.5 и 32.3% соответственно.

Другие тест-культуры были менее чувствительны - только через 24 часа М. globosa № 9 осталось 33% живых клеток, Т. ovoides - 16%. В то время как у С. albicans № 1135 и Geotrichum sp № М - погибло всего 20 и 14% соответственно (рис.1).

О Cryptococcus albidus №220

■ Rho do torn la mucilaginosa № 132

Q Trichosporon ovoides № 18

Q Malassezia globosa № 9

Ш Candida albicans № 1135

S Geotrichum № M

Рисунок 1. Доля живых клеток различных дрожжей под воздействием концентрата культуральной жидкости М. furfur № 607.

В результате экспериментов оказалось, что чувствительность к метаболитам М. furfur №607 убывала в ряду Cryptococcus - Rhodotorula -Trichosporon — Malassezia - Candida - Geotrichum. Эти данные подтверждают результаты, полученные на плотных средах: изученные штаммы базидиомицетных дрожжей более чувствительны к метаболитам М. furfur № 607, чем аскомицетные. Эксперименты, проведенные на твердых и жидких средах, продемонстрировали более явный антагонистический эффект метаболитов М. furfur на 6 штаммов базидиомицетов, чем против 13 штаммов аскомицетов.

Более того, для этих культур обнаружена строгая корреляция между числом колоний на перевернутом агаре и процентом живых клеток после обработки ККЖ в течение 24 часов (р = 0,953). Учитывая количество видов дрожжей, среди которых найдены чувствительные штаммы, спектр действия токсинов Malassezia достаточно широк, как в случае других дрожжей-

несахаромицетов: Hansenula, Candida, Kluyveromyces и другие [Buzzini P., 2006; Vadkertiova R., 2007].

Оценку антагонистической активности дрожжей рода Candida проводили количественным методом отсроченного антагонизма на «перевернутом агаре» и путем обработки клеток концентратом культуральной жидкости, полученной при выращивании самого активного штамма С. albicans.

Эксперименты на «перевернутом агаре» показали, что все штаммы С. albicans обладали различной антагонистической активностью по отношению к испытуемым культурам. Учет результатов проводили в течение 20 суток. Метаболиты, выделяемые в агар дрожжами С. albicans, воздействовали на рост всех культур дрожжей Malassezia в той или иной степени: от полного торможения роста до отсутствия какой-либо реакции.

Во всех контрольных вариантах отмечен рост колоний размером 1-2 мм, тогда как во всех опытных - происходило замедление роста, появление микроколоний диаметром менее 0.1 мм, а в некоторых случаях -отсутствие роста вообще.

Количественные показатели устойчивости культур варьировали в пределах от 54,5 до 100%, причем имели значительный разброс среди штаммов одного рода и даже вида. В свою очередь штаммы С. albicans обладали различной антагонистической активностью по отношению к испытуемым культурам. Количественный показатель антагонизма варьировал в пределах от 11,1 до 61,1%. Наиболее активным являлся штамм С. albicans № 927 (табл. 4).

В результате экспериментов на «перевернутом агаре» удалось выяснить следующее: средние показатели чувствительности к метаболитам С. albicans убывали в ряду Cryptococcus - Trichosporon - Rhodotorula -Malassezia — Geotrichum. Это не совсем согласуется с устоявшимся представлением о большей активности микоцинов в отношении дрожжей более близкого аффинитета [Golubev W.I., 1998].

Таблица 4. Антагонистическая активность культур С. albicans в отношении различных дрожжей, оцененная в опытах на «перевернутом

агаре»

У- устойчивость; АА - антагонистическая активность Самый активный штамм С. albicans № 927 был использован для оценки антагонистической активности дрожжей рода Candida. Метаболитами данного штамма обрабатывали клетки трех видов Malassezia: наиболее активного штамма М. furfur № 607, наиболее чувствительных штаммов М. sympodialis № 1 и М. globosa № 9. Микроскопирование осадков показало, что так же, как и в случае с культурой Malassezia окраска содержимого обработанных клеток в указанном диапазоне менялась от белой до интенсивно желто-коричневой. Установлено, что все 3 штамма чувствительны к ККЖ С. albicans, что согласуется с результатами в экспериментах на «перевернутом агаре».

Оказалось, что после одного часа инкубации исследуемых штаммов с ККЖ С. albicans № 927 численность живых клеток по сравнению с контролем снижалась на 34% у М sympodialis № 1, на 40% - у М. furfur № 607 и на 24% - у М. globosa № 9 (рис. 2).

53М. sympodialis № 1 ЕЗМ furfur №607 ИМ globosa № 9

Рисунок 2. Доля живых клеток различных видов дрожжей Malassezia под воздействием концентрата культуральной жидкости С. albicans.

После 24-часовой обработки испытуемых культур численность живых клеток снижалась на 57% у М. sympodialis № 1 и у М. furfur № 607, на 52% - у М. globosa № 9. Термообработка ККЖ путем автоклавирования при 0.5 атм в течение 30 минут приводила к полной потере киллерной активности.

Взаимное влияние наиболее антагонистически активных штаммов С. albicans № 927 и М. furfur № 607 оценивали в опытах на агаризованной среде Диксона и синтетической среде [Арзуманян В.Г., 1999]. Теплый агар наносили по обе стороны капроновой сетки, натянутой между пластиковыми кольцами. На одну сторону агара засевали С. albicans, на другую через несколько минут - М. furfur. Количество посевного материала рассчитывали таким образом, чтобы получить порядка 100 колоний. Контрольные чашки Петри с той же средой засевали культурами в том же количестве. Все образцы инкубировали при температуре 32 0 С в течение нескольких суток, каждый день оценивая численность и размеры колоний. На обеих средах

результат оказался одинаковым: культура С. albicans вырастала на первые сутки, всего на 6-8 часов опережая М. furfur. По количеству колоний обе культуры не отличались от контрольного варианта, однако, размеры колоний у обоих штаммов были значительной меньше в опытных вариантах. Таким образом, при одновременном заселении модельной экосистемы дрожжами С. albicans и М. furfur они испытывали взаимное фунгистатическое воздействие.

Для некоторых штаммов изучаемых дрожжей оценены характеристики антагонистических субстанций. Дозозависимый эффект антагонистически активных субстанций, выделяемых М. furfur № 607 и С. albicans № 927 оценен на наиболее чувствительных штаммах Cr. albidus № 975 и М. globosa № 9 путем обработки клеток концентратом культуральной жидкости активных штаммов. Установлено, что активные субстанции, выделяемые дрожжами, проявляли дозозависимый эффект антагонистических метаболитов в отношении чувствительных штаммов (рис. 3).

дозаКЮК; мкл

0 Cr. albidus №975 В М globosa №9

Рисунок 3. Дозозависимый эффект антагонистических метаболитов, выделяемых М. furfur № 607 и С. albicans № 927, на чувствительные клетки после обработки в течение часа.

Кроме того, определяли устойчивость антагонистически активных субстанций М. furfur № 607 и С. albicans № 927 к воздействию высокой температуры и протеиназы К в опыте на чувствительной культуре М. globosa № 9. Клетки двухсуточной тест-культуры обрабатывали в течение 24 часов стандартной дозой (200 мкл) термообработанной ККЖ, либо ККЖ, обработанной протеиназой К.

Для сравнения воздействия ККЖ на испытуемый штамм взяли два разных раствора: питательную среду; 10-кратно концентрированную питательную среду. В качестве контроля принимали количество живых клеток испытуемой культуры до обработки ее различными вариантами растворов.

Оказалось, что около двух третей живых клеток М. globosa № 9 погибало после обработки ККЖ активных штаммов дрожжей. Однако после термообработки и обработки протеиназой К антагонистическая активность ККЖ снижалась почти в два раза (табл. 5).

Таблица 5. Устойчивость ККЖ активных штаммов к воздействию высокой температуры и протеиназы К.

Варианты обработки клеток Количество жив культу ых клеток тест-ры, %

Опыт с активным штаммом С. albicans №927 Опыт с активным штаммом М. furfur № 607

Питательная среда 12.2+3.2 65,0±8,5

Концентрат питательной среды 73.1 ±7.2 59,1±7,5

ККЖ 25.616.1 20,4±6,0

ККЖ + протеиназа К 52.3±12.3 38,5±7,1

Термообработанная ККЖ 67.2±5.1 31,5±4,9

Таким образом, удалось установить, что активное вещество является чувствительным к воздействию протеиназы и высокой температуры. Термолабильность ККЖ киллерных токсинов М. furfur № 607 и С. albicans № 927, подобно токсинам ряда других дрожжей [Goto К. et al., 1990; Golubev W.I. et al., 2006; Golubev W.I., 1998], является аргументом в пользу белковой природы антагонистических субстанций у изучаемых дрожжей.

Изучение концентрата культуральной жидкости также проводили с помощью методов ВЭЖХ и гель-электрофореза. Для этого ККЖ

M. furfur № 607 предварительно разделяли на липидную и водную фазы путем экстракции культуральной жидкости смесью хлороформ:н-бутанол. Все полученные фазы: верхняя (водорастворимая) и интерфаза (липидная)-были проанализированы после очистки от твинов. Методом ВЭЖХ удалось обнаружить в верхней (водной) фазе ККЖ М. furfur № 607 белковые субстанции.

Для сравнения было проведено электрофоретическое разделение водной фазы ККЖ наименее активной культуры М. sympodialis № 6. Анализ результатов разделения образцов выявил наличие двух белковых компонентов с молекулярными массами около 33 кДа и 35 кДа в случае с М. furfur № 607.

В верхней фазе ККЖ культуры М. sympodialis № 6 не обнаружено белковых компонентов, таким образом, данная культура не выделяла в культуральную жидкость белковых метаболитов (рис. 4).

{

Трек 1 - контроль (верхняя фаза концентрированной ср. Трек 2 - верхняя фаза метаболита, выделяемого М. furfur № 607 I

Трек 3 - верхняя фаза метаболита, выделяемого М. sympodialis № б Трек 4 - белковые маркеры с молекулярной массой, Да '

— 94 ООО

— 67 ООО

— 43 ООО

— 30 ООО

— 20 ООО

— 14 500

12 3 4

Рисунок 4. Электрофореграмма водорастворимой фазы метаболитов, выделяемых двумя культурами Л/я/амег/а (окраска серебром).

Оценку антагонистической активности водорастворимой и липидной фаз ККЖ М. furfur N° 607 проводили с использованием трех наиболее чувствительных культур - М. globosa № 9, Cr. albidus № 975 и Rh. mucilaginosa № 132 (табл. 6). В качестве контроля использовали буферный раствор рН 4.6. Время обработки суспензии клеток фракциями для Malassezia составляло 24 часа, а для других культур - 2 часа. Антагонистическая активность водорастворимой фазы ККЖ М. furfur № 607 оказалась значительно выше в отношении Cr. albidus № 975 и Rh. mucilaginosa № 132. Количество живых клеток по сравнению с контролем после обработки их ККЖ уменьшалась на 85.6 и 90.7% соответственно. В то время как количество живых клеток штамма М. globosa № 9 после обработки уменьшалась всего лишь на 9%.

Таблица 6. Сравнительный анализ антагонистической активности водорастворимой и липидной фазы ККЖ М. furfur № 607 на некоторые

культуры дрожжей

Тест-штаммы дрожжей, вид, коллекционный № Количество живых клеток по сравнению с контролем после обработки, %

Водорастворимая фаза Липидная фаза

Malassezia globosa № 9 91,1 ± 2,2 13,4 ± 1,8

Cryptococcus albidus № 975 14,4 ± 1,0 23,0 ± 1,4

Rhodotorula mucilaginosa № 132 9,3 ± 0,1 63,1 ±0,1

Липидная фаза проявила наибольшую активность в отношении к культуре М. globosa - количество живых клеток после обработки их ККЖ уменьшалось на 86.6%. Данный показатель в отношении культур Cr. albidus Ns 975 и Rh. mucilaginosa № 132 уменьшался на 77 и 36.9% соответственно.

Таким образом, при оценке антагонистической активности двух фаз в отношении наиболее чувствительных культур оказалось, что гликолипидная часть антагонистического комплекса эффективна против более родственных базидиомицетов, тогда как белки из водной фазы метаболита в основном эффективны против более далеких в родственном отношении организмов.

al., 2007]. Но в ряде случаев она ассоциирована с хромосомами [Голубев В.И. с соавт., 1988]. С целью установления локализации генетической детерминанты изученной активности проведен анализ плазмид методом пульс-электрофореза в агарозном геле (рис. 5).

В треках № 7 и № 10, проявленные полосы соответствуют размеру 3 kb. Присутствие плазмид обнаружено у двух наименее антагонистически активных штаммов: М sympodialis № 6 и М. globosa № 9. Коэффициент корреляции между антагонистической активностью и наличием плазмид у штаммов составил р = - 0,829.

старт Трек 1 - М. furfur № 607

Треки 2 - 9 -1500 kb ,. ,. ,.

М. sympodialis №Мя 1-8 Трек 10 -М.globosa №9

<- 300 kb

плазмиды, 3 кЬ

123456789 10

Рисунок 5. Пульсэлектрофореграмма в агарозном геле различных культур Макшегш

Таким образом, наблюдалась обратная корреляция между наличием плазмид и киллерной активностью среди различных штаммов Ма/аиег/а. Отсутствие, согласно данным электрофоретического анализа, плазмид у штаммов-киллеров Мг/ддае^га позволяет сделать вывод, что киллерная активность у Ма/амегга детерминирована, в отличие от многих изученных дрожжей, вероятнее всего, хромосомными генами.

Наличие белков в ККЖ С. albicans № 927 обнаружено с помощью метода гель-электрофореза в полиакриламидном геле. Электрофоретическое разделение метаболитов, выделяемых культурами С. albicans № 927, показало, что исследуемый материал содержит белковые компоненты (рис. 6).

330000220000-

670006000036000-

18000-

Мол. масса, (Da)

- 94000 -67000 -43000

-30000 -20000 -14500

123 45678 9

Рисунок 6. Электрофореграмма метаболитов, выделяемых культурой С. albicans № 927 (окраска серебром). Треки 1, 2, 3, 7, 8, 9 - белковые маркеры с молекулярной массой, Да; трек 5 — исследуемый метаболит; треки 4, 6 - пустые треки.

Очевидно наличие двух четких, но относительно слабых полос, соответствующих белкам с молекулярной массой примерно 118 и 130 кДа.

Использованный метод для оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот является высокочувствительным и дает информацию о порообразующем действии киллерных субстанций. Однако данный метод не применим в тех случаях, когда не представляется возможным просто подсчитать количество живых и мертвых клеток. Для таких случаев известный метод Курцвейловой [Kurzweilova Н. et al, 1993] был модифицирован. Предложенный метод, также как и взятый за основу,

заключается в проверке целостности цитоплазматической мембраны путем использования красителя, который проникает через поры поврежденной мембраны. Изменение состояло в следующем: к суспензиям молодых клеток исследуемых культур в 500 мМ фосфатном буфере рН 4.6 (0.4 мл) добавляли по 0,2 мл ККЖ и инкубировали 2 часа при температуре 320 С при медленном перемешивании. Параллельно ставили контроль без ККЖ.

Затем клетки осаждали центрифугированием, промывали дважды тем же буфером, суспендировали в 4 мл буфера, добавив 100 мкл 10 мМ бромкрезолового пурпурного. Полученные суспензии инкубировали в течение 1 часа при перемешивании, клетки осаждали, а оптическую плотность супернатантов измеряли на спектрофотометре при длине волны 440 нм, что соответствует максимуму поглощения красителя при данном значении рН. Микроскопирование осадков показало, что окраска содержимого клеток в указанном диапазоне менялась от белого (в контроле) до интенсивно желто-коричневого.

Таким образом, по разности оптических плотностей опытного и контрольного вариантов рассчитывали процент красителя, поглощенного клетками с нарушенной мембраной цитоплазмы и тем самым оценивали антагонистическую активность исследуемой культуры.

Для проверки достоверности данного способа оценки киллерной активности проводили следующие эксперименты: полученные в опыте осадки ресуспендировали в том же буфере и аликвоты высевали на плотную среду mD для контроля жизнеспособности клеток.

Модифицированным методом исследовали антагонистическую активность культуры М. furfur № 607, выращенной на mD агаре до экспоненциальной фазы (3 суток), в отношении 8 штаммов Malassezia. Три из 8 культур не теряли жизнеспособности после пятичасового действия ККЖ. Остальные 5 в той или иной степени оказались чувствительными к препарату (табл.7). Очевидно, что целостность мембраны сохраняли только те культуры, которые были нечувствительны к действию ККЖ. Мембраны клеток тех культур, которые теряли жизнеспособность после обработки ККЖ, содержали каналы, по которым краситель проникал внутрь клеток, а во внеклеточной среде концентрация его снижалась.

Таблица 7. Влияние киллерных токсинов М./иг/иг Ж» 607 на жизнеспособность и целостность цитоплазматической мембраны штаммов дрожжей Л/а/аиеэ'а врр.

Исходное Количество КОЕ Поглощенный клетками

Штамм, № количество после 5 часов ВСР после инкубации с

КОЕ инкубации с КЖ КЖ, % от контроля

М. furfur N2 607 >250 >250 0

M. sympodialis N2 5 200 200 0

M. sympodialis N2 8 59 51 0

M. sympodialis N2 3 >250 100 7.1

M. sympodialis N2 7 >250 51 3.7

M. sympodialis N2 1 >250 47 12.5

M. sympodialis N2 4 122 2 11.3

M. sympodialis N2 6 20 10 11.8

Между числом жизнеспособных клеток и процентом поглощенного красителя ВСР отмечена обратная корреляция (р = - 0.709). Данные, полученные с помощью модифицированного метода, вполне согласуются с результатами предыдущих экспериментов.

Таким образом, настоящая модификация метода оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток может быть использована в случаях, когда невозможно точно подсчитать количество живых и мертвых клеток в исследуемом образце.

Выводы

1. Выявлено, что наиболее антагонистически активными являются штаммы С. albicans N° 927, к которому чувствительны 61,1% изученных дрожжевых культур, и М. furfur N2 607, к которому чувствительны 90% изученных дрожжевых культур.

2. Установлено, что чувствительность к метаболитам М. furfur убывает в ряду: Cryptococcus - Trichosporon - Rhodotorula — Malassezia - Candida -Geotrichum, тогда как чувствительность к метаболитам С. albicans убывает в ряду: Cryptococcus - Trichosporon - Malassezia - Rhodotorula -Geotrichum.

Malassezia, а белковая часть более активна против далеких в родственном отношении микроорганизмов. Эффект воздействия зависит от времени и дозы.

4. Киллерная активность дрожжей С. albicans представлена термолабильными и чувствительными к протеиназе белками с молекулярными массами 118 кДа и 130 кДа, которые оказывают дозозависимое воздействие на чувствительные клетки дрожжей.

5. Установлено, что микоциноподобная активность у Malassezia, в отличие от многих изученных дрожжей, детерминирована не плазмидами, а хромосомой.

6. Выявлено, что при одновременном заселении экосистемы дрожжами С. albicans и М. furfur, они испытывают взаимное фунгистатическое воздействие.

7. Разработана модификация метода оценки ЦПМ клеток, которая может быть использована в случаях, когда невозможно точно подсчитать количество живых и мертвых клеток в исследуемом образце.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ожован И.М. «Киллерные токсины клинически значимых дрожжей»/ Арзуманян В.Г., Баснакьян И.А.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-2002.-№4.-С. 79-83.

2. Ожован И.М. «Киллерная активность дрожжей Malassezia»/ Арзуманян В.Г., Баснакьян И.А.// Материалы VIII всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва. - Март 2002,-С. 306-307.

3. Арзуманян В.Г. «Модифицированный метод оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот»/ Ожован И.М.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002.-Т. 134.-№7.-С.118.

4. Арзуманян В.Г. «Киллерная активность дрожжей рода Malassezia»/ Ожован И.М.// Успехи медицинской микологии.- Материалы Первого Всероссийского Конгресса по медицинской микологии. - 2003.-Т.1.-С.42-43.

5. Арзуманян В.Г. «Киллерная активность Candida albicans (robin) berkhout по отношению к клинически значимым дрожжам»/ Ожован И.М., Сердюк O.A.// Проблемы медицинской микологии. -2005.-Т.7-№4.-С.16-20.

6. Sergeev A.Y. «Anti-yeast activity of Malassezia species»/ Arzumanian V.G., Shelemekh O.V., Ojovan I.M., Serdiuk O.A.// Journal of Chemotherapy. -2007.-V. 19.-№ 3.-P.56.

7. Арзуманян В.Г. «Антагонистическая активность дрожжей Malassezia к другим клинически значимым родам дрожжей»/ Шелемех О.В., Ожован И.М., Сергеев Ю.В.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2009.-Т. 147-№ 9.-С.298-303.

Подписано в печать 10.03.2010г. Формат 60x84/32. Печать цифровая. Усл.п.л.1,5. Тираж 100 экз. заказ № 46. Отпечатано в ООО «Реглет» Тел: 661-60-89; 790-47-77 www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ожован, Ирина Михайловна

Содержание:.

Обозначения и сокращения.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

Глава 2.1. Антагонизм между микроорганизмами.

Глава 2.2. Характеристика антагонистических субстанций дрожжей: химическая природа, специфичность, наследование.

2.2.1. Микоцины.

2.2.2. Микроцины.

Глава 2.3. Современное представление о механизме действия киллерных токсинов (микоцинов).

2.3.1. Общие представления о механизме действия микоцинов.

2.3.2. Механизм действия Kl, К2 и К28 микоцинов.

Глава 2.4. Методы определения антагонистической активности.

Глава 2.5. Микоцинообразование у клинически значимых дрожжей.

Глава 2.6. Современные аспекты применения явления микоцинообразования.

Глава 2.6. Заключение по обзору литературы.

3. Собственные исследования.

Глава 3.1 Материалы и методы исследования.

3.1.1. Объекты исследования и методы культивирования.

3.1.2. Методы оценки киллерной активности штаммов дрожжей.

3.1.3. Биохимические методы.

Глава 3.2. Оценка киллерной активности штаммов клинически значимых дрожжей и выбор наиболее активных штаммов-продуцентов.

3.2.1. Malassezia.

3.2.2. Candida albicans.

3.2.3. Взаимное влияние Malassezia и Candida albicans.

Глава 3.3. Характеристика некоторых антагонистических субстанций, продуцируемых штаммами-киллерами.

3.3.1. Malassezia furfur.

3.3.2. Candida albicans.

Глава 3.4. Модификация метода оценки целостности клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Киллерная активность клинически значимых дрожжей Malassezia и Candida albicans"

Актуальность проблемы

Антагонизм широко распространен среди различных групп микроорганизмов и обусловлен продукцией различных антимикробных веществ. Образование антимикробных веществ, в частности белков, токсичных для других организмов, известно у головневых грибов [Koltin Y., Day P.R., 1975], плесневых и других грибов [Mizutani et al., 1982], а также у бактерий [Konisky J., 1982; Блинкова Л.П., 2007]. Подобные антагонистические взаимоотношения обнаружены и у дрожжей [Bevan Е.А. et al., 1963; Woods D.R., Bevan E.A., 1968; Bussey H., 1972; Comitini F. et al., 2004; Paluszynski J.P. et al., 2007; Wang X., et al., 2007]. Белоксодержащие вещества с молекулярной массой от 10 кДа до 160 кДа, синтезируемые дрожжами и угнетающие или полностью подавляющие развитие других штаммов, видов и даже родов, принято называть киллерными токсинами или микоцишти [Golubev W., 1998].

Так называемые штаммы-убийцы (киллеры) дрожжей, продуцирующие белковые токсины фунгицидного или фунгистатического действия, известны уже более 40 лет и особенно детально исследованы у сахаромицетов [Голубев В.И. и Чуркина Л.Г., 1990; Наумов Г.И. с соавт., 2005]. Штаммы, образующие микоцины, обнаружены среди многих родов дрожжей, в том числе Candida, Cryptococcus, Rhodotorida, Kluyveromyces, Debaryomyces, Hansenida, которые встречаются в клинической практике [Young T.W., 1987; Starmer W.T. et al, 1987; Magliani W. et al., 1997; Golubev W., 1998; Schmitt M.J., 2002].

Наиболее распространенными в клинической практике являются дрожжи Candida albicans и Malassezia spp.

Дрожжи рода Malassezia являются представителями нормальной микрофлоры кожи человека и теплокровных животных. В человеческой популяции от 74 до 93% здоровых индивидуумов в возрасте от 14 до 60 лет являются носителями Malassezia spp. [Faergemann J., Fredriksson Т., 1980; Арзуманян В.Г. с соавт., 2002; Zargari A. et al., 1994]. Однако у иммунокомпрометированных носителей дрожжи Malassezia ассоциированы с целым рядом заболеваний, таких как пестрый лишай, атопический дерматит, фолликулит и другие [Арзуманян В.Г., 2001; Faergemann J., 1979; Broberg А., 1994]. Есть данные о наличии антагонистической активности Malassezia spp. против дерматофитных грибов [Weary Р.Е., 1967]. Однако до сих пор не было установлено, являются ли Malassezia продуцентами киллерных токсинов и, если да, то каков их спектр действия и другие свойства.

Дрожжи Candida albicans в норме населяют некоторые эпителиальные ткани человека - кишечник, вагинальный тракт [Seebacher S. et al, 1971; Нобл У.К., 1986; Анкирская А.С., 2001; Арзуманян В.Г. с соавт., 2004]. При снижении иммунитета популяция С. albicans значительно увеличивается и распространяется в нехарактерные локусы - ротовую полость, кожу, респираторный тракт. Несмотря на распространенность С. albicans в клинической практике данные об антагонистической активности, сведения о распространенности явления, природе антагонистических субстанций, спектре их активности, механизмах у этих дрожжей весьма немногочисленны [Philliskirk G. et al., 1975].

Популяции дрожжей родов Malassezia и Candida зачастую встречаются в одной и той же экосистеме — на коже человека. Так, например, порядка 20% больных атопическим дерматитом являются одновременно носителями дрожжей Malassezia и Candida на коже [Арзуманян В.Г. с соавт., 2002]. Как эти два рода дрожжей взаимодействуют между собой в реальных условиях, можно узнать, если смоделировать эту ситуацию в эксперименте.

Цель исследования:

Исследование способности продукции киллерных токсинов штаммами клинически значимых дрожжей Malassezia и С. albicans.

Задачи исследования;

2. Изучить свойства киллерных токсинов наиболее активных штаммов.

3. Установить локализацию генетических детерминант киллерной активности у штаммов дрожжей Malassezia.

Научная новизна

Впервые показано наличие киллерной активности и спектра ее действия у дрожжей Malassezia. Установлено, что антагонистическая активность обусловлена комплексом, состоящим из гликолипидной и белковой (33 и 35 к Да) частей, каждая из которых активна против определенных видов дрожжей. Показано, что киллерная активность у Malassezia детерминирована хромосомой.

Впервые оценен спектр действия киллерной активности у С. albicans, которая обусловлена термолабильными и чувствительными к протеиназе белками с молекулярными массами 118 и 130 кДа.

В результате проведенных исследований были выявлены наиболее активные штаммы-продуценты киллерных токсинов среди дрожжей С. albicans и Malassezia.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изученные штаммы С. albicans в 100% случаев и 90% штаммов дрожжей рода Malassezia обладают киллерной активностью, направленной против дрожжей аско- и базидномицетного аффинитета. Наиболее антагонистически активные штаммы-продуценты: Malassezia furfur № 607 и С. albicans № 927.

2. Свойства токсинов штаммов-продуцентов сводятся к следующим;

• Киллерный токсин М. furfur Nq 607 - комплекс, состоящий из термостабильной, нечувствительной к протеиназе гликолипидной и термолабильной, чувствительной к протеиназе белковой (33 кДа и 35 кДа) фракций и оказывающий дозозависимое воздействие.

• Киллерный токсин С. albicans № 927 - термолабильные, чувствительные к протеиназе белки с молекулярными массами 118 кДа и 130 кДа, оказывающие дозозависимое воздействие.

3. Генетическая детерминанта, ответственная за киллерную активность дрожжей рода Malassezia, локализована в хромосоме.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (Москва, ноябрь 2001); на I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (2003); на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (Москва, ноябрь 2009); на VTII всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002). Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН 11 декабря 2009 года.

2. Обзор литературы Глава 2.1. Антагонизм между микроорганизмами

В конкретных экологических условиях между разными группами микробов устанавливаются определенные взаимоотношения, характер которых зависит от физиологических особенностей и потребностей совместно развивающихся микробов [Егоров Н.С., 1994]. В основном эти взаимоотношения можно условно подразделить на две большие группы: благоприятные — синергизм и неблагоприятные — антагонизм. Однако взаимоотношения между микробными сообществами далеко не всегда укладываются в рамки этих подразделений, так как они чрезвычайно сложны, разносторонни и вариабельны. Изменения во взаимоотношениях происходят вследствие изменений окружающих условий существования (в частности, иммунной системы хозяина) или в результате перехода микробов из одной стадии развития в другую.

Можно отметить следующие формы взаимоотношений между микроорганизмами: сосуществование, метабиоз, симбиоз, конкуренция, хищничество, паразитизм, антагонизм. Антагонизм широко распространен в микробных сообществах, состоящих из бактерий, грибов, актиномицетов, дрожжей, водорослей, простейших и других микроорганизмов. Взаимоотношения, обусловленные продукцией любых антимикробных веществ, можно назвать активным или прямым антагонизмом. В отличие от него существует пассивный, или косвенный, антагонизм, при котором подавление одних микроорганизмов происходит за счет изменения другими микробами условий окружающей среды в неблагоприятную для развития сторону.

Продуцирование антимикробных веществ — один из факторов, дающий определенные преимущества микроорганизму-антагонисту в борьбе за существование в сложных естественных микробных ассоциациях. Таким образом, антимикробные вещества не могут считаться случайными отбросами обмена веществ микробной клетки, не играющими приспособительной роли в борьбе за существование.

Антагонистические взаимоотношения между дрожжевыми организмами в настоящее время объединяют под названием киллер-феномена. Феномен киллерной активности среди дрожжевых клеток впервые был описан учеными Makower и Bevan в 1963 году [Bevan Е.A. et al., 1963]. Они заметили, что некоторые штаммы Saccharomyces cerevisiae подавляли рост чувствительных штаммов этого же вида. Впоследствии учеными Woods D.R., Bevan Е.А. и Bussey Н. было открыто, что антагонистическая активность заключается в действии выделяемых киллерными дрожжами в среду токсичных для близкородственных культур белоксодержащих компонентов [Woods D.R., Bevan Е.А., 1968; Bussey Н, 1972]. Также было доказано, что клетки киллерных дрожжей нечувствительны (иммунны) к собственным токсинам. Существуют штаммы, не выделяющие токсины, а также не чувствительны к ним [Golubev W.I., 1998]. Поэтому все штаммы были условно разделены на три группы: «киллеры», «нейтральные» и «чувствительные». Эти наблюдения легли в основу изучения киллерной активности среди различных родов дрожжей. С тех пор антагонистическая активность была описана у большого числа родов и видов дрожжей [Young T.W., 1987].

Необходимо подчеркнуть, что феномен киллерной активности у дрожжей не является уникальным. Синтез белков, обладающих специфичной токсичностью для родственных организмов, также характерен для головневых грибов [Koltin Y., 1975], парамеций, миксомицетов [Mizutani М. et al., 1990], а также для бактерий [Konisky J., 1982; Блинкова Л.П., 2007]. Бактериальные белковые антибиотики названы бактериоцинами, и, чтобы подчеркнуть общий характер подобных антагонистических взаимоотношений, Голубев В.И. в своей работе предложил называть дрожжевые киллерные токсины микоцинами, а киллерные штаммы - микоциногенными штаммами [Golubev W.I., 1998].

Киллерная система, подобная S. cerevisiae, также открыта у Hanseniaspora uvarum [Zorg J.C. et al., 1988], Cystofilobasidium bisporidii [Карамышева З.Н. с соавт., 1993], у красных баллистоспорообразующих дрожжей Sporidiobolus sp. [Голубев В.И. с соавт., 1988]. Токсины, детерминированные линейными двунитевыми молекулами ДНК (сЬДНК) -плазмидами - выявлены у Kluyveromyces lactis [Stark M.J.R. et al., 1990], Pichia acaciae [Worsham P.L. et al., 1990] и у многих других видов. Кроме того, были обнаружены киллерные токсины, кодируемые хромосомой, например, у Candida glabrata [Sriprakash K.S. et al., 1985].

К настоящему времени показано, что это явление широко распространено среди дрожжевых организмов различных таксонов [Young T.W., 1987; Starmer W.T. et al., 1987; Magliani W. et al., 1997; Golubev W.I., 1998; Schmitt M.J., 2002]. Культуры, обладающие ингибирующей активностью, найдены у многих известных родов (таблица 1). Микоциногенные штаммы обнаружены также среди многих клинически значимых родов дрожжей, в том числе Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Kluyveromyces, Trichosporon, Debaryomyces, Hansenula [Kandel J.S., 1979; Comitini F. et al., 2004].

Таблица 1. Распространение киллерного феномена среди дрожжей

Виды Литературный источник

Candida sp. Philliskirk G., Young T.W. (1975); Sriprakash et al. (1984) Kan del J.S. and Stern T.A., (1979)

Cryptococcus sp. Stumm C. et al. (1977); Young T.W. (1987) Kandel J.S. and Stern T.A., (1979)

Debaryomyces sp. Philliskirk G., Young T.W. (1975); Golubev W.I. (1998) Kandel J.S. and Stern T.A., (1979)

Hansenula sp. Philliskirk G., Young T.W. (1975); Zorg et al. (1988)

Kluyveromyces sp. Philliskirk G., Young T.W. (1975); Stark et al. (1990) Kandel J.S. and Stern T.A., (1979)

Pichia sp. Philliskirk G., Young T.W. (1975); Worsham et al. (1990)

Rhodotorula sp. Golubev W.I. (1989); Stanner W.T. et al. (1987) Kandel J.S. and Stern T.A., (1979)

Sacch aromyces sp. Bevan E.A. and Makower(1963); Magiiani W. et al. (1997)

Sporidiobolus sp. Голубев В.И. с соавт. (1988)

Torulopsis sp. Bussey Н. and Skipper N. (1975)

Bullera sp. Golubev W.I. and Nakase T. (1997)

Trichosporon sp. Young T.W. (1987); Schmitt M.J. (2002) Kandel J.S. and Stern T.A. (1979)

Глава 2.2. Характеристика антагонистических субстанций дрожжей: химическая природа, специфичность, наследование

2.2.1. Микоцины

Антагонистические взаимоотношения между дрожжевыми организмами обусловлены продукцией киллерных токсинов или микоцинов. Киллерная активность среди дрожжей впервые был описан у сахаромицетов [Bevan Е.А. et al., 1963]. Поэтому всесторонне изученной киллерной системой является дрожжевая система S. cerevisiae, которая детально описана во многих работах [Bussey Н., 1991; Tipper D.J. et al, 1991; Wickner R.B., 1996]. В настоящее время микоциногенные дрожжи данного вида разделены на три основные группы (Kl, К2 и К28). Классификация основана на молекулярных характеристиках секретируемых токсинов, механизмах действия, перекрестном иммунитете.

Хотя киллерные токсины состоят из различных аминокислот и отличаются по механизму воздействия, наблюдаются общие основные этапы синтеза, процессинга и секреции [Golubev W.I., 1998]. Каждый токсин на начальном этапе синтезируется в виде полипептидного препротоксина. Препротоксины в целом обладают схожей структурой. Синтезированные препротоксины подвергаются дальнейшим модификациям с участием эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, везикулы. В результате сформированный токсин секретируются из клетки в виде одномерной, димерной или тримерной молекулы. Например, молекула токсина К1 (19 кДа) состоит из двух субъединиц (9.5 кДа и 9 кДа), связанных дисульфидными мостиками и полученных из гликозилированного предшественника (протоксин - 42 кДа). Изучение процесса формирования токсина К1 было настолько продуктивным, что полученные знания легли в основу понимания многих процессов, связанных с синтезом белков у высших эукариот.

Все изученные микоцины являются либо белками, либо гликопротеинами, которые состоят из одной, двух или трех субъединиц [Golubev W.I., 1998]. Молекулярная масса большинства микоцинов находится в пределах 10-30 кДа, но встречаются киллерные токсины с массой более 100 кДа. Например, выделяемый дрожжами S. cerevisiae микоцин (20.6 кДа) состоит из олиголипептидов, связанных дисульфидными мостиками, с высоким содержанием гидрофобных и заряженных аминокислот [Наумов Г.И. с соавт., 2009]. Молекулярная масса тримерного микоцина, выделяемого К. lactis намного больше, он составляет более 156 кДа. Дрожжи К. phqffii секретируют киллерный токсин, представляющий собой гликопептид с молекулярной массой 33 кДа [Comitini F. et al., 2004].

При определении природы микоцинообразования можно эффективно классифицировать киллерные штаммы дрожжей, поскольку штаммы с идентичными токсичными свойствами могут выделять идентичные токсины [Young T.W., 1987]. Идентичность токсинов может быть оценена следующими путями:

• определением спектра активности токсина против чувствительных штаммов;

• испытанием активности токсина против мутантов, устойчивых к определенным токсинам;

• испытанием перекрестной активности токсинпродуцирующих организмов;

• определением структуры токсинов.

Токсины способны убивать чувствительные штаммы дрожжей также как и штаммы дрожжей, принадлежащих другим киллерным группам, в то время как продуценты не чувствительны к своим собственным токсинам или токсинам, выделяемым другими дрожжами из своей же группы [Schmitt МJ. et al., 2002; Wickner R.B., 1996].

В основном эффект микоцина очень специфичен (таблица 2). Самый узкий спектр действия имеют киллерные токсины истинных сахаромицетов. Токсин в некоторых случаях может иметь широкий спектр действия на различные виды дрожжей. Например, Hamenula saturnus CCY38-4-2 губит Zygosaccharomyces bailii, S. cerevisiae, некоторые штаммы Candida albicans, Candida krusei, Kluyveromycesphqffii, и Hansenula sp. [Vondrejs V., et al., 1991].

Наиболее широким спектром действия обладают токсины, продуцируемые дрожжами Hansemda, Candida, Kluyveromyces и некоторыми другими [Buzzini P., Martini А., 2001]. Их активность проявляется против многих видов патогенных дрожжей, входящих в состав родов Candida, Cryptococcus, К I uyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Trichosporon. Некоторые виды Rhodotorula проявляют киллерную активность против большинства видов аскомицетов и базидиомицетов [Vadkertiova R., Slavikova Е., 1995,2007].

Спектры действия конкретных токсинов могут сильно различаться по своему диапазону: от штаммов внутри одного вида до действия на представителей родственных родов [Koltin Y., 1975; Middelbeek EJ. et al., 1980; Голубев В.И. и др., 1988]. Устанавливать этот диапазон необходимо с использованием максимального разнообразия представителей таксонов, а также значительного количества штаммов одного вида воизбежании искажений за счет резистентных штаммов, устойчивых мутантов. По последней причине представляются ограниченными возможности использования киллерных токсинов в идентификации на основе определения чувствительности/устойчивости к микоцинам [Голубев В.И., 1989].

Таблица 2. Спектр действия микоцинов, выделяемых некоторыми видами дрожжей

Микроорганизмы, выделяющие микоцины Чувствительн ые к микоцинам виды дрожжей Источник литературы

Hansettula saturnus Zygosaccharomyces bailii Saccharomyces cerevisiae Candida albicans (нек. шпи) Candida krusei Kluyveromyces phaffii Hansenula sp. Vondrejs and Palkova, 1997

Sacch aromycea cerevisiae K1 Saccharomyces cerevisiae (чувств, шт.) Candida giabrata Candida fluviatilis Candida rugosa Толсторуков с соавт., 1989

Saccharomyces cerevisiae K2 Kluyveromyces marxianus Pichia canadensis Candida maltosa Candida tropicalis Голсторуков с соавт., 1989

Kluyveromyces spp. Pichia anomala Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Candida utilis Candida giabrata Panchal et al., 1985

Известны два типа наследования микоцинообразования у дрожжей -цитоплазматический и хромосомный. Основные характеристики по генетической детерминации, структуре киллерного токсина, механизму действия наиболее исследованных киллерных систем дрожжей представлены в таблицу 3.

Во многих исследованиях показано, что микоцинообразование с цитоплазматическим типом наследования определяется наличием:

• вирусоподобных частиц: линейных двунитевых молекул РНК (dsPHK) [Толсторуков И.И. с соавт., 1989; Berry Е.А. et al., 1972], например, у S. cerevisiae [Bevan Е.А. et al., 1963; Наумов Г.И. с соавт., 2009] и у Ustilagosp. [Koltin Y., 1975];

• плазмидной линейной двунитевой молекулой ДНК у дрожжей К. lactis, P. acaciae, P. inositovora [Tipper DJ., 1984, Wilson С., 1989; Paluszynski J.P. et al., 2007];

• митохондриальной ДНК (например, у S. paradoxus, Rh. mucilaginosa, C. glabrata, и у некоторых штаммов S. cerevisiae) [Наумов Г.И., 1985].

Три основные группы микоциногенных штаммов S. cerevisiae включают в себя штаммы, продуцирующие токсины, кодируемые dsPHK [Schmitt M.J., Breinig F., 2006]. Токсины Kl, K2 и К28 кодируются цитоплазматически наследуемыми вирусоподобными частицами dsPHK, заключенных в белковую капсулу (Ml, М2 и М28 соответственно). Репликация и заключение в капсулу данных частиц зависит от другой группы вирусов «хелперов» (L-A) [Bostain К.A. et al., 1980]. Частицы М dsPHK ответственны либо за киллерную активность, либо за устойчивость. Такие вирусоподобные частицы не являются инфекционными и передаются вегетативной клеткой при делении или через слияние [Tipper D.J. et al., 1984].

Таблица 3. Основные характеристики некоторых наиболее изученных киллерных систем дрожжей.

Генетическая детерминация Киллерная система Киллерный токсин Размер, кДа рецептор Механизм действия

Плазмидная линейная двунитевая молекула РНК (dsPHK) Saccharomyces cerevisiae

К1 a(3 димер 19.0 P-U6-D-глюкан Увеличение транспорта ионов через мембрану

К2 21.5 (3-1,6-D-глюкан Увеличение транспорта ионов через мембрану

К28 21.5 а-1,3-манноза Подавление синтеза ДНК

Плазмидная двунитевая молекула днк Kluyveromyces lactis сфу тример 156.5 хитин Остановка клеточного цикла на фазе Gi

Хромосома Saccharomyces cerevisiae

KHR мономер 20 неизвестно Увеличение транспорта ионов через мембрану

KHS мономер 75 неизвестно Увеличение транспорта ионов через мембрану

Изучение К1 киллерной системы привело к исчерпывающей информации по миковирусам, их взаимоотношении с клеткой «хозяина» дрожжей, физиологии и структурным характеристикам эукариотических дрожжевых клеток. Феномен киллерной активности дрожжей для ряда ученых представлял собой превосходную модель для изучения взаимодействий "хозяин-вирус" между клетками, а также для исследования механизмов синтеза и выделения белков [Wickner R.B., 1993; Douglas С.М. et al, 1988; Schmitt M.J., Breing F, 2006].

Термообработка, УФ-облучение, обработка различными веществами (бромистый этидий, циклогексимид, акридиновый оранжевый и др.) индуцируют элиминацию цитоплазматических dsPHK или плазмид, что сопровождается превращением соответствующих киллеров в чувствительные штаммы. Данные факты лишь подтверждают связь плазмид или вирусоподобных РНК со свойством киллерной активности.

Микоцинообразование может быть детерминировано хромосомными генами [Наумов Г.И., 1985]. Например, термостабильный (KHR) и термолабильный (KHS) токсины S. cerevisiae, которые отличаются не только по отношению к термообработке, но и имеют различные оптимумы рН. Данные токсины представляют собой протеины с молекулярной массой 20 и 75 кДа соответственно [Goto et al., 1990].

К настоящему времени известно уже немало антагонистов, у которых генетические детерминанты киллерной активности локализованы в хромосомных генах [Голубев В.И. с соавт., 1988]. Например, термолабильный микоцин (15 кДа) Psendozyma tsukubaensis [Golubev W.I. et al., 2006] (таблица 4). Он обладает очень узким спектром действия и проявляет киллерную активность в интервале 3.5-6.0 рН. Термолабильный, чувствительный к протеиназе К микоцин (10 кДа) Tilletiopsis albescens обладает более широким спектром действия (многие виды Rhodotorula, Pseitdozyma) [Golubev W.I., 1998].

Таблица 4. Локолизация генетических детерминант, обуславливающих киллерную активность некоторых дрожжей

Дрожжи Генетическая детерминация Источник литературы

S. cerevisiae dsRNA Bevan Е.А. et al., 1963; Bevan Е.А. et al., 1973; WicknerR.B., 1996

Н. uvarum dsRNA Schmitt M.J., et al., 1997

Z. bailii dsRNA Schmitt M.J. and Neuhausen F,, 1994

U. maydis dsRNA Park C.M., et al., 1994

К. lactis dsDNA Chandra J.P., et al., 1985

P. acaciae dsDNA Paluszynski J.P., et al., 2007

Pichia inositovora dsDNA Hayman G.T. and Bolen P.L., 1991

Pichia kluyveri Хромосома Young T.W., 1987

Pichia farinosa Хромосома Suzuki C. and Nikkuni S., 1994

P. anomala Хромосома Sawant A.D., Ahearn D.G., 1990

Candida Хромосома Walker G.M. et al, 1995

Cryptococcus Хромосома Walker G.M. et al, 1995

Torulopsis Хромосома Walker G.M. etal, 1995

Pseudozyma tsukubaensis Хромосома Golubev W.I. et al., 2006

Williopsis mrakii Хромосома Hodgson V.J., etal., 1995

Киллерные системы, детерминированные хромосомой, были идентифицированы уже у многих родов дрожжей, включающих оппортунистических патогенов, таких как Candida, Cryptococcus, Torulopsis [Walker G.M. et al, 1995; Yokomori Y., 1988; Buzzini P., 2000].

В пользу ядерной наследственности микоцинообразования свидетельствует и высокая стабильность этого признака, то есть киллерная активность сохраняется при пересевах. В случае внехромосомного наследования киллерный фенотип при поддержании культур в лабораторных условиях сохраняется лишь некоторое время [Голубев В.И., 1990].

Таким образом, антагонистическая активность у дрожжей обусловлена белками или гликопротеинами, обладающими различными диапазонами действия: от штаммов внутри одного вида, до представителей более далеких в родственном отношении таксонов. Микоциногенная активность дрожжей может наследоваться цитоплазматически и ассоциироваться с наличием вирусоподобных частиц dsRNA, или плазмид, или митохондриальной ДНК. Киллерная активность некоторых дрожжей может быть ассоциирована с хромосомными генами.

2.2.2. Микроцины

Антагонистические взаимоотношения между дрожжами не ограничиваются микоциногенией, а могут быть обусловлены иными антифунгальными агентами. Помимо микоцинов - токсинов белковой природы с таксономически специфичным спектром действия, недавно открыты низкомолекулярные агенты, выделяемые дрожжами - микроцины [Golubev W.I., 1994]. Существование данных двух типов токсинов у дрожжей подчеркивает большую схожесть между киллерным феноменом (микоциногенией) и бактериоциногенией.

Микроцины представяют собой низкомолекулярные гликолипиды или олигопептиды (около 1 кДа). Очевидно, благодаря маленькому размеру молекулы, они обладают следующими свойствами:

• термостабильность;

• устойчивость к протеолизу, к крайним значениям рН;

• растворимость в спиртах;

• способность к диффузии через диализную мембрану.

Широкий спектр действия микроцинов на аскомицетные и базидиомицетные дрожжи далеких друг от друга филогенетических групп также связан с низким молекулярным весом микроцинов. Такой спектр чувствительных к гликолипидам грибов, включающие виды, патогенные для человека, отсутствие или низкая токсичность позволяют рассматривать их в качестве перспективных компонентов антифунгальных препаратов. Механизм действия этих низкомолекулярных антимикотиков еще не достаточно изучен.

Фунгицидный гликолипид обнаружен у дрожжей Pseudozyma fusiformata [Голубев В.И., 2001], обладающий широким спектром действия. Из обследованных 280 видов дрожжей, принадлежащих к 80 родам, 83% видов были чувствительны. Гликолипид, обладающий аналогичной фунгицидной активностью, обнаружен у дрожжевых грибов Cr. humicola [Kulakovskaia E.V. et al., 2007] и у P. flocculosa [Mimee В., et al., 2005]. Антагонистическая активность проявляется в отношении различных видов дрожжей, в том числе Cryptococcus sp. и Candida sp. Данные гликолипиды обладают термостабильностью, устойчивостью к проназе Е и бактериальной протеазе. Было обнаружено, что данные микроцины имеют молекулярную массу 1 кДа.

Штаммы дрожжей Cryptococcus humicola способны секретировать микроцины, которые являются олигопептидами молекулярной массой около 1 кДа и детерминированы хромосомной ДНК [Golubev W.I., 1994].

Целлобиозолипиды дрожжевых грибов Cr. humicola и P. fusiformata обладают сходной фунгицидной активностью по отношению к различным дрожжам, в том числе к возбудителям криптококкозов и кандидозов. Наибольшую чувствительность к этим препаратам проявляют базидиомицетные дрожжи, в частности возбудитель криптококкоза Filobasidiella neoformans, клетки которого почти полностью погибают после 30-минутной инкубации в растворе гликолипида при концентрации 0.02 мг/мл. Такой же эффект в отношении аскомицетных дрожжей, в том числе, возбудителей кандидозов, достигается лишь при 5-8 кратной концентрации гликолипидов.

Целлобиозолипид P. fusiformata, который в отличие от гликолипида Cr. Humicola, в состав которого входит гидроксикапроновая кислота в качестве О-заместителя целлобиозы и дополнительную 15-гидроксигруппу в агликоне, более эффективно подавляет рост исследованных мицелиальных грибов по сравнению с целлобиозолипидом из О. humicola. Видимо наличие заместителей и гидроксильных групп влияет на антагонистическую активность микроцинов.

Выделенные с растений дрожжи Pseudozyma graminicola подавляют рост почти всех исследованных аскомицетов и базидиомицетов (более 270 видов около 100 родов), включая патогенные виды [Голубев В.И. с соавт., 2008]. Базидиомицеты к целлобиозолипиду более чувствительны, чем аскомицеты. Секретируемый данными дрожжами фунгицидный агент идентифицирован как гликолипид, состоящий из остатка целлобиозы с двумя О-заместителями (ацетил и 3-гидроксикапроновая кислота) и 2,15,16-тригидроксипальмитиновой кислоты. Выход АТФ из клеток, обработанных этим гликолипидом, свидетельствует о нарушении им проницаемости цитоплазматической мембраны.

Поскольку задержка роста может быть связана не только с микоцинами и микроцинами, необходимо различать губительный эффект. Во многих случаях антимикробная активность дрожжей обусловлена изменениями значений рН в среде из-за продукции органических кислот, избирательного поглощения ионов, выделения феромонов.

Таким образом, антагонистическая активность, проявляемая дрожжами, в отношении родственных и не родственных родов может быть обусловлена белками, гликопротеинами и низкомолекулярными гл ико липи дами.

Глава 2.3. Современное представление о механизме действия киллерных токсинов (микоцинов)

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ожован, Ирина Михайловна

5. Выводы

1. Выявлено, что наиболее антагонистически активными являются штаммы С. albicans № 927, к которому чувствительны 61,1% изученных дрожжевых культур, и М. furfur № 607, к которому чувствительны 90% изученных дрожжевых культур.

2. Установлено, что чувствительность к метаболитам М. furfur убывает в ряду: Cryptococcus — Trichosporon — Rhodotorula — Malassezia — Candida - Geotrichum, тогда как чувствительность к метаболитам С. albicans убывает в ряду: Cryptococcus - Trichosporon - Malassezia — Rhodotorula -Geotrichum.

3. Установлено, что киллерная активность дрожжей М. furfur представлена комплексом, состоящим из термостабильной, нечувствительной к протеиназе гликолипидной и термолабильной и чувствительной к протеиназе белковой (33 кДа и 35 кДа) частей. Гликолипидная часть более активна против наиболее родственных видов дрожжей, особенно Malassezia, а белковая часть более активна против далеких в родственном отношении микроорганизмов. Эффект воздействия зависит от времени и дозы.

4. Киллерная активность дрожжей С. albicans представлена термолабильными и чувствительными к протеиназе белками с молекулярными массами 118 к Да и 130 к Да, которые оказывают дозозависимое воздействие на чувствительные клетки дрожжей.

6. Выявлено, что при одновременном заселении экспериментальной экосистемы дрожжами С. albicans и М. furfur, они испытывают взаимное фунгистатическое воздействие.

7. Разработана модификация метода оценки цитоплазматической мембраны клеток, которая может быть использована в случаях, когда невозможно точно подсчитать количество живых и мертвых клеток в исследуемом образце.

4. Заключение

Обнаружение учеными Makower и Bevan [Bevan Е.А. et al., 1963] в 1963 году феномена киллерной активности среди дрожжей стало началом множества открытий в области микробиологии. К настоящему времени показано, что данное явление широко распространено среди различных таксонов дрожжевых организмов (таблица 1). В России исследования в этой области полностью сосредоточены на дрожжах, распространенных в природе, и практически отсутствуют работы по киллерной активности у клинически значимых дрожжей. Необходимость проведения исследований по изучению киллерных токсинов (микоцинов), выделяемых клинически значимыми дрожжами, очевидна.

В качестве главных объектов изучения киллерной активности нами были выбраны дрожжи родов Candida и Malassezia. Такой выбор обусловлен следующим рядом факторов. Дрожжи рода Candida относятся к компонентам нормальной микрофлоры человека, то есть постоянно обитают в теле здоровых людей [Kurtzman С.Р. et al., 1998; Дьяков Ю.Т. с соавт., 2003]. Важной особенностью этих дрожжей является их способность к росту при температуре 37 °С, то есть при температуре человека. Дрожжи рода Candida встречаются в норме (единичные клетки) в кишечном и вагинальном трактах. Массовое развитие дрожжей Candida в теле человека, обусловленное снижением иммунитета, приводит к различным кандидамикозам. Данные об антагонизме, в частности киллерной активности, у Candida мало представлены в литературе [Philliskirk and Young, 1975].

Дрожжи рода Malassezia являются облигатными симбионтами человека, обитающими на поверхности кожи и на волосистой поверхности головы здоровых людей, причем плотность заселения кожи этими дрожжами коррелирует с количеством выделяемого сального секрета [Ahearn D.G., Simmons R.B., 1998; Арзуманян В.Г. и др., 1998]. Однако при различных нарушениях иммунной системы данные дрожжи могут вызывать различные заболевания кожи: как себорейный дерматит, фолликулит, пестрый лишай и даже некоторые системные заболевания у иммунокомпрометированных носителей [Lee К.Н. et al., 1989; Inamadar А.С., Palit A., 2003].

В процессе изучения колонизации кожи здоровых людей различными видами Malassezia нами было обнаружено, что у 3 из 32 человек видовой состав этих дрожжей изменился в течение двух лет. Исходный вид М. globosa был заменен на М. sympodialis. Причем новая культура обладала большей скоростью роста по сравнению с предыдущей. Очевидно, что формирование микробного пейзажа человека в норме и патологии зависит как от состояния макроорганизма, так и от свойств микроорганизмов. Мы предположили, что определенные виды или штаммы Malassezia могут продуцировать факторы, имеющие антагонистическую активность по отношению к прочим видам/ родам дрожжей.

На сегодняшний день нами удалось обнаружить лишь одну публикацию, касающуюся антагонистических метаболитов Malassezia (Pityrosporum ovale) в отношении прочих родов грибов [Weary РЕ., 1967]. Неизвестное секретируемое вещество было активно против дерматофитов: Trichophyton rubrum, Т. schoenleini и Microsporum canis.

На основании вышеизложенного возникла необходимость изучения, киллерной активности у дрожжей Candida albicans и Malassezia spp.

Для проведения данного исследования нами были использованы, несколько методов оценки киллерной активности. Мы не стали использовать метод зон ингибиции [Stumm et al., 1977; Young T.W. et al., 1978], так как он является скорее качественным, чем количественным методом. Кроме того критическим фактором, от которого зависит обнаружение киллерной активности, является соотношение клеток чувствительного и киллерного штамма. Как при обильном засеве чувствительного штамма, так и при малом инокуляте штамма-киллера, зоны подавления роста очень узкие, быстро зарастают или вообще не образуются.

Один из использованных нами методов заключался в оценке жизнеспособности культур, выращиваемых на плотной среде, на которой предварительно культивировали антагонистические штаммы [Арзуманян В.Г., 2005]. Для этого культивировали активные штаммы дрожжей на агаризованной среде, затем агар переворачивали и на обратную сторону засевали испытуемую культуру.

Другой метод по Курцвейловой [Kurzweilova Н. et al, 1993] позволял не только оценить киллерную активность, но и определить порообразуещее действие киллерного токсина. Данный метод основан на обработке испытуемых культур ККЖ, полученной в результате культивирования активного штамма и последующем окрашивании клеток красителем ВСР, который проникает через образовавшиеся поры в ЦПМ. При микроскопировании подсчитывали количество живых/мертвых клеток.

В процессе работы оказалось, что данный метод может быть модифицирован для ряда случаев, когда не представляется возможным подсчитать количество живых и мертвых клеток. Данные, полученные с помощью модифицированного метода, вполне согласуются с результатами других экспериментов. Преимущества данного метода - простота и скорость исполнения, в то время как в традиционных методах необходимо специальное оборудование (флуоресцентный микроскоп, проточный цитофлюориметр, обеспечивающий компьютерный анализ данных).

Работая с коллекцией штаммов Malassezia, полученных от здоровых людей и пациентов с атопическим дерматитом, мы имели возможность оценить киллерную активность этих культур по отношению друг к другу. Для этого мы использовали метод определения активности на плотной среде [Арзуманян В.Г., 2005].

Оказалось, что наиболее активным и наименее чувствительным явился изолят М. furfur № 607 (таблица 7). Из всего набора культур 90% были чувствительны к данному изоляту, более того, ни одна из культур не проявила киллерную активность по отношению к М. furfur № 607. Наименее активным и наиболее чувствительным явился штамм М. globosa № 9.

Для последующих экспериментов нами был выбран наиболее активный штамм - М. furfur № 607. С помощью того же метода («перевернутый агар») оценили киллерную активность данной культуры в отношении коллекционных штаммов дрожжей С. albicans, Rhodotorula spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Geotrichum spp. Оказалось, что испытуемая культура воздействовала фунгистатически на штаммы культур С. albicans, так как лишь частично подавляла рост дрожжей (таблица 8). В случае с базидиомицетными и другими аскомицетными дрожжами киллерная активность была более явной (рисунки 3, 4). Нами отмечено фунгицидное действие метаболитов, выделенных культурой М. furfur № 607 (таблица 9), на штаммы Trichosporon № 18, Geotrichum № 1206, Ciyptococcus № 975.

С целью определения термочувствительности проводили термообработку агара, на котором рос исследуемый самый активный штамм М. furfur № 607. Практически во всех случаях эта процедура приводила к снижению антагонистической активности метаболитов, что может свидетельствовать о частичной термолабильности активных веществ. Так как активность метаболитов после термообработки менялась в разной степени, можно предположить, что киллерная активность, возможно, представлена белоксодержащим веществом и гликолипидом.

Антагонистическую активность самой активной культуры М. furfur Лг° 607 оценивали также другим методом в жидкой среде к выбранным в первой серии экспериментов наиболее чувствительным культурам дрожжей. Метод заключался в обработке клеток культуральной жидкостью, полученной в результате культивирования активного штамма на синтетической среде, содержащей Твин 40, бычью желчь и аспарагин [Арзуманян В.Г., 1999]. Далее клетки обрабатывали красителем ВСР и подсчитывали процент окрашенных (убитых) клеток (рисунок 6). В результате экспериментов оказалось, что чувствительность к метаболитам М. furfur № 607 убывала в ряду

Cryptococcus

Rhodotorula —

Trichosporon —

Malassezia —

Candida —

Geotrichum

Наибольшую чувствительность из испытуемых культур показали базидиомицетные дрожжи Cr. albidus № 220 и R. mucilaginosa N9 132 (рисунок 7). Таким образом, данные по антагонистической активности, полученные в экспериментах на жидких и твердых средах, согласуются между собой: базидиомицетные дрожжи более чувствительны к метаболитам М. furfur № 607, чем аскомицетные. Учитывая количество видов дрожжей, среди которых найдены чувствительные штаммы, спектр действия токсинов Malassezia достаточно широк, как в случае других дрожжей-несахаромицетов: Hansenula, Candida, Kluyveromyces и другие [Buzzini P., Martini A., 2001; Vadkertiova R., Slavikova E., 1995, 2007].

Для некоторых штаммов изучаемых дрожжей были оценены характеристики антагонистических субстанций. Установлено, что активная субстанция, выделяемая М. furfur № 607 проявляла дозозависимый эффект в отношении чувствительного штамма Cr. albidus № 975. В эксперименте прослеживалась обратная корреляция между процентом живых клеток в суспензии дрожжей и концентрацией культуральной жидкости (рисунок 11).

Кроме того определяли устойчивость антагонистически активной субстанции к воздействию высокой температуры и протеиназы в опыте на чувствительной культуре М. globosa № 9 (таблица 11). Удалось установить, что активное вещество является термолабильным и чувствительным к протеиназе.

Изучение концентрата культуральной жидкости также проводили с помощью методов ВЭЖХ и гель-электрофореза (рисунки 12 и 13). Для этого ККЖ предварительно разделяли на липидную и водную фазы путем экстракции культуральной жидкости смесью хлороформ:н-бутанол. Методом ВЭЖХ удалось обнаружить три белка в водной фазе и два в липидной. Методом электрофореза показано наличие, по меньшей мере, двух белков с молекулярными массами около 33 кДа и 35 кДа, выделяемых М. furfur № 607. При этом подобные белковые компоненты не были обнаружены в водорастворимой фазе метаболитов, выделенных неактивной культурой М. sympodialis № 6. Чувствительность киллерного токсина М. furfur N2 607 к воздействию высокой температуры и протеиназы, электрофоретическая подвижность токсина свидетельствуют о том, что он, подобно киллер-токсинам ряда других дрожжей [Goto et al., 1990; Golubev W.I. et al., 2006; Golubev W.I., 1998], является белоксодержащей субстанцией.

При оценке антагонистической активности двух фаз в отношении наиболее чувствительных культур (таблица 12) оказалось, что гликолипидная часть антагонистического комплекса эффективна против более родственных базидиомицетов, тогда как белки из водной фазы метаболита в основном эффективны против более далеких в родственном отношении организмов.

Из данных литературы известно, что киллерная активность дрожжей может быть генетически детерминирована вирусоподобными частицами dsPHK [Толсторуков И.И. с соавт., 1989; Berry Е.А. et al., 1972], плазмидами [Tipper D.J., 1984, Wilson С., 1989; Paluszynski J.P. et al., 2007]. Но в ряде случаев она ассоциирована с хромосомами [Голубев В.И. с соавт., 1988] или митохондриальным геномом [Наумов Г.И., 1985; Наумов Г.И. с соавт., 2009] (таблица 2). С целью установления генетической детерминации изученной активности было проведен анализ плазмид методом пульс-электрофореза в агарозном геле (рисунок 14). Наблюдалась обратная корреляция между наличием плазмид и киллерной активностью среди различных штаммов. Плазмиды обнаружены у наименее активных штаммов М. sympodialis № 6 и М. globosa № 9. Отсутствие, согласно данным электрофоретического анализа, плазмид у штаммов-киллеров Malassezia позволяет сделать вывод, что киллерная активность у Malassezia детерминирована, в отличие от многих изученных дрожжей, вероятнее всего, хромосомными генами.

Антагонистическую активность 11 штаммов дрожжей рода Candida изучали на 18 штаммах аскомицетных и базидиомицетных дрожжей с помощью двух вышеупомянутых методов. Эксперименты на «перевернутом агаре» показали, что все штаммы С. albicans обладали различной антагонистической активностью по отношению к испытуемым культурам (таблица 10).

Наиболее активным явился штамм С. albicans № 927. Чувствительность к метаболитам убывала в ряду

Cryptococcus —

Trichosporon —

Rhodotorula —

Malassezia —

Geotrichum — Candida

Это не совсем согласуется с устоявшимся представлением о большей активности микоцинов в отношении дрожжей более близкого аффинитета [Golubev W.I., 1998].

Наиболее активный штамм С. albicans №927 использовали далее для изучения антагонистической активности в жидкой среде на 3 штаммах Malassezia (рисунок 9). Установлено, что все 3 штамма были чувствительны к ККЖ С. albicans (рисунок 8), что согласуется с результатами в экспериментах на «перевернутом агаре».

Свойства антагонистической субстанции, выделяемой С. albicans, были изучены различными методами. Показано, что ККЖ обладал дозозависимым эффектом: в экспериментах оценки чувствительности штамма М. globosa № 9, прослеживалась обратная корреляция между процентом живых клеток и концентрацией ККЖ (рисунок 15). Изучаемую субстанцию проверяли также на устойчивость к воздействию высокой температуры и протеиназы. Оказалось, что после термообработки и воздействия протеиназы К антагонистическая активность ККЖ значительно снижалась (таблица 13). Термолабильность ККЖ, подобно киллерному токсину Malassezia и токсинам ряда других дрожжей [Goto et al., 1990; Golubev W.I. et al., 2006; Golubev W.I., 1998], является аргументом в пользу белковой природы антагонистической субстанции у С. albicans.

Кроме того, электрофоретическое разделение метаболитов показало наличие белковых компонентов (рисунок 16) с молекулярными массами 118 кДа и 130 кДа.

Поскольку дрожжи родов Candida и Malassezia зачастую обитают в одной и той же экосистеме - на коже, не исключена ситуация, когда штаммы этих родов могут конкурировать между собой. Моделирование такой ситуации должно позволить оценить взаимное влияние этих дрожжей. С этой целью был проведен эксперимент, при котором наиболее активные в антагонистическом отношении штаммы С. albicans № 927 и М. furfur № 607 одновременно засевали по обе стороны агаровой пластины в равном количестве КОЕ. Оказалось, что С. albicans на несколько часов опережала рост культуры М. furfur. Однако в итоге по обилию колоний культуры не отличались, но размеры колоний у обоих штаммов были значительно меньше, чем в контроле (рисунок 10). Таким образом, очевидно, что данные микроорганизмы испытывали взаимное фунгистатическое воздействие.

Логическим продолжением работ, связанных с изучением свойств киллерных токсинов у клинически значимых дрожжей может явиться:

• создание препаратов, содержащих киллерные токсины активных штаммов, для лечения кожных заболеваний, ассоциированных с грибковыми инфекциями;

• использование киллерных субстанций в качестве антигенов для иммунизации лабораторных животных с последующим получением антиидиотипических антител и их оценкой в качестве кандидатов грибных вакцин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ожован, Ирина Михайловна, Москва

1. Анкирская А. С. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. 3. № 2.

2. Арзуманян В.Г., Мокроносова М.А., Гервазиева В.Б. Дрожжеподобные грибы рода Malassezia (Pityrosporum). Вестник РАМН. 1998. 5: 44-47.

3. Арзуманян В.Г. Синтетические среды для культивирования дрожжей Malassezia (Pityrosporum). Вестник РАМН. 1999. 11: 54-56.

4. Арзуманян В.Г., Магаршак О.О., Семенов Б.Ф. Дрожжеподобные грибы у пациентов с аллергическими заболеваниями: видовое разнообразие и чувствительность к противогрибковым препаратам. Бюл. Эсперимент. Биол. Мед. 2000. 6: 704-708.

5. Арзуманян В.Г. Грибы Malassezia на коже здоровых людей и больных атопическим дерматитом. Вестник РАМН. 2001. 2: 29-31.

6. Арзуманян В.Г., Зайцева Е.В., Кабаева Т.Н., Темпер P.M. Оценка стафилококковой и нелипофильной дрожжевой микрофлоры кожи у больных с кожной патологией при контактном способе посева. Вестник дерматологии и венерологии. 2004. 6:

7. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А. и др. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма на примере пробиотических культур и оппуртунистических дрожжей. Клиническая лабораторная диагностика. 2005. 5: 53-55.

8. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. М. Пищевой промышл., 1979. 52с.

9. Ю.Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. Учеб. пособие. Электр. Версия. 2005.

10. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. М. Медицина. 2003. 136с.

11. Блинкова Л.П., Альтшулер М.Л., Дорофеева Е.С., Горобец О.Б. Молекулярные основы продукции и действия бактериоцинов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2007. 2: 97-104.

12. Голубев В.И., Циоменко А.Б., Тихомирова Л.П. Не содержащие плазмид штаммы-киллеры дрожжей Sporidiobolus paravosevs. Микробиология. 1988. 58: 99-103.

13. М.Голубев В.И., Чуркина Л.Г. Широкое распространение штаммов-убийц у дрожжей Rhodotorula mucilaginosa (Jorgensen) Harrison. Известия Академии наук СССР. Серия биологическая. 1990. 6: 854-861.

14. Голубев В.И. Спектр действия киллер-токсинов Rhodotorula glutinis и его таксономическое значение. Микробиология. 1989. 58(1): 99-103.

15. Голубев В.И., Кулаковская Т.В., Голубева Е.В. Pseudozyma fusiformata ВКМ Y- 2821 продуцент антифунгального гликолипида. Микробиология. 2001.

16. Голубев В.И., Кулаковская Т.В., Шашков А.С., Кулаковская Е.В., Голубева Е.В. Антифунгальный целлобиозолипид, секретируемый эпифитными дрожжами Pseudozyma graminicola. Микробиология. 2008. 77(2). 201-206.

17. Дьяков Ю.Т., Сергеев Ю.В. Новое в систематике и номенклатуре грибов. Нац. Академ. Микологии. 2003. 494с.

18. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. М.: изд-во МГУ. 1994. 512с.

19. Карамышева З.Н., Ксензенко В.Н., Голубев В.И., Ратнер Е.Н., Тихомирова Л.П. Характеристика вирусов микоциногенного штамма ВКМ Е-2700 дрожжей Cystojilobasidium bisporidii. Докл. РАН. 1993. 331(3): 376-378.

20. Кулаковская Е.В., Кулаковская Т.В., Голубев В.И., Шашков А.С., Грачев А.А., Нифантьев Н.Э. Фунгицидная активность целлобиозолипидов из культуральной жидкости дрожжей Cryptococcus humicola и Pseudozyma fusiformata. Биоорг. химия 2007. 33(1): 167-171.

21. Наумов Г.И., Тюрина JI.B., Бурьян Н.И., Наумова Т.И. Виноделие -экологическая ниша сахаромицетов-убийц типа К2. Биол. науки. Науч. докл. высшей школы. 1973. 7: 103-107.

22. Наумов Г.И. Сравнительная генетика дрожжей Сообщение XXI11. Необычное наследование токсинообразования у Saccharomycesparadoxus. Генетика. 1985.21(12): 1794-1798.

23. Наумов Г.И., Тюрина JI.B., Бурьян Н.И., Скорикова Т.К. Токсинообразование и состав производственных популяций дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биотехнология. 1986. 4: 28-34.

24. Наумов Г.И., Иванникова Ю.В., Наумова Е.С. Молекулярный полиморфизм вирусных dsPHK дрожжей Saccharomyces paradoxus. Молекулярная Генетика Микробиология и Вирусология. 2005. 1: 38-40.

25. Наумов Г.И., Иванникова Ю.В., Чернов И.Ю., Наумова Е.С. Природный полиморфизм плазмидных двунитевых РНК дрожжей Saccharomyces. Микробиология. 2009. 78(2): 242-247.

26. Нобл У.К. Микробиология кожи человека. Медицина. 1986.

27. Толсторуков И.И., Зимина М.С., Казанцева Д.И. Киллер-фактор К2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae М437 обладает широким видовым спектром действия. Биотехнология. 1989. 5(3): 295-302.

28. Aguiar С., Lucas С. Yeasts killer/sensitivity phenotypes and halotolerance. Food technol. Biotechnol. 2000. 38(1): 39-46.

29. Ahearn D.G., Simmons R.B. Malassezia Baillon. The yeasts, a taxonomic study. Ed. By Kurtsman C.P., Fell J.W. Elsevier. 1998. 782c.

30. Bamett J.A., Payne R.W., Yarrow D.: Yeast identification PC Program version 4. 1996.

31. Bashford C.L., Smith J.C. The use of optical probes to monitor membrane potencial. Meth. Enzymol. 1979. 55: 569-586.

32. Berry E.A.,Bevan E.A. A new species of double-stranded RNA from yeast. Nature (London). 1972. 239: 279-280.

33. Bevan E.A., Makower. The physiological basis of the killer character in yeast. In: Geerts SJ (ed.). Genetics today, Xith Int Congr Cenet vol. 1. Pergamon Press, Oxford. 1963. 202-203.

34. Bevan E.A., Herring A.J., Mitchell D.J. Preliminary characterization of two species of dsRNA in yeast and their relationship to the killer character. Nature (Lond). 1973. 245:81-86.

35. Boekout Т., Foncesca A., Sampaio J.P., Golubev W.I. Classification of heterobasidiomycetous yeasts: characteristics and affiliation of genera to higher taxa of Heterobasidiomycetes. Can. J. Microbiol. 1993. 39: 276-290.

36. Bostain K.A., Sturgeon A., Tipper D.J. Encapsidation of yeast killer double-stranded ribonucleic acids: dependence of M on L. J. Bacteriol. 1980. 143: 463-470.

37. Breinig F., Tipper D.J., Schmitt M.J. Krelp, the plasma membrane receptor or the yeast K1 viral toxin. Cell. 2002. 108: 395-405.

38. Breinig F., Sendzik Т., Eisfeld K., Schmitt M.J. Dissecting toxin immunity in virus-infected killer yeast uncovers an intrinsic strategy of self-protection. PNAS. 2006. 103(10): 3810-3815.

39. Broberg A. Pityrosporum Ovale in healthy children, infantile seborrheic dermatitis and atopic dermatitis. Acta Dermat. Venerol. 1994. 2-47.

40. Bussey H. Effects of the yeast killer factor on sensitive cells. Nature New Biol. 1972. 235: 73-75.

41. Bussey H., D. Saville, K. Hutchins. Binding of yeast killer toxin to a cell wall receptor on sensitive Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 1979. 140: 888892.

42. Bussey H. K1 killer toxin, a pore-forming protein from yeast. Mol. Microbiol. 1991. 5: 2339-2343.

43. Butler A.R., J.H. White, Y. Folawiyo, A. Edlin, D. Gardiner, M.J.R. Stark. Two Saccharomyces cerevisiae genes which control sensitivity to G1 arrest induced by Kluyveromyces lactis toxin. Mol. Cell. Biol. 1994. 14: 63066316.

44. Buzzini P., Martini A. Biodiversity of killer activity in yeasts isolated from the Brazilian rain forest. Can. J Microbiol. 2000. 46(7): 607-611.

45. Buzzini P., Martini A. Discrimination between Candida albicans and other pathogenic species of the genus Candida by their differential sensitivities to toxins of a panel of killer yeasts. J. Clinic. Microb. 2001. 39(9): 3362-3364.

46. Buzzini P., Martini A. Large-scale screening of selected Candida maltosa, Debaryomyces hansenii and Pichia anomala killer toxin toxin activity against pathogenic yeasts. Med. Mycol. 2001. 39(6): 479-482.

47. Cenci E, Bistoni F, Mencacci A. A synthetic peptide as a novel anticryptococcal agent. Cell Microbiol. 2004. 6: 953-61.

48. Chandra J.P., Cheryl M., Judy V.O. et al. Phenotypic expression of Kluyveromyces lactis killer toxin against Saccharomyces spp. Appl and Envir Microbiol. 1985. 50(2): 257-260.

49. Comitini F., Di Pietro N., Zacchi L., Mannazzu I., Ciani M. Kluyveromyces phqffii killer toxin active against wine spoilage yeasts: purification and characterization. Microbiology. 2004. 150(8): 2535-2541.

50. Conti S., Fanti F., Magliani W., Gerloni M., Bertolotti D., Salati A., Cassone A., Polonelli L. Mycobactericidal activity of human natural, monoclonal, and recombinant yeast killer toxin-like antibodies. J Infect Dis. 1998. 177(3): 807-811.

51. Douglas C.M., Sturley S.L., Bostian K.A. Role of protein processing, intracellular trafficking and endocytosis in prodaction of and immunity to yeast killer toxin. Eur J.Epidemiol. 1988. 4: 400-408.

52. Faergemann J. Experimental tinea versicolor in rabbits and humans with Pityrosporum orbicidare. The Journal of Investigative Dermatology. 1979. 72. 1:326-329.

53. Faergemann J. Pityrosporum Infections. J. American Acad. Derm. 1994. 31: 18-20.

54. Faergemann J., Fredriksson T. Age incidence of Pityrosporum orbiculare on human skin. Acta Dermato-Venerologica. 1980. 60: 531-533.

55. Fiori P.L., Mattana A., Dessi D., Conti S., Magliani W., Polonelli L. In vitro acanthamoebicidal activity of a killer monoclonal antibody and a synthetic peptide. J Antimicrob Chemother. 2006. 57(5): 891-898.

56. Golubev W.I., Tsiomenko A.B., Tichomirova L.P. Plasmid-free killer strains of the yeast Sporidiobolus paravosevs. Microbiologia. 1988. 58: 99-103.

57. Golubev W.I. The action spectrum of killer toxins produced by Rhodotorula glutinis and its taxonomic significance. Microbiologia. 1989. 58: 99-103.

58. Golubev W., Shabalin Y. Microcin production by the yeast Cryptococcus humicola. FEMS Microbiol. Letters. 1994. 119: 105-110.

59. Golubev W.I., Nakase T. Micocinogeny in the genus Bullera: taxonomic specificity of sensitivity to the mycocin produced by Bullera sinensis. FEMS Microbiol Letters. 1997. 146: 59-64.

60. Golubev W.I. Killer activity of Tilletiopsis albenscens Gohkale: Taxonomic and phylogenetic implication. Syst Appl Microbiol. 1998. 21: 429-432.

61. Golubev W.I. Micocins (Killer toxins). In: Kurtzman C.P., Fell J.W. (ed.). The Yeast. A Taxonomic study. Elsevier. 1998. 55-62.

62. Golubev W.I., Pfeiffer I., Golubeva E.W. Micocin production in Pseudozyma tsukubaensis. Mycopathologia. 2006. 162(4): 313-316.

63. Goto K.5 Iwase Y., Kitano K. Isolation and properties of a chromosome-dependent KHR killer toxin in Saccharomyces cerevisiae. Agric.Biol.Chem. 1990. 54: 505-509.

64. Javadekar V.S., SivaRaman H, Gokhale D.V. Industrial yeast strain improvement: construction of a highly flocculent yeast with a killer character by protoplast fusion. J Indust Microbiol. 1995. 15: 94-102.

65. Hayman G.T., Bolen P.L. Linear DNA plasmids of Pichia inositovora are associated with a novel killer toxin activity. Curr. Genet. 1991. 19: 389-393.

66. Hodgson V.J., Button D. and Walker G.M. Anti-Candida activity of a novel killer toxin from the yeast Williopsis mrakii. Microbiology 1995. 141: 20032012.

67. Holmes A.R., Cannon R.D. Shepherd M.G. Effect of calcium ion uptake on Candida albicans morphology. FEMS Microbiol Lett. 1991. 77: 187-194.

68. Javadekar V.S., SivaRaman H., Gokhale D.V. Industrial yeast strain improvement: construction of a highly flocculent yeast with a killer character by protoplast fusion. J.Ind.Microbiol. 1995. 15: 94-102.

69. Johnston J.R., Mortimer R.K. Electrophoretic karyotyping of laboratory and commercial strains of Saccharomyces and other yeast. Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. 36: 569-572.

70. Kagan B.L. Mode of action of yeast killer toxins: channel formation in lipid bilayers. Nature. 1983. 302: 709-711.

71. Kandel J.S., Stem T.A. Killer phenomenon in pathogenic yeast. Antimicrob. Agents And Chemotherapy. 1979.15(4): 568-571.

72. Keszthelyi A., Ohkusu M., Takeo K., Pfeiffer I., Litter J., Kucsera J. Characterization of the anticryptococcal effect of the FC-1 toxin produced by Filobasidium capsuligenum. Mycoses. 2006. 49(3):176-183.

73. Kitamoto H.K., Ohmomo S., Nakahara T. Selection of killer yeasts (Kluyveromyces lactis) to prevent aerobic deterioration in silage making. J Dairy Sci. 1993.76: 803-811.

74. Klassen R., Paluszynski J.P., Wemhoff S., Pfeiffer A., Fricke J., Meinhardt F. The primary target of the killer toxin from Pichia acaciae is tRNA(Gln). Mol Microbiol. 2008. 69(3): 681-697.

75. Koltin Y., P.R. Day. Specificity of Ustilago maydis killer proteins. Appl. Microbiol. 1975. 30: 694-696.

76. Konisky J. Colicins and other bacteriocins with established modes of action. Annu Rev Microbiol. 1982.36: 125-44.

77. Kulakovskaia E.V., Kulakovskaia T.V., Golubev W.I., Shashkov A.S., Grachev A.A., Nifantiev N.E. Fungicidal activity of cellobiose lipids from cultural fluid of yeast Cryptococcus humicola and Pseudozyma fusiformata. BiorgKhim. 2007. 33(1): 167-171.

78. Kurtz, M.B. New antifungal drug targets: A vision for the future. ASM News 1998. 64:31-39.

79. Kurtzman C.P. Pichia E.C. Hansen emened. Kurtzman. In: Kurtzman C.P., FellJ.W. (eds) The yeast, a taxonomic study, 4th edn. Elsevier, Amsterdam. 1998. 273-352.

80. Kurzweilova H., Sigler K. Fluorescent staining with bromocresol purple: a rapid method for determining yeast cell dead count developed as an assay of killer toxin activity. Yeast. 1993. 9: 1207-1211.

81. Laemmli U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. 227: 680-685.

82. Lachance M-A, Starmer W. T. Ecology and yeast. In: Kurtzman C.P., Fell J.W. (ed.). The Yeast. A Taxonomic study. Elsevier. 1998. 21-30.

83. Lee K.H., Kim Y.G., Bang D. Scanning electron microscopy of Malassezia furfur in tinea versicolor. Yonsei Med Journal. 1989. 30 (4): 334338.

84. Lowes K.F., Shearman C.A., Payne J., MacKenzie D., Archer D.B., Merry R.J., Gasson M.J. Prevention of yeast spoilage in feed and food by the yeast mycocine HMK. Appl Environ Microbiol. 2000. 66: 1066-1076.97.Lowry O.H., 1951

85. Magliani W., Conti S., Bernardis F. D. et al. Therapeutic potential of antiidiotype single chain antibodies with yeast killer toxin activity. Nature biotechnology. 1997. 15:155-158.

86. Magliani.W. Polonelli L. New immunotherapeutic strategies to control vaginal candidasis. Trends in Molecular Medicine. 2002. 8(3): 121-126.

87. Magliani W., Conti S., Frazzi R., Ravanetti L., Maffei D.L., Polonelli L. Protective antifungal yeast killer toxin-like antibodies. Current Molecular Medicine. 2005. 5(4): 443-452.

88. Magliani W., Conti S., Travassos L.R., Polonelli L. From yeast killer toxins to antibiobodies and beyond. FEMS Microbiol Lett. 2008. 9.

89. Marquina D., Santos A., Peinado J.M. Biology of killer yeasts. Int. Microbiol. 2002. 5: 65-71.

90. Martinae В., Zhu H., Kubalski A., Zhou X., Culbertson M., Bussey H. and ICing C. Yeast K1 killer toxin forms ion channels in sensitive yeast spheroplasts and in artificial liposomes. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1990. 87: 6228-6232.

91. Mayser P., Tows A., Kramer H.-J., WeiB R. Further characterization of pigment-producing Malassezia strains. Mycoses 2004. 47 (1-2): 34-39.

92. Merril C.R., Switzer R.C., Van Keuren M.L. Trace polypeptides in cellular extracts and human body fluids detected by two-dimensional electrophoresisand a highly sensitive silver stain. Proc Natl Acad Sci USA. 1979. 76: 43354339.

93. Middelbeek E.J., Hermans J.M.N., et al. High incidence of sensitivity to yeast killer toxin among Candida and Torulopsis isolates of human origin. Antimicrobial agents and Chemotherapy. 1980. 17(3): 350-354.

94. Mimee В., Labbe' C., Pelletier R. Antifungal activity of flocculosin, a novel glycolipid isolated from Pseudozyma flocculosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2005. 49(4): 1597-1599.

95. Morace G., Manzara S., Dettori G., Fanti F., Conti S., Campani L., Polonelli L., Chezzi C. Biotyping of bacterial isolates using the yeast killer system. Eur J Epidemiol. 1989. 5: 303-310.

96. Oakley-Gutowski K.M., Hawthorn D.B., Kavanagh Т.Е. Am. Soc. Brewing Chemists.1992. 50: 48-52.

97. Palfree R., H. Bussey. Yeast killer toxin: purification characterization of the toxin from Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 1979. 93: 487-493.

98. Palpacelli V., Ciani M., Rosini G. Activity of a different killer yeast on strains of yeast species undesirable in the food industry. FEMS Microbiol Lett. 1991. 84: 75-78.

99. Paluszynski J.P., Klassen R., Meinhardt F. Pichia acaciae Killer System: Genetic Analysis of Toxin Immunity. Appl Environm Microbiol. 2007. 73 (13): 4373-4378.

100. Park C.M., Bruenn J.A., Ganesa C., Flurkey W.F., Bozarth R.F. and Koltin Y. Structure and heterologous expression of the Ustilago maydis viral toxin KP4. Mol. Microbiol. 1994. 11: 155-164.

101. Petering J.E., Symons M.R., Langridge P., Henschke P.A. Determination of killer activity in fermenting grape juice by using a marked Saccharomyces wine yeast strain. Appl.Environ.Microbiol. 1991. 57: 3232-3236.

102. Pfeiffer P., Radler F., et al. Effect of a killer toxin of yeast on eucariotic systems. Appl. Envirom. Microbiol. 1988. 54(4): 1068-1069.

103. Pfeiffer I., Golubev W., Farkas Z., Kucsera J., Golubev N. Mycocin production in Cryptococcus aquaticus. Antonie van Leeuwenhoek. 2004. 86: 369-375.

104. Philliskirk G., Young T.W. The occurrence of killer character in yeasts of various genera. Antonie Leeuwenhoek J Microbiol Serol. 1975. 41: 147-151.

105. Polonelli L., G. Morace. Reevaluation of the yeast killer phenomenon. J. Clin. Microbiol. 1986. 24:866-869.

106. Polonelli L., Conti S., Gerloni M. Antibiobodies: antibiotic-like antiidiotypic antibodies. J Med Vet Mycol. 1991. 29: 235-242.

107. Polonelli L., Conti S., Gerloni M., Morace G., Menozzi M.G., Cailliez J.C. Conceptions and perspectives of the yeast killer phenomenon. J de Мус Med 1(4). 1991.284-295.

108. Polonelli L., Conti S., Gerloni M., Morace G., Menozzi M.G., Cailliez J.C. Potential of the yeast killer phenomenon. Revista Iberoamericana de Micologia. 1992. 9 (1): 23-27.

109. Polonelli L., De Bernadis F., Conti S., Boccanera M., Magliani W., Gerloni M., Cantelli C., Cassone A. Human natural yeast killer toxin-like candidacidal antibodies. J Immunol. 1996. 156(5): 1880-1885.

110. Polonelli L, Ponto'n J, Elguezabal N, Moragues MD, Casoli C. Antibody Complementarity-Determining Regions (CDRs) can display differential antimicrobial, antiviral and antitumor activities. PLoS ONE. 2008. 3(6): 2371.

111. Puhalla J.E. Compatibility reaction on solid medium and interstrain inhibition in Ustilago maydis. Genetika. 1985. 60: 461-474.

112. Purcell A.W., McCluskey J., Rossjohn J. More than one reason to rethink the use of peptides in vaccine design. Nat Rev Drug Discov. 2007. 6:404414.

113. Quackenbush R.C., Shields A.F. Local re-utilization of thymidine in normal mouse tissues as measured with iododeoxyuridine. Cell Tissue Kinet. 1988. 21(6): 381-7.

114. Reiter J., Herker E., Madeo F., Schmitt MJ. Viral killer toxins induce caspase-mediated apoptosis in yeast. J Cell Biol. 2005. 168(3): 353-358.

115. Rosini G., Cantini. Canadian J. Microbiol. 1987. 29: 1462-1464.

116. Santos A., Marquina D. Ion channel activity by Pichia membranifaciens killer toxin. Yeast. 2004. 21(2): 151-162.

117. Santos A., Marquina D. Killer toxin of Pichia membranifaciens and its possible use as a biocontrol agent against grey mould disease of grapevine. Microbiol. 2004. 150: 2527-2534.

118. Savoia D., Avanzini C., Conti S. In vitro leishmanicidal activity of a monoclonal antibody mimicking a yeast killer toxin. J Eukaryot Microbiol. 2002.49:319-323.

119. Sawant A.D., Ahearn D.G. Involvement of a cell wall receptor in the mode of action of an anti-candida toxin of Pichia anomala. Antimicrob. Agents and Chemotherapy. 1990. 34(7): 1331-1335

120. Schmitt M.J., Neuhausen F. Killer toxin-secreting double- stranded RNA mycoviruses in the yeasts Hanseniaspora uvarum and Zygosaccharomyces bailii. J. Virol. 1994. 68: 1765-1772.

121. Schmitt M. J. Cloning and expression of a cDNA copy of the viral K28 killer toxin gene in yeast. Mol Gen Genet. 1995. 246: 236-246.

122. Schmitt M.J., Poravou O., Trenz K. and Rehfeldt K. Unique double-stranded RNAs responsible for the anti-Candida activity of the yeast Hanseniaspora uvarum. J. Virol. 1997. 71: 8852-8855.

123. Schmitt M. J., Breinig F. The viral killer system yeast: from molecular biology to application. FEMS Microbiol Rev. 2002. 26: 257-276.

124. Schmitt M. J., Breinig F. Yeast viral killer toxins: lethality and self-protection. Nat Rev Microbiol. 2006. 4(3): 212-221.

125. Seebacher S., Hubner U., Blaschke-Hellmessen R. Vergleichende untersuchungen zum vorkommen von sprobpilsen auf gesunder und krankhaft veranderter haut. Mycosen 1971;14:8:371-383.

126. Seguy N., Polonelli L., Doi-Cas E., Cailliez J.C. Effect of a killer toxins of Pichia anomala to Pneumocystis: perspectives in the control of pneumocystosis. FEMS Immunol Med Microbiol. 1998. 22: 145-149.

127. Selitrennikoff C.P. Antifungal proteins. Appl. Environ. Microbiol. 2001. 67: 2883-2894.

128. Snyder C., Seguy N., Lafitte S. et al. Production of anti-toxin antibodies by immunization with Pichia killer toxin-like antiidiotypic monoclonal antibodies. J. Eukaryot. Microbiol. 1999. 46(5): 138.

129. Spacek R., Vondrejs V. Rapid method for estimation of killer toxin activity in yeasts. Biotechnol. Lett. 1986. 8: 701-706.

130. Sriprakash K.S., Clark-Walker G.D., McArthur C.R. Location of transcriptional control signals and transfer RNA sequences in Torulopsis giabrata mitochondrial DNA. EMBO J. 1985. 4(2): 465-73.

131. Stark M.J.R., Boyd A., Milecham A.J., Romanos M.A. The plasmid-encoded killer system of Kluyveromyces lactis: a review. Yeast. 1990. 6: 129.

132. Starmer W.T., Ganter P.F., Aberdeen V. The ecological role of killer yeasts in natural communities of yeasts. Can J Microbiol. 1987. 33: 783-796.

133. Stumm C., Middlebeek E.J., de Vries G.J.M. Killer-sensitive relationships in yeast from natural habitats. Antonie Leeuwenhoek J Microbiol Serol. 1977. 43: 125-128.

134. Suzuki C., Nikkuni S. The primary and subunit structure of a novel type killer toxin produced by a halotolerant yeast, Pichia farinosa. J. Biol. Chem. 1994. 269: 3041-3046.

135. Tipper D. J., Bostian K. A. Double-stranded ribonucleic acid killer system in yeasts. Microbiol. Rev. 1984. 48(2): 125-156.

136. Tipper D. J. and Schmitt M. J. Yeast dsRNA viruses: replication and killer phenotypes. Mol. Microbiol. 1991. 5: 2331-2338.

137. Travassos L.R., Silva L.S., Rodrigues E.G., Conti S., Salati A. Therapeutic activity of a killer peptide against experimental paracoccidioidomycosis. J Antimicrob Chemother. 2004. 54: 956-958

138. Vadkertiova R., Slavikova E. Killer activity of yeasts isolated from the water environment. Pol J Microbiol. 1995. 41(9): 759-766.

139. Vadkertiova R., Slavikova E. Killer activity of yeasts isolated from natural environments against some medically important Candida species. Pol J Microbiol. 2007. 56(1): 39-43.

140. Vondrejs V., Palkova Z., Sulo P. Application of killer systems in yeasts to selection techniques. Vol. 1. In: Cheremisinoff PN, Ferrante LM (ed.) Biotechnology current progress. Technomic Publishing, Lancaster. 1991. 227.

141. Vondrejs V., Janderova В., Valasek L. Yeast killer K1 and its exploitation in genetic manipulations. Folia Microbiol. 1996. 41: 379-394.

142. Vondrejs V., Palkova Z. Chemical warfare among the yeasts: the "killer" phenomenon, genetics and applications. In: J.F.T. Spencer, D. M. Spencer (ed.) Yeasts in Natural and Artificial Habitats. 1997. 155-170.

143. Yamamoto Т., Hiratani Т., Hirata H., Imai M., Yamaguchi H. Killer toxin from Hansenula mrakii selectively inhibits cell wall synthesis in a sensitive yeast. FEBS Lett. 1986. 197(l-2):50-54.

144. Yarrow D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts. In: The Yeasts, a Taxonomic Study. Elsevier. Ed.by Kurtzman C.P., Fell J.W. 1998.77-100.

145. Yokomori Y., Akyama H., Shimizu K. Isolation of a wild Candida killer yeast with a novel killer property. Agric. Biol. Chem. 1988. 52: 2791-2796.

146. Young T.W., Yagui M. A comparison of the killer character in different yeasts and its classification. Antonie van Leeuwenhoek. 1978. 44: 59-77.

147. Young T.W. Killer yeasts. In: Rose A.H., Harrison J. S. L. (ed.). The Yeasts. Acad. Press. 1987. 2: 131.

148. Walker G.M., McLeod A.H., Hodson V.J. Interaction between killer yeasts and pathogenic fungi. FEMS Microbiol Lett. 1995. 127: 213-222.

149. Wang X., Chi Z., Yue L., Li J. Purification and characterization of killer toxin from a marine yeast Pichia anomala YF07b against the pathogenic yeast in crab. Curr Microbiol 2007. 55: 396^101.

150. Watanabe K., Sakai Y., Takezaki T. Bacterial interference in mixed infection in the rat bladder. J. Bacteriol. 1988. 174: 408-414.

151. Weary P.E., Canby C.M. Keratinolytic activity of Trichophyton schoenleini, Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes. J. Invest. Dermatol. 1967. 48(3): 240-8.

152. Wickner R.B. Double-stranded RNA virus replication and packaging. J. Biol. Chem. 1993. 268: 3797-3800.

153. Wickner R.B. Double-stranded RNA viruses of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev. 1996. 60: 250-265.

154. Wilson C., Whittaker P. A. Factors affecting activity and stability of the Kluyveromyces lactis killer toxin. Appl. Environ. Microbiol. 1989. 55(3): 695-699.

155. Woods DIR., Bevan E.A. Studies on the nature of the killer factor produced by iSaccharomyces cerevisiae. 1968. Heredity. 21: 121-130.

156. Worsham P.L., Bolen P.L. Killer toxin production in Pichia acaciae is associated with linear DNA plasmids. Curr.Genet. 1990. 18: 77-80.

157. Zargari A., Harfast В., Johansson S. Identification of allergerr components of the opportunistic yeast Pityrosporum Orbiculare by monoclonal antibodies. Allergy. 1994. 49: 50-56.

158. Zhu H., Bussey H. The K1 toxin of Saccharomyces cerevisiae kills spheroplasts of many yeasts species. Appl. Environ. Microbiol. 1989. 55: 2105-2107.

159. Zorg J.S., Radler F. Killer toxin producing strains of the yeasts Hanseniaspora uvarum and Pichia kluyveri. Arch.Microbiol. 1988. 149: 261267.

Информация о работе

Ожован, Ирина Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Киллерная активность клинически значимых дрожжей Malassezia и Candida albicans - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно