Влияние микробного фермента литиказы на развитие экспериментального кандидозного вагинита

Сачивкина, Надежда Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние микробного фермента литиказы на развитие экспериментального кандидозного вагинита
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние микробного фермента литиказы на развитие экспериментального кандидозного вагинита"

САЧИВКИНА Надежда Павловна

ВЛИЯНИЕ МИКРОБНОГО ФЕРМЕНТА ЛИТИКАЗЫ НА РАЗВИТИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО КАНДИДОЗНОГО

ВАГИНИТА

03.02.03-микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Москва-2010

004613824

Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов».

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук,

доцент Васильева Елена Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Волкова Рауза Асхатовна

доктор медицинских наук,

профессор Грубер Ирина Мироновна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский Государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова».

Защита диссертации состоится 24 ноября 2010 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г.Москва, ул.Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г.Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. б.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Среди микотических инфекций кандидоз занимает ведущее место. Особое значение эта патология приобретает в гинекологической практике: кандидозный вагинит (KB) составляет до 20-30% в структуре инфекций урогенитального тракта. Практически каждая вторая женщина за свою жизнь имеет хотя бы один эпизод КВ. Несмотря на то, что современная антимикотическая терапия достаточно эффективна в отношении острой инфекции, лечение хронического рецидивирующего KB не всегда является результативным. Проблема противорецидивной терапии осложняется ещё и тем, что при широком использовании препаратов азоловой группы возможно формирование устойчивости кандид к ним.

В этой связи возникает необходимость поиска альтернативных путей этиотропной терапии КВ. Возможным перспективным направлением такого поиска является изучение ферментов, воздействующих на дрожжеподобные грибы (ДПГ). Одним из них является литиказа, разрушающая маннопротеиновый комплекс - основной структурный элемент клеточной стенки ДПГ. Исходя из вышеизложенного, актуальным является изучение действия литиказы на вирулентность Candida albicans, что может служить основанием для использования указанного фермента в создании препарата, альтернативного существующим антимикотикам.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было оценить фермент литиказу, расщепляющий маннопротеиновый комплекс клеточной стенки Candida albicans, как основной элемент нового антимикотического препарата в комплексном лечении рецидивирующего кандидозного вагинита.

Поставленная цель достигалась путём последовательного решения следующих задач:

1. Выбор перспективного штамма - продуцента литиказы.

2. Отработка режима его культивирования и оптимизации получения фермента.

3. Отработка способа выделения, очистки литиказы и её стандартизации.

4. Оценка действия полученного фермента на клинические изоляты Candida albicans: определение литического действия, влияние на жизнеспособность ДПГ, адгезивные свойства, морфогенез, способность к фагоцитозу и продукцию ферментов агрессии - протеиназ.

5. Создание модели рецидивирующего KB на лабораторных животных.

6. Исследование действия литиказы на течение рецидивирующего KB у мышей.

Научная новизна. Предложена оригинальная модель рецидивирующего кандидозного вагинита, адекватная KB женщин. В опытах in vivo доказан терапевтический и противорецидивный эффект литиказы.

Определено фунгицидное и фунгистатическое действие литиказы.

Установлено, что возбудитель KB, подвергшийся действию литиказы, теряет способность адгезироваться на вагинальном эпителии, но остаётся способным коадгезироваться с лактобактериями. Кандиды, обработанные литиказой,

активнее фагоцитируются и становятся доступными действию лизосомных ферментов макрофагов.

Впервые было показано, что коммерческий препарат Контрикап ингибирует продукцию ферментов агрессии Candida albicans - аспартил-протеиназ, в результате чего переход ДПГ в мицелиальную форму не реализуется. А под действием литиказы происходит нарушение структуры клеточной стенки, что способствует образованию проростковых трубок без индукции протеиназ. Такой вариант морфогенеза не сопровождается повышением инвазивности.

Установленные факты позволяют считать рациональным включение в схему лечения KB литиказы и ингибиторов протеиназ.

Практическая значимость. Разработана технология получения литиказы из природного продуцента Cellulomonas cellulans АС-870. Предложенная схема выделения и очистки искомого продукта позволяет получить литиказу, превышающую по удельной активности современные коммерческие образцы. Полученный по предложенной технологии фермент может быть основой лечебного препарата, предназначенного для лечения KB и профилактике его рецидивов. Включение в схему лечения KB фермента, разрушающего маннопротеиновый комплекс клеточной стенки ДПГ и ингибитора протеиназ, можно рассматривать как альтернативу использования антимикотиков из группы азолов в случае развития к ним резистентности. Положения, выносимые на защиту.

1. Рецидивирующий кандидозный вагинит воспроизводится на лабораторной модели путём заражения мышей, предварительно обработанных антибиотиками и эстрадиолом, адаптированным штаммом С. albicans. Рецидив инфекции вызывается аналогичной повторной обработкой мышей, но без дополнительного их заражения.

2. На лабораторной модели рецидивирующего KB был продемонстрирован терапевтический эффект литиказы, заключавшийся в быстрой санации влагалища и отсутствии рецидива инфекции после попытки его индукции.

3. Выбран продуцент литиказы - Cellulomonas cellulans АС-870.

4. Разработана технология получения и очистки литиказы путём культивирования на сердечно-мозговом бульоне с добавлением пекарских дрожжей и последующим выделением искомого продукта с молекулярной массой в интервале 100-30 кД методом ультрафильтрации. Установлен терапевтический эффект литиказы за счёт частичной гибели популяции ДПГ в результате их лизиса, а также снижение адгезии оставшихся жизнеспособными кандид на вагинальном эпителии.

5. Доказано, что ДПГ, обработанные литиказой, сохраняют коадгезивные свойства в отношении лактобактерий, но становятся более доступными к действию фагоцитов.

6. Подтверждено, что ДПГ под действием литиказы, несмотря на активацию морфогенеза, не активируют ферменты агрессии - аспартил-протеиназы.

7. Разработан и рекомендуется к применению новый способ снижения патогенного потенциала С. albicans за счёт использования ингибитора аспартил-протеиназ, блокирующего переход ДПГ в мицелиальную форму. Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались:

- на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008);

- на Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009);

- на заседании кафедры микробиологии и вирусологии РУДЫ. Публикации: По теме диссертации опубликовано 6 работ. Из них 3 статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ, остальные - тезисы докладов на международных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 31 рисунок. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 180 источников из них 63 отечественных и 117 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для выбора продуцента литиказы использовали: штамм Micrococcus luteus №4698, полученный из музея живых культур ГИСК им. Тарасевича МЗ РФ; штамм Cellulomonas cellulans АС-870 из национальной коллекции микроорганизмов ФГУП ГОС НИИ Генетика; и 2 штамма Micrococcus luteus из коллекции кафедры микробиологии РУДН.

В качестве тест-объекта были выбраны 10 клинических изолятов ДПГ вида Candida albicans, выделенных у женщин с бессимптомной и манифестной формой кандидоза. Штамм Lactobacillus fermentum 90 TS-4(21) был получен Рожковой И.Ю. по признаку агглютинации с конконавалином А и вошел в национальную коллекцию микроорганизмов ФГУП ГОС НИИ Генетика.

Для культивирования микрококков использовали основные питательные среды МПБ, МПА, СМБ (сердечно-мозговой бульон), СМА (сердечно-мозговой агар), СМБ или СМА с добавлением убитых пекарских дрожжей с целью повышения продукции литиказы. ДПГ культивировали в зависимости от цели опыта на жидкой или плотной среде Сабуро с добавлением пенициллина или стрептомицина 100 ЕД/л. Лактобактерии выращивали на стандартной среде МРС в микроанаэростате с использованием GasPak Anaerobic System.

Фермент Lyticase 20000 ЕД («Sigma», Германия) взята нами как референс-препарат. В основных опытах использовался фермент литиказа, полученный нами при культивировании Cellulomonas cellulans. Этот препарат тестировали соответственно по коммерческой литиказе.

Ингибирование протеолитической активности ДПГ осуществляли путём введения в среду культивирования ингибитора протеиназ - коммерческого препарата Контрикала с исходной активностью 10000 ЕД/мл.

В исследовании использовались животные:

- при моделировании кандидозной инфекции - беспородные мыши - 110 голов; линейные мыши линии BALB -13 голов; линейные мыши линии С-57 BLACK -8 голов. В работу были взяты самки весом 30-40г.;

- при изучении острой токсичности препарата литиказы - беспородные мыши, обоего пола, массой 30-50 г. - 20 голов;

- при постановке реакции фагоцитоза - беспородные мыши, обоего пола, массой 30-50 г. - 20 голов, а также крысы обоего пола, массой 120-160 г. - 15 голов.

Для изучения адгезивных свойств ДПГ на клетках-мишенях использовали эпителиоциты влагалища (ЭВ), полученные от клинически здоровой женщины на 10-18 день менструального цикла (было получено информированное согласие донора). Эпителиоциты смывали 5 мл ЗФР с ватно-марлевого тампона, затем трижды промывали ЗФР рН=7,2 путём центрифугирования 1000 об/мин в течение трёх минут. Полученную взвесь клеток тестировали в камере Горяева.

Для определения влияния литиказы на способность ДПГ фагоцитироваться использовали перитонеальные макрофаги мышей из асцитной жидкости и альвеолярные макрофаги крыс.

Макрофаги из асцитной жидкости получали после предварительного введения животным в брюшную полость 3 мл стерильного мясо-пептонного бульона. Полученные клетки отмывали трижды ЗФР, ресуспендировали и определяли их концентрацию путём подсчёта в камере Горяева.

Для выделения альвеолярных макрофагов крысам, находящихся под эфирным наркозом, вскрывали грудную клетку, извлекали легкие вместе с трахеей и сердцем. Для промывания легких применяли жидкость следующего состава: среда 199 (без антибиотиков), содержащая гепарин (5 МЕД/мл) и 1% питательной среды DMEM/F12. РН среды доводили до 7,0-7,2 с помощью NaOH, используя РН-метр.

Электронно-микроскопические исследования проводили на просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) JEM -100 С.

Нефелометрию взвеси ДПГ проводили на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2МП при длине волны 750 мкм.

Стерилизующую фильтрацию культуральной жидкости (КЖ) осуществляли с помощью нитроцеллюлозного фильтра с размером пор 0,02 мкм. Для получения литиказы КЖ фракционировали методом ступенчатой мембранной диафильтрации на ячейках с использованием мембран «Диафло» марки ХМ-300, ХМ-100, РМ-20.

Определение литического действия литиказы по отношению к Candida albicans по модифицированному методу Scott J. и Schekman R.

Тест-объектом для определения активности литиказы был выбран клинический изолят С. albicans №40, выделенный от беременной женщины с проявлениями КВ. Суточную культуру ДПГ, полученную на агаре Сабуро (24 ч, 37° С), трижды отмывали ЗФР и доводили клеточную взвесь до концентрации 5

единиц по оптическому стандарту мутности (4,7 х 108 кл/мл) (ГИСК им. Тарасевича). Культуру С. albicans обрабатывали литиказой с активностью 0,15; 0,30; 0,60; 1,25; 2,50; 5,00; 10,00 ЕД в течение часа при 37°С на шейкере. В контрольный образец взвеси ДПГ добавляли ЗФР. Литическое действие фермента определяли по модифицированному методу Scott J. и Schekman R., учитывая величину снижения оптической плотности взвеси, регистрируемую на КФК-2МП. Активность образца выражали в единицах действия, определяемых по предварительно построенной калибровочной кривой, где референс-препаратом служила коммерческая литиказа. Удельную активность рассчитывали в единицах действия на мг белка, определяемого методом Лоури. Определение фунгицидного и фунт статического действия литиказы

Фунгицидное и фунгистатическое действие фермента по отношению к С. albicans подтверждали по высеву на плотной среде Сабуро. 1 мл раствора литиказы в ЗФР с исходной удельной активностью 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120 ЕД наслаивали на среду Сабуро и выдерживали 5 часов при температуре 37°С для полного впитывания жидкости. В контрольный образец вводили ЗФР. После этого засевали 10 мкл суспензии ДПГ, обеспечивающей рост около 50 КОЕ в контроле. Учет результатов проводили через 24 часа инкубации в термостате по проценту сохранивших жизнеспособность ДПГ после обработки ферментом относительно контроля.

Определение фунгицидного и фунгистатического действия литиказы методом серийных разведений в жидкой питательной среде

Из культуры C.albicans №40 готовили взвесь, содержащую 105 клеток в 1 мл бульона, пользуясь бактерийным оптическим стандартом. Затем поставили ряд разведений литиказы (от 10 до 5120 ЕД) в мясо-пептонном бульоне по 2 мл, во все пробирки прибавили по 0,2 мл культуры C.albicans. Установили два контроля; контроль роста ДПГ без введения литиказы и контроль «чистоты» фермента, содержащий 5120 ЕД литиказы без внесения культуры. После 48 часов в термостате произвели учет результатов реакции по наличию или отсутствию роста. Из всех пробирок сделали высев газоном по 0,1 мл на плотную среду Сабуро. Через 24 часа инкубации в термостате подсчитали число КОЕ на чашках.

Определение жизнеспособности Candida albicans после обработки литиказой

Взвесь ДПГ трижды отмывали ЗФР и доводили концентрацию клеток по стандарту мутности до 5 единиц. К 1 мл взвеси в опытные пробирки добавляли литиказу с исходной удельной активностью 0,15; 0,30; 0,60; 1,25; 2,50; 5,00; 10,00 ЕД. В контрольный образец вводили ЗФР. Взвесь инкубировали 1 час при постоянном перемешивании, затем разводили в 1000 раз и делали посев газоном на среду Сабуро. После суточной инкубации в термостате подсчитывали количество КОЕ в контроле и опыте. Определяли процент сохранивших жизнеспособность ДПГ после обработки ферментом.

Определение способности дрояокеподобных грибов адгезироваться на эпителиоцитах влагалища

Полученную взвесь эпителиоцитов влагалища (ЭВ) стандартизовали по числу клеток в камере Горяева. Затем готовили взвесь ДПГ по стандарту мутности, соответствующую 5 единицам (4,7 х 108 кл/мл). Взвесь клеток ЭВ и ДПГ объединяли в соотношении 100 ДПГ на один эпителиоцит.

Суточную культуру С. albicans обрабатывали литиказой, активностью 0,15; 0,30; 0,60; 1,25; 2,50; 5,00; 10,00 ЕД в течение часа при 37" С на шейкере. После 30 минут инкубации клетки трижды отмывали ЗФР и центрифугировали 2 минуты при 1000 об/мин. Из отмытого осадка готовили мазки, которые окрашивали по Граму. В 50 полях зрения подсчитывали эпителиоциты, на которых адгезировались ДПГ. Определяли следующие показатели: К - % вагинальных эпителиоцитов с адгезированными С. albicans (показатель адгезии эпителиоцитов); средний показатель адгезии (СПА) - количество ДПГ на одном эпителиоците относительно общего числа всех эпителиоцитов (интегративный показатель); и индекс адгезии (ИА) - количество ДПГ на одном ВЭ относительно числа активных эпителиальных клеток (показатель, характеризующий адгезивность С. albicans). Коадгезия лактобацилл к дрожжеподобным грибам

При изучении коадгезии лактобацилл L. fermentum 90 TS-4(21) клон 3 к ДПГ, обработанных ферментом литиказой, было использовано 10 клинических изолятов С. albicans. Взвесь ДПГ доводили до 5 единиц по оптическому стандарту мутности и обрабатывали при 37° С в течение часа литиказой 2 ЕД при постоянном помешивании. В контроле вместо литиказы к взвеси кандид добавляли ЗФР. После этого ДПГ трижды отмывали ЗФР. Затем клетки помещали на 1 час в среду 199 для стимуляции трубкообразования.

Суточные культуры лактобацилл триады отмывали ЗФР и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Клеточную взвесь необходимой концентрации получали, доводя её до стандарта мутности 5 единиц. К лактобациллам добавляли ДПГ в соотношении 100: 1. Инкубировали 30 минут в термостате, затем снова отмывали трёхкратно ЗФР. Осадок ресуспендировали в 50 мкл ЗФР. Мазки окрашивали по Граму.

Учёт коадгезии лактобацилл к ДПГ вели в 50 полях зрения. Подсчитывали количество лактобацилл, прилипших к дрожжевой и мицелиальной форме С. albicans в опытной и контрольной группе. Определяли процент клеток ДПГ, на которых произошла адгезия лактобацилл, и индекс коадгезии (среднее количество клеток лактобацилл на одной клетке ДПГ, участвующей в адгезивном процессе).

Определение влияния литиказы на способность кандид фагоцитироваться

С, albicans, как объект фагоцитоза, исследовали в реакции фагоцитоза с перитонеальными макрофагами мышей in vitro. Для выявления влияния литиказы на способность ДПГ фагоцитироваться, их суточную культуру трижды отмывали ЗФР и доводили клеточную взвесь до концентрации 5 единиц по стандарту мутности (4,7 х 108 кл/мл). К 1 мл микробной взвеси добавляли 1 мл литиказы 2 ЕД (опыт), в другую пробирку - 1 мл ЗФР

(контроль). Инкубировали 1 час при 37° С при постоянном перемешивании. После взаимодействия с литиказой ДПГ трижды отмывали ЗФР.

Перитонеальные макрофаги, полученные от десяти мышей, ресуспендировали в среде 199. К 0,2 мл клеточной взвеси добавляли 0,3 мл взвеси ДПГ и 0,15 мл бычьей сыворотки. Перемешивали компоненты и термостатировали полученную смесь 30 и 120 минут при 37° С. Затем в пробирки добавляли 5 мл ЗФР, встряхивали и центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин. По окончании центрифугирования отобранного образца, надосадочную жидкость удаляли и из осадка делали мазки, по десять на опытную и контрольную группы, которые затем окрашивали метиленовым синим. В препаратах подсчитывали не менее 100 клеток (общее число макрофагов). Таким образом, способность культуры фагоцитироваться оценивалась по показателям фагоцитарного захвата (30-минутная экспозиция), и переваривания (120-минутная экспозиция). Определяли процент фагоцитарно-активных макрофагов (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее количество ДПГ, поглощенных одним активным макрофагом (фагоцитарное число - ФЧ). Также подсчитывали общее количество кандид внутри всех активных макрофагов (Е).

Индекс периваривающей способности (ИПС) макрофагов определяли по формуле:

ИПС = (ФЧ3,у - ФЧ120) / ФЧзс х 100%, (1)

где ФЧзо' - фагоцитарное число после 30-минутной экспозиции, ФЧпо1 - фагоцитарное число после 120-минутной экспозиции.

Учет завершенности фагоцитоза вели следующим образом:

ПЗФ = (Езо' - 2,20') / 23<г х 100%, (2)

где ПЗФ - показатель завершенности фагоцитоза, £3о' - 2 после 30- минутной экспозиции, Еда - £ после 120- минутной экспозиции.

Также представлялось необходимым определить процент сохранивших жизнеспособность С.а1ЫсапБ не только после обработки ферментом, но и после экспозиции культуры с макрофагами. По окончании двух часов реакции фагоцитоза обработанных (2 ЕД) и необработанных литиказой кандид делали высев лизатов макрофагов газоном на плотную среду Сабуро. Активность переваривания фагоцитированных ДПГ учитывали по количеству колоний после суточной инкубации в термостате. Контролем в данном случае служила нативная взвесь С.аИмсапв.

Для изучения влияния обработки литиказой на способность ДПГ фагоцитироваться альвеолярными макрофагами крыс, взвесь макрофагов центрифугировали 15 мин. при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли 1,0 мл среды 199, содержащей 20 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота. Каплю полученной взвеси помещали в камеру Горяева и подсчитывали количество макрофагов в 1 мл. Взвесь клеток разводили средой 199, содержащей 20 % бычьей сыворотки, и доводили их концентрацию до 500.000 в 1 мл. К 1 мл взвеси, содержащей 500.000

макрофагов, добавляли 0,1 мл взвеси, содержащей 25.000.000 клеток С. albicans (оптимальная нагрузка - 50 ДПГ на 1 макрофаг).

Взвесь макрофагов с кандидами помещали в пенициллиновые флаконы, по 1 мл в каждый, плотно закрывали резиновыми пробками и в наклонном положении ставили в термостат при 37°С. Для изучения поглотительной активности клеток взвесь инкубировали в термостате в течение 60 минут. Для определения переваривающей способности - еще 1 час 30 минут (итого 150 минут) в новых флаконах со свежей порцией среды 199, содержащей 20 % бычьей сыворотки.

После окончания инкубации покровные стекла с прикрепленными к ним клетками вынимали пинцетом, осторожно промывали в чистой среде 199 и подсушивали на воздухе. Макрофаги фиксировали в течение 15 минут в метиловом спирте. После фиксации препараты подсушивали и окрашивали по Романовскому-Гимза в течение 30 минут.

После этого стекла приклеивали полистиролом на предметные стекла. Таким образом, получали по десять препаратов контрольной и опытной групп. В одном препарате подсчитывали не менее 100 клеток и определяли ФЧ, ФИ и Е.

Индекс периваривающей способности (ИПС) и показатель завершенности фагоцитоза (ГОФ) высчитывали по формулам, аналогичным (1) и (2). Методы изучения индукции морфогенеза дрожжеподобных грибов

В опытах было использовано 10 клинических изолятов С. albicans. При исследовании действия литиказы на морфогенез ДПГ соответствующую культуру обрабатывали разными дозами фермента в течение одного часа. После обработки взвесь ДПГ отмывали от литиказы и переносили в среды, в которых наблюдали индукцию проростковых трубок. В качестве таких сред были использованы: среда 199, жидкая среда Сабуро с разной концентрацией глюкозы и без неё, жидкая среда Сабуро с бычьей сывороткой (1:2). Для подавления трубкообразования применяли ингибитор протеиназ Контрикал 10000 ЕД. Активность трубкообразования оценивали по проценту клеток C.albicans с герминативными трубками относительно общего числа ДПГ. Определение протеиназной активности Candida albicans

Протеиназную активность культуры ДПГ выявляли по расщеплению альбумина, введённого в плотную питательную среду; зону ферментированного лизиса выявляли путём окраски альбумина амидошварцем или кумаси. В жидкой среде протеолитическую активность оценивали по снижению концентрации белка, определяемого методом Лоури. Статистическая обработка полученных данных

Полученные в процессе работы данные анализировали биометрически с использованием критерия Стьюдента и константного метода, а также обрабатывали методами вариационной статистики с использованием программы «Advanced Grapher Version 2.11» и MS Office Excel. С помощью этих программ проводили регрессионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Получение литиказы

Имевшиеся в нашем распоряжении культуры микрококков не отличались ни по морфологическим свойствам, ни по скорости роста в жидкой питательной среде. Попытки выбрать продуцента литиказы с помощью метода отсроченного антагонизма, используя в качестве тест культуры С. albicans №40, оказались безуспешными. В связи с этим, литическое действие фермента микрококков оценивали с помощью метода, предложенного Scott J. и Schekman R. - по величине снижения оптической плотности суспензии ДПГ после воздействия на них литиказой в течение часа. На основании проведенных исследований из четырех культур микрококков мы отобрали один штамм, более активно продуцирующий литиказу. Им оказался Cellulomonas cellulans АС-870 из национальной коллекции промышленных микроорганизмов ГНИИ Генетики.

Одним из первых этапов отработки технологии получения литиказы был выбор питательной среды для культивирования С. cellulans АС-870 с максимальным выходом искомого продукта. Для этого штамм-продуцент выращивали на трёх вариантах питательных сред: МПБ, СМБ, СМБ с убитыми пекарскими дрожжами. Активность фермента в КЖ составила на МПБ -2,2±0,4 ЕД; СМБ - 2,5±0,4 ЕД; СМБ с убитыми пекарскими дрожжами - 3,2±0,2 ЕД соответственно. Из этого следует, что оптимальной средой культивирования можно считать СМБ с добавлением пекарских дрожжей. Последние, являясь субстратом для действия литиказы, выполняют роль её индуктора.

На следующем этапе отрабатывался режим культивирования. Перед внесением в микробиологические флаконы типа матрас объемом 1,5 литра культура С. cellulans АС-870 стабилизировалась путём создания холодового шока (экспозиция инокулята при температуре +4° С в течение 20 минут). Далее матрасы с засеянной культурой на СМБ с добавлением убитых пекарских дрожжей инкубировали при 37° С и постоянном помешивании, контролируя динамику роста по оптической плотности. Динамика накопления биомассы в среде культивирования представлена на рис.1. Из представленного рисунка следует, что культура выходит на стационарную фазу при выбранном режиме культивирования через 60 часов. В процессе культивирования нами контролировалась изменение активности литиказы (рис.2). Было показано, что активность литиказы увеличивалась в период экспоненциального роста культуры и достигала максимума в стационарной фазе, после чего снижалась. Мы пришли к выводу, что оптимальным периодом эффективного культивирования является интервал 65-72 часов. В течение этого периода происходит наибольшее накопление искомого продукта литиказы. Более продолжительное культивирование снижало активность фермента, что могло быть связано с накоплением в биомассе собственных эндопротеаз, высвобождающихся при аутолизе культуры. Этот процесс подтверждают результаты определения протеолитической активности КЖ в динамике культивирования (рис.1).

12 24 36 48 60 72 84 96 чась|

Рисунок I. Динамика роста культуры С. се11и1ап8 АС-870 и изменение протеолитической активности КЖ.

ЕД

часы

12 24 36 48 60 72 84 96

Рисунок 2. Изменение активности литиказы в динамике культивирования С. сеИЫапз АС-870.

Основываясь на данных литературы, в которой приводятся молекулярные параметры литиказы, в технологию был введен этап ультрафильтрации с целью очистки искомого продукта. Этот прием позволил выделить фермент, активность которого в 2,4 раза превышала удельную активность коммерческих образцов. Такой результат мог быть достигнут благодаря тому, что в технологической схеме был исключен этап переосаждения целевого продукта. Однако, обсуждая возможность применения предложенной методики в производственных масштабах, следует учесть, что в работе не проводилась оценка потери активности фермента в процессе лиофильной сушки. Поскольку данный этап является важным, он требует специальных исследований. Оценка острой токсичности полученной литиказы

Исходя из того, что полученный нами фермент предполагалось использовать как лечебный, была оценена его острая токсичность. Для этого 0,4 мл раствора, содержащего 0,45 мг белка (удельная активность препарата 48,3 ЕД/мг белка), вводили в дорсальную вену хвоста десяти опытным мышам. Количество животных в контроле тоже составило десять голов, им вводили 0,4 мл

физиологического раствора. Наблюдение за мышами велось в течение десяти дней. ЛД50 определить не удалось из-за технических ограничений даже при введении максимального количества активного ингредиента. Поэтому можно считать, что ЛД50 вещества превышает 11,25 мг/кг массы тела (из расчета 0,45 мг белка на мышь весом 40 гр.). Животные всех групп во время периода наблюдения были здоровы, активны, их поведенческие реакции не были нарушены, масса тела не снижалась. Побочные эффекты, связанные с введением препаратов обоих групп, не выявлены. Не было отмечено каких-либо патологических изменений при макроскопическом изучении ЦНС и внутренних органов. Из этого следует, что токсическая доза полученной литиказы выше чем 0,45 мг белка, т.е. в пределах тех концентраций с которыми мы работали, фермент не токсичен.

Литичеекое действие литиказы на дрояокеподобные грибы

Получение высокоактивной литиказы позволило подойти к решению основного вопроса о возможности использования этого фермента в лечении кандидозного вагинита. В проведенных экспериментах по прямому воздействию фермента на клинические изоляты Candida albicans было показано, что при инкубации с литиказой (активность 10 ЕД) в течение одного часа гибнет 53% популяции относительно контроля. Литический эффект сопровождался снижением количества жизнеспособных ДПГ и зависел от дозы фермента, использованного в опыте.

В ходе работы нами получено уравнение, отражающее зависимость литического эффекта от дозы фермента. В опыте по высеву на среду Сабуро оставшихся жизнеспособных клеток ДПГ оказалось, что зависимость снижения их числа подчиняется аналогичной закономерности.

По полученным уравнениям можно было рассчитать 50% эффект действия литиказы, он составил по показателю снижения оптической плотности культуры 5,0 ЕД, а по показателю жизнеспособности - 7,8 ЕД.

Представляло большой интерес изучить, происходит ли полный лизис культуры кандид только за счет действия литиказы, и какая нужна для этого доза фермента, поскольку данные литературы об этом отсутствуют. В связи с этим, был проведен ряд экспериментов с использованием разных доз литиказы на плотной и жидкой средах Сабуро. Установлено, что при добавлении в жидкую среду культивирования кандид фермента активностью 1280 ЕД/мл и выше приводит к отсутствию роста тест-культуры. Эти же данные подтвердились в опыте на плотной Сабуро, когда литиказа наслаивалась на среду перед посевом культуры С. albicans.

Влияние литиказы на Candida albicans, наблюдаемое при электронной микроскопии

С помощью электронной микроскопии удалось зафиксировать, какие именно изменения претерпевает клеточная клетка C.albicans №40 под действием литиказы 10 ЕД в течение одного часа. Выяснилось, что маннопротеиновый слой заметно истончается за счет разрыва связей маннана (рис.ЗА,Б,Г,Д), однако глюканновый и хитиновый слои остаются без изменений. В некоторых местах происходит разрыв всей клеточной стенки (рис.ЗЕ).

is miss

SiSii

Рисунок 3. Электронные микрофотографии Candida albicans №40 в опытной группе. Увеличение 15000.

В опыте вокруг кандиды видна зона просветления среды, а фибриллярный слой отсутствует полностью, хотя в контроле он четко обозначен (рис.4А-Г).

Разрушение маннопротеинового комплекса вызывает деструкцию скелетона клетки кандид и гибель ее содержимого в результате лизиса органелл (рис.ЗВ). Очевидно, что действие литиказы приводит к изменению структуры клеточной стенки кандид, а значит и её свойств. Можно предположить, что эти преобразования коснутся и изменения проницаемости клеточной стенки Candida albicans для современных лекарственных средств.

Рисунок 4. Электронные микрофотографии Candida albicans №40 в контрольной группе. Увеличение 15000.

Изменение адгезивных свойств Candida albicans после обработки литиказой

Известно, что поверхностный маннопротеиновый комплекс принимает участие в адгезии ДПГ к клеткам-мишеням, тем самым является ключевым фактором колонизации. Можно предположить, что разрушение этого комплекса влияет на адгезивные свойства ДПГ. В этой связи мы определяли способность С. albicans адгезироваться на эпителиоцитах влагалища (ЭВ) до и после обработки литиказой в разных концентрациях. При этом среднее значение адгезивного индекса ДПГ, не обработанных ферментом, составило 4,2±0,4 и

га Basil

было существенно выше этого показателя после обработки ДПГ литиказой 10 ЕД (1,6±0,1). Эффект снижения адгезии зависел от дозы фермента (рис.5). Из рисунка следует, что выраженный эффект снижения адгезивных свойств культуры С. albicans может быть выявлен при обработке её литиказой уже в концентрации 0,15 ЕД.

ИА

4,5 -М

, Не

ЕД

О 0,15 0,3 0,6 1,25 2,5 5 10

Рисунок 5. Изменение индекса адгезии С. albicans на ЭВ.

После обработки литиказой 10 ЕД уровень адгезии снизился по показателю К % в 1,4; по ИА - в 2,6 и по СПА - в 4 раза соответственно до низкого уровня адгезии (рис.6 А-В).

Приведённые данные позволяют заключить, что изменение структуры клеточной стенки в результате частичного разрушения маннанового слоя за счёт действия литиказы препятствует прикреплению С. albicans к эпителию влагалища, т.е. снижается патогенность ДПГ, связанная с адгезивностью. Коадгезия лактобацилл к дрожжеподобным грибам, обработанным литиказой

Исходя из приведённых выше данных, изменение структуры маннопротеинового слоя под воздействием литиказы приводит к потере адгезинов, взаимодействующих с рецепторами эпителиоцитов влагалища. Возник вопрос, в какой степени такие изменения в клеточной стенке ДПГ влияют на лиганды, обеспечивающие адгезию лактобацилл.

Для решения этого вопроса проводилась коадгезия штамма L. fermentum 90TS-4 к десяти штаммам ДПГ.

Выяснилось, что в результате обработки ДПГ литиказой их адгезивные свойства по отношению к L. fermentum 90TS-4 не изменялись. Индекс коадгезии лактобацилл на дрожжевой форме кандид до обработки их литиказой составил 8,9±1,1; после - 7,6±0,6; на мицелиальной форме до обработки -27,3±1,8; после обработки - 28,8±2,5. Это позволяет заключить, что природа адгезинов, обеспечивающих колонизацию ДПГ, т.е. их прилипание к ЭВ, и адгезию с лактобациллами, различна. Адгезины, связанные с колонизацией эпителия, по всей вероятности, имеют маннопротеиновую природу, в то время

как адгезины, ассоциированные с адгезией ДПГ и лактобацилл, являются литиказонезависимыми.

Влияние литиказы на способность Candida albicans фагоцитироваться

Одним из основных механизмов сдерживания кандидозной инфекции принято считать успешную функциональную деятельность фагоцитов, которая, в свою очередь, во многом зависит от свойств фагоцитируемого объекта, определяя специфичность поражения, клинические признаки и морфологические проявления. Представлялось необходимым оценить способность перитонеальных и альвеолярных макрофагов фагоцитировать интактные C.albicans и обработанные литиказой (2 ЕД).

Существуют различные методы изучения фагоцитирующей активности макрофагов. В качестве модели, хорошо себя зарекомендовавшей и наиболее часто используемой в опытах, мы взяли модель перитонеальных макрофагов мышей in vitro. Широкое распространение данная модель получила в первую очередь потому, что она легко воспроизводится. При определении фагоцитарного индекса (ФИ) через 30 минут в контроле было выявлено 47,0±0,7% фагоцитов с захваченными нативными ДПГ. Фагоцитарное число (ФЧ) составило 1,8±0,2. При взаимодействии макрофагов с клетками С. albicans, обработанными литиказой, эти показатели повышались: ФИ составил 79,0±0,4%, а ФЧ - 2,7±0,2. После 120-минутной экспозиции эта закономерность сохранялась: ФИ в контроле составил 48,0±0,7%, в опыте - 66,0±0,6%; ФЧ в контроле - 1,7±0,1, в опыте - 2,7±0,2.

При подсчете таких показателей как индекс переваривающей способности (ИПС) и показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) опыт и контроль имели достоверную разницу (Р<0,05): ИПС в опыте на 1,8% был выше, чем в контроле и составил 7,4±0,4%. Наиболее информативным для оценки действия литиказы на течение фагоцитоза оказался ПЗФ, который почти в 5 раз в опыте отличался от контроля и составил 16,4±0,5% и 3,5±0,2% соответственно. Результаты свидетельствуют, что изменение поверхностной структуры клеточной стенки С. albicans путём разрушения маннанового слоя усиливает захват их фагоцитами. Можно сделать вывод, что ДПГ, обработанные литиказой, становятся более доступными к действию фагоцитов.

Однако, принимая во внимание, что ДПГ после захвата макрофагами плохо перевариваются в фаголизосомах, представляло значительный интерес оценить в сравнительных опытах устойчивость к внутриклеточному перевариванию интактных и обработанных литиказой С. albicans. Для этого делали высев лизатов макрофагов с фагоцитированными ДПГ газоном на плотную среду Сабуро. Оказалось, что после контакта нативных кандид с макрофагами перевариванию подвергалось 41,0±0,4% клеток. В то время как в случае их обработки ферментом, этот показатель был выше и соответствовал 48,0±1,0%. Полученные данные указывают на то, что переваривающая фаза фагоцитоза проходит более эффективно в случае повреждающего клеточную стенку действия фермента литиказы.

Наиболее эффективный фагоцитоз осуществляется макрофагами, так как они обладают большим количеством эффективных антимикотических факторов, в

отличие от нейтрофилов, которые первыми устремляются в очаг инфицирования. Макрофаги способны на прямую адгезию ДПГ рода Candida. Причем, самыми активными и более дифференцированными являются альвеолярные макрофаги, чем и объясняется очень редкое поражение легких при попадании и колонизации в них кандид.

Для оценки фагоцитоза была использована методика получения AM из бронхоальвеолярной жидкости крыс, экспрессированных in vitro. Данные 3 независимых экспериментов были проанализированы и различия были признаны статистически достоверными при Р<0,05.

После часа инкубации показатели ФИ и ФЧ в опыте и контроле достоверно не отличались: ФИ в опытной группе составил 91,0±1,0%, в контрольной -88,7±0,8%; ФЧ в опыте - 8,2±0,9, в контроле - 8,6±1,0. Однако при последующей инкубации (150 минут) ФИ и ФЧ интактного препарата были значительно выше, чем обработанного литиказой и составили 83,7±0,7% и 9,4±1,1 соответственно, по сравнению с 46,0±0,4% и 5,9±0,9 в опыте. Более того, при сравнении ФИ и ФЧ опыта в разное время можно прийти к выводу, что AM переварили основную часть микроорганизмов по окончании срока инкубации, а в контроле фагоцитоз оставался еще на стадии захвата. Было выявлено, что величина ИПС, а также ПЗФ, более наглядно характеризующие антимикотический эффект литиказы, были достоверно в разы выше в опыте по сравнению с контролем и равнялись: ИПС=28,6±2,3% и -8,0±0,7%, ПЗФ=64,7±0,4% и -2,6±0,4% соответственно. Отрицательная величина этих двух показателей в контроле говорит о том, что AM не справлялись со своей задачей, а ДПГ могли размножаться и сохранять жизнеспособность в течение длительного времени внутри макрофагов.

Таким образом, обработка ДПГ ферментом литиказой даже в малых дозах (2 ЕД) достоверно снижает устойчивость кандид в реакции фагоцитоза. Факторы индукции морфогенеза дрожжеподобных грибов

Одним из признаков патогенности С. albicans является образование герминативных (проростковых) трубок и переход ДПГ в мицелиальную форму. По данным литературы, индукция трубкообразования может быть вызвана под действием различных факторов (бедность питательного субстрата, наличие в среде обитания ДПГ белка, изменение рН среды и т.д.). Нами была предпринята попытка оценить различные варианты стимуляции трубкообразования для дальнейших экспериментов по изучению изменения морфогенеза С. albicans под действием литиказы.

Индукцию герминативных трубок ДПГ осуществляли при культивировании их на среде 199, среде Сабуро с добавлением бычьей сыворотки в различных разведениях, а также среде Сабуро с различной концентрацией глюкозы. Опыты были проведены на 10 клинических изолятах С. albicans.

В среднем, количество трубкообразующих клеток С. albicans при культивировании на среде 199 составило 24,7±4,1 %. При стимуляции сывороткой 1:2 и в среде без глюкозы эти показатели были ниже и составляли 20,0±2,4 % и 12,6±1,9 % соответственно.

Отмечались штаммовые различия в трубкообразовании при всех вариантах индукции. Клинические изоляты, полученные от женщин с манифестной формой инфекции, более активно переходили в мицелиальную форму. Особенно наглядно этот эффект можно отметить при стимуляции морфогенеза на среде 199.

Влияния ингибитора протеиназы - контрикала на морфогенез Candida albicans

В образовании проростковых трубок участвуют аспартил-протеиназы (SAP). В нашей работе этот эффект был продемонстрирован в следующем опыте.

Был произведён посев С. albicans №40 на среду Сабуро с индуктором морфогенеза (бычья сыворотка). В одну чашку добавляли контрикал (опыт), а в другой ингибитор протеаз отсутствовал (контроль). Из рис.6 следует, что по характеру роста ДПГ наблюдались различия в контроле и опыте. Выросшие ДПГ на среде без контрикала переходили в мицелиальную форму, а на среде с контрикалом оставались в дрожжевой форме.

А Б

Рисунок 6. Образование псевдомицелия ДПГ на плотной среде: А - контроль без контрикала; Б - опыт с добавлением контрикала.

На следующем этапе эксперимента нами была выявлена доза контрикала, полностью блокирующая рост псевдомицелия. Оказалось, что минимальная действующая доза контрикала составляет 2500 ЕД в случае индукции трубкообразования на среде 199, а в случае индукции с бычьей сывороткой и дефиците глюкозы - 5000 ЕД. Контролем служила среда без ингибитора протеиназ. При этом блокирование образования проростковых трубок наблюдалось у всех десяти исследуемых ДПГ.

Подтверждением того, что задержка образования проростковых трубок связана с блокированием протеиназ, доказывалось в следующем опыте. После образования колоний С. albicans на плотной среде, содержащей бычью сыворотку, с контрикалом (опыт) и без контрикала (контроль) проводили окраску кумаси (рис.7).

Из приведённого рисунка видно, что вокруг колоний, в которых ДПГ росли в мицелиальной форме (контроль - рис.7А), образовывалась зона просветления, т.е. секретируемые SAP разрушали бычью сыворотку, используемую нами, как индуктор морфогенеза. В случае добавления контрикала (опыт - рис.7Б) такая

А Б

Рисунок 7. Определение протеазной активности ДПГ в виде зоны просветления на плотной среде с бычьей сывороткой (окраска кумаси):

А - среда без добавления контрикала (контроль); Б - среда с добавлением контрикала (опыт).

Влияние литиказы на морфогенез Candida albicans

Исходя из того, что при воздействии литиказы на клеточную стенку ДПГ происходит разрушение маннопротеинового слоя, мы считали целесообразным исследовать, в какой степени такое воздействие может повлиять на морфогенез. Решение этой задачи было реализовано в следующих опытах.

Производили индукцию образования герминативных трубок в среде 199, Сабуро с бычьей сывороткой и Сабуро с дефицитом глюкозы. При разных вариантах индукции трубкообразования в среднем у 16,0±3,5 % клеток ДПГ образовывались герминативные трубки. Обработка ДПГ ферментом, разрушающим углеводную часть маннопротеинового комплекса клеточной стенки, увеличивала этот показатель до 58,8±4,9 %. Таким образом, можно считать, что разрушение маннопротеинового слоя клеточной стенки ДПГ способствует переходу их в мицелиальную форму. Как известно, такой вариант роста С. albicans ассоциируется с увеличением их инвазивности. По данным литературы, образование проростковых трубок сопровождается активацией ферментов агрессии, поэтому представляло интерес выяснить, в какой степени стимуляция трубкообразования под воздействием литиказы может быть связана с продукцией аспартил - протеиназ. Решить этот вопрос можно было, если в среду культивирования вводился ингибитор протеиназ. Добавление в среду контрикала в дозе 2500 ЕД полностью блокировало образование проростковых трубок у интактных ДПГ, но не изменяло показатель трубкообразования у клеток, предварительно обработанных литиказой. Очевидно, в естественных условиях трубкообразование происходит за счёт собственных аспартил-

протеиназ. Разрушение литиказой маннопротеинового комплекса в его углеводной части индуцирует формирование проростковых трубок. Однако, при этом эндопротеазы, как фактор агрессии, не активируются и инвазивность возбудителя не реализуется.

Основываясь на результатах предыдущих опытов, мы приняли решение проверить действие литиказы на выработку ДПГ секреторных аспартил-протеиназ в следующем опыте.

Посев культуры С. albicans №40, которую в течение часа обрабатывали литиказой 2 ЕД/мл, затем отмывали от неё, был произведён на среду Сабуро с индуктором морфогенеза (бычья сыворотка) с добавлением контрикала. Выросшие колонии ДПГ переходили в мицелиальную форму, несмотря на наличие в среде ингибитора аспартил-протеиназ.

Подтверждением того, что литиказа стимулирует образование проростковых трубок при полном блокировании выработки протеиназ, служил и следующий опыт. Взвесь С. albicans№40 обрабатывали в течение часа литиказой 2 ЕД/мл, затем, трижды отмыв от фермента с помощью ЗФР, высевали на среду с контрикалом. Вокруг колоний ДПГ не образовывалась зона просветления, т.е. переход в мицелиальную форму спровоцирован не действием аспартил-протеиназ, которые разрушили бы бычью сыворотку в среде, а действием литиказы.

Выполненные нами эксперименты позволили заключить, что активация морфогенеза С. albicans после обработки их литиказой не сопровождается повышением активности ферментов агрессии - аспартил-протеиназ. По всей вероятности, разрыхление клеточной стенки в результате частичной деструкции маннопротеинового слоя достаточно для образования проростковых трубок. В том случае если морфогенез активируется не ферментами, обеспечивающими в дальнейшем прорастание герминативных трубок в ткани, то его нельзя признать как абсолютный эквивалент инвазивности.

Изучение терапевтического действия литиказы при моделировании кандидозной инфекции у мышей

Для исследования терапевтического действия литиказы при кандидозном вагините необходимо было создать модель этой болезни. Первым этапом решения такой задачи являлся выбор штамма Candida albicans, способного вызвать кандидозный вагинит у лабораторных животных. В качестве инфицирующего агента был использован клинический изолят С. albicans №40, выделенный от больной женщины и охарактеризованный нами ранее по признакам патогенности (образование герминативных трубок, протеолитическая активность, адгезивные свойства, устойчивость к фагоцитозу и т.д.). Культуру этого штамма вводили интравагинально по 20 мкл беспородным мышам на фоне дисбиоза, который вызывали путём перорального введения животным на протяжении пяти дней доксициклина гидрохлорида и пенициллина интравагинально по 40 мг/кг. На восьмой день после заражения из влагалища делали высев. Выделенную культуру вновь вводили интактным животным (второй пассаж). В дальнейшем он хранился при -70°С в

забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) с добавлением глицерина до 15%. Вирулентность использованного в работе штамма определяли по величине минимальной заражающей дозы после интравагинального введения его мышам. На группе животных из 35 голов выбирали оптимальную заражающую дозу адаптированного штамма. Семи группам животных по 5 голов в каждой вводили культуру ДПГ в дозах 10б, 5x106, 107, 5x107, 10s, 5x108, 109 микробных клеток в 1 мл. В течение 35 дней после заражения у них контролировали течение инфекции. Минимальная заражающая доза составила 5x106 КОЕ/мл. При этом удавалось инфицировать не более 20% мышей. При увеличении дозы до 108 КОЕ/мл инфекция развивалась у 80% животных. Дальнейшее повышение дозировки не сопровождалось существенным увеличением частоты инфицирования.

Влагалищное содержимое мышей для исследования забирали на каждые вторые сутки. Данные образцы разводили с помощью ЗФР в 10 раз до объема 50 мкл. Контроль течения инфекции и получение данных обсеменённости влагалища производили подсчётом числа колоний С. albicans, выросших после посева в чашки с агаром Сабуро. Результаты учитывали по клиренсу, рассчитанному по формуле:

К= Со-С/Со. 100%, (3)

где К - клиренс (очищение),

Со - число ДПГ в 1 мкл влагалищного отделяемого мышей в первоначальный момент времени после заражения,

С, - число ДПГ в 1 мкл влагалищного отделяемого мышей через известный промежуток времени.

С целью моделирования рецидивирующего течения инфекции после санации влагалища мышей вновь обрабатывали антибиотиками. В результате у 16,6±5,4% животных наблюдалось обострение микотической инфекции. Мы считаем, что характер течения инфекции может зависеть от гормонального фона особей, взятых в эксперимент. В связи с этим, мы посчитали целесообразным синхронизировать всех животных по этому признаку путём стимуляции течки. Дополнительная обработка мышей эстрадиолом 25 мг/кг (препарат «Месалин») увеличила частоту рецидивирования до 90%. После заражения обсеменённость влагалища ДПГ возрастала к 8-9 дню, затем начиналось очищение, а к 30 дню выделить кандиды из влагалищных образцов не удавалось. Рецидив инфекции развивался в результате повторной обработки животных без заражения. В том случае, если мышей обрабатывали только антибиотиками, частота развития рецидива не превышала 16,6±5,4%, а при дополнительной обработке месалином частота выхода в рецидивирующую форму увеличивалась до 90,0±9,5%. Следует отметить, что при этом степень обсеменённости влагалища не зависела от способа провокации рецидива.

Таким образом, модель KB предусматривала однократное интравагинальное заражение животных адаптированным штаммом С. albicans в дозе 10" КОЕ/мл на фоне дисбиоза, вызванного антибиотиками и искусственно индуцированной течки. После элиминации возбудителя из влагалища провоцировали рецидив инфекции путём повторной обработки животных антибиотиками и гормоном.

На высоте манифестации рецидива животным опытной группы с интервалом в 2 дня интравагинально вводили литиказу. Контроль санации в опытной и контрольной группах осуществляли по высеву ДПГ. Две серии опытов были проведены с использованием разных доз фермента: 2 и 10 ЕД/мл.

Рисунок 8. Изменение клиренса влагалища от С. albicans при действии литиказы в дозе 2 ЕД/мл.

К=100 % - полное очищение от ДПГ.

Рисунок 9. Изменение клиренса влагалища от С. albicans при действии литиказы в дозе 10 ЕД/мл.

Из данных, приведенных на рис.8 следует, что уже после первого введения литиказы происходит значительное снижение обсеменённости влагалища Кандидами по сравнению с контролем. При использовании литиказы в дозе 10 ЕД/мл, санация завершается на 8 дней раньше, чем при дозе 2 ЕД/мл.

Представляло интерес выяснить, является ли санация полной или частичной после применения литиказы. С этой целью у мышей повторно провоцировали рецидив. Из данных, приведённых на рис.9 следует, что в контрольной группе, не леченной литиказой, развивался рецидив KB, в то время как у животных, получавших фермент, рецидивирование не отмечалось.

Проведённые исследования позволяют заключить, что литиказа, как фермент, разрушающий основную структуру клеточной стенки С. albicans, способствует санации макроорганизма от ДПГ. При этом их элиминация из влагалища настолько эффективна, что провокация рецидива инфекции оказывается невозможной. Следовательно, литиказу можно рассматривать как перспективный препарат для лечения и профилактики рецидивов КВ.

Учитывая тот факт, что при инфекции С. albicans переходят из дрожжевой формы в инвазивную мицелиальную за счёт активации системы протеолитических ферментов, в схему лечения KB целесообразно включать ингибиторы протеиназ. Таким образом, эффект терапевтического действия препаратов, разрушающих или модифицирующих клеточную стенку, может быть усилен, поскольку оставшиеся в популяции ДПГ будут элиминированы препаратом альтернативного действия.

ВЫВОДЫ

1. Из числа исследованных объектов наиболее продуктивным в отношении литиказы оказался штамм Cellulomonas cellulans АС-870. Предложена технология получения и очистки литиказы путём культивирования на сердечно-мозговом бульоне с добавлением пекарских дрожжей и последующим выделением искомого продукта с молекулярной массой в интервале 100-30 кД методом ультрафильтрации. Полученный по данной технологии фермент превышал удельную активность коммерческого препарата сравнения.

2. Установлено, что терапевтический эффект литиказы обусловлен гибелью популяции дрожжеподобных грибов в результате их лизиса и снижением адгезии оставшихся жизнеспособными кандид на вагинальном эпителии.

3. Подвергшиеся воздействию литиказы дрожжеподобные грибы сохраняют коадгезивные свойства в отношении лактобактерий, но лучше фагоцитируются. Изменённые под действием литиказы кандиды, несмотря на активацию морфогенеза, не активируют ферменты агрессии аспартил-протеиназы.

4. Установлено, что ингибиторы аспартил-протеиназ блокируют переход С. albicans в инвазивную мицелиальную форму. Эти препараты могут быть рекомендованы для лечения рецидивирующего кандидозного вагинита.

5. Разработана экспериментальная модель рецидивирующего кандидозного вагинита, включающая сочетанную обработку животных антибиотиками и эстрадиолом, заражение адаптированного к ним штаммом С. albicans №40, и, после естественной санации, провокацию рецидива инфекции путём повторной обработки антибиотиками и гормоном.

6. Показано антимикотическое действие литиказы на модели рецидивирующего кандидозного вагинита у мышей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сачивкина Н.П., Кравцов Э.Г., Васильева Е.А. Изучение фермента литиказы как нового антимикотического препарата.// Вестник РУДН. Серия «Агрономия и животноводство», 2008. - № 3 - С.37-43.

2. Сачивкина Н.П., Кравцов Э.Г., Васильева Е.А., Анохина И.В., Далин М.В. Коадгезия пробиотического штамма Lactobacillus fermentum и клинических изолятов Candida albicans в процессе морфогенеза.// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 2008. - С.108-109.

3. Сачивкина Н.П., Кравцов Э.Г., Васильева Е.А., Анохина И.В., Далин М.В. Некоторые особенности патоморфогенеза Candida albicans.// Бюллетень московского общества испытателей природы «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», 2009. - Т.114, -№2-С. 189-190.

4. Проценко А.В., Кравцов Э.Г., Тоскин И., Анохина И.В., Сачивкина Н.П., Далин М.В., Васильева Е.А. Изменение адгезивных свойств клинических штаммов Candida albicans при взаимодействии с пробиотическим штаммом Lactobacillus fermentum.// Бюллетень московского общества испытателей природы «Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование. Охрана окружающей среды» 2009. - Т.114, - №3 - С. 287293.

5. Сачивкина Н.П., Кравцов Э.Г., Васильева Е.А., Далин М.В. Изучение антимикотической активности литиказы.// Журнал «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», 2009.- Т. 148, -№8 - С. 180-183.

6. Сачивкина Н.П., Кравцов Э.Г., Васильева Е.А., Анохина И.В., Далин М.В. Изучение действия микробного фермента литиказы в опытах моделирования кандидозного вагинита на мышах.// Журнал «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», 2010. -Т.149, - №6 - С.666-669.

Сачивкина Надежда Павловна (Россия).

Влияние микробного фермента литиказы на развитие экспериментального кандидозного вагинита.

Для изучения антимикотического действия выбран фермент микробного происхождения - литиказа, разрушающий основной структурный элемент клеточной стенки дрожжеподобных грибов - маннопротеиновый комплекс. Доказан фунгицидный и фунгистатический эффект литиказы. Установлено, что возбудитель вагинального кандидоза, подвергшийся действию литиказы, теряет способность адгезироваться на вагинальном эпителии, но остаётся способным коадгезироваться с лактобактериями. Кандиды, обработанные литиказой, активнее фагоцитируются и становятся доступными действию лизосомных ферментов макрофагов. Под действием литиказы происходит нарушение структуры клеточной стенки, что способствует образованию проростковых трубок без индукции протеиназ. Предложена оригинальная модель рецидивирующего вагинаньного кандидоза, адекватная вагинальному кандидозу женщин. В опытах in vivo доказан терапевтический и противорецидивный эффект литиказы.

Sachivkina Nadczda Pavlovna (Russia).

Influence of microbic enzyme lyticase on development experimental vaginal candidosis.

For studying antimicotic enzyme actions of a microbic origin - lyticase, a destroying basic structural element of a cellular wall of dimorphic fungus — a mannoprotein complex is chosen. It is proved fungicidal and fungistatic effect of lyticase. It is established that the vaginal candidosis activator, after the lyticase action, loses ability to adhese on vaginal epithelial cells, but remains capable co-adhese with lactobacillus. Candida, processed by lyticase, is phagocytosed better and becomes more accessible to lizosome enzymes action of macrophages. Under lyticase action there is an infringement of a cellular wall structure that promotes formation tubes without an induction of proteinases. The original model of the repeating vaginal candidosis corresponds the candidosis of women. In experiences in vivo it is proved therapeutic and antirepeating lyticase effect.

Подписано в печать: 20.10.10 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 769158 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сачивкина, Надежда Павловна

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Коллекция микроорганизмов.

2.1.2. Характеристика продуцентов литиказы.

2.1.3. Питательные среды.

2.1.4. Тест — системы.

2.1.5. Реагенты.

2.1.6. Биообъекты.

2.1.7. Оборудование.

2.2. Методы.

2.2.1. Определение активности литиказы.

2.2.1.1. Определение литического действия литиказы по отношению к

С.albicans по модифицированному методу J. Scott и Schekman R.

2.2.1.2. Определение фунгицидного и фунгистатического действия литиказы.

2.2.1.3. Определение фунгицидного и фунгистатического действия литиказы методом серийных разведений в жидкой питательной среде.

2.2.1.4. Определение жизнеспособности Candida albicans после обработки литиказой.

2.2.2. Оценка влияния литиказы на Candida albicans, наблюдаемое при электронной микроскопии.

2.2.3. Определение способности дрожжеподобных грибов адгезироваться на эпителиоцитах влагалища.

2.2.4. Коадгезия лактобацилл к дрожжеподобным грибам.

2.2.5. Определение влияния литиказы на способность дрожжеподобных грибов фагоцитироваться.

2.2.5.1. Реакция фагоцитоза с перитонеальными макрофагами мышей in vitro.

2.2.5.2. Реакция фагоцитоза с альвеолярными макрофагами крыс in vitro.

2.2.6. Методы изучения индукции морфогенеза С. albicans.

2.2.7. Определение протеиназной активности С. albicans.

2.2.8. Статистическая обработка полученных данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Получение литиказы.

3.1.1. Выделение и очистка литиказы из культуральной жидкости Cellulomonas cellulans АС-870.

3.1.2. Оценка острой токсичности полученного фермента литиказы.

3.2. Действие литиказы на биообъекты.'.

3.2.1. Литическое действие фермента на дрожжеподобные грибы-.

3.2.2. Влияние литиказы на Candida albicans, наблюдаемое при электронной микроскопии.

3.2.3. Изменение адгезивных свойств С. albicans после обработки литиказой.

3.2.4. Коадгезия лактобацилл к дрожжеподобным грибам, обработанным литиказой.

3.2.5. Влияние литиказы на способность Candida albicans фагоцитироваться.

3.2.5.1. Реакция фагоцитоза с перитонеальными макрофагами мышей.

3.2.5.2. Реакция фагоцитоза с альвеолярными макрофагами крыс in vitro.

3.2.6. Факторы индукции морфогенеза C.albicans.

3.2.7. Влияния ингибитора протеиназы - контрикала на морфогенез C.albicans.

3.2.8. Влияние литиказы на морфогенез C.albicans.

3.3. Изучение терапевтического действия литиказы при моделировании кандидозной инфекции у мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние микробного фермента литиказы на развитие экспериментального кандидозного вагинита"

Актуальность проблемы

Среди микотических инфекций кандидоз занимает ведущее место [6,9,56]. Особое значение эта патология приобретает в гинекологической практике. По данным ряда авторов, кандидозный вагинит (KB) составляет до 20-30% в структуре инфекций урогенитального тракта [42,109]. Прилепская В.Н. и Байрамова Г.Р. отмечают, что ежегодно в мире регистрируется более 2 млн. случаев заболеваний KB [46]. Практически каждая вторая женщина за свою жизнь имеет хотя бы один эпизод КВ. Несмотря на то, что современная антимикотическая терапия достаточно эффективна в отношении острой инфекции, лечение хронического рецидивирующего KB не всегда является результативным [43]. Так, при назначении системных антимикотиков (препаратов из группы азолов), процент излечиваемости в острой фазе KB обычно составляет 80-90 % [37,50,51]; при этом рецидивы заболевания наблюдаются в течение 6 месяцев у 20-22 % женщин [40,43].

По данным Sobel J.D. [163,165], значительная частота рецидивов KB заставляет врача пролонгировать схему лечения или увеличивать дозу антимикотика. По мнению Хамановой И.В. [62] и Odds F.S. [142], удлинение периода лечения способно лишь сдвинуть во времени вероятность повторных проявлений кандидоза, а увеличение дозы препарата ведёт к дополнительным побочным эффектам [144]. Проблема противорецидивной терапии осложняется ещё и тем, что при широком использовании препаратов азоловой группы возможно формирование устойчивости кандид к ним [56].

В этой связи возникает необходимость поиска альтернативных путей этиотропной терапии КВ. Возможным перспективным направлением такого поиска является изучение ферментов, воздействующих на дрожжеподобные грибы (ДПГ). Одним из них является литиказа, разрушающая маннопротеиновый комплекс — основной структурный элемент клеточной стенки Candida albicans. Исходя из вышеизложенного, особо актуальным является изучение действия литиказы на вирулентность кандид, что может служить основанием для использования указанного фермента в создании препарата, альтернативного существующим антимикотикам.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было оценить фермент литиказу, расщепляющий маннопротеиновый комплекс клеточной стенки Candida albicans, как основной элемент нового антимикотического препарата в комплексном лечении рецидивирующего кандидозного вагинита.

Поставленная цель достигалась путём последовательного решения следующих задач:

1. Выбор перспективного штамма — продуцента литиказы.

2. Отработка режима его культивирования и оптимизации получения фермента.

3. Отработка способа выделения, очистки литиказы и её стандартизации.

4. Оценка действия полученного препарата на клинические изоляты Candida albicans: определение литического действия, влияние на жизнеспособность ДПГ, адгезивные свойства, морфогенез, способность к фагоцитозу и продукцию ферментов агрессии — протеиназ.

5. Создание модели рецидивирующего KB на лабораторных животных.

6. Исследование действия литиказы на течение рецидивирующего KB у мышей.

Научная новизна

Предложена оригинальная модель рецидивирующего кандидозного вагинита, адекватная KB женщин. В опытах in vivo доказан терапевтический и противорецидивный эффект литиказы.

Определено фунгицндное и фунгистатическое действие литиказы.

Впервые было показано, что коммерческий препарат Контрикал ингибирует продукцию ферментов агрессии Candida albicans - аспартил-протеиназ, в результате чего переход ДПГ в мицелиальную форму не реализуется. А под действием литиказы происходит нарушение структуры клеточной стенки, что способствует образованию проростковых трубок без индукции протеиназ. Такой вариант морфогенеза не сопровождается повышением инвазивности.

Практическая значимость

Разработана технология получения литиказы из природного продуцента Cellulomonas cellulans АС-870. Предложенная схема выделения и очистки искомого продукта позволяет получить литиказу, превышающую по удельной активности современные коммерческие образцы. Полученный по предложенной технологии фермент может быть основой лечебного препарата, предназначенного для лечения KB и профилактике его рецидивов. Включение в схему лечения KB фермента, разрушающего маннопротеиновый комплекс клеточной стенки ДПГ и ингибитора протеиназ, можно рассматривать как альтернативу использования антимикотиков из группы азолов в случае развития к ним резистентности.

Положения, выносимые на защиту

3. Выбран продуцент литиказы — Cellulomonas cellulans АС-870.

6. Подтверждено, что ДПГ под действием литиказы, несмотря на активацию морфогенеза, не активируют ферменты агрессии — аспартил-протеиназы.

7. Разработан и рекомендуется к применению новый способ снижения патогенного потенциала С. albicans за счёт использования ингибитора SAP, блокирующего переход ДПГ в мицелиальную форму.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сачивкина, Надежда Павловна

ВЫВОДЫ

6. Показано антимикотическое действие литиказы на модели*рецидивирующего кандидозного вагинита у мышей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сачивкина, Надежда Павловна, Москва

1. Агольцов В.А. Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы) // Автореферат дисс. докт. ветер, наук. Н.Новгород -2006.-26 с.

2. Акопян Т.Э. Бактериальный вагиноз и кандидозный вагинит у беременных (диагностика и лечение) // Дисс. канд. медиц. наук. -М.- 1996.- 141 с.

3. Анкирская A.C. Бактериальный вагиноз // Ж. акушерства и гинекологии. 1995.-№6. -С. 13-16.

4. Анкирская A.C., Муравьева В.В., Фурсова С.А., Миронова Т.Г. Некоторые аспекты лечения урогенитального кандидоза // Вест. Росс, ассоц. акуш. и гинекол. 2000. - № 1 - С. 106-109.

5. Анохина И.В. Материалы к характеристике лектинсвязывающего адгезина в поверхностных структурах лактобактерий // Дисс. канд. медиц. наук.-М.-2007.-112 с.

6. Антоньев A.A., Бульвахтер Л.А., Глазкова Л.К., Ильин И.И. Кандидоз кожи и слизистых оболочек // М., Медицина. 1985. - 155 с.

7. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях // С.-Петербург, 1962. — 178 с.

8. Байрамова Г.Р. ВКВ. Рациональная фармакотерапия // Гинекология. -2006, Экстравыпуск. С . 11-14.

9. Байрамова Г.Р. Кандидозный вульвовагинит // М., Медицина для всех. -1999.-№ 1-С. 19-22.

10. Борисов Л.Б., Кузьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии // М., Медицина. 1993. - 239 с.

11. Борисов Л.Б., Смирнова A.M., Фрейдлин И.С. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология // М., Медицина. — 1994.- 528 с.

12. Бурова С.А. Особенности течения и терапии грибковых инфекций у детей // Доктор. Ру. 2003. - № 12 - С. 24-25.

13. Бурова С.А., Воинова Г.В. Клинические разновидности и лечение кандидоза // Вестник дерматологии и венерологии. 1997. — № 4 — С. 2428.

14. Быков В.Л. Динамика инвазивного роста Candida albicans в тканях хозяина // Вестник дерматологии и венерологии. 1990. — № 4 — С. 25-28.

15. Быков В.Л. Этиология, эпидемиология и патогенез кандидозного вульвовагинита // Акушерство и гинекология. 1986. - № 9 — С. 5-7.

16. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов // Л., Медицина. 1978. - С. 72-75.

17. Долгов Г.В., Абашин В.Г. Возможности повышения эффективности лечебного эффекта Флуконазола у больных хроническим (рецидивирующим) кандидозным вульвовагинитом // Успехи медицинской микологии. — 2004. — № 4 — С. 162-163.

18. Дуглас С.Д., Куи П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике // Пер. с англ. М., Медицина. - 1983. - С. 63-64, 87-88.

19. Егорова Е.В., Минскер О.Б. Грибковые и некоторые паразитарные заболевания женских половых органов // М., Медицина. 1988. — 221 с.

20. Иммунологические методы // Пер. с нем. под ред. Г.Фримеля. М., Медицина. - 1987. - С. 333-338, 384-386.

21. Караев З.О., Лебедева Т.Н. К вопросу о биологической активности

22. Candida albicans // Микотическая инфекция и сенсибилизация. Сборник науч. труд. Ленинград - 1982. - С. 14-17.

23. Кашкин К.П., Дмитриева Л.Н. Белки системы комплемента: свойства и биологическая активность // Клин. лаб. диагн. 2000. - № 7 - С. 25-32.

24. Кашкин П.Н., Шеклаков Н.Д. Руководство по медицинской микологии // Ленинград - 1978. - 121 с.

25. Кирющенков А. Бактериальный вагиноз и генитальный кандидоз // Ж. Врач. 2003. - № 1 - С. 11-15.

26. Кисина В.И. Комбинированная терапия смешанных инфекций влагалища // Consilium Medicum. 2005. - № 1 - С. 7.

27. Климов Л.А. Адгезивные свойства грибов рода кандида, выделенных от детей дома ребенка, страдающих воспалительными заболеваниями респираторного тракта // Вест. Ряз. мед. ин-та. — 1991. — 10 с.

28. Коломойцева Т.Н. Особенности микробного пейзажа влагалища женщин репродуктивного возраста в условиях колонизации грибами рода Candida // Материалы региональной научно-практической конференции. — Пермь -2003.-С. 61-64.

29. Лабинская A.C. Практикум по медицинской микробиологии // М., Медицина. 1963. - 463 с.

30. Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. Антиэндотоксиновый иммунитет в регуляции численности эшерихиозной микрофлоры кишечника // М., Медицина. 2007. - 216 с.

31. Лурье A.A. Хроматографические материалы. Справочник // М., Химия. — 1978.-С. 190-191.

32. Майбогин A.M. Изучение фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов при взаимодействии с липосомами.// Электронный ресурс, Минск, 2002 URL: http://www.bsmu.by/bioch/files/Majbog.pdf. (дата обращения: 01.06.2009).

33. Матвеева Е.А. Влияние ожоговой травмы на течение пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa // Дисс. канд. медиц. наук. М. - 1980.- 143 с.

34. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник // М., Медицина. 1987. -С. 310-311.

35. Мирзабалаева А.К. Основные принципы лечения хронического кандидоза гениталий у женщины // Вестник дерматологии и венерологии. 2004. —2.С. 20-22.

36. Мирзаболаева А.К., Долго-Сабурова Ю.В., Колб З.К. Опыт применения вагинальных суппозиториев "Ливарол" у больных ОВКВ // Гинекология.- 2006. № 2 - С. 8-11.

37. Муравьева В.В. Микробиологическая диагностика бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста // Автореф. дис. канд. медиц. наук. — М. — 1997. 23 с.

38. Мюллер Э., Лёффлер В. Микология // М., Мир. 1995. - 343 с.

39. Низаева А.Р. Новые подходы к терапии хронического рецидивирующего вульвокандидозного вагинита // Вестник Санкт-Петербургскойгосударственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. 2006. -№3 - С. 142-146.

40. Определитель бактерий Берджи. Под редакцией Хоулта Д., Крига Н., Снита П. 9 издание. Том 2. М., Мир. - 1997. - 315 с.

41. Осипова И.Г. Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе // Дисс. доктора биолог, наук. -Москва-2003.- 118 с.

42. Падейская E.H., Бакланова О.В. Синтетические химиотерапевтические препараты для лечения микозов // Химико-фармацевтический журнал. -2003. -№ 4-С. 12-21.

43. Под редакцией Ф.Герхарда и др. Методы общей бактериологии // Пер. с англ. М., Мир. - 1984. - т. 2 - 469 с.

44. Прилепская В.Н. Генитальный кандидоз. Современные подходы к лечению // Акушерство и гинекология. 1996. - № 6 - С. 28-29.

45. Прилепская В.Н., Байрамова Г.Р. Вульвокандидозный вагинит -современные пути решения проблемы // Трудн. Пациент. — 2006. — № 9 -С. 33-37.

46. Прилепская В.Н., Байрамова Г.Р. Современные представления о вагинальном кандидозе // Русский медицинский журнал. 1998. - № 5 — С. 301-308.

47. Роговская С.И, Прилепская В.Н., Байрамова Г.Р. Опыт применения Дифлюкана при лечении генитального кандидоза // Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов. 1997. - № 1 - С. 100-107.

48. Рожкова И.Ю. Селекция варианта штамма-продуцента лактобактерина Lactobacterium fermentum 90-TS-4 для использования в гинекологической практике // Дисс. канд. медиц. наук. М. - 1999. - 154 с.

49. Романовская Т.А. Современная практика и вопросы стандартизации терапии кандидозного вульвовагинита // Гинекология. 2004. - №1 -С. 57-73.

50. Романовская Т.А., Сергеев Ю.В. Хронический кандидозный вагинит: новые возможности терапии // Журнал иммунопатол., аллергол., инфектол. 2005. - № Г - С. 18-23.

51. Роуз Э. Химическая микробиология // М., Медицина 1971. - С. 89-90.

52. Савичева A.M. Диагностика и лечение урогенитального кандидоза // Трудн. пациент. 2006. - № 9 - С. 28-33.

53. Самсыгина Г.А., Буслаева Г.Н., Корнюшин М.А. Кандидоз новорождённых и детей раннего возраста // М., Медицина. 2006. - 40 с.

54. Сергеев А.Ю. Иммунитет при кандидозе // Иммунопатология, аллергология, инфектология. — 1999. № 1 - С. 81-86.

55. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Иммунопатогенез грибковых инфекций и иммунокоррекция // М., Медицина. 2000. - 256 с.

56. Серов В.Н. Рациональная терапия влагалищной инфекции // Гинекология. 2005. -№ 2-С. 34-51.

57. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови живых организмов // Описание изобретения к патенту РФ. Регистрационный номер заяКВи: 2003107776/15 от 01.09.2004.

58. Тихомиров A.JI. Варианты терапии острого и хронического кандидозного вульвовагинита // Гинекология. — 2005. № 3 — С. 43-46.

59. Тихомиров A.J1. Основные принципы лечения кандидозного вульвовагинита // Consilium Medicum. — 2006. № 6 — С. 58-62.

60. Ткаченко JI.B., Жукова С.И. Преимущества комбинированной терапии хронического рецидивирующего кандидозного вульвовагинита // Гинекология. 2006. - № 2 - С. 73-78.

61. Хамаганова И.В. Кандидозный вульвовагинит // Леч. Врач. 2007. - № 3 -С. 50-53.

62. Хмельницкий O.K. Хмельницкая Н.М. Патоморфология микозов человека // С.-Петербург 2005. - 431 с.

63. Antley P.P., Hazen К.С. Role of yeast cell growth temperature on Candida albicans virulence in mice // Infect. Immun. 1988. - № 11 - P. 2884-2890.

64. Belcher R.W., Carney J.F., Monahan F.G. An electron microscopic study of phagocytosis of Candida albicans by polymorphonuclear leukocytes // Lab. Invest. 1993. - № 12 - P. 620-627.

65. Biely P. Enzymes of the yeast lytic system produced by Arthrobacter bacterium and their role in the lysis of yeast cell walls // Z. Allg. Mikrobiol. — 1997. -№6-P. 465-480.

66. Blasi E., Pitzurra L., Bartoli A., Puliti M., Bistoni F. Tumor necrosis factor as an autocrine and paracrine signal controlling the macrophage secretory response to Candida albicans // Infect. Immun. 2004. - № 4 - P. 1199-1206.

67. Blasi E., Pitzurra L., Puliti M., Lanfrancone L., Bistoni F. Early differential molecular response of a macrophage cell line to yeast and hyphal forms of Candida albicans // Infect. Immun. 2002. - № 3 - P. 832-837.

68. Borelli C., Rüge E., Schaller M., Monod M. The crystal structure of the secreted aspartic proteinase 3 from Candida albicans and its complex with pepstatin A // Proteins. 2007. - № 8 - P. 738-48.

69. Borg-von Zepelin M., Beggah S., Boggian K., Sanglard D. The expression of the secreted aspartyl proteinases SAP4 to SAP6 from Candida albicans in murine macrophages // Mol. Microbiol. 1998. - № 8 - P. 543-554.

70. Braude A. Candida, Infectious diseases and Medical Microbiology. 2nd ed. — 1986.-571 p.

71. Brawner D.L., Cutler J.E. Cell surface and intracellular expression of two Candida albicans antigens during in vitro and in vivo growth // Microb. Pathog. 1997.-№4-P. 249-257.

72. Brawner D.L., Cutler J.E., Beatty W.L. Caveats in the investigation of form -specific molecules of Candida albicans // Infect. Immun. 2000. - № 21. P. 378-383.

73. Brown J.M., Frazier R.P. Phenotypic and genetic characterization of Cellulomonas // J. Clin. Microbiol. 2005. - № 3 - P. 1732-1737.

74. Calderone R.A, Braun P.C. Adherence and receptor relationships of Candida albicans // Microbiol. Rev. 2001. - № 3 - P. 11-20.

75. Calderone R.A., Fonzi W.A. Virulence factors of Candida albicans // Trends Microbiol. 2001. - № 9 - P. 327-335.

76. Cannon R.D., Chaffm W.L. Oral colonization by Candida albicans // Crit. Rev. Oral. Biol. 1999. -№ 10 - P. 359-383.

77. Cannon R.D., Holmes A.R., Mason A.B., Monk B.C. Candida: clearance, colonization, or candidiasis // J. Dent. Res. 1995. - № 5. - P. 1152-1161.

78. Casanova M., Chaffm W.L. Cell wall glycoproteins of Candida albicans as released by different methods // J. Gen. Microbiol. 2001. - № 5 -P. 1045-1051.

79. Casanova M., Gil M.L., Cardenoso L., Martinez J.P., Sentandreu R. Identification of wall specific antigens synthesized during germ tube formation by Candida albicans // Infect. Immun. - 1999. - № 1 - P. 262-271.

80. Casanova M., Martinez J.P., Chaffin W.L. Identification of germ tube cell wall antigens of Candida albicans // J. Med. Vet. Mycol. 2001. - № 4 - P. 269272.

81. Cassone A. Cell wall of Candida albicans: its functions and its impact on the host // Curr. Top. Med. Mycol. 1999. - № 3 - P. 248-314.

82. Cassone A. Differential chemokine response of human monocytes to yeast and hyphal forms of Candida albicans and its relation to the ß 1-6 glucan of the fungal cell wall // J. Leukoc. Biol. 2000. - № 8 - P. 923-932.

83. Chaffin W.L., Stocco D.M. Cell wall proteins of Candida albicans // Can. J. Microbiol. 1993. - № 10 - P. 143 8-1444.

84. Chen B., Xiao-Li X. MNN5 Encodes an Iron Regulated a-1,2-Mannosyltransferase Important for Protein Glycosylation, Cell Wall Integrity, Morphogenesis, and Virulence in Candida albicans // Eukaryot Cell. — 2006. — №2-P. 238-247.

85. Cheng G., Wozniak K., Matthew A. Comparison between Candida albicans Agglutinin Like Sequence Gene Expression Patterns in Human Clinical Specimens and Models of Vaginal Candidiasis // Infect. Immun. — 2005. - № 3 -P. 1656-1663.

86. Critchley I.A., Douglas L.J. Isolation and partial characterization of an adhesin from Candida albicans // J. Gen. Microbiol. 1997. - № 3 - P. 629-636.

87. Cutfield S.M., Dodson E.J., Anderson B.F. The crystal structure of a major secreted aspartic proteinase from Candida albicans in complexes with two inhibitors // J. Mol. Biol. 1995. - № 11 - P. 1261-1271.

88. Cutler J.E., Brawner D.L., Hazen K.C., Jutila M.A. Characteristics of Candida albicans adherence to mouse tissues // Infect. Immun. 2000. — № 6 — P. 19021908.

89. Davies D. Method for treating fungal infections using lytic enzymes // United States Patent № 4062947 Dec., 13 - 1977.

90. De Bernardis F., Arancia S., Morelli L., Hube B., Sanglard D. Evidence that members of the secretory aspartyl proteinase gene family, in particular SAP2, are virulence factors for Candida vaginitis // J. Infect. Dis. 1999. — № 9 —1. P. 201-208.

91. De Bernardis F., Cassone A. Rat model of Candida vaginal infection // Handbook of animal models of infection. — 1999. — Academic Press, New York.-P. 735-740.

92. De Bernardis F., Miihlschlegel F.A., Cassone A., Fonzi W.A. The pH of the host niche controls gene expression in and virulence of Candida albicans // Infect. Tmmun. 1998. - № 6 - P. 3317-3325.

93. Diamond R.D. Interaction of phagocytic cells with Candida and other opportunistic fungi // Arch. Med. Res. 1993. - № 24 - P. 361-369.

94. Doi K., Doi A. Cloning and expression in Escherichia coli of the gene for Micrococcus beta-( 1 -3)-glucanase // J. Bacteriol. 2006. - № 12 - P. 12721276.1. V.

95. Douglas L.J. Adhesion of Candida species to epithelial surfaces // Crit. Rev. Microbiol. 1997. - № 1 - P. 27-43.

96. Edwards J.E. Invasive Candida infections: evolution of a fungal pathogen // N. Engl. J. Med. 1991. - № 4 - P. 1060-1062.

97. Edwards J.E., Mayer C.L., Calderone R.A. Cell extracts of Candida albicans block adherence of the organisms to endothelial cell // Infect. Immun. 1992. -№6-P. 3087-3091.

98. Elliott K.A. Managing patients with vulvovaginal candidiasis // USA. Nurse Pract. 1998. - №3 - P. 44-53.

99. Elorza M.V., Murgui A., Sentandreu R. Dimorphism in Candida albicans: contribution of mannoproteins to the architecture of yeast and mycelial cell walls // J. Gen. Microbiol. 1999. - № 9 - P. 2209-2216.

100. Ernst J. Transcription factors in Candida albicans environmental control of morphogenesis // Microbiology. - 2000. - № 4 - P. 1763-1774.

101. Eschenbach D.A. Bacterial vaginosis: Emphasis on Upper Genital Tract Complications // Obstet. Gyn. Clin. Nort. Am. 1989. - № 3 - P. 593-610.

102. Felk A., Kretschmar M. Candida albicans hyphal formation and the expression of the Efgl regulated proteinases Sap4 to Sap6 are required for the1 invasion of parenchymal organs // Infect. Immun. — 2002. - № 7 — P. 36893700.

103. Ferrer P., Hedegaard L., Halkier T., Diers I., Savva D., Asenjo A. Molecular cloning of a lytic enzyme from Micrococcus // Ann NY Acad. Sci. 1996. -№5-P. 555-565.

104. Fidel P.L., Lynch M.E. Candida specific cell - mediated immunity is demonstrable in mice with experimental vaginal candidiasis // Infect. Immun. -1993. -№ 1 - P. 1990-1995.

105. Fidel P.L., Lynch M.E., Sobel J.D. Circulating CD4 and CD8 T cells have little impact on host defense against experimental vaginal candidiasis // Infect. Immun. 1995. - № 7 - P. 2403-2408.

106. Fidel P.L., Sobel J.D. Immunopathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis // Contracept Fertil. Sex. 1996. - № 2 - P. 33-40.

107. Fiske M.J., Tobey-Fincher K.L., Fuchs R.L. Cloning of two genes from Bacillus circulans WL-12 which encode 1,3-beta-glucanase activity // J. Gen. Microbiol. 1990. ~№ 12 - P. 2377-2383.

108. Floyd L., Wormley Jr., Joseph C. Cell Adhesion Molecule and Lymphocyte Activation Marker Expression during Experimental Vaginal Candidiasis // Infect. Immun. 2001. - № 8 - P. 5072-5079.

109. Ghannoum M.A. Potential role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis // Clin. Microbiol. Rev. 2000 - 13 - p. 122-143.

110. Gil M.L., Casanova M., Martinez J.P., Sentandreu R. Antigenic cell wall mannoproteins in Candida albicans isolates and in other Candida species // J. Gen. Microbiol. 1997. - № 5 - P. 1053-1061.

111. Gilkes N.R., Henrissat B., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A. Domains in microbial a-mannases: sequence conservation, function, and enzyme families // Microbiol. Rev. 1996. - № 6 - P. 303-315.

112. Gilmore B.J., Retsinas E.M., Lorenz J.S., Hostetter M.K. An iC3b receptor on Candida albicans: structure, function and correlates for pathogenicity // J. Infec. Dis. 1988. - № 1 - P. 38-46.

113. Gow N.A. Germ tube growth of Candida albicans // Curr. Top. Med. Mycol. -1997. -№ 8 -P. 43-55.

114. Gustafson K.S., Vercellotti G.M., Bendel C.M., Hostetter M.K. Molecular mimicry in Candida albicans // J. Clin. Invest. 1991. - № 87 - P. 1896-1902.

115. Hamad M., Ghaleb M. Persistent colonization and transient suppression of DTH responses in an estrogen dependent vaginal candidosis murine model // New Microbiol. - 2002. - № 1 - P. 65-73.

116. Hazen B., Hazen K. Dynamic expression of cell surface hydrophobicity during initial yeast cell growth and before germ tube formation of Candida albicans // Infect. Immun. 1998. - №9 - P. 2521-2525.

117. Hazen K. Cell surface hydrophobicity of medically important fungi, especially Candida albicans // American Society for Microbiology. 1990. - № 11. P. 249-295.

118. Hube B. Possible role of secreted proteinases in Candida albicans infection // Rev. Iberoam. Micol. 1998. - № 15 - P. 65-68.

119. Hube B., Naglik J. Candida albicans proteinases: resolving the mystery of a gene family // Microbiology. 2001. - № 14 - P. 1997-2005.

120. Jack D. Epidemiology and pathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis // Am. J. Obst. 1995. - № 3 - P. 78-85.

121. Jeffries T.W., Eveleigh D.E., Reese E.T. Enzymatic hydrolysis of the walls of yeast cells and germinated fungal spores // Biochim. Biophys. Acta. — 1997. — № 10-P. 10-23.

122. Jenkinson H., Shepherd M. Coaggregation of Streptococcus sanguis and other streptococci with Candida albicans // Infect. Immun. 1990. - № 58 - P. 14291436.

123. Kanbe T., Cutler E. Minimum Chemical Requirements for Adhesin Activity of the Acid Stable Part of Candida albicans Cell Wall Phosphomannoprotein Complex // Infection and Immunity. - 1998. - № 12 - P. 5812-5818.

124. Karen L., Floyd L. Candida Specific Antibodies during Experimental Vaginal Candidiasis in Mice // Infect. Immun. - 2002. - № 10 - P. 5790-5799.

125. Kennedy MJ. Adhesion and association mechanisms of Candida albicans // Curr. Top Med Mycol. 1998. - № 2 - P. 73-169.

126. Klotz S.A. Plasma and extracellulas matrix proteins mediate in the fate of Candida albicans in the human host // Med. Hypotheses. — 1994. — № 5 — P. 328-334.

127. Lee J.C., King R.D. Characterization of Candida albicans adherence to human vaginal epithelial cells in vitro // Infect. Immun. 2003. - № 9 - P. 1024-1030.

128. Li R., Cutler J. Chemical definition of an epitope/adhesin molecule on Candida albicans //J. Biol. Chem. 1993. -№ 25 - P. 182-189.

129. Li Y., Yang P., Yao B. Gene cloning, expression, and characterization of mannanase from Bacillus circulans CGMCC 1416 // J. Microbiol. Biotechnol. -2008, Jan. № 18-P. 160-166.

130. Magliani W. Yeast killer systems // Clin. Microbiol. Rev. 1997. - № 10 - P. 369-400.

131. Mann J., Jeffries T., Macmillan J. Production and Ecological Significance of Yeast Cell Wall Degrading Enzymes from Oerskovia // Environmental microbiology. - 1978. - № 4 - P. 594-605.

132. Mann J.W., Macmillan J.D. Yeast Spheroplasts Formed by Cell Wall -Degrading Enzymes from Oerskovia sp. // J. Bacteriol. 1992. - № 9 - P. 821824.

133. Marcilla A., Elorza M.V., Mormeneo S., Rico H., Sentandreu R. Candida albicans mycelial wall structure: supramolecular complexes released by zymolyase, chitinase and beta-mercaptoethanol // Arch. Microbiol. 2001. -№4-P. 312-319.

134. Mardh P.A. The vaginal ecosystem // Amer. J. Obstet. Gynecol. 1991. - № 12-P. 1163-1168.

135. Marodi L., Johnston R. Enhancement of macrophage candidacidal activity by interferon-gamma // Immunodeficiency. 1993. - № 4 - P. 181-185.

136. Masuoka J. Surface Glycans of Candida albicans and Other Pathogenic Fungi: Physiological Roles, Clinical Uses, and Experimental Challenges // Clin. Microbiol. Rev. -2004. -№ 17(2)-P. 281-310.

137. McLellan Jr., William L. Phosphomannanase (PR-Factor), an enzyme required for the formation of yeast protoplasts // J. Bacteriol. 1998. - № 3 - P. 967974.

138. Meiller T.F., Falkler W.A. Candida dubliniensis and Candida albicans display surface variations consistent with observed intergeneric coaggregation // Rev. Iberoam. Micol. 1999. -№ 16 - P. 187-193.

139. Miyakawa Y, Kuribayashi T. Role of specific determinants in mannan of Candida albicans serotype A in adherence to human buccal epithelial cells // Infect. Immun. 1992. - № 60(6) - P. 2493-2499.

140. Monod M., Togni G., Sanglard D. Multiplicity of genes encoding secreted aspartic proteinases in Candida species // Mol. Microbiol. 1994. - № 13 —1. P. 357-368.

141. Odds F.S. Candida and candidosis // 2nd ed. London, Bailliere Tindall. 1988. - 123 p.

142. Paul L., Fidel J. Effects of Reproductive Hormones on Experimental Vaginal Candidiasis // Infect. Immun. 2000. - № 2 - P. 651-657.

143. Perry C., Whittinton R. Fluconazole. An update of its antimicrobial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic use invaginal candidiasis II Drugs. 1995.-№ 1 - P. 994-1006.

144. Poulain D., Tronchin G., Lefebvre B., Husson M. Antigenic variability between Candida albicans blastospores isolated from healthy subjects and patients with Candida infection // Sabouraudia. 1992. - № 9 - P. 173-177.

145. Rangel M.S., Houston A.K., Bale M.J., Wenzel R.P. An experimental model for study of Candida survival and transmission in human volunteers // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - № 13 - P. 590-595.

146. Rico H., Herrero E., Miragall F., Sentandreu R. An electron microscopy study of wall expansion during Candida albicans yeast and mycelial growth using concanavalin A-ferritin labelling of mannoproteins // Arch. Microbiol. — 1991. -№ 15-P. 111-114.

147. Romani L., Mencacci A., Cenci E., Mosci P. Course of primary candidiasis in T cell depleted mice // J. Infect. Dis. - 2002. - № 12 - P. 1384-1392.

148. Rombouts F.M., Phaff H.J. Lysis of yeast cell walls. Lytic ensyms from Bacillus circulans WL-12 // Eur. J. Biochem. 1986. - № 3 - P. 121-130.

149. Ryley J.F., McGregor S. Quantification of vaginal Candida albicans infections in rodents // J. Med. Vet. Mycol. 1986. - № 24 - P. 455-460.

150. Samaranayake Y., Samaranayake L., So M. The antifungal effect of lactoferrin and lysozyme on Candida krusei and Candida albicans // Microbiol. 1998. -№ 11 - P. 18-34.

151. Schumann P., Weiss N. Reclassification of Cellulomonas cellulans // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2001. -№ 51 P. 1007-1010.

152. Scott J.H., Schekman R Lyticase: Endoglucanase and Protease Activities That Act Together in Yeast Cell Lysis // J. Bacteriol. 1990. - №4 - P. 414-423.

153. Segal E. Inhibitors of Candida albicans adhesion to prevent candidiasis // Adv. Exp. Med. Biol. 1996. - № 40 - P. 197-206.

154. Segal E., Soroka A., Lehrer N. Attachment of Candida to mammalian tissues -clinical and experimental studies // Mikrobiol. Hyg. 1994 - № 6 - P. 257265.

155. Segal E., Soroka A., Schecter A. Correlative relationship between adherence of Candida albicans to human vaginal epithelial cells in vitro and candidal vaginitis // Sabouraudia. 1984. - № 22 - P. 191-200.

156. Shah D.T., Glover D.D., Larsen B. In situ mycotoxin production by Candida albicans in women with vaginitis // Gynecol. Obstet. Invest. — 1995. — № 1 P. 67-69.

157. Shen S.H., Slilaty S.N. Primary sequence of the glucanase gene from Oerskovia xanthineolytica // J. Biol. Chem. 1998. - № 6 - P. 1058-1063.

158. Shepherd V., Lane K. Ingestion of Candida albicans down regulated mannose receptor expression on rat macrophages // Arch. Biochem. Biophys. — 1997. -№ 15(344)-P. 350-356.

159. Sherwood J., Gregory D. Contact sensing in Candida albicans: a possible aid to epithelial penetration // J. Med. Vet. Mycol. 1992. - № 30 - P. 461-469.

160. Silen J.L., Agard D.A. Molecular analysis of the gene encoding lytic protease: evidence for a preproenzyme // Gene. — 1998. — № 69 P. 237-244.

161. Sobel J.D. Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis // Ann. NY. Acad. Sci. 1998. - № 4 - P. 547-557.

162. Sobel J.D. Reccurent vulvovaginal candidiasis (RVVC) // Int. J. STD & AIDS. -2001.-№ 12-P. 21-24.

163. Sobel J.D. Vulvovaginitis. When Candida becomes a problem // Dermatol. Clin. 1998. -№ 16 - P. 763-768.

164. Sobel J.D., Muller G., McCormick J.F. Experimental chronic vaginal candidosis in rats // Sabouraudia. 1985. - № 23 - P. 199-206.

165. Soil D.R., Langtimm C.J., Hicks J., Galask R. High frequency switching in Candida strains isolated from vaginitis patients // J. Clin. Microbiol. - 1987. -№25-P. 1611-1622.

166. Staib P., Lermann U. Tetracycline Inducible Expression of Individual Secreted Aspartic Proteases in Candida albicans Allows Isoenzyme - Specific Inhibitor Screening // Antimicrob. Agents. Chemother. - 2008. - № 52(1) - P. 146-156.

167. Sturtevant J., Calderone R. Candida albicans adhesins: biochemical aspects and virulence // Rev. Jberoam. Micol. 1997. - № 14 - P. 90-97.

168. Sullivan R.F., Holtman M.A. Taxonomic positioning of two enzymogenes based on phylogenetic analysis of 16S rDNA, fatty acid composition and phenotypic characteristics // J. Appl. Microbiol. 2003. - № 4 - P. 1079-1086.

169. Sundstrom P.M., Kenny G.E. Enzymatic release of germ tube specific antigens from cell walls of Candida albicans // Infect. Immun. - 1995. - № 3 -P. 609-614.

170. Tan J., Zhang S. Susceptibility to vaginal candidiasis under different conditions in mice // Technolog. Med. Sci. 2005. - № 6 - P. 744-756.

171. Taylor B., Staib P. Profile of Candida albicans Secreted Aspartic Proteinase Elicited during Vaginal Infection // Infect. Immun. — 2005. - № 73(3)1. P. 1828-1835.

172. Tomme P., Gilkes R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi // Adv. Microb. Physiol. 1995. - № 7 - P. 51-81.

173. Tronchin G., Bouchara J.P., Senet J.M. Fungal cell adhesion molecules in Candida albicans // Eur. J. Cell. Biol. 1991. - № 7 - P. 23-33.

174. Villarroya H.,Williams J. Purification and Properties of Mannanases from the Germinated Seeds of Trifolium repens // Biochem. J. 1978. - № 1751. P. 1079-1087.

175. Warren J., Stoll D. Mannan Degrading Enzymes from Cellulomonas fimi // Appl Environ Microbiol. - 1999. - № 65(6) - P. 2598-2605.

176. White T.C., Agabian N. Candida albicans secreted aspartyl proteinases: isoenzyme pattern is determined by cell type, and levels are determined by environmental factors // J. Bacteriol. 1995. - № 77 - P. 5215-5221.

177. Yahata N., Tanaka H. Structure of the gene encoding ensyms of Bacillus circulans WL-12//Gene.-1990.-№ 1-P. 113-117.

178. Yu Z., Staddon W. Partial characterization of a Candida albicans flmbrial adhesin // Infect. Immun. 1994. - № 62 - P. 2834-2842.

Информация о работе

Сачивкина, Надежда Павловна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Влияние микробного фермента литиказы на развитие экспериментального кандидозного вагинита - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы