Совершенствование лабораторной диагностики инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, с использованием компьютерных технологий

Чемурзиева, Наталья Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование лабораторной диагностики инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, с использованием компьютерных технологий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование лабораторной диагностики инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, с использованием компьютерных технологий"

На правах рукописи

0034488 12

ЧЕМУРЗИЕВА Наталья Вадимовна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С УСЛОВНО ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЬЮТЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОКТ 2008

Пермь-2008

003448812

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования Пермская Государственная медицинская академия им академика Е А Вагнера Росздрава Пермь

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор

Карпунина Тамара Исаковна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук

Октябрьский Олег Николаевич

доктор медицинских наук

Зубарева Надежда Анатольевна

Ведущая организация Омская Государственная медицинская академия Омск

диссертационного совета ДМ004 019 01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, г Пермь, ул Голева, 13 Факс (3422)44 67 11

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН http //www iegm ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан « J? » ¿v; г><е~е>М^2008 г

Защита состоится «

w 2008 года в /¿Р часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

Введение

Актуальность проблемы Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие существенно изменилась, что связано с постоянной эволюцией бактерий и вовлечением в патологические процессы условно патогенных микроорганизмов (Gahnski el al, 1994, Csonka, 1996, Priestley, 1997, Анкирская, 2000, Кисина, 2002, Ленгелер с соавт, 2005) В связи с двойственной природой последних - условно патогенные микроорганизмы (УПМ) в качестве комменсалов присутствуют в составе нормальной микрофлоры здоровых людей, а также регистрируются как этиопатогены при различных местных и генерализованных процессах - у клиницистов нередко возникают сложности при оценке результатов обследования, определении целесообразности назначаемого лечения и

выборе лекарственных препаратов (Петрович, 2001, Коломойцева, 2004, Володин, Коршунов 2008, Падейская, 2008) В диагностике неспецифических инфекций до последнего времени решающее значение при определении этиологической значимости придавалось численности обнаруженных микроорганизмов в пораженном органе, а в случае микстинфекции - установлению количественных соотношений между ассоциангами (Кира, 2001, Падруль и соавт, 2004, Борисов, 2005) Однако многими исследователями (Кудрявцева с соавт, 2001, Reid, 2004 и др) в подобных ситуациях зачастую более существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности Ценность этого критерия повышается при выявлении не одного, а нескольких факторов вирулентности, и особенно в патогенетически значимой дозе и/или уровне активности Теперь стало очевидно, что такие диагностические тесты, как ИФА и ПЦР, высоко информативные при заболеваниях, вызванных абсолютными патогенами, не обеспечивают адекватную диагностику при инфекциях, обусловленных условно патогенными микроорганизмами (Dommgue et al, 2003, Michailova et al, 2005, Елисеева с соавт, 2006) В то же время метрические параметры, в частности степень обсемененности исследуемого материала, размеры микробных клеток и колоний, уровень чувствительности к антибиотикам, регистрируются посредством визуальной оценки результатов культурального исследования Такой способ обработки информации в значительной степени

субъективен Тем не менее, подобные характеристики могут отражать функциональное состояние микроорганизмов, что особенно актуально при оценке вовлеченности условно патогенных представителей в патологический процесс Решение вопроса об этиологической роли УПМ в очаге поражения облегчается при выяснении ответной реакции макроорганизма в зоне первичной колонизации, поскольку степень реактивности и динамические изменения показателей локальных факторов неспецифической защиты в существенной мере отражают «поведение» условного патогена как комменсала или возбудителя инфекционного процесса В подобных случаях использование неинвазивных методов исследования наиболее предпочтительно, поскольку любое повреждение слизистых и кожных покровов повышает риск микробной контаминации внутренней среды организма Весьма перспективным для определения бактерицидных и бактериостатических свойств биологических жидкостей, на наш взгляд, является использование рекомбинантных штаммов бактерий, несущих плазмиды с lux-оперонами природных люминесцирующих микроорганизмов и методы клинической кристаллографии биологических жидкостей (БЖ) (Пшеничнов, 2002, Дерябин, 2004, Шабалин, 2005) Они высокоспецифичны, экспрессны и мало затратны Однако общепринятая оценка полученных результатов, основанная лишь на описательных характеристиках, значительно снижает их диагностическую значимость и практически исключает возможность стандартизации (Ruderman et al, 1998, Kern, 2002, Theodondis et al, 2003) Именно поэтому, использование методов компьютерной морфометрии, позволяющих объективизировать данные лабораторной диагностики, становится все более востребованным в клинической медицине и достаточно широко применяется в цитологических, гистологических и патоморфологических исследованиях (Фот с соавт, 2002, Свешников, 2006, Тугой с соавт, 2006) Однако в микробиологической диагностике данные методы анализа используется крайне ограниченно

актуальной и насущной проблемой клинической микробиологии Применение компьютерных технологий, адаптирование существующих аналитических программ к задачам микробиологического исследования позволят подойти к решению этого вопроса с позиций доказательной медицины

Цель настоящей работы: повышение информативности и объективизация результатов микробиологических исследований при оценке этиологической значимости условно патогенных микроорганизмов с помощью методов компьютерной морфометрии

Основные задачи исследования

- оценить возможности традиционных методов микробиологического анализа в диагностике инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами

- на основе компьютерных технологий отобрать и усовершенствовать методические приемы, способствующие определению роли УПМ, изолируемых из материала обследованных пациентов

- разработать новые подходы к оценке локальных ответных реакций в зоне инфицирования УПМ

- разработать алгоритм комплексной оценки этиологической значимости УПМ при различных инфекционных процессах

Научная новизна Впервые на основе комплексного подхода определена этиологическая значимость УПМ, изолируемых при микробиологическом исследовании различного патологического материала Показано, что на этапе скрининга для идентификации выделенного штамма в качестве возбудителя инфекции, наряду с определением степени обсемененности анализируемого образца, целесообразно изучение морфометрических характеристик выделенных микроорганизмов, которые различны у соименных видов, вызывающих заболевание и входящих в норме в состав представителей транзиторной или облигатной микрофлоры организма-хозяина Впервые обоснована информативность морфометрии с применением компьютерного анализа цифровых изображений клеток и колоний исследуемых культур в определении роли УПМ в патологическом процессе

Впервые с помощью компьютерных технологий выявлена возможность получения ошибочных результатов при оценке степени антибиотикочувствительности микробных культур диско-диффузионным методом, и предложен оригинальный подход к решению этой задачи Показано, что основанное на автоматической регистрации оптической плотности измерение диаметра зоны задержки роста вокруг диска, нагруженного соответствующим антибиотиком, повышает эффективность этого метода преимущественно при исследовании штаммов с промежуточной резистентностью

Впервые предложен новый подход к дифференциации природы (асептическая или инфекционная) воспалительных процессов Для его реализации при открытой травме глаза рассчитан оригинальный дифференцирующий коэффициент (К<1) на основе количественной оценки структурообразующих компонентов кристаллограмм слезной жидкости Доказано, что при Кс1 < 3,1 воспаление связано с инфекционным процессом (Заявка № 2008108059 Приоритетная справка от 29 02 2008)

Впервые для определения бактерицидной активности раневого отделяемого (БАРО) показана возможность регистрации гашения люминесценции биотестов с использованием компьютерных технологий Уровень БАРО учитывается посредством оригинального коэффициента бактерицидности (Кб) Установлено, что предложенная модификация повышает информативность исследования по сравнению с существующими технологиями (Патент на изобретение №2321858 «Способ оценки интенсивности воспалительной реакции в операционной ране»)

Теоретическая и практическая значимость. Выработан новый алгоритм оценки этиологической значимости УПМ при их обнаружении в исследуемом материале, учитывающий как биологические особенности изолятов, так и ответную реакцию макроорганизма в зоне первичной колонизации Предложены коэффициенты, позволяющие оценивать изучаемые процессы в количественном выражении Применение предложенных методов при определении чувствительности микробных культур к антибиотикам повышает качество проводимого исследования

Использование количественных показателей при кристаллографическом исследовании биологических жидкостей позволяет выработать стандартные

критерии для диагностики патологических состояний Внесены изменения в режимы микрофотосъемки кристаллограмм, значительно улучшающие качество получаемых изображений и обеспечивающие возможность их автоматической обработки В серии специальных экспериментов определено оптимальное количество исследуемого материала и обоснована целесообразность использования его минимальных объемов без потери качества

Показано, что компьютерные технологии при оценке этиологической значимости УПМ придают применяемым методикам экспрессность и повышают их объективность Использование методов компьютерной морфометрии позволяет не только производить измерения в автоматическом режиме, но и систематизировать, подвергать статистической обработке, архивировать аналитические данные, что в значительной степени облегчает микробиологический мониторинг инфекций, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами

Основные положения, выносимые на защиту: 1 Биологические особенности условно патогенных микроорганизмов, вызывающих локальные инфекционные процессы, обусловливают необходимость комплексного подхода к оценке этиологической значимости изолируемых штаммов с учетом их количества, степени патогенности и ответной реакции организма в очаге поражения

2 Использование адаптированных компьютерных программ для обработки данных микробиологического анализа существенно объективизирует интерпретацию полученных результатов и облегчает их учет при диагностике инфекций, ассоциированных с условно патогенной микрофлорой

3 Применение компьютерных технологий при оценке состояния биологических жидкостей как одного из показателей изменения ответной реакции в динамике инфекционного процесса расширяет аналитические возможности и повышает информативность применяемых диагностических тестов

Личный вклад автора в проведенное исследование: автором самостоятельно проведены микроскопические и бактериологические исследования, разработаны новые и модифицированы существующие способы обработки их результатов, адаптированы возможности морфометрических программ (Image-

Рго+, Морфология-Мастер) для решения микробиологических задач, а также проведена систематизация и анализ полученных результатов

Апробация работы и публикации: основные положения работы доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), Юбилейной научно-практической конференции ФМБА России «Высокие технологии в промышленной медицине» (Пермь, 2008), Научной сессии ГОУ ВПО ПГМА им ак Е А Вагнера Росздрава (Пермь, 2008)

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получены Патент Российской Федерации №2321858 от 10 04 2008, приоритетная справка на Заявку на изобретение №2008108059 от 29 02 2008, приоритетная справка на Заявку на изобретение №2008113940 от 09 04 2008

Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в практику Городского центра репродукции и планирования семьи при МСЧ №9, г Перми, отделения травмы глаза Краевой клинической больницы, отделения общей хирургии ГКБ №2 г Перми Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии и вирусологии, офтальмологии, факультетской хирургии с курсом урологии ГОУ ВПО ПГМА им ак Е А Вагнера Росздрава

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им ак Е А Вагнера Росздрава (номер государственной регистрации темы 0120 0502713)

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 218 источников, из них 175 отечественных и 43 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 15 таблицами и 27 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа выполнена в ГОУ ВПО ПГМА им ак Е А Вагнера Росздрава на кафедре микробиологии и вирусологии (заведующий кафедрой - доктор медицинских наук, профессор Э С Горовиц), в Отделе учебно-методического и научного обеспечения

Лабораторному и экспериментальному изучению были подвергнуты следующие материалы 286 образцов вагинального секрета женщин репродуктивного возраста с различными инфекционными заболеваниями влагалища, 59 и 24 образца патологического материала от больных торакального отделения и отделения реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) соответственно, 60 образцов смывов с аппаратуры ИВЛ из ОРИТ, 64 образца слезной жидкости от больных с травмой глаз и 15 (контроль) - от здоровых людей, а также 20 образцов раневого отделяемого от пациентов Центра колопроктологии «Евромедсервис» и 15 культур микроорганизмов клинических изолятов, любезно предоставленных бактериологической лабораторией Городской клинической больницы №7, для сравнительной оценки степени их антибиотикочувствительности

Для определения роли УПМ в инфекционном процессе изучали морфофункциональные особенности выделенных микроорганизмов традиционными микробиологическими методами При цитологическом исследовании вагинального секрета учитывали количество лейкоцитов, эпителиальных клеток в поле зрения, определяли их суммарное количество (СК) и цитологический коэффициент (ЦК) (Трухина, 2005, Машуров, 2008), при микроскопическом - наличие мицелия и бластоспор Candida (Кубанов с соавт, 2001), численность и морфотипы сопутствующей микрофлоры, а также присутствие «ключевых» клеток Морфометрическому анализу подвергали клетки и колонии С albicans Бактериологические исследования вагинального секрета проводили согласно методике Р В Федорова, Е Р Федоровой, Н Ю Матюхиной (1995), содержимого эмпиемной полости больных торакального отделения, смывов с внутренних поверхностей дыхательной аппаратуры ИВЛ в отделении РИТ проводили в соответствии с приказом МЗ РФ №535 от 22 07 85 «Об

унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях», а также с практическими рекомендациями Российской ассоциации специалистов по хирургическим инфекциям (2004) При идентификации бактерий рода Pseudomonas, дополнительно учитывали образование пигмента и их способность расти при 42°С Биохимическое исследование фосфолипазной активности (ФЛА) Candida albicans и Pseudomonas auruginosa выполняли на основе методики ГН Нестеровой с соавт (1987) Морфометрическое определение ФЛА проводили на основе методики Е А Трухиной (2005) с вычислением коэффициента вирулентности (Кв), рассчитанного по соотношению площадей сформировавшейся колонии и зоны опалесценции, образовавшейся вокруг нее Для изучения

атибиотикочувствительности использовали диско-диффузионный метод При оценке полученных результатов для определения диаметра зоны задержки роста применяли метод компьютерной морфометрии Уровень местной ответной реакции при открытой травме глаза оценивали по результатам, полученным методом клиновидной дегидратации слезной жидкости, с последующим вычислением предложенного нами дифференцирующего коэффициента (Kd) Для определения бактерицидной активности раневого отделяемого при хирургических вмешательствах применяли метод автоматической регистрации гашения биолюминесценции с использованием био-теста «Эколюм-5» (Данилов, Зарубина, 2001) Контроль осуществляли стандартным бактериологическим методом (Дерябин, Поляков, 2005) При компьютерной обработке материала была использована программа Image-Pro+ Для оценки полученных результатов применяли методы описательной статистики Обработку статистических данных проводили с использованием стандартных пакетов программ MS «Excel, 2000» и Statistica 6 0

Результаты исследования и их обсуждение Для реализации комплексного подхода к оценке этиологической значимости УПМ, предполагающего изучение как свойств изолируемых штаммов, так и показателей реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации, работа проводилась в двух направлениях, характеризующих особенности микроорганизма и ответную реакцию макроорганизма Было выполнено

углубленное «слепое» микробиологическое исследование 88 образцов вагинального секрета, отобранных при микроскопии мазков 286 женщин, проходивших обследование в городском Центре планирования семьи и репродукции Основным критерием отбора служило выявление бластоспор и /или псевдомицелия дрожжеподобных грибов

Результаты традиционных (цитологического, бактериоскопического, бактериологического) методов исследования позволили выделить III основные группы К I группе отнесли образцы (п=35), морфологические и количественные характеристики которых соответствовали состоянию нормоценоза и кандидоносительства Для II группы (п=20) были свойственны признаки острой монокандидозной инфекции, в частности, количество грибов Candida составило в среднем 7,49±0,31 lg КОЕ/мл, наблюдались мицелиарные формы гриба Численность лактобактерий составила 6,05±0,05 lg КОЕ/мл на фоне общего снижения как общего количества, так и видового разнообразия сопутствующей микрофлоры III группа была представлена 33 образцами (37,5 % от общего количества) с нечетко выраженными признаками инфекции Данные микологического исследования образцов этой группы отличались значительным разбросом показателей lg КОЕ/мл = 5,3±1,2 (М±с), те грибы выявляли как в диагностически значимых (5,7±0,65), так и незначимых (4,8±0,12) количествах, обнаруживали «ключевые» клетки, типичных представителей родов Bactercndes, Gardnerella, Mobiluncus, лактоморфотипы отсутствовали или определялись как единичные не во всех полях зрения Культуральная диагностика выявила снижение титра лактобактерий до 3,01+0,05, характерным было и присутствие строгих анаэробов в высоких титрах Таким образом, более трети проб исследованного материала с диагностической точки зрения оказались проблемными (табл 1)

В подобных ситуациях роль условных патогенов, в том числе С albicans, в воспалительном процессе традиционно определяется по количественному признаку (КОЕ/мл), учитываемому при культуральном исследовании В то же время, по мнению ряда авторов (Богомолова, 1987, Хмельницкий, 2000), количественные характеристики не являются исчерпывающими и не всегда отражают истинное участие выделенного микроорганизма в инфекционном процессе Активная колонизация при развитии инфекционного заболевания

Таблица 1

Состав микрофлоры влагалища пациенток обследованных групп

Показатели I группа (n=35) П группа (n=20) III группа (n=33) P< 0,05

lg КОЕ/мл Количество случаев lg КОЕ/мл Количество случаев lg КОЕ/мл Количество случаев

Lactobacillus spp 6,1 ±0,07 35(100%) 6,05±0,05 18(90%) 3,0 ±0,28 28 (84,8%) ** ***

Е coli 3,7±0,39 9(25,7%) 1,32 ±0,32 17 (85%) 1,4 ±0,77 8 (24,2%) * ** *** > >

Enterobacteriaceae(npo4ue) 3,15±0,29 7(20%) 2,63 ± 0,34 10 (50%) 2,7 ±0,96 5 (15,1%) •

Saureus 3,25±0,11 8(22,8%) 2,48 ±0,31 5 (25%) 3,6 ±0,87 3 (9%) *

S epidermidis 3,1 ±0,09 11(31,4%) 1,5 ±0,24 13 (65%) 1,2 ±0,96 7(21,2%) *

Staphylococcus sp (haem+) 2,35+0,54 12 (60%) 3,3 ± 0,43 18(54,5%)

Streptococcus sp (haem +) 1,79±0,38 6(17,1%) 1,1 ±0,28 9 (45%) 3,3 ±0,87 10 (30,3 %) ** *** »

Streptococcus sp (haem -) 2,86±0,92 5(14,2%) 1,15±0,18 7(35%) 5,3 ±0,87 12(36,4%) ** ***

Corynebacterium spp 3,6±0,08 10(28,5%) 1,2 ± 0,11 9 (30%) 3,6 ±0,63 13 (39,4%) *

Bacteroides spp 2,48±1,01 7(20%) 2,25±0,65 4(20%) 8,45 ± 0,71 14 (42,4%) ** ***

Mobiluncus spp 1,87±0,63 3(8,5%) 1,45±0,0 1(5%) 10,0 ± 0,25 30(90,9%) ** *** »

Gardnerella spp 2,95±0,88 8(22,8%) 2,3±0,77 4(20%) 9,85 ± 0,87 17(51,5%) ** ***

Peptococcus spp 3,75 ± 0,21 11 (33,3%)

Peptostreptococcus spp 3,6 ±0,19 13 (39,4%)

Candida spp 2,3±0,08 35(100%) 7,49 + 0,31 20(100%) 5,3±1,2 33 (100%) * ** *** » >

*- I- Пгруппа ** - II-1П группа *** - I - 1П группа

диктует необходимость перераспределения внутриклеточной энергии с приоритетом процессов интенсивного деления, что должно отражаться на размерах микроорганизма Основываясь на данных литературы (Перт, 1978, Сергеев, 2001, Ленгелер, 2005), мы предприняли попытку оценить возможность использования метрических характеристик для определения роли С albicans в воспалительном процессе С этой целью морфометрическому анализу подвергали цифровые фотографии колоний, выросших на плотной среде Сабуро, а также приготовленные из них мазки-препараты, окрашенные по Граму Количество колоний регистрировали в автоматическом режиме Их метрические данные в заранее откалиброванных единицах измерения (см - для колоний, мкм - для клеток) заносились в электронные таблицы и статистически обрабатывались Полученные при этом результаты позволили выделить две подгруппы - Ша и Шб В подгруппе Ша выделенные штаммы не требовательны к температуре культивирования, колонии Candida чаще всего сформировывались к концу первых суток, как в условиях термостата, так и при комнатной температуре, диаметр колоний равнялся 1,32 ± 0,267 см, а при анализе изображений мазков-препаратов выявлены клетки крупных размеров (2,9±,87 мкм в длину и 2,2±0,65мкм в поперечнике), с типичной для бластоспор С albicans морфологией, иногда почкующиеся При этом все выделенные штаммы по изученным морфологическим свойствам можно отнести к "авирулентным" (Богомолова, 1987, 1991), когда грибы оцениваются как представители транзиторной нормофлоры В подгруппе Шб размеры колоний были достоверно (р=0,02) меньше, образование колоний в условиях термостата происходило к концу вторых суток, а при комнатной температуре культуры прорастали через 72 часа и более, либо вообще не давали роста Клетки гриба были более мелкие (2,4±0,83 мкм в длину, 2,1±0,59 мкм в поперечнике), выявлялись мицелиальные формы, что косвенно указывало на вовлеченность С albicans в патологический процесс Таким образом, полученные метрические данные позволяли предположить, что в подгруппе Illa С albicans присутствовали лишь в качестве комменсалов, а в подгруппе III6 - как возбудители инфекционного процесса Исходя из имеющихся в литературе данных о том, что фосфолипазная активность (ФЛА) С albicans может отражать степень их

вирулентности (ОЬаппоит, 2000, Трухина, 2005), мы использовали этот показатель для подтверждения наших предположений

В серии специальных экспериментов нами проведен сравнительный анализ двух методов определения фосфолипазной активности - традиционного и морфометрического При этом была установлена сильная прямая связь (г=0,91) между показателями ФЛА, полученными традиционным способом и рассчитанными на основе компьютерной морфометрии Поскольку биохимическое определение ФЛА достаточно трудоемко и продолжительно во времени, использование с этой целью посева на среду Сабуро с желтком представляется наиболее предпочтительным, а применение компьютерного анализа при учете результатов повышает информативность такого исследования (рис 1)

При этом для группы Ша коэффициент вирулентности равнялся 0,35±0,087, а для группы Шб - 0,77±0,136, что в соответствии с данными ЕВ Трухиной (2005) подтвердило наши предположения о роли С albicans как комменсалов в группе Ша и как возбудителей в группе Шб Сведенные воедино данные морфометрического анализа (табл 2), отражающие особенности представителей каждой подгруппы, свидетельствуют о целесообразности такого подхода при определении роли Candida в патологическом процессе

С целью подтверждения универсальности компьютерного морфометрического анализа мы использовали в качестве дополнительного маркера для дифференцировки госпитальных штаммов определение фосфолипазной активности культур Р aeruginosa - одного из наиболее часто встречающихся возбудителей внутрибольничных инфекций, изолированных от больных торакального отделения, ОРИТ и из смывов с аппаратов ИВЛ отделения

Рис 1 Проявление фосфолипазной активности С. albicans на среде Сабуро с добавлением желтка

РИТ При этом выявили следующую закономерность штаммы, выделенные из образцов смывов, и изоляты из транстрахеального аспирата больных ОРИТ , как правило, отличались более высоким (р = 0,02) уровнем ФЛА (Кв = 1,2 ± 0,15 и Кв = 1,1 ± 0,21 соответственно), чем культуры от больных торакального отделения (0,49 ± 0,137) Как считают многие исследователи, именно этому ферменту принадлежит ведущая роль в патогенезе пневмоний, поскольку благодаря ФЛА

Таблица 2

Метрические характеристики культур С. albicans

Характеристики Группа III а Группа III б

Форма клеток Продолговатые единичные клетки и шаровидные, почкующиеся формы, чаще крупные Почкующиеся клетки гриба, округлой формы, нити псевдомицелия, чаще мелкие

Размер клеток М(5) длина (мкм) поперечник (мкм) 2,85± 0,877 2,23 ±0,641 2,66± 0,855 2,12±0,622

Коэффициент сферичности 1,44 1,61

Диаметр колоний (см) 1,32±0,267 0,33±0,021

Степень ФЛА (Кв) 0,35± 0,087 0,77±0,136

^ КОЕ/мл 4,8±0,12 5,7+0,65

микроорганизмам удается разрушать поверхностный слой альвеолярных мембран (сурфактант), содержащих значительное количество фосфолипидов Важно подчеркнуть, что характерной особенностью госпитальных штаммов является способность формировать биопленки на поверхности синтетических полимеров -материалов, из которых изготовлены детали дыхательного оборудования Как считают исследователи, именно в таком состоянии бактерии способны «консервировать» биохимические свойства, отвечающие за биодеградацию защитных покровов и факторов неспецифической резистентности макроорганизма При попадании в органы дыхания они успешно реализуют накопленный потенциал

(Ершов с соавт., 2000, Chastre et. al, 2002, Faberga et al, 2002). Использование показателя уровня ФЛА в качестве дополнительного маркера госпитальных штаммов, в первую очередь в ОРИТ, представляется нам целесообразным.

Важной характеристикой внутрибольничных штаммов микроорганизмов является и показатель их антибиотикочувствительности (Меньшиков, 2002, Сидоренко, 2002, Руднов, 2006). Общепринятый метод серийных разведений отличается трудоемкостью, а интерпретация результатов, полученных диско-диффузионным методом, в ряде спорных случаев вызывает серьезные затруднения. Нами была изучена чувствительность к антибиотикам 15 микробных культур, выделенных из клинического материала, и предложен модифицированный способ учета результатов, в основу которого положена автоматическая регистрация диаметра зоны задержки роста (ЗЗР).

Принцип регистрации основан на разнице оптических плотностей питательной среды и «микробного газона». В качестве примера приводим результаты определения антибиотикочувствительности Streptococcus pneumoniae к некоторым препаратам (рис.2). В случаях с амикацином по результатам «ручного» измерения культуру S. pneumoniae, в соответствии с рекомендациями CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institution, 2005) следует отнести к резистентным, в то же время данные автоматического определения свидетельствуют о её промежуточной резистентности.

Препарат I 11

D (мм) S ((мм2) D ((мм) S (мм (2)

Амикадин 14 153,9 16,1 298,1

Эритромицин 16 200,9 14,1 140,9

а б

Рис.2. Иллюстрация автоматической обработки (а) регистрации диаметров (В) и площадей (5) зон задержки роста (б), выполненных в «ручном» (I) и автоматическом (II) режимах.

В случае с эритромицином при «ручном» измерении показатели соответствуют таковым у культур с промежуточной резистентностью, в то время как по результатам автоматической обработки штамм следует отнести к резистентным.

Подобные расхождения в расчетах объясняются, во-первых, тем, что при автоматической обработке учитываются показатели не двух, как принято, а интегрированная величина 180 диаметров, измеренных с интервалом в 2 градуса Во-вторых, что является особенно важным, колонии, сформированные резистентными формами в зоне задержки роста, нередко невидимые невооруженным глазом, отличаются от нее по оптической плотности и, соответственно, не регистрируются при автоматической обработке Таким образом, значения их диаметров не включаются в расчеты, снижая интегрированный, показатель диаметра ЗЗР Следовательно, уменьшение диаметра, выявленное при компьютерной регистрации, может указывать на появление колоний в зоне задержки роста и служить косвенным свидетельством инициации селекции штамма Более того, принцип, положенный в основу подобной регистрации ЗЗР при определении антибиотикочувствительности, позволяет объективно контролировать равномерность распределения питательной среды и формирования «микробного газона» Следует также иметь в виду, что зона задержки роста не всегда соответствует форме идеального круга При компьютерной обработке изображений в основу определения площади выделенного объекта положена не традиционная формула 51 = тгг2, а интегрированная сумма площадей формирующих ее единиц (пикселей) Очевидно, логично предположить, что величина площади ЗЗР, измеренная подобным способом, является более объективным показателем антибиотикочувствительности микробной культуры и в спорных случаях может способствовать конкретизации (уточнению) полученных результатов, однако в связи с отсутствием стандартизованных величин данного показателя в своей работе мы руководствовались общепринятыми (диаметр ЗЗР) параметрами

Вторым направлением нашей работы было изучение показателей реактивности макроорганизма в зоне первичной микробной колонизации Нами проанализированы фации (высушенная на стекле капля) слезной жидкости больных с травмой глаза, полученные методом клиновидной дегидратации, с целью выявления особенностей кристаллообразования при асептических воспалительных процессах, а также процессах, обусловленных УПМ По мнению ряда авторов, при различных офтальмологических заболеваниях биохимические

показатели слезной жидкости достаточно информативны для характеристики локальных процессов (Бржеский, 1990). Инфекционное воспаление сопровождается изменением содержания общего белка и баланса белковых фракций, повышением концентрации ^А, в и М в слезе (Мошетова, Волков, 2004), что неизбежно отражается на формировании кристаллограмм (Шабалин, 2003, Алешаев, 2003, Суслеева с соавт., 2004, Девяткин с соавт., 2004, Чухман с соав., 2004, Акопян, 2005). Нами предложен способ количественной оценки, основанный на автоматическом выделении зон, формирующих фацию, и определении их площадей, по соотношению которых вычисляли дифференцирующий коэффициент (рис.3).

а б в

Рис. 3. Фрагменты фаций слезной жидкости представителей трех обследованных групп: а - контрольная группа, б - II - группа, в - III - группа

Для группы контроля дифференцирующий коэффициент (Kd) был равен 7,5±0,89, при воспалительных процессах неинфекционной природы Kd = 5,6±0,81; инфекционной природы - Kd = 3,1±0,60 (табл. 3). Несмотря на то, что во II группе бактериологическое исследование не дало результата и дифференцирующий коэффициент в среднем составлял Kd = 5,6±0,81, т.е. соответствовал асептическому воспалению, в 14,3% случаев в этой группе значение Kd = 3,2±0,45 приближалось к уровню Kd = 3,1 «септической» группы. Подобный факт может свидетельствовать о наличии существующей, но не выявленной, «скрытой» инфекции и/или указывать на высокий риск ее развития. Кроме того, он может быть связан с сопутствующей офтальмопатологией. Величина Kd в подобных ситуациях указывает на необходимость (или ее отсутствие) проведения повторного клинико-микробиологического обследования.

Таблица 3

Значения дифференцирующего коэффициента при различной степени тяжести воспалительного процесса

Контрольная группа (1^) М ± 8Э II группа (Ка) М±БО III группа (Кй) М ± БО

среднее тш шах среднее ПИП тах среднее тт тах

7,5±0,89 5,7 9,1 5,6±0,81 4,3 6,7 3,1±0,60 2,0 3,8

*р =0,006 для 1-2 группы, р =0,009 для 2-Згруппы

Важно отметить, что одним из достоинств морфометрического метода является его универсальность можно исследовать образцы любых жидких сред организма, поскольку анализируются лишь фотоизображения их фаций, принципы формирования которых одинаковы Своеобразие рисунка (текстуры) кристаллограммы, обусловленное в первую очередь биохимическим составом, и, как следствие, физико-химическим состоянием анализируемой пробы, придает специфичность получаемому результату

Оценивая ответную реакцию организма, следует учитывать, что воспаление служит патогенетической основой большинства инфекционных процессов Оно инициируется микробной инвазией и эволюционирует вместе с ней При хирургических вмешательствах повреждающее действие операционной травмы становится фоном, на котором либо возникает и прогрессирует инфекционное осложнение, либо флогогенные факторы устраняются и происходит репарация поврежденных тканей (Маянский, 2006) Помешать микробной колонизации раневой поверхности - самый простой способ заблокировать инфекционный процесс Соответственно, раневое отделяемое должно обладать выраженной антиколонизационной активностью, т к содержит антиадгезивные, биостатические, биоцидные факторы, активность которых возрастает в ответ на микробную инвазию Таким образом, уровень бактерицидной активности биологических жидкостей в зоне повреждения может стать свидетельством участия УПМ в воспалении (Воеводина, с соавт 1990, Савченко с соавт 1996, Дерябин с соавт 2005)

Нами проанализирована бактерицидная активность 20 образцов раневого отделяемого, которую мы тестировали по подавлению биолюминесценции микроорганизмов. В частности, анализ влияния проб раневого отделяемого на свечение рекомбинантного штамма Е.соН выявил прогрессирующее падение уровня биолюминесценции по мере увеличения времени контакта с ним (рис.4).

а б

Рис. 4. Результаты автоматической регистрации светящихся объектов в контроле (а) и в опыте (б) после 30-минутной экспозиции.

Ингибирующее действие проявлялось уже к 10-й минуте инкубации, достигая максимума к 30-й, и в дальнейшем достоверно не изменялось. При параллельном исследовании проб были прослежены однотипные тенденции в подавлении свечения (количества светящихся клеток) и снижении доли бактерий, выживших после 10, 20, 30, 40 мин контакта с образцами раневого отделяемого. Вместе с тем число клеток, сохранивших жизнеспособность после 30—40 мин экспозиции и определенных при посеве на плотную питательную среду, оказалось практически вдвое больше, чем количество «светящихся» объектов. Поскольку гашение бактериальной люминесценции отражает воздействие на клеточную стенку комплекса бактерицидных факторов (комплемента, лизоцима, Р-лизина и т.д.), то снижение числа объектов, соответствующих заданным компьютерной программой порогам яркости и регистрируемым в автоматическом режиме, может быть связано с проявлением не только бактерицидного, но и бактериостатического воздействия раневого отделяемого. Такой эффект не выявляется посредством культурального метода, хотя и отражает ответную реакцию в очаге инфекции. На основании проведенных исследований был предложен коэффициент

бактерицидности (Кб), рассчитанный по формуле

Кб = (Ак - А„)/Ак х 100, где Ак и Ас- средние значение количества светящихся объектов, определенные при автоматизированном подсчете 10 полей зрения в контроле и опыте соответственно При значении К6 > 60% интенсивность воспалительной реакции оценивали как высокую, соответствующую развитию инфекционно-воспалительного осложнения в зоне хирургического вмешательства Динамические наблюдения за БАРО показали, что ее максимальные значения проявлялись спустя сутки после операции Поскольку во всех случаях наблюдали положительную динамику послеоперационного процесса, изменения БАРО носили однотипный характер, и к 6-м суткам ее уровень снижался на 27 - 34%

На основании проведенных исследований разработан алгоритм (рис 4) определения этиологической значимости УПМ, учитывающий как особенности микроорганизмов, так и степень реактивности макроорганизма На первом этапе используются традиционные микробиологические тесты, а также применяются кристаллографический и биолюминесцентный методы исследования соответствующих биологических жидкостей Дальнейшую обработку результатов проводят в автоматическом режиме, используя возможности компьютерных программ анализа изображений Наибольшая сложность заключается в выборе характеристик, подлежащих автоматическому учету, и критериев для маркировки анализируемых объектов, а также программного ресурса, способного решить поставленные задачи Предлагаемый подход представляется нам оптимальным, поскольку, суммируя полученные результаты, как правило, удается определить этиологическую значимость изолируемого микроорганизма

Выводы.

1 Установлено, что в диагностике инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, результаты традиционных методов микробиологического анализа более чем в трети (37,5%) проанализированных случаев не позволяют однозначно определить этиологическую значимость последних

2 Выявлено, что бактериоскопические и бактериологические тесты, в том числе оценка антибиотикочувствительности, отражают патогенетический потенциал изолируемых условно патогенных микроорганизмов

Рис 4 Алгоритм определения этиологической значимости условно патогенных

микроорганизмов

Использование компьютерных технологий при определении метрических характеристик клеток и колоний, зон задержки роста микробного "газона" для оценки антибиотикочувствителыюсти при диско-диффузионном методе, уровня ферментативной активности изолированных микроорганизмов с расчетом коэффициента вирулентности, повышают значимость этих тестов, обеспечивая их статистическую достоверность

3 Показано, что предложенный способ оценки чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, основанный на компьютерной обработке диаметров зон задержки роста вокруг стандартного диска, способствует конкретизации результатов исследования штаммов с промежуточной резистентностью и позволяет контролировать равномерность распределения питательной среды и формирования микробного "газона"

4 Для дифференциальной диагностики воспалительных процессов инфекционной и неинфекционной природы разработан способ количественной оценки кристаллограмм биологических жидкостей и на примере слезной жидкости рассчитан дифференцирующий коэффициент (КУ), который способствует оценке "вовлеченности" изолируемых условно патогенных микроорганизмов в патологический процесс

5 Для оценки бактерицидной активности раневого отделяемого в зоне первичной колонизации модифицирован способ регистрации, учитывающий эффект гашения биолюминесценции биотеста с применением компьютерного анализа, и выведен коэффициент бактерицидное™ (К«), позволяющий при динамических наблюдениях определять участие микробного фактора в развитии воспалительного процесса

6 Установлено, что использование возможностей компьютерного программного обеспечения (11г^е-Рго+, «Морфология-Мастер») в соответствии с разработанным алгоритмом, регламентирующим выбор функций на каждом этапе проводимого исследования, позволяет повысить качество микробиологической диагностики

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Карпунина Т И Морфометрические показатели в оценке действия «Микосиста» на грибы рода Candida /Г И Карпунина, Е В Трухина, Н В Чемурзиева //Материалы Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» - Пермь, 2004 - С 48-49

2 Карпунина Т И Изменение микробного пейзажа содержимого пародонтальных карманов у больных хроническим генерализованным пародонтитом/ Т И Карпунина, JI Е Леонова, Е Н Таболина, Н В Чемурзиева // Естествознание и гуманизм - Томск, 2006 - Т 3 №4 - С 84-85

3 Карпунина Т И Фосфолипазы оппортунистических грибов их возможная роль в патогенезе и диагностике микозов/Т И Карпунина, А А Олина, М Г Машуров, Н В Чемурзиева, В А Драбкова// Проблемы медицинской микологии -2006 -Т 8-№4-С 41-47

4 Косарева П В Морфологическая характеристика пиелонефрита, протекающего на фоне инфекционного энтероколита, вызванного условно-патогенной микрофлорой, у детей грудного возраста/ П В Косарева, Ф А Шилова, Н И Аверьянова, Е С Патлусова, Н В Чемурзиева// Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2006 - С 176

5 Лисичкин А Л Оценка интенсивности воспалительных реакций при исследовании раневого отделяемого с использованием компьютерных технологий/ А Л Лисичкин, Н В Чемурзиева, Т И Карпунина// Вестник Уральской медицинской академической науки - 2006 - № 3 - 1(14) - С 136-138

6 Чемурзиева Н В Возможности использования методов компьютерной морфометрии в клинической диагностике/ Н В Чемурзиева, Е А Трухина// Материалы юбилейной научной сессии ПГМА - Пермь, 2006 - С 306-307

7 Чемурзиева Н В Новые подходы к обработке результатов кристаллографии слезной жидкости/ Н В Чемурзиева, В Н Бусырева, Т И Карпунина// Материалы Юбилейной научно-практической конференции ФМБА России «Высокие технологии в промышленном здравоохранении - Пермь, 2007 - С 219221

8 Чемурзиева Н В Возможности использования методов компьютерной морфометрии в микробиологической диагностике / Н В Чемурзиева,

ТИ Карпунина, НП Новоселова// Материалы 1Хсъезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов -Москва Санэпидмедиа, 2007 - Т 3 - С 93

9 Чемурзиева Н В К вопросу об оценке чувствительности бактериальных культур к антибиотикам/Н В Чемурзиева, Т И Карпунина, Н П Новоселова, Е В Афанасьевская//Вестник Российской военно-медицинской академии - 2007 -1 (17) - С 286-287

10 Карпунина ТИ Особенности диагностики вагинальною кандидоза, ассоциированного с возбудителями неспецифических вагинитов/ Т И Карпунина, А А Олина, М Г Машуров, Н В Чемурзиева, В А Драбкова// Пермский медицинский журнал - 2007 - Т 24 -№1-2 -С 62-65

11 Карпунина Т И Новые подходы к оценке кристаллографии биологических жидкостей при патологических процессах различной природы/Т И Карпунина, Н В Чемурзиева, Э С Горовиц // Материалы научной сессии ПГМА - Пермь, -2008 - С 351 -353

12 Карпунина Т И Способ оценки интенсивности воспалительной реакции в операционной ране/ Патент на изобретение №2321858 10 апреля 2008 // Т И Карпунина, А Л Лисичкин, Н В Чемурзиева, Ю Б Бусырев

13 Карпунина ТИ Способ дифференциальной диагностики инфекционно-воспалительных осложнений при травме глаза/ Заявка №2008108059, приоритетная справка от 29 02 2008 // ТИ Карпунина, Э С Горовиц, Н В Чемурзиева, В Н Бусырева

14 Карпунина ТИ Способ дифференциальной диагностики бактериального вагиноза и неспецифического вагинита/ Заявка №2008113940, приоритетная справка от 09 04 2008 // Т И Карпунина, А А Олина, Н В Чемурзиева

ЧЕМУРЗИЕВА Наталья Вадимовна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 01 10 2008 Формат 60x90/16

Набор компьютерный Уел печ л 1 _Тираж 100 экз Заказ № 733/2008_

Отпечатано в типографии «Пресстайм» Адрес 614025, г Пермь, ул Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чемурзиева, Наталья Вадимовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I Современные представления об этиологической роли условно патогенных микроорганизмов и способах ее оценки (Обзор литературы ).

1.1. Особенности взаимодействия условно патогенных микроорганизмов и макроорганизма.

1.1.1. Биологические особенности условно патогенных микроорганизмов.

1.1.2. Особенности инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами.

1.2. Основные подходы к изучению и оценке этиологической роли условно патогенных микроорганизмов.

1.2.1. Бактериологические исследования.

1.2.2. Морфофункциональные характеристики условно патогенных микроорганизмов.

1.2.3. Определение антибиотикочувствительности условно патогенных микроорганизмов.

1.3. Проявление ответной реакции макроорганизма в зоне первичной колонизации.

1.3.1. Кристаллографические методы исследования биологических жидкостей для определения роли условно патогенных микроорганизмов в воспалительном процессе.

1.3.2. Использование био-тестов для определения реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации.

ГЛАВА II Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Микроскопические методы.

2.2.1. Цитологическое и бактериоскопическое исследование вагинального секрета.

2.3. Бактериологические методы.

2.3.1 Бактериологическое исследование вагинального секрета.

2.3.2. Бактериологическое исследование образцов патологического материала из торакального отделения, ОРИТ и смывов с ИВЛ.:.

2.3.3. Бактериологическое исследование раневого отделяемого при открытой травме глаза.

2.4. Определение антибиотикочувствительности.

2.5. Биохимические методы.

2.5.1. Определение фосфолипазной активности Candida albicans на яично-желточной плотной среде.

2.5.2.

Определение фосфолипазной активности Candida albicans на желточно-буферной смеси.

2.5.3. Определение фосфолипазной активности Pseudomonas auruginosa.

2.6. Определение бактерицидной активности раневого отделяемого.

2.7. Морфометрические методы исследования.

2.8. Кристаллографические методы исследования.

ГЛАВА III Неспецифические и внутрибольничные инфекции.

3.1. Исследование Candida albicans при различных формах кандидозной инфекции.

3.1.1. Микроскопические исследования.

3.1.2. Бактериоскопические критерии различных вариантов кандидозной инфекции влагалища.

3.1.3. Результаты культурального исследования вагинального секрета.

3.2. Возможности морфометрического анализа в совершенствовании диагностики кандидозной инфекции.

3.2.1. Использование морфометрического метода для 63. определения фосфолипазной активности С. albicans

3.3. Внутрибольничные инфекции.*.

3.3.1. Метод компьютерной морфометрии при оценке вирулентности Pseudomonas aeruginosa.

3.3.2. Возможности компьютерной морфометрии при оценке антибиотикочувствительности.

ГЛАВА IV Условно патогенные микроорганизмы и инфекционные осложнения при оперативных вмешательствах.

4.1. Микробиологическое исследование раневого 77 отделяемого.

4.2. Кристаллография слезной жидкости при открытой травме глаза.

4.3. Методы определения бактерицидной активности раневого отделяемого.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование лабораторной диагностики инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, с использованием компьютерных технологий"

Актуальность проблемы. Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие существенно изменилась, что связано с постоянной эволюцией бактерий и вовлечением в патологические процессы условно патогенных микроорганизмов [8, 62, 190]. В связи с двойственной природой последних — условно патогенные микроорганизмы (УПМ) в качестве комменсалов присутствуют в составе нормальной микрофлоры здоровых людей, а также регистрируются как этиопатогены при различных местных и генерализованных процессах - у клиницистов нередко возникают сложности при оценке результатов обследования, определении целесообразности назначаемого лечения и выборе лекарственных препаратов [33, 67, 87, 106, 110]. В диагностике неспецифических инфекций до последнего времени решающее значение при определении этиологической значимости придавалось численности обнаруженных микроорганизмов в пораженном органе, а в случае микстинфекции — установлению количественных соотношений между ассоциантами [20,59, 61, 194]. Однако многими исследователями [25,59,189] в подобных ситуациях зачастую более существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности. Ценность этого критерия повышается при выявлении не одного, а нескольких факторов вирулентности и, особенно, в патогенетически значимой дозе и/или уровне активности. Теперь стало очевидно, что такие диагностические тесты, как ИФА и ПЦР, высоко информативные при заболеваниях, вызванных абсолютными патогенами, не обеспечивают адекватную диагностику при инфекциях, обусловленных условно патогенными микроорганизмами [46, 185]. В то же время, метрические параметры, в частности, степень обсемененности исследуемого материала, размеры микробных клеток и колоний, уровень чувствительности к антибиотикам регистрируются посредством визуальной оценки результатов культурального исследования. Такой способ обработки информации в значительной степени субъективен. Тем не менее, подобные характеристики могут отражать функциональное состояние микроорганизмов, что особенно актуально при оценке вовлеченности условно патогенных представителей в патологический процесс. Решение вопроса об этиологической роли УПМ в очаге поражения облегчается при выяснении ответной реакции макроорганизма в зоне первичной колонизации, поскольку степень реактивности и динамические изменения показателей локальных факторов неспецифической защиты в существенной мере отражают «поведение» условного патогена как комменсала или возбудителя инфекционного процесса. В подобных случаях использование неинвазивных методов исследования наиболее предпочтительно, поскольку любое повреждение слизистых и кожных покровов повышает риск микробной контаминации внутренней среды организма. Весьма перспективным для определения бактерицидных и бактериостатических свойств биологических жидкостей, на наш взгляд, является использование рекомбинантных штаммов бактерий, несущих плазмиды с lux-оперонами природных люминесцирующих микроорганизмов и методы клинической кристаллографии биологических жидкостей (БЖ) [38, 40, 41, 44,160, 161, 182 ] . Они высоко специфичны, экспрессны и мало затратны. Однако, общепринятая оценка полученных результатов, основанная лишь на описательных характеристиках, значительно снижает их диагностическую значимость и практически исключает возможность стандартизации. Именно поэтому, использование методов компьютерной морфометрии, автоматической обработки и оценки результатов, позволяющие объективизировать данные лабораторной диагностики, становятся все более востребованными в клинической медицине, и достаточно широко применяются в цитологических, гистологических и патоморфологических исследованиях [1, 2, 3, 31, 53, 83, 150]. Однако в микробиологической диагностике данные методы анализа используется крайне ограничено.

Комплексный подход, учитывающий как биологические особенности УПМ, так и специфику локальной ответной реакции макроорганизма, выбор наиболее информативных и доступных для практики критериев, позволяющих определить роль изолируемых штаммов в патологическом процессе, представляется актуальной и насущной проблемой клинической микробиологии. Применение компьютерных технологий, адаптирование существующих аналитических программ к задачам микробиологического исследования позволит подойти к решению этого вопроса с позиций доказательной медицины.

Цель: повышение информативности и объективизация результатов микробиологических исследований при оценке этиологической значимости условно патогенных микроорганизмов с помощью методов компьютерной морфометрии.

Задачи: оценить возможности традиционных методов микробиологического анализа в диагностике инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами.

- разработать новые подходы к оценке локальных ответных реакций в зоне инфицирования УПМ.

- разработать алгоритм комплексной оценки этиологической значимости УПМ при различных инфекционных процессах.

Научная новизна. Впервые на основе комплексного анализа обоснован новый подход к определению этиологической значимости УПМ, изолируемых при микробиологическом исследовании различного патологического материала. Показано, что на этапе скрининга для идентификации выделенного штамма в качестве возбудителя инфекции, наряду с определением степени обсемененности анализируемого образца, целесообразно изучение морфометрических характеристик выделенных микроорганизмов, которые различны у соименных видов, вызывающих заболевание и входящих в норме в состав представителей транзиторной или облигатной микрофлоры организма-хозяина. Впервые обоснована информативность морфометрии с применением компьютерного анализа цифровых изображений клеток и колоний исследуемых культур в определении роли УПМ в патологическом процессе.

Впервые с помощью компьютерных технологий выявлена возможность получения ошибочных результатов при оценке степени антибиотикочувствительности микробных культур диско-диффузионным методом, и предложен оригинальный подход к решению этой задачи. Показано, что основанное на автоматической регистрации оптической плотности, измерение диаметра зоны задержки роста вокруг диска, нагруженного соответствующим антибиотиком, повышает эффективность этого метода преимущественно при исследовании штаммов с промежуточной резистентностью.

Впервые предложен новый подход к дифференциации природы (асептическая или инфекционная) воспалительных процессов. Для его реализации при открытой травме глаза рассчитан оригинальный дифференцирующий коэффициент (Кс1) на основе количественной оценки структурообразующих компонентов кристаллограмм слезной жидкости. Доказано, что при Кс1 <3,1 воспаление связано с инфекционным процессом (Заявка № 2008108059. Приоритетная справка от 29.02.2008).

Впервые для определения бактерицидной активности раневого отделяемого (БАРО) показана возможность регистрации гашения люминесценции биотестов с использованием компьютерных технологий. Уровень БАРО учитывается посредством оригинального коэффициента бактерицидности (Кб). Установлено, что предложенная модификация повышает информативность исследования по сравнению с существующими технологиями (Патент на изобретение №2321858 «Способ оценки интенсивности воспалительной реакции в операционной ране»).

Практическая значимость. Выработан новый алгоритм оценки этиологической значимости УПМ при их обнаружении в исследуемом материале, учитывающий как биологические особенности изолятов, так и ответную реакцию макроорганизма в зоне первичной колонизации. Предложены коэффициенты, позволяющие оценивать изучаемые процессы в количественном выражении. Применение предложенных методов при определении чувствительности микробных культур к антибиотикам повышает качество проводимого исследования.

Использование количественных показателей при кристаллографическом исследовании биологических жидкостей позволяет выработать стандартные критерии для диагностики патологических состояний. Внесены изменения в режимы микрофотосъемки кристаллограмм, значительно улучшающие качество получаемых изображений и обеспечивающие возможность их автоматической обработки. В серии специальных экспериментов определено оптимальное количество исследуемого материала и обоснована целесообразность использования его минимальных объемов без потери качества.

Показано, что компьютерные технологии при оценке этиологической значимости УПМ придают применяемым методикам экспрессность и повышают их объективность. Использование методов компьютерной морфометрии позволяет не только производить измерения в автоматическом режиме, но и систематизировать, подвергать статистической обработке, архивировать аналитические данные, что в значительной степени облегчает микробиологический мониторинг инфекций, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологические особенности условно патогенных микроорганизмов, вызывающих локальные инфекционные процессы, обусловливают необходимость комплексного подхода к оценке этиологической значимости изолируемых штаммов с учетом их количества, степени патогенности и ответной реакции организма в очаге поражения.

2. Использование адаптированных компьютерных программ для обработки данных микробиологического анализа существенно объективизирует интерпретацию полученных результатов и облегчает их учет при диагностике инфекций, ассоциированных с условно патогенной микрофлорой.

3. Применение компьютерных технологий при оценке состояния биологических жидкостей, как одного из показателей изменения ответной реакции в динамике инфекционного процесса, расширяет аналитические возможности и повышает информативность применяемых диагностических тестов.

Личный вклад автора в проведенное исследование: автор самостоятельно проводил микроскопические и бактериологические исследования, разрабатывал новые и модифицировал существующие способы обработки их результатов, адаптировал возможности морфометрических программ (Image-Pro+, Морфология-Мастер) для решения микробиологических задач, а также проводил систематизацию и анализ полученных результатов.

Апробация работы и публикации: основные положения работы доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), Юбилейной научно-практической конференции ФМБА России «Высокие технологии в промышленной медицине» (Пермь, 2008), Сессии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава (Пермь, 2008).

Диссертация апробирована на расширенном заседании научного координационного Совета по микробиологии ГОУ ВПО «ПГМА им.ак. Е.А.Вагнера Росздрава» от 26 июня 2008 г.

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получены Патент Российской Федерации № 2321858 от 10.04.2008, приоритетная справка на

Заявку на изобретение №2008108059 от 29.02.2008, приоритетная справка на Заявку на изобретение № 2008113940 от 09.04.2008.

Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в практику Городского центра репродукции и планирования семьи при МСЧ №9, отделения травмы глаза Краевой клинической больницы, отделения общей хирургии ГКБ №2. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии, офтальмологии, факультетской хирургии с курсом урологии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава (номер государственной регистрации темы 0120. 0502713).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 218 источников, из них 172 отечественных и 46 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 23 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Чемурзиева, Наталья Вадимовна

ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что в диагностике инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, результаты традиционных методов микробиологического анализа более чем в трети (37,5%) проанализированных случаев не позволяют однозначно определить этиологическую значимость последних.

2. Выявлено, что бактериоскопические и бактериологические тесты, в том числе оценка антибиотикочувствительности, отражают патогенетический потенциал изолируемых условно патогенных микроорганизмов. Использование компьютерных технологий при определении метрических характеристик клеток и колоний, зон задержки роста микробного "газона" для оценки антибиотикочувствительности при диско-диффузионном методе, уровня ферментативной активности изолированных микроорганизмов с расчетом коэффициента вирулентности, повышают значимость этих тестов, обеспечивая их статистическую достоверность.

3. Показано, что предложенный способ оценки чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, основанный на компьютерной обработке диаметров зон задержки роста вокруг стандартного диска, способствует конкретизации результатов исследования штаммов с промежуточной резистентностью и позволяет контролировать равномерность распределения питательной среды и формирования микробного "газона".

4. Для дифференциальной диагностики воспалительных процессов инфекционной и неинфекционной природы разработан способ количественной оценки кристаллограмм биологических жидкостей и на примере слезной жидкости рассчитан дифференцирующий коэффициент

К<1), который способствует оценке "вовлеченности" изолируемых условно патогенных микроорганизмов в патологический процесс.

5. Для оценки бактерицидной активности раневого отделяемого в зоне первичной колонизации модифицирован способ регистрации, учитывающий эффект гашения биолюминесценции биотеста с применением компьютерного анализа, и выведен коэффициент бактерицидности (Кб), позволяющий при динамических наблюдениях определять участие микробного фактора в развитии воспалительного процесса.

6. Установлено, что использование возможностей компьютерного программного обеспечения (Image-Pro+, «Морфология-Мастер») в соответствии с разработанным алгоритмом, регламентирующим выбор функций на каждом этапе проводимого исследования, позволяет повысить качество микробиологической диагностики.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В последние десятилетия в общей структуре инфекционных заболеваний увеличивается доля неспецифических инфекций, причиной которых являются условно-патогенных микроорганизмы. Общее ухудшение экологической обстановки, снижение иммунного статуса населения предоставляют широкое поле деятельности представителям данной группы для проявления патогенных свойств. Биологические особенности УПМ, их убикваторность и гетерогенность с одной стороны, расширение спектра и утяжеление оперативных вмешательств, широкое внедрение в практику здравоохранения диагностических и лечебных процедур, связанных с нарушением целостности покровов, повсеместное применение антибиотиков -с другой, приводят к возникновению новых антибиотикорезистентных вариантов бактерий, появлению персистирующих штаммов микроорганизмов. Все это, в конечном итоге, результируется в нарастании внутрибольничных, хронических, смешанных, вторичных инфекций, сепсиса и т. д.Инфекции, вызванные условно патогенными микроорганизмами, характеризуются медленным развитием и малой напряженностью приобретенного иммунитета, что обусловливает низкий титр антител, поэтому применение таких методов диагностики как ИФА и ПЦР, являются малоэффективными. В подобных условиях проявление ответной реакции макроорганизма на инфекцию может также свидетельствовать о роли выделенных культур и их взаимоотношениях с организмом-хозяином. Очевидно, что сложившаяся ситуация диктует отработку новых подходов для определения роли условно-патогенных микроорганизмов в воспалительных процессах. Какой из представителей УПМ присутствует как комменсал, а какой является основной причиной воспаления, можно сказать, лишь изучив и вирулентные свойства каждого из ассоциантов, и степень выраженности ответной реакции макроорганизма. На сегодняшний день микробиологические методы, суть которых состоит в выделении, идентификации микроорганизмов и учете их количества, остаются основными при решении вопроса об этиологической значимости возбудителя. В то же время, численность того или иного представителя сообщества, без учета степени вирулентности, не может служить показателем его лидирующей роли в инфекционном процессе, поскольку численность микроорганизма и степень его вирулентности не всегда находится в прямой взаимосвязи. Для определения этиологической значимости необходимы дополнительные исследования. Традиционные методы связаны с определенными трудностями — длительность во времени, необходимость специализированных помещений, затрат на расходные материалы и специально обученного персонала. Проблема корректности методологии микробиологических исследований и адекватности тестов проводимого анализа поставленным задачам существует с момента формирования микробиологии как самостоятельного научного направления. В современных условиях многие сложившиеся на протяжении столетия представления и, казалось бы, незыблемые постулаты требуют пересмотра и переосмысления [45, 58, 60, 82]. Это во многом обусловлено ускорением эволюции микроорганизмов под влиянием весьма существенных изменений в условиях среды их обитания. Появляющиеся новые диагностические технологии позволяют получать огромное количество дополнительной информации, однако её интерпретация порой не только не облегчает решение задач микробиологического анализа, а, наоборот, создает дополнительные трудности для исследователей и, в особенности практиков.

Особое значение качество лабораторных исследований имеет в клинической микробиологии, поскольку своевременное и достоверное определение этиологии инфекции в значительной степени определяет успешность и эффективность проводимого лечения, а порой позволяет сохранить жизнь и здоровье пациентов с различными инфекционными заболеваниями.

Биологические особенности УПМ; убикваторность и широкое представительство в нормофлоре человека; выраженная гетерогенность их популяций; природная и приобретенная антибиотикорезистентность большинства из них - требуют новых подходов и совершенствования традиционных методов микробиологического анализа. Это позволило бы разработать достоверные критерии для дифференцировки изолируемых штаммов по основному принципу - является ли выделенный микроорганизм возбудителем или контаминантом (комменсалом, представителем транзиторной микрофлоры и т.п.).

Развитие компьютерных технологий, введение в практику лабораторного дела автоматизированных систем анализа создают предпосылки для повышения его эффективности. Однако в основном эти системы предназначены для проведения иммунологических, биохимических, цитологических исследований. Компьютерные программы, разработанные для морфологических исследований, нередко применяются в гистологической и патологоанатомической практике. Использование их в микробиологической практике встречается крайне редко. В то же время, методы классической световой микроскопии могут дать ценную информацию о значимости выделенных культур, поскольку морфологические характеристики клеток и колоний зачастую связаны со степенью их вирулентности. Полученные с помощью морфометрических программ математические характеристики последних помогут повысить значимость морфологических методов исследования при определении этиологической значимости выделенных микроорганизмов. Проявление ответной реакции макроорганизма оценивают, как правило, по изменениям биохимических показателей его внутренних сред (крови, мочи, желчи и т.д.). Поскольку приоритетность неинвазивных методов очевидна, то внедрение в практику клинических исследований новых технологий, в частности, методов кристаллографии и биолюминесцентного анализа биологических жидкостей, закономерно. Использование количественных характеристик при интерпретации результатов, полученных методом компьютерной морфометрии, позволяет подойти к оценке полученных результатов с позиций доказательной медицины. Таким образом, исходя из назревшей потребности в совершенствовании существующих классических методов диагностики оппортунистических инфекций и возможностей компьютерной морфометрни, мы адаптировали часть программ для анализа изображений к комплексной оценки роли УПМ при воспалительных процессах.

Исходя из глубокого убеждения о необходимости комплексного подхода к оценке этиологической значимости УПМ, включающего изучение как свойств изолируемых штаммов, так и показателей реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации, работа проводилась в двух направлениях.

Во-первых, были проведены исследования, направленные на определение возможностей ряда традиционных тестов и компьютерных программ, адаптированных нами, для решения задач микробиологического анализа.

Во-вторых, применены методы кристаллографии и биолюминесценции для изучения ответной реакции макроорганизма, результаты которого позволили оценить значимость этой составляющей инфекционного процесса с помощью как общепринятых, так и оригинальных тестов, а также способов их оценки.

Было выполнено углубленное «слепое» микробиологическое изучение 88 образцов вагинального секрета, отобранных при микроскопии мазков 286 женщин, проходивших обследование в городском Центре планирования семьи и репродукции. Основным критерием отбора служило выявление бластоспор и /или псевдомицелия дрожжеподобных грибов. Результаты традиционных (цитологических, бактериоскопических, бактериологических) методов позволили выделить основные группы. К 1 группе отнесли образцы, морфологические и количественные характеристики которых соответствовали состоянию нормоценоза или кандидоносительству, для образцов II группы были свойственны признаки, характерные при монокандидозной инфекции, в III группу вошли образцы с проявлением кандидозного вагинита в сочетании с бактериальным вагинозом (БВ +КВ). При более детальном микологическом исследовании образцов III группы было выделено две подгруппы

Подгруппы III а и III б, достаточно спорные с диагностической точки зрения. В таких ситуациях роль Candida albicans в воспалительном процессе определяют по количественному признаку (КОЕ/мл Candida). Однако, по мнению ряда авторов количественные характеристики С. albicans не являются исчерпывающими, поэтому необходимо изучение дополнительных свойств, и в первую очередь факторов вирулентности. Основываясь на данных литературы о связи размеров и форм клеток и колоний со степенью их вирулентности, мы использовали методы компьютерного анализа для получения их метрических характеристик. Морфометрическому анализу подвергали цифровые фотографии чашек Петри с выросшими колониями С. albicans, а также приготовленных из них мазки-препараты, окрашенные по Грамму. КОЕ регистрировали в автоматическом режиме. Результаты обсчетов автоматически заносились в электронные таблицы в заранее установленных единицах измерения (см - для колоний, мкм — для клеток) и статистически обрабатывались. Были получены следующие результаты: на этапе выделения культуры группы Ша титр грибов был выше, чем в группе Шб (5,7±0,65 в группе Illa против 3,2±0,12 в группе III6).

Диаметр колоний был достоверно ( р=0,02) выше 1,32 (0,267) в группе Illa против 0,33 (0,021) в группе III6. При анализе изображений мазков-препаратов было выявлено, что для группы Illa характерны морфотипы С. albicans, типичные для выявляемых при нормоценозе, когда грибы оцениваются как представители транзиторной УП микрофлоры. Присутствовали клетки крупных размеров (2,9 ± 0,87мкм- в длину и 2,2 ± 0,65мкм- в поперечнике), с типичной для С. albicans морфологией, иногда представленной почкующимися формами. Компьютерная морфометрия позволяет не только выявить делящиеся клетки, что не всегда возможно при световой микроскопии, но и рассчитать их долю в общем объеме популяции, что является косвенным показателем её состояния. При этом все выделенные штаммы по изученным биологическим свойствам можно отнести к "авирулентным" [17, 196]. Для группы III6 были характерны более мелкие клетки гриба (2,4± 0,83мкм- в длину, 2,1 ± 0,59мкм- в поперечнике). Такой морфотип характерен для вирулентных штаммов С. albicans.

Известно, что фосфолипазная активность С. albicans так же является показателем степени её патогенности. В связи с этим был использован морфометрический способ оценки фосфолипазной активности (ФЛА) С. albicans, основанный на вычислении коэффициента вирулентности (Кв), рассчитанного по соотношению площадей сформировавшейся колонии и зоны опалесценции, образовавшейся вокруг неё. Исходные данные (площадь колонии и зоны просветления) получали анализируя изображения колоний С. albicans.

В серии специальных экспериментов мы проверяли, насколько получаемые величины Кв для каждой изученной культуры согласуются с результатами традиционного биохимического исследования фосфолипазной активности в анализируемом образце. При этом была установлена сильная прямая связь между показателями ФЛА (у.е.) и предлагаемого нами Кв (г=0,91). Используя предложенный способ, определили ФЛА в образцах групп Illa и Шб. При этом были получены следующие результаты: для группы Ша Кв равнялся 0,35(0,087), для группы III6 Кв = 0,77±0,136.

Суммируя полученные данные, можно сделать следующее заключение: для группы Ша характерны большие размеры колоний и клеток, а также невысокое значение Кв, что может свидетельствовать лишь о сопутствующей роли С. albicans в воспалительном процессе, несмотря на диагностически значимую численность. Для группы III6 характерно присутствие мелких колоний и клеток, высокий уровень Кв, что свидетельствует о высокой степени вирулентности и позволяет предполагать участие С. albicans в воспалительном процессе.

Следующим этапом исследования стало изучение возможности применения морфометрического способа определения ФЛА бактериальных культур. В качестве материала исследования были использованы образцы патматериала (п=59) от больных торакального отделения, ОРИТ и смывы с аппаратов ИВЛ отделения РИТ. С целью определения степени вирулентности выделенной культуры Pseudomonas aeruginosa, изучали её фосфолипазную активность. Была выявлена следующая закономерность: штаммы, выделенные из образцов смывов с аппаратуры и изолятов транстрахеального аспирата пациентов как правило, отличались более высоким уровнем ФЛА ( Кв=1,18 ± 0,153 и Кв =1,12 ± 0,210соответственно) в сравнении с микроорганизмами, выделенными в торакальном отделении

Кв = 0,49 ± 0,137) (р = 0,02). ). Как считают многие исследователи, именно этому ферменту принадлежит ведущая роль в патогенезе пневмоний, поскольку благодаря ФЛА микроорганизмам удается разрушать поверхностный слой альвеолярных мембран (сурфактант), содержащих значительное количество фосфолипидов. Важно подчеркнуть, что характерной особенностью госпитальных штаммов является способность формировать биопленки на поверхности синтетических полимеров — материалов, из которых изготовлены детали дыхательного оборудования. Как считают исследователи, именно в таком состоянии бактерии способны «консервировать» биохимические свойства, отвечающие за биодеградацию защитных покровов и факторов неспецифической резистентности макроорганизма. При попадании в органы дыхания, они успешно реализуют накопленный потенциал, чему способствует их высокая устойчивость к применяемым антибактериальным средствам [156,201, 205]. Использование этого параметра в качестве дополнительного маркера госпитальных штаммов, в первую очередь в ОРИТ, представляется нам целесообразным. Анализ показателей ФЛА, полученных методом компьютерной морфометрии и общепринятым методом, установил сильную прямую связь между показателями ФЛА (у.е.) и предлагаемого нами Кв (г=0,89).

Важной характеристикой условно патогенных микроорганизмов является и показатель их антибиотикочувствительности. Общепринятый метод серийных разведений достаточно трудоемок, а интерпретация результатов, полученных диско-диффузионным методом, в ряде спорных случаев, вызывает серьезные затруднения. Предложенный способ оценки полученных результатов, основанный на автоматической регистрации зоны задержки роста, позволяет оценивать антибиотикочувствительность не по диаметру (ЗЗР), а по её площади. Вполне допустимо, что данный показатель более достоверен, особенно при оценке пограничных результатов. Более того, использование методов компьютерной морфометрии при оценке антибиотикочувствительности позволяет объективно контролировать равномерность распределения питательной среды и рост микробного "газона".

Таким образом, данные, полученные при морфометрическом анализе, не расходятся с результатами традиционных методов исследования и дают дополнительную информацию, облегчая интерпретацию полученных результатов.

Вторым направлением нашей работы было изучение показателей реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации. В связи с этим исследованию подвергали образцы патологического материала от 37 больных с открытой травмой глаза. Всего было изолировано 47 бактериальные культуры. Из коагулазопозитывных стафилоккоков (КПС) все изоляты были идентифицированы как S. aureus, при этом ни один из них не отличался повышенной антибиотикорезистентностью и не относился к группе MRSA. Особого внимания заслуживали коагулазонегативные стафилококки (КОС), поскольку они доминировали среди выделенных и идентифицированных культур. В большинстве случаев КОС обнаруживали в составе 2-3 компонентных ассоциаций в сочетании как с Грам+, так и Грам- бактериями. Более того, общепризнанно, что КОС по своей природе обладают низким патогенным потенциалом. В этих случаях особенно сложно установить, является ли изолированный микроорганизм этиологическим фактором, либо это случайная контаминация образца. Для решения этих задач нами проанализированы фации слезной жидкости больных с травмой глаза, полученные методом клиновидной дегидратации, с целью выявления особенностей кристаллообразования при воспалительных процессах инфекционной и неинфекционной природы. Интерпретацию полученных результатов проводили с использованием компьютерной морфометрии. Традиционно оценка полученных кристаллограмм базируется на описательных характеристиках, с выделением определенных морфотипов, соответствующих той или иной патологии. Подобная трактовка результатов не всегда корректна и не поддается стандартизации. Нами предложен способ количественной оценки, основанный на автоматическом выделении зон фации, определении их площадей с последующим расчетом дифференцирующего коэффициента. Группу контроля составили 15 человек, не страдающих хроническими заболеваниями и без признаков офтальмопатологии. В результате проведенных исследований были получены следующие результаты: в группе контроля дифференцирующий коэффициент (Кс1) был равен 7,52±0,89, при воспалительных процессах неинфекционной природы (2группа, с отрицательными результатами бактериологического исследования) Кс1 = 5,62±0,81, при инфекционном начале воспалительного процесса (3 группа -положительные результаты бактериологического исследования) Кс^З,! 1±0,60. Следует отметить достоверное (р = 0.01) снижение дифференцирующего коэффициента по мере увеличения количества ассоциантов - от Кс1 =3,11±0,60 до Ка= 1,16±0,29.

Несмотря на то, что у представителей 2 группы бактериологическое исследование не дало результата, и дифференцирующий коэффициент в среднем составил К<1 =5,62, в 14.3% случаев в этой группе дифференцирующий коэффициент определялся как Кс1 = 3,23 ±0,45. С одной стороны подобный факт может свидетельствовать о наличии существующей, но не выявленной «скрытой инфекции» в силу недостаточной результативности бактериологического метода исследования. С другой стороны, он может быть обусловлен снижением общей сопротивляемости макроорганизма, связанной с возрастными показателями, наличием хронических заболеваний, иммунодефицитом. В подобных ситуациях нам представляется целесообразным проведение повторного бактериологического исследования для исключения или подтверждения наличия возбудителя.

Важно отметить, что одним из достоинств морфометрического метода анализа изображений является его универсальность: можно исследовать образцы любых жидких сред организма, поскольку анализу подвергаются лишь фотоизображения фаций, а принципы их формирования одинаковы. Своеобразие рисунка (текстуры) образца, обусловленное в первую очередь биохимическим составом, и, как следствие, физико-химическим состоянием анализируемой пробы, придает специфичность получаемому результату. Оценивая ответную реакцию организма, следует учитывать, что воспаление служит патогенетической основой большинства инфекционных процессов. Оно инициируется микробной инвазией и эволюционирует вместе с ней. При хирургических вмешательствах повреждающее действие операционной травмы становится фоном, на котором либо возникает и прогрессирует инфекционное f осложнение, либо флогогенные факторы устраняются, и происходит репарация поврежденных тканей. Помешать микробной колонизации раневой поверхности самый простой способ заблокировать инфекционный процесс. Соответственно раневое отделяемое должно обладать выраженной антиколонизационной активностью, т.к. содержит антиадгезивные, биостатические, биоцидные факторы. Таким образом, оценивая уровень бактерицидной активности биологических жидкостей, можно судить о характере воспаления. Нами проанализированы 20 образцов раневого отделяемого на предмет их бактерицидной активности. Анализ влияния проб раневого отделяемого на свечение использованного рекомбинантного штамма E.coli выявил прогрессирующее падение уровня люминесценции по мере увеличения времени контакта. Ингибирующее действие проявлялось уже к 10-минуте инкубации, достигая максимума к 30 минуте, и в дальнейшем достоверно не изменялось. При параллельном исследовании проб была прослежена выраженная взаимосвязь между подавлением свечения количеством светящихся клеток) и долей бактерий, выживших после 10, 20, 30, 40 мин контакта с образцами раневого отделяемого, определяемой на основе бактериологического исследования.

Поскольку гашение бактериальной люминесценции отражает воздействие на клеточную стенку комплекса бактерицидных факторов (комплемент, лизоцим, (3-лизин и т.д.), результирующее в развитие бактерицидного эффекта, то снижение числа объектов, соответствующих заданным программой порогам яркости и регистрируемым в автоматическом режиме, можно расценивать как проявление бактерицидной активности раневого отделяемого (БАРО). Динамические наблюдения за БАРО показали, что её максимальные значения регистрировали спустя сутки после операции. Поскольку во всех случаях течение послеоперационного процесса проявляло положительную динамику, изменения БАРО носили однотипный характер, и к 6 суткам уровень его активности снижался на 27 — 34%. Снижение люминесценции является следствием бактерицидного воздействия на рекомбинантные штаммы .Е.соН, что подтверждается совпадением результатов тестирования БАРО с 4 использованием традиционного бактериологического метода.

На основании проведенных исследований нами разработан алгоритм определения этиологической значимости УПМ, учитывающий как особенности микроорганизма, так и выраженность ответной реакции макроорганизма в зоне первичной колонизации (рис. 5). В основе лежит анализ изображений исследуемого материала (мазки-препараты, колонии на плотных средах, кристаллограммы). В каждом конкретном случае был определен критерий для маркировки интересующих нас объектов, и последующих измерений. Для определения патогенетических свойств микроорганизма на первом этапе использовали традиционные микробиологические методы, результаты которых оценивали с использованием компьютерных методов анализа, дающих дополнительную объективную информацию. Для оценки степени реактивности макроорганизма применяли кристаллографический и биолюминесцентный

Особенности микроорганизма

Реакция макроорганизма

Микробиологические .методы

Исследование биологических жидкостей

Микроскопические (световая микроскопия)

Кристаллографические методы

Люминесцентная

МИКРОСКОПИЯ

Бактериологический (выделение, идентификация,определение а! 1тибиоти кочувст.)

Анализ фации БЖ, полученных методом к-линови/шпй пегилплтяпии

Регистрация гашения биолюминесценции

Компьютерная обработка полученных результатов

Выбор критерия для автоматической маркировки объектов

Показатели цветности I

Показатели оптической плотности

Определение метрических характеристик микробных клеток в окрашенных препаратах V

Доопределение ферментативной активности

Определение КОЕ и метрических характеристик колоний

Оценка антибиотикочувствительности

V V V

Анализ кристаллограмм —

Определение бактерицидной активности БЖ

Показатели интенсивности

1 г

Определение этиологической значимости микроорганизма

Рис. 5 Алгоритм определения этиологической значимости условно-патогенных микроорганизмов методы исследования биологических жидкостей, с дальнейшей компьютерной обработкой результатов. Суммируя полученные результаты, определяли этиологическую значимость микроорганизма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чемурзиева, Наталья Вадимовна, Пермь

1. Автандилов Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии / Г.Г. Автандилов. М., 1996. - 256 с.

2. Автандилов Г.Г. Перспективы развития диагностической медицинской морфометрии / Г.Г. Автандилов // Науч.-практ. журн. «Клинико-лабораторный консилиум». 2004. - № 2. - С. 39-42.

3. Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская морфометрия / Г.Н. Автандилов. М., 2002. - 288 с.

4. Адгезивные реакции candida albicans в условиях кондиционирования метаболической активности эпителиоцитов / М.И. Заславская, Т.В. Махрова, Е.В. Салина и др. // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерапия. 2000. -№ 2, прилож. 1. - С. 58-59.

5. Азнаурян A.M. Современные методы диагностики холестеатомы среднего уха: автореф. дис. . канд. мед. наук / A.M. Азнаурян; СПб., 2007. 25 с.

6. Алешаев A.M. Кристаллографическое исследование слезной жидкости у больных с проникающими ранениями глазного яблока: автореф. дис. . канд. мед. наук / A.M. Алешаев; М., 2003. — 22 с.

7. Аникина А.Ю. Неинвазивные методы определения риска прогрессирования глаукомной оптической нейропатии: автореф. дис. . канд. мед. наук / А.Ю. Аникина; М., 2006. 25 с.

8. Анкирская A.C. Вагинальные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами (бактерии, грибы, микоплазмы): критерии диагностики / A.C. Анкирская: http://www.hirurgia.ru.

9. Анкирская A.C. Видовой состав и некоторые биологические свойства лактобацилл при различных состояниях микроэкологии влагалища / A.C. Анкирская, В.В. Муравьева // Акушерство и гинекология. — 2000. — № 3. С. 2628.

10. Антибактериальная профилактика и качество ее проведения в абдоминальной хирургии / В.Г. Плешков, A.B. Голуб, А.П. Москалев и др. // Инфекции в хирургии 2007. - Т. 5. - № 2. - С. 24-26.

11. Антибиотикопрофилактика, антибиотикотерапия и микробиологическая ситуация в хирургическом стационаре / В.Н. Оболенский, Л.С.Аронов, Г.В. Родоман и др. // Антибиотики и химиотерапия. — 2004. № 10.-С. 34-38.

12. Баженов Л.Г. Изучение вирулентности грибов рода кандида, выделенного от больных язвенной болезнью, с помощью Paramecium caudatum / Л.Г. Баженов, Л.С. Таирова, Е.В. Артемова // Акушерство и гинекология. — 2000. -№ 3. С. 7-8.

13. Белобородов В.Б. Стафилококковые инфекции / В.Б. Белобородов, С.Д. Митрохин // Инфекции и антимикробная терапия. — 2003. Т. 5. — № 1. — С. 12-18.

14. Беюл Е.А. Дисбактериозы кишечника и их клиническое значение / Е.А. Беюл, Е.Б. Куваева // Клиническая медицина. — 1986. — № 11. — С. 37-44.

15. Биолюминесцентный метод определения степени интоксикации при перитоните / Т.В. Воеводина, О.Е. Нифантьев, А.Н. Коволевский и др. //. Лабораторное дело. М.: Медицина, 1990. - № 9. - С. 23-25.

16. Биофизические аспекты кристаллографических исследований. вирусных инфекций в эксперименте / И.А. Мальчиков, И.А. Тузанкина, Ю.В. Григорьева и др.// Вирусология. 2006. - Т. 7. - С. 508-520.

17. Богомолова Т.С. О факторах патогенности дрожжеподобных грибов рода Candida / Т.С. Богомолова, Г.И. Горшкова, З.О. Караев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 1987. № 7. — С. 92-95.

18. Богомолова Т.С. Признаки, характеризующие вирулентность Candida albicans / Т.С. Богомолова, Г.И. Горшкова // Международный микологический симпозиум «Микозы и иммунодефициты». — Л., 1991.

19. Бойцов А.Г. Метод дисков не оптимален для практики? / А.Г. Бойцов, О.Н. Ластовка // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерапия. 2000. - № 2, прилож. 1. —С. 10-11.

20. Бондаренко В.М. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы / В.М. Бондаренко, Т.В. Мацулевич. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 304 с.

21. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно-патогенных бактериях / В.М. Бондаренко // ЖМЭИ. 1997. - № 4. - С. 20-26.

22. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса / В.М. Бондаренко // ЖМЭИ. 1999. - № 5. - С. 34-39.

23. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов; Медицинское информационное агентство. М., 2005. — 716 с.

24. Бржеский В.В. Слезная жидкость в диагностике некоторых повреждений и заболеваний глаз: автореф. дис. . канд. мед. наук / В.В. Бржеский; Л., 1990. 22 с.

25. Бухарин О.В. Бактерионосительство (медико-экологический аспект) / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвятцов. Екатеринбург: Изд-во УрО РАН, 1996. - 208 с.

26. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий / О.В. Бухарин. — М.: Медицина, 1999.-300 с.

27. Василенко В.В. Дисбактериоз синдром раздраженного кишечника: эссе-анализ проблемы / В.В. Василенко // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2000. - № 6. - С. 10-13.

28. Введение в клиническую микробиологию / А.Г. Бойцов, В.П. Иванов, О.Н. Ластовка и др. СПбГМА им. И.И. Мечникова, 1999; ГГМУ, 2004.

29. Вегман Е.Ф. Кристаллография, минералогия, петрография и рентгенография / Е.Ф. Вегман, Ю.Г. Руфанов, И.Н. Федорченко. М., 1990. -262 с.

30. Влияние факторов внешней среды на кристаллизацию ротовой жидкости / Н.Г. Коротких, А.Н. Пашков, С.В. Болгов и др. // Стоматология. Медиасфера. 2002. - Т. 81. - № 4. - С. 13-15.

31. Возможности анализатора изображений «ВидеоТест» для проведения микрофотометрических исследований в цитологии / Г.И. Штейн, В.Г.

32. Пантелеев, A.B. Поваркова и др. // Цитология, 1998. Т. 40. - № 10. - С. 913— 916.

33. Володин H.H. Бактериальные вагинозы / H.H. Володин, В.М. Коршунов: http://www. esus.ru.

34. Воробьев A.A. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / под ред. А.А Воробьева. М.: Медицинское информационное агентство, 2006. - 704 с.

35. Воробьев A.A. Мир микробов / A.A. Воробьев, A.JI. Гинзбург, В.М. Бондаренко // Вестник РАМН. 2000. - № 11. - С. 8-13.

36. Гайворонская В.И. О применении кристаллографического метода в диагностике некоторых патологических процессов / В.И. Гайворонская // Судебно-медицинская экспертиза. 1998. - № 3. - С. 37-40.

37. Галеев Ф.С. Микробный пейзаж в различных подразделениях многопрофильного городского стационара / Ф.С. Галеев, P.M. Габдулхаков, С.Г. Хасанова // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерапия. 2000. — № 2, прилож. 1. - С. 14.

38. Дасаева J1.A. Клиническое значение «литос-системы» в диагностике мочекаменной болезни / J1.A. Дасаева, Е.М. Шилов, Л.И. Зайцева // Поликлиника. 2004. - № 4. - С. 30.

39. Дерябин Д.Г. Особенности использования тест-систем при исследовании абиотических сред и биологических жидкостей / Д.Г. Дерябин, Е.Г. Поляков, И.Ф. Каримов // Вестник ОГУ. -2004. № 5. - С. 101-104.

40. Дерябин Д.Г. Спектр микрофлоры, изолируемой из различных отделов репродуктивного тракта женщин / Д.Г. Дерябин, A.A. Минаков, С.Д. Борисов // ЖЭМИ. 2001. - № 4. - С. 84-86.

41. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность / Д.Г. Дерябин. Изд-во УрО РАН, 2000. - 252 с.

42. Егорова О.В. Комплектация современных лабораторий медико-биологической направленности / О.В. Егорова // Науч.-практ. журн. «Клинико-лабораторный консилиум ». 2004. — № 2. — С. 43-44.

43. Елисеева И.В. О роли латентных, трудно культивируемых и некультивируемых персистентных бактерий в патологии человека / И.В. Елисеева // Мат. Всерос. науч.-практ. конф. М., 2001. — С. 5-7.

44. Елисеева И.В.О роли латентных, трудно культивируемых и некультивируемых персистентных бактерий в патологии человека / И.В. Елисеева, Е.М. Бабич, Ю.Л. Волянский и др. // Аналы Мечниковского института. 2006. - № 1. - С. 12-39.

45. Захарова Г.П. Нарушения мукоцилиарной системы у больных хроническим риносинуситом и их коррекция: автореф. дис. . д-ра мед. наук /

46. Захарова Г.П.; СПб., 2007. 35 с.

47. Зырянов В.В. Современные направления и методы мониторинга антибиотикорезистентности патогенных бактерий / Зырянов В.В., B.C. Липский // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерапия. — 2000. — № 2, прилож. 1. С. 21.

48. Икомасова М.А. Исследование ротовой жидкости для диагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта у детей / М.А. Икомасова, ГЛО. Порецкова, Д.В. Печкуров: http://www.gastroportal.ru.

49. Иммуные механизмы воспалительных процессов при заболевании внутренних органов / И.П. Корюкина, A.B. Туев, В.Ю. Мишланов и др. / ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава. Пермь, 2008. - 150 с.

50. Инфекционные болезни: руковод. для врачей / под ред. В.И. Покровского. -М.: Медицина, 1996. 528 с.

51. Использование компьютерных систем анализа изображений для автоматизации анализа спермы человека / М.Ю. Егоров, A.B. Струй, С.А. Шлыкова и др. // Науч.-практ. журн. «Клинико-лабораторный консилиум». -2004.-№3.-С. 31-32.

52. К проблеме саливадиагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта: математические аспекты / С.Ф. Гуляева, А.К. Мартусевич, А.Н. Кошкин и др. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2004. — № 1.-С. 42-43.

53. Камакин Н.Ф. Тезиокристаллоскопическое исследование биологических субстратов: метод, рекомендации / Н.Ф. Камакин, А.К. Мартусевич. Киров: Типография КГМА, 2005. - 34 с.

54. Камакин Н.Ф. Характеристика тезиокристаллоскопического портрета биологических жидкостей организма человека в норме и при патологии / Н.Ф. Камакин, А.К. Мартусевич // Вятский медицинский вестник. 2002. - № 3. - С. 66-71.

55. Камакин Н.Ф. Характеристика тезиокристаллоскопического портрета биологических жидкостей организма человека в норме и при патологии / Н.Ф.

56. Камакин, A.K. Мартусевич // Вестник новых медицинских технологий. 2003. -Т. X. - № 4. - С. 57-59.

57. Карпунина Т.И. Новые подходы к оценке состояния системы «микроорганизмы-макроорганизм»: автореф. дис. . д-ра мед. наук / Т.И. Карпунина; Пермь, 2001. 39 с.

58. Кира Е.Ф. Инфекции и репродуктивное здоровье (часть 1): http ://www/j owd/sp/ru.

59. Кисина В.И. Микроценоз влагалища в норме и при вагинальных инфекциях: методы его коррекции / В.И. Кисина // Репродуктивное здоровье женщины. 2003. - № 1(13). - С.72-76.

60. Клюжев В.М. Эпидемиологические и организационные аспекты профилактики внутригоспитальных инфекций / В.М. Клюжев, В.Г. Акимкин // Воен.-мед. журн. -1996. № 8. - С. 23-28.

61. Козлов P.C. Нозокомиальные инфекции: эпидемиология, патогенез, профилактика, контроль / P.C. Козлов // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерапия. 2000. - № 1. - Т. 2. - С. 16-30.

62. Количественное определение бактерий в клинических материалах / Ю.М. Фельдман, Л.Г. Махонева, A.B. Шапиро и др. // Лабораторное дело. -1984. — № 10.-С. 616-619.

63. Коломойцева Т.Н.Микробиологические варианты вагинальногокандидоза. Новые подходы к терапии: автореф. дис. . канд. мед. наук / Т.Н. Коломойцева; Пермь, 2005. -24 с.

64. Кристаллизация ротовой жидкости при различных условиях / Г.М. Барер, А.Б. Денисов, И.Н. Михалева и др. // Проблемы нейростоматологии и стоматологии. М.: Медицина, 1998. - №1. - С. 20-22

65. Кристаллические агрегаты ротовой жидкости у больных с патологией желудочно-кишечного тракта / А.Б. Денисов, Г.М. Барер, Т.М. Стурова и др. — М.: Медицина, 2003. № 2. - С. 26-29.

66. Кубась В.Г. Кандидозная инфекция / В.Г. Кубась, О.П. Данилова, H.A., Чайка. СПб., 1996. - С. 46.

67. Ленгелер И. Современная микробиология. Прокариоты /И. Ленгелер, Г. Древе, Г.Шлегель // М. Мир. 2005. - 492 с.

68. Лисовая H.A. Информативность новых лабораторных технологий в диагностике заболеваний почек у детей: автореф. дис. . канд. мед. наук / H.A. Лисовая; СПб., 2001. 26 с.

69. Мальчиков И.А. Значение вирусных инфекций в патологии, связанной с нарушениями противоинфекционной защиты, и методы их выявления: автореф. дис. . д-ра мед. наук / И.А. Мальчиков; Екатеринбург, 2007. 25 с.

70. Мартусевич А.К. Информативность исследования кристаллообразования при зоонозах на модели животных / А.К. Мартусевич, О.Б. Жданова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. — 2006. -№ 1.-С. 30-38.

71. Мартусевич А.К. Тезиокристаллоскопическая картина слюны у пациентов гастроэнтерологического профиля при использованиифизиотерапевтических методов лечения / А.К. Мартусевич, Ю.К. Царев, A.M. Эпштейн: http://www.expodata.ru.

72. Мартусевич А.К. Тезиокристаллоскопия в идентификации качества лекарственного препарата / А.К. Мартусевич, О.Б. Жданова: http://www.rusvrach.ru.

73. Машуров М.Г. Вульво-вагинальный кандидоз в Пермском крае (от клинико-микробиологических особенностей к совершенствованию терапии): автореф. дис. . канд. мед. наук / М.Г. Машуров; Пермь, 2008. 26 с.

74. Маянский А.Н. Микробиология для врачей / А.Н. Маянский. Н. Новгород, 1999.-400 с.

75. Маянский А.Н. Патогенетическая микробиология / А.Н. Маянский. -Н. Новгород, 2006. 520 с.

76. Медицинская микробиология / под ред. В.И. Покровского, O.K. Поздеева. -М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. 1200 с.

77. Меньшиков Д.Д. Размышления о путях развития лабораторной службы / Д.Д. Меньшиков // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. -№ 1. - С. 50-55.

78. Меньшиков Д.Д. Возможности и перспективы использования компьютерных систем надзора за бактериальными ВБИ / Д.Д. Меньшиков, Р.Ф. Астафьева// ЖМЭИ. 1999. -№ 2. - С. 104-107.

79. Меньшиков Д.Д. Тест-методы как одно из направлений в диагностике антибиотикорезистентности микроорганизмов / Д.Д. Меньшиков, Е.Д. Меньшикова // Клиническая лабораторная диагностика. Микробиология. — 2002.-№6.-С. 35-37.

80. Методические рекомендации по определению чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом. Смоленская государственная медицинская академия, 1999. — 22 с.

81. Мирзабалаева А. К. Основные принципы лечения хронического кандидоза гениталий у женщины. // Вестник дерматологии и венерологии. -1994. № 2. - С. 2022.

82. Мирзабалаева А.К. Кандидоз гениталий у женщин репродуктивного возраста. Перечень основных методов и критериев диагностики микозов: метод, рекомендации / А.К. Мирзабалаева. СПб.: СПбМАПО, 2001. - С. 24.

83. Миронов А.Ю. Клиническая микробиология: краткое руководство / А.Ю. Миронов, П.Р. Марри, И.Р. Шей. М.: Мир, 2006. - 425 с.

84. Миронов А.Ю. Основы клинической микробиологии и иммунологии / А.Ю. Миронов; под ред. A.A. Воробьева. М., 1997. - 156 с.

85. Морфологическая картина водянистой влаги в оценке патофизиологических механизмов инволютивного катарактагенеза / A.A. Девяткин и др. // Вестник офтальмологии. 2004. - № 1. - С. 41^12.

86. Морфологическая картина жидких сред глаза при набухающей катаракте / A.A. Девяткин, С.Н. Шатохина, В.М. Малов и др. // III Всероссийская школа офтальмолога: сб. науч. тр. М., 2004. С. 309-312.

87. Морфологические исследования внутриглазных жидкостей в оценке патофизиологических механизмов развития набухающей катаракты / В.М. Малов, С.Н. Шатохина, Е.Б. Брошевская и др. // РМЖ. 2003. - Т. 4. - № 3. - С. 132-134.

88. Морфометрический анализ фаций сыворотки крови / М.Э. Бузоверя, И.В. Шилипор, С.Н. Шатохина и др. // Клиническая лабораторная диагностика. -2003.-№9.-С. 22-23.

89. Морфометрические исследования эритроцитов в диагностике анемий / М.Н. Зенина, Е.И. Клыкова, Т.А. Карнилова и др. // Науч.-практ. журн. «Клинико-лабораторный консилиум». 2004. - № 3. - С. 28-30.

90. Мошетова J1.K. Современные представления о слезной жидкости, значение ее в диагностике / J1.K. Мошетова, O.A. Волков // Клиническая офтальмология. 2004. - Т. 5. - № 4. - С. 138-139.

91. Нагорнова Н.Д. Эффективность кристаллографического анализа слезной жидкости в оценке прогрессирования глаукоматозной оптической нейропатии / Н.Д. Нагорнова // Сб. тр. науч.-практ. конф. «Современные технологии лечения глаукомы». — М., 2003. С. 69-73.

92. Назарова JI.O. Морфологические методы исследования слезной жидкости в диагностике воспалительных заболеваний органа зрения / JI.O. Назарова, Г.Л. Прокофьева // IV Всероссийская школа офтальмолога. — М., 2005. С. 369-374.

93. Новое в диагностике мочекаменной болезни / Л.А. Дасаева, В.Н. Шабалин, С.Н. Шатохина и др. // Вестник новых медицинских технологий. -2004. № 3. - С. 47-49 .

94. Олескин A.B. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов / A.B. Олескин, И.В. Ботвинко, Е.А. Цавкелова. // Москва.- 1999г.

95. Опыт применения вагинальных суппозиториев «Ливарол» у больных острым кандидозным вульвовагинитом / А.К. Мирзабалаева, Ю.В. Долго-Сабурова, З.К. Колб и др. // Гинекология. 2006. - Т. 8. - № 2. С. 34-35.

96. Орджоникидзе Н.В. Вагинальный кандидоз и беременность / Н.В. Орджоникидзе, В.Л. Тютюнник: http://www.rmj.ru.

97. Особенности выживаемости бактерий в микробных сообществах /

98. H.В. Заславская, Н.К. Артеменко, М.М. Чижевская и др. // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерапия. 2000. — № 2, прилож. 1. — С. 19-20.

99. Падейская E.H. Клиническая микробиология и химиотерапия на рубеже веков / E.H. Падейская: http://nedug.ru.

100. Панина JI.K. Явление диморфизма в свете теории самоорганизации / JI.K. Панина, Е.В. Богомолова. // Успехи медицинской микологии . 2003. - Т.1.-С. 43—45.

101. Пантелеев В.Г. Применение современных аппаратно-программных комплексов в цитологической практике / В.Г. Пантелеев // Атлас «Цитологическая диагностика заболеваний легких». 2005. — С. 199.

102. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт М.: Мир, 1978. - 330 с.

103. Петрович Н.С. Лабораторная диагностика бактериального вагиноза/ Н.С. Петрович; Уральская государственная медицинская академия, лабораторное отделение. 2001. - Вып. 3. - № 3. - С. - 4.

104. Петрович Ю.А. Биохимия слезы и ее изменения при патологии / Ю.А. Петрович, H.A. Терехина // Журн. «Вопросы медицинской химии». -1990.-№3.- С. 13-18.

105. Петровская В.Г. Общие закономерности в системе паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций / В.Г. Петровская // ЖМЭИ. 1982. - № 8. - С. 24-31.

106. Петровская В.Г. Проблема вирулентности бактерий / В.Г. Петровская. Л., 1967.

107. Поваркова A.B. Компьютерный анализ изображений в медицине /

108. A.B. Поваркова // Морфология, 1997. № 5. - С. 103-106.

109. Покровский В.И. Человек и микроорганизмы. Здоровье и болезнь /

110. B.И. Покровский // Вестник РАМН. 2000. - № 11. - С. 3-6.

111. Послеоперационная раневая инфекция при остром аппендиците (частота, структура, этиология и профилактика) / Н.Ф. Сивец, A.A. Адарченко, Е.И. Гудкова и др. // Здравоохрание. 2003. — № 10. — С. 39-40.

112. Приказ МЗ РФ СССР № 535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». — М., 1985. — 126 с.

113. Прозоровский C.B. Проблемы инфектологии / C.B. Прозоровский. -М.: Медицина, 1991.-398 с.

114. Прошина О.И. Кристаллографический метод обследования при некоторых заболеваниях глаз: метод, рекомендации / О.И. Прошина. М., 1988 -8 с.

115. Разумова С.Н. Диагностические и прогностические критерии стоматологической патологии по морфологической картине ротовой жидкости у пациентов различных возрастных групп: автореф. дис. . д-ра мед. наук / С.Н. Разумова; М., 2007. 32 с.

116. Рапис Е.Г. Белок и жизнь / Е.Г. Рапис. — Иерусалим: Филобиблон; М.: Милта-ПКПГИТ, 2002. 257 с.

117. Рапис Е.Г. К проблеме нуклеации (образования клеток) при самоорганизации наноструктур белка in vitro и in vivo / Е.Г. Рапис // Журн. технич. физики, 2005. Т. 75, выпуск 6. - С. 107.

118. Родионов А.Н. Грибковые заболевания кожи / А.Н. Родионов. -СПб.: Питер, 1998. С. 21.

119. Родионов А.Н. Грибковые заболевания кожи: руководство для врачей / А.Н. Родионов. 2-е изд. - СПб: Питер, 2000. - 288 с.

120. Роль кластерного анализа кристаллограмм слезной жидкости в комплексном обследовании больных первичной глаукомой / Н.И. Курышева, М.Н. Колединцев, В.Н. Трубилин и др. // Глаукома, 2005. - Т. 2. - № 2. - С. 12.

121. Рыжкова O.A. Клинико-диагностическое значение морфологической картины сыворотки крови у больных туберкулезом легких: автореф. дис. . канд. мед. наук / O.A. Рыжкова; М., 2008. 28 с.

122. Савина JI.B. Кристаллоскопические структуры сыворотки крови здорового и больного человека / Л.В. Савина. — Краснодар, 1999. — 238 с.

123. Саттон Д. Определитель патогенных и условно патогенных грибов / Д. Саттон, М. Фотергилл, М. Ринальди -М.: Мир, 2001. 486 с.

124. Свешников A.B. Компьютерная обработка и анализ изображения, полученного при световой микроскопии / A.B. Свешников // Колосовские чтения. 2006. - № 2. - С. 85-86.

125. Семененко Т.А. Иммунодефицитные состояния как фактор риска развития госпитальных инфекций / Т.А. Семененко, В.Г. Акимкин // Эпидем. и инфекц. болезни. 2000. - №. 5. - С. 14-17.

126. Сергеев А.Ю. Кандидоз / А.Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев. М.: Триада-X, 2000.-183 с.

127. Сергеев А.Ю. Кандидоз: природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение / А.Ю. Сергеев. — М.: Триада-Х, 2001.-472 с.

128. Сидоренко C.B. Антибиотикограмма: Диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов / C.B. Сидоренко, В.Е. Колупаев. Смоленск, 2000. -28 с.

129. Сидоренко C.B. Будущее клинической микробиологии как лабораторной службы / C.B. Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия. -1999. -№ 10.-С. 3-7.

130. Сидоренко C.B. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом / C.B. Сидоренко // КМАХ. 2001. - Т. 3. - № 4

131. Славинский A.A. Компьютерный анализ изображения нейтрофильных лейкоцитов: миелопероксидаза / A.A. Славинский, Г.В. Никитина // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000. — № 1. С. 21-23.

132. Смирнов И.В. Возбудители бактериальных инфекций человека / И.В. Смирнов. КМАХ-2002. - Т. 2. - № 2.

133. Современные представления о патогенезе инфекционных заболеваний / Е.В. Пименов, A.A. Тотолян, A.A. Бывалов и др. // Вестник РАМН. 2003. - № 6 - С. 3-9.

134. Способ получения носового секрета для морфологического исследования / Г.П. Захарова, В.В. Шабалин, Ю.К. Янов и др: http://ntpo.com/patents

135. Страчунский Л.С. Антибактериальная терапия: практ. руковод. / под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. М.: Полимаг, 2000. -С. 191.

136. Страчунский Л.С. Современные методы клинической микробиологии / под ред.Л.С. Страчунского, С.Н. Козлова. Вып.1.- Смоленск.: МАКМАХ. -2003.- 104 с.

137. Сулеева Б.О. Тезиграфия слезы как критерий воспалительного процесса при удалении травматической катаракты / Б.О. Сулеева, Г.К. Мухамеджанова, Х.М. Отман // III Всерос. школа офтальмолога: сб. науч. трудов. М., 2004. - С. 348-352.

138. Тарасевич Ю.Ю. Качественный анализ закономерностей высыхания капли многокомпонентного раствора на твердой подложке / Ю.Ю. Тарасевич,

139. Д.М. Православнова // Журнал технической физики. — 2007. Т. 77. - Вып. 2. -С. 17-20.

140. Тарасевич Ю.Ю. Моделирование дендритного роста кристаллов соли в биологических жидкостях / Ю.Ю. Тарасевич, В.О. Константинов, А.К. Аюпова // Известия вузов. Северо-кавказский регион. Естественные науки. — 2001. -Спецвыпуск. С. 147-149.

141. Ткаченко JI.B. Эффективные схемы лечения острого и рецидивирующего кандидозного вульвовагинита/ JI.B. Ткаченко, Жукова С.И., Углова Н.Д. // Рус. мед. журн. 2003. - Т. 11. - № 16. - С. 926-929

142. Тотолян A.A. Генетика патогенности микроорганизмов/ A.A. Тотолян // Вестник РАМН. -2000. № 11. - С. 29-32.

143. Тугой И.А. Программа MORPHIX для морфологического и денситометрического анализа цифровых изображений / И.А. Тугой, С.А. Строев // Колосовские чтения. 2006. - № 2. - С. 96.

144. Уварова Е.В. Влагалище как микроэкосистема в норме и при воспалительных процессах гениталий различной этиологии (обзор литературы) / Е.В. Уварова, Ф.Ш. Султанова // Гинекология. 2002. - Т.4 - № 4. - С. 189196

145. Факторы персистенции дрожжеподобных грибов рода Candida / A.B. Валышев, Н.Б. Перунова, И.В. Валышева и др. // Успехи медицинской микологии. 2003. - Т. 1. - С. 53.

146. Фоминых Г.В. Клинико-лабораторная характеристика уратной нефропатии у детей: автореф. дис. . канд. мед. наук / Г.В. Фоминых; Екатеринбург. 2006. - 23 с.

147. Фот Н.П. Видовая идентификация микроорганизмов рода стафилококков с применением методов кластер-анализа / Н.П. Фот, О.С. Бравичева. -Вестник ОГУ. 2002. - № 3. - С. 132-135.

148. Хаитов P.M. Экологическая иммунология / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, Х.И. Истамов. М., 1995. - 219 с.

149. Характеристика микрофлоры, выделенной при острых воспалительных заболеваниях легких и плевры / О.М. Абрамзон, H.H. Елагина, О.Л. Карташова и др. // ЖМЭИ. 2003. - № 4. - С. 44-47.

150. Хмельницкий O.K. О кандидозе слизистых оболочек / O.K. Хмельницкий // Арх. Патол. 2000. - Т. 62. - № 6. - С. 3-10.

151. Ченцова О.Б. Кристаллографический метод обследования при некоторых заболеваниях глаз / О.Б. Ченцова, И.Л. Теодор // Метод, рекомендации. -М., 1988. 8 с.

152. Чеснокова М. Г. Анализ высеваемости грибов рода Candida из различного клинического материала / М.Г. Чеснокова, Т.Д. Соловьева, О.И. Карпова // Успехи медицинской микологии. 2003. - Т. 1. - С. 59.

153. Шабалин В.Н. Морфология биологических жидкостей в клинической лабораторной диагностике / В.Н. Шабалин, С.Н. Шатохина // Клиническая лабораторная диагностика. — 2002. — № 3. — С. 25—32.

154. Шабалин В.Н. Фундаментальные основы биологических ритмов / В.Н. Шабалин, С.Н. Шатохина // Вестник РАМН. М.: Медицина. - № 8. -2000. - С. 4-7.

155. Шабалин В.Н. Морфология биологических жидкостей человека / В.Н. Шабалин, С.Н. Шатохина. М.: Хризостом, 2001. - 304 с.

156. Шабалин В.Н. Принципы аутоволновой самоорганизации биологических жидкостей / В.Н. Шабалин, С.Н. Шатохина // Вестник РАМН. -2000.-JSfe3.-C. 45-49.

157. Шатохина С.Н. Диагностическое значение профильной дегидратации сыворотки крови: структурная форма информации / С.Н. Шатохина, В.Н. Шабалин // Лаборатория. 1999. - № 4. - С. 3-5.

158. Шатохина С.Н. Ранняя диагностика уролитиаза и состава солей мочи (система ЛИТОС) / С.Н. Шатохина, В.Н. Шабалин // Урология и нефрология. -1998.-№ 1.-С. 19-23.

159. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии / Б.А. Шендеров // Антибиотики и мед.биотехн. 1987. - № 3. - С. 164-170.

160. Штейн Г.И. Изменение морфометрических параметров окрашенных серебром ядрышек гепатоцитов крыс при циррозе печени и в процессе ее реабилитации / Г.И. Штейн, М.В. Кудрявцева, Б.Н. Кудрявцев. Цитология, 1999.-Т. 41.-№7. -С. 574-579.

161. Эмануэль B.JI. Лабораторная медицина как составная часть медицины доказательной / B.JI. Эмануэль, В.Г. Пантелеев // Науч.-практ. журн. «Клинико-лабораторный консилиум». 2004. — № 2. - С. 36-38.

162. Энтеробактерии (руководство для врачей) / И.В. Голубева, В.А. Килесо, Б.С. Киселева и др. — М.: Медицина, 1985. — 321 с.

163. Этиологическая структура внутрибольничных гнойно-септических инфекций и принципы их бактериологической диагностики / А.А. Адарченко, Е.И. Гудкова, И.Н. Слабко и др. // Здравоохрание. 2003. - № 10. - С. 39^40.

164. Ярилин А.А. Основы иммунологии. / А.А. Ярилин. М.: Медицина, 1999.-607 с.

165. Яхно Т.А. О существовании регулярных структур в жидкой сыворотке (плазме) крови человека и фазовых переходах в процессе ее высыхания /

166. Т.А. Яхно, О.А. Седова, А.Г. Санин, А.С. Пелющенко// Журнал технической физики//. 2003. - Т. 73(4). - С. -23-27

167. Anderson R. The Significance and potential molecular mechanisms of gastrointestinal barrier homeostasis / R. Anderson // Scand. J. Gastroenterol. 1997. -Vol. 32. -№ 11. —P. 1073-1083.

168. Annarelli C., Reyes L., Fornazero J., Bert J., Cohen R., Coleman A.W., Ion and molecular recognition effects on the crystallisation of bovine serum albuminsalt mixtures // Cryst. Eng. 2000. Vol. 3 (3). - pp. 173-194 .

169. Bacterial identification methods / M. Gobernado et. all. // Enfern. Infecc. Microbiol. Clin. 2003. - Vol. 21. - Suppl. 2. - 613 p.

170. Bacteria Associated with Bacterial Vaginosis / L.P. Hale, A. Swidsinski, W. Mendling et al. 2006. -NEJM. - Vol. - 354. - P. 202-203.

171. Baldwin T. Structure, folding and mechanism of bacterial luciferase / T. Baldwin, M. Zeigler, F. Raushel // Bioluminescence and chemiluminescence.

172. Banno Y. Secreted phospholipases of the dimorphic fungus, Candida albicans; separation of three enzymes and some biological properties / Y. Banno, T. Yamada, Y. Nozawa // Sabouraudia. 1985. - Vol. 23. - P. 47-54.

173. Barousse M.M, Growth inhibition of Candida albicans by human vaginal epithelial cells / M.M Barousse, C. Steele, K. Dunla, et al. // J. Infect. Dis. 2001. -Vol. 184.-P. 1489-1493.

174. Characterization of vaginal microbial communities in adult healthy women using cultivation-independent methods / X. Zhou, S.J. Bent, M.G. Schneider et al. // Microbiology. 2004 - Vol. 150. - P. 2565-2573.

175. Dan-M; Poch-F; Leibson-L; Smetana-S; Priel-I Rectal colonization with vancomycin-resistant enterococci among high-risk patients in an Israeli hospital//J-Hosp-Infect. 1999. - V. 43. N. 3. P. 231

176. Davidov Y. Improved bacterial SOS promoter lux fusions for genotoxicity detection / R. Rozen, D. Smulski, Y. Davidov et all // Gen. Toxicol.Environ. Mutagen. 2000. - V. 466. - P. 97-107.

177. Deegan R.D. Pattern formation in drying drops// Phys. Rev. E. 2000.-Vol. 61. - P. 475.

178. Deitch E.A. Simple intestinal obstruction causes bacterial translocation in man / E.A. Deitch // Archives of Surgery. 1989. - Vol. 124. - P. 699-701.

179. Effect of Iron Limitation on Slime Production by Staphylococcus aureus / L. Baldassarri, L. Bertuccini,. M.G. Ammendolia et al. // Eur. J Clin. Microbiol. Infect. Dis. -2001. Vol. 20. - P. 343-345.

180. Evaluation of Candida ID, a new chromogenic medium for fungal isolation and preliminary identification of some yeast species. / H. Fricker-Hidalgo, S. Orenga, B. Lebeau et al. // J.Clin. Microbiol. 2001. -Vol 39. - P. 1647-1649.

181. Gale C.A. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INTI / C.A. Gale, C.M. Bendel, M. McClellan et al. // Science. 1998. - Vol. 279. - P. 1355-1358.

182. Galinski E.A. Microbial behaviour in solt-stressed ecosystems / E.A. Galinski, H.G. Truper // FEMS Microbiol. Rev. 1994. - Vol. 15. - P. 95-108.

183. Ghannoum M. Candida adherence to epithelial cells / M. Ghannoum, S. Radwan // CRC Press Inc.- Boca Raten, Fla. 1990.

184. Ghannoum M.A. Extracellular phospholipases as universal virulence factor in pathogenic fungi / M.A. Ghannoum // J. Med. Mycol. 1998. - Vol. 39. -P. 55-59.

185. Ghannoum M.A. Potential role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis / Ghannoum M.A. // Clin.Microbiol.Rev. 2000. -Vol. 13. - No.l.- P. 122-143.

186. Growth inhibition of Candida albicans by human vaginal epithelial cells / M.M. Barousse, C. Steele, K. Dunla, et al. // J. Infect. Dis. 2001. - Vol. 184. - P. 1489-1493.

187. Hensel M. Molecular genetic approaches for the study of virulence in both pathogenic bacteria and fungi / M. Hensel, D.W. Holden // Microbiology. 1996. -Vol. 142.-P. 1040-1058.

188. Howlett J.A. Candida albicans ultrastructure: colonization and invasion of epithelium / J.A. Howlett, C.A. Squier // Infect. Immun. 1980. - Vol. 29. - P. 252260.

189. Ibrahim A.S. Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of Candida albicans /A.S. Ibrahim, F. Mirbod, S.G. Filler et al. // Infect. Immun. -1995.-Vol. 63.-P. 1993-1998.

190. Immunology. The immune system in health and disease / C.A. Janeway, P. Travery, M. Walpot et al. London, 1999. - P. 735.

191. Improved bacterial SOS promoter lux fusions for genotoxicity detection / Y. Davidov, R. Rozen, D. Smulski et al. // Gen. Toxicol.Environ. Mutagen. 2000. -Vol. 466. - № 1 - P. 97-107.

192. Intra-Abdominal Perforations // Eur. J Clin. Microbiol. Infect. Dis. -2001. Vol. 20 - P. 475-481.

193. Konig C. Factors compromising antibiotic activity against biofilms of staphylococcus epidermidis / C. Konig, S. Schwank, J. Blaser // Eur. J Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001. - Vol. 20. - P. 20-26.

194. Mardh P.A. Bacterial vaginosis: a threat to reproductive health? Historical perspectives, current knowledge, controversies and reseaech demands / P.A. Mardh // Eur. J. Contracept Reprod. Health Care. 2000. - Vol. 5. - P. 208-219.

195. Morphological variability and cell-wall deficiency in Mycobacterium tuberculosis heteroresistant' strains / L. Michailova, Vol. Kussovski, T. Radoucheva et al. // Int.J. Tuberc. Lung. Dis. 2005. - Vol. 8. - P. 907-914.

196. Naglik J.R. Candida albicans Secreted Aspartyl Proteinases in Virulence and Pathogenesis / J.R. Naglik, S.J. Challacombe, B. Hube // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - Vol. 67. - P. 400^128.

197. Navon-Venezia S. Update on Pseudomonas auriginosea and Acinetobacter baumannii infection in the healthcare setting / S. Navon-Venezia , R. Ben-Ami, Y. Carneli. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 18. - P. 306-313.

198. Nonspecific vaginitis: diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations / R. Amsel, P.A. Totten, C.A. Spiegel et al. // Am. J. Med. 1983. -Vol. 74. - P. 14-22.

199. Parise F., Allain C. Shape Changes of Colloidal Suspension Droplets during Drying // J. Phys. II France, 1996, vol. 6, p. 1111-1119dJV^ №

200. Rectal colonization with vancomycin-resistant enterococci among high-risk patients in an Israeli hospital / M. Dan; F. Poch; L. Leibson // J. Hosp. Infect.1999.-Vol. 43. -№ 3. P. 231.

201. Odds F.C. Candida species and virulence / F.C. Odds // ASM News. -1994.-Vol. 60.-P. 313-318.

202. Ren S. The use of a genetically engineered pseudomonas species (Shkl) as a bioluminescent reporter for heavy metal toxicity screening in wastewater treatment plant influent / S. Ren, P. Frymier // Water Environ. Res. — 2003. — Vol. 75.-P. 21-29.

203. Salminen S. Lactic acid Bacteria in the Gut in Normal and Disorderd States / S. Salminen, M. Deighton // Dig. Dis. 1992. - Vol. 10. - P. 227-238.

204. Sdiwebke J.R. Correlation of behaviors with microbiological changes in vaginal flora / J.R. Sdiwebke, C.M. Richey, H.L. Weiss // J. Infect. Dis. 1999. -Vol. 180.-P. 1632-1636.

205. Songer J.G. Bacterial phospholipases and their role in virulence / J.G. Songer// Trends microbial. 1997. - Vol. 5. - P. 156-161.

206. The possibility of detecting a few molecules using bioluminescence and chemiluminescence is exiting, especially in conext of miniaturized analytical devices / A. Roda, M. Guardigly, E. Michelini et al. // Anal.Chem. 2003. - P. 462^170.

207. Vulvovaginal symptoms in women with bacterial vaginosis / M.A. Klebanoff, J.R. Schwebke, J. Zhang et al. // Obstet Gynecol. 2004. - Vol. 104. - P. 267-272.

208. Wang J. Bacterial vaginosis / J. Wang // Prim. Care Update Ob. Gyns.2000.-Vol. 7.-P. 181-185.

209. Wiley John & Sons Perspective for the 21st Centrury. / England, 1999. -P. 376-379.

Информация о работе

Чемурзиева, Наталья Вадимовна
кандидата биологических наук
Пермь, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Совершенствование лабораторной диагностики инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами, с использованием компьютерных технологий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы