Молекулярно-генетическое исследование местного иммунитета при вагинитах

Непша, Оксана Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическое исследование местного иммунитета при вагинитах
ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование местного иммунитета при вагинитах"

На правах рукописи

НЕПША ОКСАНА СЕРГЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ВАГИНИТАХ

03.03.03 — иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2012 г.

005049030

Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России и ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России.

Научный руководитель: Трофимов Дмитрий Юрьевич,

доктор биологических наук.

Официальные оппоненты: Яздовский Виктор Владимирович,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией, ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф.Владимирского»,

Винницкий Леонид Ильич,

доктор медицинских наук, профессор,

заведующий лабораторией,

ФГБУ «Российский научный центр хирургии

имени академика Б.В. Петровского» РАМН.

Ведущая организация: Факультет фундаментальной медицины ФГЪОУ

ВПО «МГУ имени М.В.Ломоносова».

Защита состоится 26 декабря 2012 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан ¿/¿^ноября 2012 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

-^Сеславина Лия Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема инфекционно-воспалительных заболеваний женской репродуктивной системы продолжает оставаться одной из самых важных в акушерско-гинекологической практике. В настоящее время, наряду со снижением роли абсолютных патогенов в развитии инфекционно-воспалительных процессов влагалища, все большее значение в патогенезе таких заболеваний приобретают микроорганизмы, относящиеся к группе условно-патогенных: бактерии, грибы, микоплазмы, являющиеся составной частью нормальной микрофлоры [Липова Е.В., 2009; Ширева Ю.В., 2010].

Заболевания урогенитального тракта, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), принято рассматривать как дисбаланс биоты - дисбиоз [Болдырева М.Н., 2009]. Нарушение нормальной микрофлоры влагалища в большинстве случаев связано с развитием локального инфекционно-воспалительного процесса, характеризующегося рядом различных клинических проявлений: от бессимптомного носительства (например, кандидоносительство, мико-, уреаплазменная инфекция) до развернутой картины воспаления. Практическая диагностика таких состояний влагалища вызывает значительные трудности.

С развитием молекулярно-генетических методов, в частности количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественной ПЦР-РВ), задачи лабораторной диагностики дисбиотических состояний решаются более успешно [Ворошилина Е.С., 2011].

Остается нерешенным вопрос определения степени реактивности и динамического изменения компонентов локального иммунитета при воспалительных состояниях, обусловленных, в том числе, и дисбиотическими нарушениями. Оценка локального иммунитета слизистой влагалища в рутинной практике в настоящее время осуществляется в большинстве случаев единственным способом - путем подсчета количества лейкоцитов в поле зрения микроскопа в нативном материале. Ввиду

многообразия микроорганизмов и многогранности иммунного ответа, единичный показатель - количество клеток - не отражает в полной мере состояние мукозального иммунитета и является малоинформативным. Кроме того, результаты данного теста являются достаточно субъективными и во многом зависят от квалификации врача клинической лабораторной практики [Дмитриев Г.А., 2010; Schwiertz A. et. al., 2006]. В связи с этим установление объективных маркеров, способных более полно отразить состояние локального иммунитета является крайне актуальным.

На сегодняшний день в научной литературе существует большое количество информации относительно диагностической и прогностической значимости иммунологических показателей в алгоритме диагностики воспалительных состояний влагалища [Campos A. et. al., 2012; Hickey D. et. al., 2011]. Однако данные научные наработки до сих пор не нашли широкого применения в практике врачей акушеров-гинекологов.

В настоящее время к генам, контролирующим иммунный ответ, наряду с генами главного комплекса гистосовместимости относят широкий спектр генов, участвующих в его регуляции.

Учитывая преимущества метода ПЦР-РВ, а именно: его быстроту (в среднем для проведения анализа биологического материала методом ПЦР необходимо от 2-х до 4-х часов) и объективность, перспективным является изучение транскриптов (мРНК) генов иммунного ответа непосредственно в тканях, что позволит дать оценку динамическому состоянию организма, которое является результатом взаимодействия его генотипа, фенотипа и факторов внешней среды.

Результатом совместного использования современных молекулярно-генетических методов оценки экспрессии генов иммунного ответа и методов математической статистики, может явиться новый способ диагностики локального воспаления слизистой влагалища, который будет отражать состояние местного иммунитета.

Цель работы: изучить молекулярно-генетические особенности местного иммунитета при вагинитах у беременных и небеременных женщин и оценить возможность использования транскрипционного профиля генов иммунного ответа для совершенствования методов диагностики локального воспаления.

Задачи

1. На основании клинической картины у небеременных женщин репродуктивного возраста и беременных женщин перед родами и оценки состояния биоценоза влагалища методом ПЦР-РВ сформировать исследуемые группы.

2. С помощью количественной ПЦР-РВ и метода обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) охарактеризовать и сравнить профиль представленности транскриптов генов цитокинов (IL1B, IL6, IL8, IL10, IL 12A, IL 15, IL 18, IL23, TNFA, IFNG, TGFB1 и LIF), транскрипционных факторов (TBX21, GATA3, FOXP3 и RORC), То11-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9), поверхностных клеточных молекул (CD45, CD68, CD69, IL2RA) и гранулизина (GNLY) в клетках слизистой влагалища здоровых небеременных женщин и здоровых беременных женщин и соответствующих женщин с вагинитами.

3. Сравнить профиль экспрессии исследуемых генов иммунного ответа в клетках слизистой влагалища в группах здоровых беременных и здоровых небеременных женщин.

4. На основании количественной оценки транскриптов в клетках вагинальных соскобов отобрать наиболее информативные гены для оценки состояния слизистой влагалища.

5. Выявить роль изменений локального иммунитета влагалища в развитии осложнений родового акта и послеродового периода.

6. На основании экспериментальных данных и методов математической статистики предложить диагностическую модель оценки

воспалительных состояний влагалища, основанную на определении количества мРНК генов иммунного ответа.

Научная новизна. Впервые получены данные об уровне экспрессии мРНК широкого спектра генов иммунного ответа (IL1B, IL6, IL8, ILIO, IL 12A, IL15, IL18, IL23, IL2RA, GNLY, TNFA, TGFB1, LIF, IFNG, TLR2, TLR4, TLR9, ТВХ21, GATA3, RORC, FOXP3, CD45, CD68, CD69) в клетках слизистой влагалища здоровых небеременных женщин и здоровых беременных женщин и соответствующих женщин с вагинитами.

Выявлена ассоциация экспрессии 14 генов (IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFA, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC) из 24 исследуемых с проявлением местного воспаления.

В результате количественной оценки транскриптов генов провоспалительных цитокинов IL12A и IL18, а также общего макрофагального рецептора CD68 и основного транскрипционного фактора ТЬ2-клеток GATA3 показано достоверное снижение экспрессии этих генов в клетках слизистой влагалища при наличии местного воспаления, что не согласуется с представлениями классической иммунологии.

Разработан метод диагностики локального воспалительного процесса, протекающего на слизистых влагалища, на основании определения количества транскриптов генов IL 1 В, IL 18, ILIO, TLR4, CD68 и GATA3 для беременных и небеременных женщин репродуктивного возраста.

Практическая значимость. Установлены маркеры воспалительного процесса. При вагинитах в клетках слизистой влагалища беременных и небеременных женщин повышается количество транскриптов генов IL1B, IL8, ILIO, TNFA, TLR2, TLR4, CD45, CD69, а количество транскриптов генов G AT A3, CD68, TGFB1, IL12A, RORC, IL18 уменьшается.

порогового значения 96% и 95% соответственно как для беременных женщин, так и для небеременных женщин.

Создана основа для разработки диагностических тест-систем с использованием предложенной модели.

Показана возможность практического использования разработанного метода для диагностики локального воспалительного процесса во влагалище в практике акушеров-гинекологов.

Определены перспективы практического использования ОТ-ПЦР для оценки состояния локального иммунитета путем измерения мРНК генов иммунного ответа: учитывая схожее строение слизистых оболочек организма, полученные результаты могут быть перенесены на другие участки слизистых, что позволит расширить границы применения полученных результатов.

Показано, что наличие местной воспалительной реакции, определяемое по профилю экспрессии генов иммунного ответа, является важным диагностическим критерием, позволяющим объективно разграничить бессимптомное носительство условно-патогенной микрофлоры от проявлений вагинита.

Внедрение в клиническую практику современных методов исследования локального иммунитета влагалища у беременных женщин перед родами позволит объективно оценить наличие или отсутствие воспалительной реакции, а также своевременно предпринять меры по профилактике послеродовых воспалительных осложнений.

По результатам диссертационной работы подана заявка на изобретение № 201147924 «Способ диагностики вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках».

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 5 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций. Материалы исследований были представлены на Всероссийском форуме «Мать и дитя»

(Москва, 2011г.), VI Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012г.), V Российской конференции "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012г.).

Диссертация частично выполнена в рамках работ по государственному контракту №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011г.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 74 русскоязычных источника и 123 источника на иностранном языке. Работа содержит 11 таблиц и 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе диссертационной работы был исследован биологический материал от 295 пациенток, полученный в клиническом отделении ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в рамках выполнения государственного контракта №16.522.12.2009. Среди обследованных было 194 небеременные женщины в возрасте от 19 до 45 лет и 101 беременная женщина в возрасте от 18 до 40 лет в сроках от 37 до 41 недель беременности без родовой деятельности с целым плодным пузырем.

Материалом для исследования служили соскобы слизистой с задних и боковых стенок влагалища.

Критерием включения в группы здоровых беременных и здоровых небеременных женщин было отсутствие жалоб на момент обследования, отсутствие клинических признаков воспаления, лейкоцитарной реакции и дисбиотических нарушений биоценоза влагалища, наличие абсолютного нормоценоза.

Критерием включения в группы беременных и небеременных женщин с вагинитами было наличие жалоб, отечности и гиперемии со стороны слизистой влагалища, выраженной воспалительной реакции, которая

подтверждалась лейкоцитарной реакцией (более 10 лейкоцитов в поле зрения микроскопа).

Критерием исключения было наличие абсолютных патогенов (iChlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium) и ВПГ 1 и 2 типа, а также применение антибактериальных препаратов менее, чем за месяц до исследования. В отношении беременных женщин критериями исключения также являлись наличие у пациенток тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологии, истмико-цервикальная недостаточность с ее хирургической коррекцией.

На основании клинико-анамнестических данных и результатов лабораторного исследования биоценоза влагалища методом «Фемофлор» беременные и небеременные пациентки были разделены на несколько групп сравнения. Формирование лабораторного заключения по результатам исследования методом «Фемофлор» (№ ФСР 2009/04663) было основано на критериях, разработанных Е.С. Ворошилиной и соавт. (2011).

Небеременные женщины (п=194) были разделены на следующие группы: группа здоровых небеременных женщин (п=40), группа небеременных женщин с вагинитами (п=115); дополнительно были выделены группы женщин с незначительной выраженностью воспаления и числом лейкоцитов в мазке менее 10 в поле зрения: группа женщин с кандидоносительством (п=14), количество Candida spp. более 103 геномэквивалент/мл (гэ/мл) на фоне сохраненной нормофлоры, группа женщин с Ureaplasma spp. более 104 гэ/мл (п=10) на фоне сохраненной нормофлоры и группа женщин с облигатно-анаэробным дисбиозом (п=15).

Беременные женщины (п=101) были разделены на следующие группы: группа здоровых беременных женщин (п=42), группа беременных женщин с вагинитами (п=24); дополнительно были выделены группы женщин с незначительной выраженностью воспаления и числом лейкоцитов менее 10 в поле зрения: группа женщин с кандидоносительством (п=11), количество Candida spp. более 103 гэ/мл на фоне сохраненной нормофлоры, группа

женщин с Ureaplasma spp. более 104гэ/мл (п=16) на фоне сохраненной нормофлоры и группа женщин с обильными выделениями из половых путей (п=8). Эта группа интересна тем, что проблема интерпретации наличия обильных выделений (состояние физиологической нормы или патология) у беременных женщин является актуальной, т.к. до сих пор нет четкого понимания в отношении назначения профилактической терапии.

Микроскопический метод. Микроскопию вагинальных мазков, окрашенных по Граму, проводили по стандартной методике [Анкирская A.C., 2009]. Учитывали: характер вагинального эпителия, наличие «ключевых клеток», количество лейкоцитов, общую микробную обсемененность, морфологический состав микрофлоры, наличие дрожжеподобных грибов.

Исследование микрофлоры влагалища методом ПЦР-РВ. Взятие биологического материала осуществляли в пробирки с физиологическим раствором. Осаждение клеток и бактериальных агентов проводили путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 10 минут. Полученные клетки ресуспендировали в 100 мкл физиологического раствора. Для выделения ДНК использовали наборы «Проба ГС» («ДНК-Технология», Россия). Объем образцов после выделения составил 100 мкл.

Методом ПЦР-РВ проводилась количественная оценка биоценоза влагалища с помощью комплекта реагентов «Фемофлор» («ДНК-Технология», Россия): учитывали общее количество бактерий (общая бактериальная масса (ОБМ)), количество Lactobacillus spp. и 14 основных групп УПМ, включая аэробные микроорганизмы (Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp.), облигатно-анаэробные (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Ätopobium vaginae), Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp. и Candida spp.

Амплификацию осуществляли на приборе «ДТ-964» («ДНК-Технология», Россия) в режиме реального времени согласно инструкции производителя.

Формирование лабораторного заключения по результатам исследования методом «Фемофлор» было основано на критериях, разработанных Е.С. Ворошилиной и соавт. (2011), а также на основании методического пособия для врачей «Фемофлор» от фирмы-производителя.

Под абсолютным нормоценозом понимали вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры (Lactobacillus spp.) в его составе была более 80% по отношению к ОБМ, количество Ureaplasma spp., M. hominis - менее 104гэ/мл, Candida spp. — менее 103гэ/мл. Условный нормоценоз расценивали как вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры в его составе была более 80%, но количество Ureaplasma spp., M. hominis - могло быть более 104 гэ/мл и/или количество Candida spp. - более 103гэ/мл. Под анаэробный и аэробным дисбиозом понимали дисбаланс биоты, обусловленный одним или несколькими анаэробными и аэробными УПМ соответственно в количестве более 20% по отношению к ОБМ, и долей нормофлоры менее 80%. Смешанный дисбиоз - дисбаланс, вызванный сочетанием бактериальной аэробной и/или анаэробной биоты, возможно, в сочетании с Candida spp. на фоне снижения количества нормофлоры.

Исследование профиля мРНК генов иммунного ответа методом ОТ-ПЦР. Для изучения состояния местного иммунитета определяли представленность транскриптов генов цитокинов (IL1B, IL6, IL8, ILIO, IL 12 A, IL15, IL18, IL23, TNF A, IFNG, TGFB1, LIF), транскрипционных факторов (ТВХ21, GATA3, FOXP3, RORC), То11-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9), поверхностных клеточных молекул (CD45, CD68, CD69, IL2RA) и гранулизина (GNLY) в клетках слизистой влагалища. Во избежание деградации РНК взятие материала осуществляли в пробирки со специальной транспортной средой (лизирующий раствор набора «Проба НК», «ДНК-Технология», Россия). Осаждение РНК проводили изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками промывочными растворами. Объем образцов после выделения составил 50 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) ставили в объеме 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца). В качестве праймеров для ОТ использовали специфичные олигонуклеотиды. Реакцию проводили при температуре 40°С в

течение 30 мин, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ кДНК разводили в 5 раз в ТЕ-буфере. Амплификацию осуществляли на приборе «ДТ-964» («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции производителя. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки.

Статистическая обработка результатов. Для количественной оценки уровня экспрессии мРНК генов применялся метод сравнения индикаторных циклов (метод AACq) с нормировкой по трем референсным генам ТВР, В2М, GUS.

В качестве меры центральной тенденции количественных признаков выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки - верхний (Н) и нижний квартили (L). Для оценки значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна-Уитни для несвязанных совокупностей. Значения Me в контрольной группе были приняты за 1, а значения Me в исследуемых группах показывала во сколько раз уровень экспрессии гена выше или ниже по отношению к группе здоровых пациенток.

Отношение шансов (ОШ) и значимость различий в частоте встречаемости качественных признаков рассчитывали с помощью программного продукта WINPEPI. ОШ приведено с 95% доверительным интервалом. Статистическую обработку данных проводили с помощью статистического пакета SPSS Statistics версии 17.0 (Inc., Chicago, USA).

При разработке критериев диагностики вагинита был проведен многофакторный анализ и построена математическая модель, позволяющая вычислить значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) для каждого клинического образца. С использованием полученной функции была построена классификационная модель. Для расчёта оптимального значения величины порога отсечения (точки cut off) использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic). Основой данного анализа является построение ROC-кривой, которая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров.

Критерием выбора точки cut off является требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование микрофлоры влагалища небеременных женщин методом ПЦР-РВ. По типу биоценоза у обследованных небеременных женщин репродуктивного возраста наблюдалось преобладание нормофлоры. Из 194 пациенток нормоценоз был выявлен у 128 (66%), из них абсолютный нормоценоз - у 62 (48,4%), а условный - у 66 (51,6%).

Среди женщин с абсолютным нормоценозом (п=62) доля УПМ не превышала 6%, доля лактобактерий была не ниже 94%, микоплазм и грибов Candida spp. выше диагностического порогового уровня (104гэ/мл для микоплазм и 103 гэ/мл для грибов) выявлено не было.

Из 66 женщин с условным нормоценозом у 28 (43,5%) Ureaplasma spp. превышала пороговое значение 104пэ/мл, а у 56 (84,8%) Candida spp. обнаруживалась в количестве более 103 гэ/мл, при этом у 18 женщин (28,1%) одновременно были повышены количества обоих микроорганизмов. Доля УПМ среди женщин с условным нормоценозом не превышала 15% по отношению к ОБМ. Доля нормофлоры была не ниже 80%.

У 66 (34%) из 194 пациенток были выявлены дисбиотические нарушения влагалища, которые характеризовались значительным снижением нормофлоры от 75% до 1% против 94% у женщин с нормоценозом. Из них у 8 (12,1%) наблюдался аэробный дисбиоз. Доля нормофлоры была снижена от 62% до 1%. Доля всех УПМ в среднем составляла от 30% до 99% по отношению к ОБМ. Группа женщин с данным дисбиозом по сравнению с женщинами с нормоценозом характеризовалась наибольшим увеличением количества факультативных аэробов семейств Streptococcus spp. от 30% до 80% и Enterobacterium spp. от 30% до 99%. У 3 пациенток были выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 гэ/мл.

Среди пациенток с дисбиотическими нарушениями (п=66) у 30 (45,5%)

был выявлен облигатно-анаэробный дисбиоз. Доля УПМ составляла более

20% по отношению к ОБМ. Количество лактобактерий было снижено от 79%

до 1% по отношению к ОБМ. Данное дисбиотическое нарушение

характеризовалось преобладанием следующих групп микроорганизмов: Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. от 20 до 99%, Eubacterium spp. от 20 до 30%, Lachnobacterium spp./Clostridium spp. от 25 до 99%, Atopobium vaginae от 20 до 80%, Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp. от 20 до 40% по отношению к ОБМ. У 21 женщины была выявлена Ureaplasma spp, у 5 — М. hominis в количестве более 104 гэ/мл.

У 28 из 66 женщин (42,4%) с дисбиотическими нарушениями наблюдался смешанный вариант биоценоза, где присутствовали облигатно-анаэробные и/или аэробные микроорганизмы в количестве более 20% по отношению ОБМ, а также Candida spp. в количестве более 103 гэ/мл. Общее содержание лактобактерий не превышало 50% в сравнении с ОБМ. Данная группа характеризовалась увеличением количества облигатно-анаэробных микроорганизмов от 32 до 99% и аэробных - от 20 до 80%. У 3 женщин была выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 гэ/мл, а у 18 - Candida spp. в количестве более 103 гэ/мл.

По структуре биоценоза в группе небеременных женщин с вагинитами (п=115) различали несколько вариантов состояния биоценоза: абсолютный нормоценоз (п=22), условный нормоценоз, характеризующийся увеличением количества Candida spp. (п=42), аэробный дисбиоз (п=8), облигатно-анаэробный дисбиоз (п=15) и смешанный дисбиоз (п=28).

Исследование микрофлоры влагалища беременных женщин методом ПЦР-РВ. По типу биоценоза у обследованных беременных женщин (п=101) наблюдалось преобладание нормофлоры. Нормоценоз был выявлен у 95 беременных женщин (94%). При этом абсолютный нормоценоз влагалища выявлен у 59 (62,1%), а условный - у 36 пациенток (37,9%).

Из 36 женщин с условным нормоценозом у 18 (50%) количество Ureaplasma spp. превышало 104 гэ/мл, а у 20 (55,6%) - была обнаружена Candida spp. в количестве более 103 гэ/мл, у 2 женщин одновременно были повышены количества обоих микроорганизмов.

Дисбиотические нарушения влагалища были выявлены у 6 (5,9%) пациенток из 101. Наблюдалось значительное снижение доли нормофлоры -количество лактобактерий при дисбиозе не превышало 60%. Группа женщин

с данным типом биоценоза по сравнению с группой женщин с абсолютным нормоценозом характеризовалась увеличением количества факультативных аэробов: семейство Streptococcus spp. до 30% и Enterobacterium spp. до 25%.

Смешанного типа дисбиоза, а также облигатно-анаэробного среди беременных женщин выявлено не было.

По структуре биоценоза в группе беременных женщин с вагинитами (п=24) различали: абсолютный нормоценоз (п=9), условный нормоценоз (п=9), характеризующийся наличием Candida spp. более 103 гэ/мл, и аэробный дисбиоз (п=6).

Частота встречаемости Ureaplasma spp. и Candida spp. не зависела от наличия лактобактерий, что соотносится с данными литературы [Zhou H. et al., 2006; Прилепская B.H., 2010].

Исследование профиля экспрессии мРНК генов иммунного ответа методом ОТ-ПЦР. Одной из ключевых характеристик клеток организма является профиль экспрессии генов, описывающий их состояние и функциональную активность. Для оценки профиля экспрессии генов была использована технология анализа количества мРНК в образцах относительно референсных генов (ТВР, В2М, GUS) с помощью реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР в реальном времени. Для определения состояния локального иммунитета влагалища у всех женщин был проведен анализ экспрессии генов IL1B, IL6, IL8, ILIO, IL12A, IL15, IL18, IL23, TNFA, IFNG, TGFB1, LIF, ТВХ21, G AT A3, FOXP3, RORC, TLR2, TLR4, TLR9, CD45, CD68, CD69, IL2RA и GNLY.

Наличие локальной воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища в группах беременных и небеременных женщин с вагинитами характеризуется достоверным повышением экспрессии генов TLR2, TLR4, IL1B, IL6, IL8, GNLY, ТВХ21, IFNG, ILIO, CD45, IL2RA и CD69 (р<0.05) в сравнении со здоровыми женщинами. Увеличение количества транскриптов генов TLRs, провоспалительных цитокинов, а также маркеров активированных Т-клеток и транскрипционного фактора ТВХ21 при вагинитах свидетельствует об активации клеток врожденного и адаптивного

иммунитета, что подтверждается данными ряда авторов [Wirth M., 2007; Anton G. et al., 2008].

В эпителиальном слое слизистой оболочки влагалища в норме содержатся дендритные клетки, у5Т-лимфоциты, а при воспалении туда мигрируют другие популяции клеток (С08+-Т-клетки, NK-клетки). Состав популяции клеток иммунной системы в подслизистом слое более разнообразен (макрофаги, нейтрофилы, типичные Т- и В-лимфоциты, дендритные клетки, NK-клетки). Об активации лимфоцитарного звена иммунной системы говорит повышение экспрессии мРНК общего лейкоцитарного антигена CD45, раннего активационного антигена Т-лимфоцитов CD69, а также IL2RA, экспрессирующихся на активированных Т-клетках [Pudney J. et al., 2005; Ярилин A.A., 2010].

При вагинитах у беременных и небеременных женщин отмечалось достоверное снижение уровня экспрессии мРНК генов IL12A, IL18, CD68, а также G AT A3 и RORC и увеличение ILIO по сравнению с соответствующими группами контроля.

По данным ряда авторов [Strobl H., 2004; Rydström А., 2007] CD68 экспрессируется помимо активированных макрофагов и на некоторых популяциях дендритных клеток. Являясь профессиональными антигенпрезентирующими клетками, при активации они мигрируют в региональные лимфатические узлы для представления антигена наивным Т-клеткам, что способствует их последующей дифференцировке. Принимая во внимание достоверное повышение количества мРНК ТВХ21 при вагинитах, ожидалось, что экспрессия IL12A и IL18, необходимых для дифференцировки ThO-лимфоцитов в Thl-клетки и их клональной пролиферации, будет повышена. Снижение количества транскриптов IL12A, IL 18 и CD68 может быть вызвано тем, что данные события осуществляются в региональных лимфоидных органах, а не локально [Cunningham A. et al., 2013].

Транскрипционный фактор GATA3, помимо регуляции дифференцировки Т-клеток по ТЬ2-пути, играет важную роль в биологии эпителиальных клеток. Снижение уровня транскрипта гена GATA3 вероятно

связано с физиологическими процессами слущивания и обновления вагинального эпителия при развитии локального воспаления [KurekD. et. al., 2008]. Возможно, этими же физиологическими процессами объясняется и снижение экспрессии гена TGFB1 при воспалении, который участвует в дифференцировке эпителиальных клеток [Juuti-Uusitalo К. et. al., 2006].

Согласно современным представлениям, основными клетками-продуцентами ILIO являются макрофаги, дендритные клетки, B-клетки, а также различные субпопуляции Т-клеток. ILIO, являясь регуляторным цитокином, может напрямую регулировать врожденный и адаптивный ответы макроорганизма на вторжение инфекционного агента, и по принципу обратной связи ограничивать развитие локального воспалительного процесса [Kevin N. et. al., 2008].

Провоспалительная функция ILIO также реализуется в отношении ТЫ7-клеток путем подавления их дифференцировки. Вероятно, по этой причине детектировалось достоверное снижение экспрессии гена RORC при вагинитах [Frank L. van de Veerdonk et. al., 2009].

Среди беременных женщин с вагинитами отмечено увеличение количества транскриптов генов IL6, LIF, IL 15, GNLY и IFNG (р<0.05) по сравнению с группой здоровых беременных женщин. Также, следует отметить, что уровень экспрессии этих генов в мазках беременых женщин был выше в сравнении с небеременными. Эти данные косвенно свидетельствуют об активации NK-клеток, необходимых для поддержания нормально протекающей беременности и развития плода [Piccinni MariePierre, 2006].

Группа небеременных женщин с кандидоносительством (п=14) мало отличалась от группы здоровых небеременных женщин по уровню экспрессии исследуемых генов, за исключением TGFB1, экспрессия которого была повышена в 2 раза. Среди беременных женщин с кандидоносительством (п=11) отмечалось достоверное снижение экспрессии генов IL8, IL 18, TGFB1, GATA3, RORC, LIF и повышение IL6 и ILIO (р<0,05).

Группа небеременных пациенток с Ureaplasma spp. более 104гэ/мл (п=10) по профилю экспрессии анализируемых генов была сходна с группой небеременных женщин с вагинитами и характеризовалась достоверным повышением экспрессии генов TLR2, TLR4, IL1B, IL8, CD45, CD69 и снижением экспрессии генов CD68, IL 18 и GATA3 по сравнению с группой здоровых небеременных пациенток. Среди беременных пациенток с Ureaplasma spp. (п=16) профиль экспрессии анализируемых генов не отличался от такого в группе здоровых беременных женщин за исключением IL 15, его экспрессия была повышена в 3 раза.

Группа небеременных пациенток с облигатно-анаэробным дисбиозом (п=15) характеризовалась достоверным снижением уровней экспрессии генов CD68, IL18, GATA3 и IL12A (р<0,05) в сравнении с группой здоровых небеременных женщин.

Группа беременных женщин с обильными выделениями (п=8) не отличалось по количеству транскриптов анализируемых генов в клетках слизистой влагалища от такового в группе здоровых беременных, за исключением гена GATA3, экспрессия которого была повышена в 2 раза.

Следует отметить, что уровень экспрессии генов IL6, LIF, TLR9, GNLY, IL2RA, IL15, ТВХ21, RORC, FOXP3 и IFNG в клетках слизистой влагалища невысок. Область линейного диапазона для анализируемых генов соответствует концентрациям от 600 до 108 копий мРНК на на образец. Количество копий мРНК генов, преведенных выше, в большей части клинических образцов выходила за нижние границы линейного диапазона (600 копий мРНК/образец). Кроме того экспрессия этих генов детектировалась не во всех образцах, поэтому данные маркеры нецелесообразно использовать для диагностики воспалительных состояний.

Поскольку экспрессия референсных генов (ТВР, В2М, GUS) может изменяться при некоторых обстоятельствах, а нормировка по группе из нескольких таких генов достаточно трудоемка, поиск генов, соотношение экспрессии которых может служить самостоятельным индексом (маркером) того или иного состояния, представляет большой интерес для использования

в диагностических целях. В этом случае соотношение экспрессии вычисляется по формуле:

[Ген1]/[ Ген2] = Е2Ср2/Е1Ср1, где Ср1 и Ср2- значения характеристических циклов ПЦР, а Е1 и Е2 -эффективности амплификации соответствующих генов.

В случае исследования групп женщин с вагинитами в качестве такого индекса могут служить соотношения экспрессии генов 11ЛВ/С068, 1Ы0/1Ы8 иТЬЯ4/ОАТАЗ (рис.1).

□ небеременные здоровые О небеременные вагинит

Т1_Р4КЗАТАЗ*

Рисунок 1. Соотношения значений индексов в группе здоровых мебеременных женщин и группе небеременных женщин с вагинитами, нормированные на Ме группы здоровых небеременных женщин (за 1 приняты значения Ме в группе здоровых небеременных женщин (*р<0,05)).

Наличие статистически значимых различий в профиле экспресси этих генов легло в основу создания модели, позволяющей объективно оценить наличие локальной воспалительной реакции.

Для построения классификационной модели, позволяющей разделять группы здоровых женщин и пациенток с вагинитами, а также ее проверки, для небеременных женщин репродуктивного возраста было проанализировано две выборки: обучающая (п=78) и проверочная (п=77).

Обе выборки включали по 2 группы: группу здоровых женщин и группу женщин с вагинитами. Деление на группы осуществляли случайным образом.

В результате проведения многофакторного анализа была подобрана каноническая линейная дискриминантная функции (КЛДФ), уравнение которой имело вид:

{üb-»чшь

где [IL1B], [CD68], [ILIO], [IL18], [TLR4] и [GATA3] - значения экспрессии данных генов (значения Ср) для конкретного образца.

Данная функция позволила классифицировать пациенток репродуктивного возраста по наличию воспалительной реакции во влагалище. В результате классификации 95% (19 из 20) здоровых небеременных женщин и 93% (54 из 58) пациенток с вагинитами были классифицированы верно (рис. 2).

-¿5—

/ 1 Im • 1

/Х7

/ ______ / V

5 3 Значения КЛДФ 1 3

^^^"здоровые небеременные женщины • небеременные вагинит — — —cut off

Рисунок 2. Распределение групп здоровых небеременных женщин и женщин с вагинитами в зависимости от значений КЛДФ для обучающей выборки.

При проверке подобранной функции на тестовой выборке (п=77) анализ данных показал, что 95% пациенток были классифицированы верно.

Для оценки диагностических возможностей предложенной модели с использованием КЛДФ был выполнен ROC-анализ. Площадь под ROC-

кривой составила 0,98 (р<0,05). Данное значение согласно экспертной шкале позволило оценить предложенную модель как «отличную».

В качестве точки cut off было выбрано значение, равное -0,61, соответствующее максимальной сумме чувствительности и специфичности. Чувствительность и специфичность предложенной модели по разделению здоровых женщин и пациенток с вагинитом в области порогового значения составила 96% и 95% соответственно. Значения показателей КЛДФ выше cut off классифицировались как признак локальной воспалительной реакции слизистой влагалища (рис.3).

По результатам классификации с использованием предложенной модели пациентки дополнительных групп сравнения были разделены следующим образом: 86% пациенток с кандидоносительством, 40% женщин с Ureaplasma spp. более 104 гэ/мл и 47% пациенток с облигатно-анаэробным дисбиозом были классифицированы как здоровые женщины (рис. 3).

4,0 3,0 2,0 © 1,0 S •»

а -1,0

£ -2,0 д

ß, -3,0 -4,0 -5,0 -6,0

--0--i.~-_.g--X--

группа здоровых небеременных женщин

группа небеременных женщин с вагинитами

группа небеременных женщин с Candida spp.>10A3 гэ/мл

группа небеременных женщин с Ureaplasma 5рр.>10л4 гэ/мл

группа небеременных женщин с облигатно-анаэробным

дисбиозом — — cut off

Рисунок 3. Распределение групп небеременных женщин репродуктивного возраста в зависимости от значений КЛДФ.

В ходе выполнения работы были выявлены общие тенденции в

изменении эксперессии генов иммунного ответа при вагинитах как среди

небеременных женщин, так и среди беременных пациенток. Данный факт

послужил основанием использовать подобранные ранее маркерные индексы

(ЦЛВ/СБбв, 11Л0/1Ы8 и Т1Л4/ОАТАЗ) для разделения групп условно ! 21

здоровых беременных женщин и женщин с воспалением. Следует отметить, что уровень экспрессии потенциальных генов-маркеров локального воспаления (IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF A, G AT A3, CD68, IL 12A, IL 18, TGFB1) в контрольных группах небеременных и беременных женщин отличается: среди беременных пациенток контрольной группы достоверно повышена экспрессия генов ILIO, IL12A, TGFB1 и CD68 и снижена - IL18, TNF A, CD45 (р<0.05) по сравнению с контрольной группой небеременных женщин репродуктивного возраста (рис. 4), что, вероятно, связано с разным физиологическим состоянием (беременность).

□ здоровые небеременные

□ злооовые беоеменные

Рисунок 4. Уровни экспрессии генов иммунного ответа в вагинальных мазках здоровых беременных и здоровых небеременных женщин, нормированные на Ме группы здоровых небеременных женщин. За 1 приняты значения Ме в группе здоровых неберемеиных женщин (*р<0,05)

В связи с разным уровнем экспрессии генов в группах здоровых беременных и небеременных женщин для группы беременных пациенток были определены другие коэффициенты в уравнении КЛДФ:

где [IL1B], [CD68], [ILIO], [IL18], [TLR4] и [GATA3] - значения экспрессии данных генов (значения Ср) для конкретного образца.

В результате классификации 95% (38 из 40) здоровых беременных женщин и 96% (23 из 24) пациенток с вагинитами были классифицированы верно.

По результатам ROC-анализа площадь под ROC-кривой составила 0,993 (р<0,05). Данное значение согласно экспертной шкале позволило оценить предложенную модель как «отличную». Значение точки cut off составило 0,65. Чувствительность и специфичность предложенной модели составила 96% и 95% соответственно. Значения показателей функции выше cut off классифицировались как признак локальной воспалительной реакции слизистой влагалища.

По результатам классификации с использованием предложенной модели беременные пациентки дополнительных групп сравнения были разделены следующим Образом: 82% женщин с кандидоносительством, 75% женщин с Ureaplasma spp. более 104 гэ/мл, а также все пациентки с обильными выделениями были классифицированы как здоровые (рис. 5).

4,0 3,0 2,0

ef 1,0 а

I 0,0

я в го

-2,0 -3,0 -4,0

-а. - & - _а д - X--

1 ä ° *

1 А 1 *

0 8

о о

О группа здоровых беременных женщин

□ группа беременных женщин с вагинитами

А группа беременных женщин с Candida spp.>10A3 гэ/мл

О группа беременных женщин с Ureaplasma spp.>10A4 гэ/мл

X группа беременных женщин с обильными выделениями

--cut off

Рисунок 5. Распределение групп беременных женщин в зависимости от значений КЛДФ.

Анализ течения родов показал, что осложнения родов и послеродового периода статистически значимо чаще встречались в группе беременных с

признаками воспаления слизистой влагалища (р= 1,3*10"5, (Ж=10,4 (3,2832,94)). Таким образом, помимо качественного и количественного состава микробиоты влагалища существенным фактором риска послеродовых осложнений является наличие локальной воспалительной реакции слизистой влагалища.

В результате проведенных исследований был предложен новый метод объективной оценки локального воспалительного процесса для беременных и небеременных женщин на основании определения количества транскриптов генов иммунного ответа, что может использоваться в качестве дополнительного диагностического критерия, позволяющего объективно различить бессимптомное носительство условно-патогенных микроорганизмов от проявлений вагинита.

С развитием молекулярно-генетических методов, в частности количественной ОТ-ПЦР, появилась возможность оценки профиля активности различных генов в широком спектре биологического материала. Лабораторная оценка профиля экспрессии генов иммунного ответа во влагалище на базе стандартной ПЦР лаборатории позволяет существенно повысить объективность диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний и может быть использована для своевременной профилактики осложнений родов и послеродового периода.

ВЫВОДЫ

1. Получены новые научные данные, конкретизирующие предстравления о молекулярно-генетических особенностях местного иммунитета и его роли в иммунологии реподукции.

2. Впервые проведено систематическое исследование профиля экспрессии широкого спектра генов иммунного ответа (24 гена) и выявлена ассоциация экспрессии 14 из них (IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF A, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC) с проявлением местного воспаления.

3. Воспалительные состояния влагалища беременных и небеременных женщин сопровождаются изменением уровня транскриптов

генов иммунного ответа (экспрессия генов IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFA повышается, a G AT A3, CD68, IL 12 A, IL 18, TGFB1, RORC снижается), что позволяет использовать данные маркеры для оценки воспалительного процесса.

4. Установлено повышение экспрессии генов ILIO, IL 12A, TGFB1, CD68 и снижение - IL 18, TNFA, CD45 в клетках слизистой влагалища здоровых беременных женщин в сравнении со здоровыми небеременными женщинами.

5. На фоне локального изменения экспрессии генов IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNFA, G AT A3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC в предродовом периоде установлено статистически значимое повышение частоты осложнения родов (преждевременное излитие околоплодных вод, разрыв мягких тканей родовых путей) и послеродового периода (раневая инфекция, послеродовой эндометрит) в группе беременных женщин с вагинитами.

6. Оценка количества мРНК генов IL1B, IL18, ILIO, CD68, TLR4 и GATA3 может служить основой для создания метода диагностики воспалительных состояний влагалища с чувствительностью и специфичностью в области порогового значения 96% и 95% соответственно как для беременных, так и для небеременных женщин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О. С., Трофимов Д.Ю., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Екимов А.Н. Состояние локального иммунитета при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. //Иммунология. - 2011. - №3. - С.154-163.

2. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Донников А.Е. Цитокиновый профиль иммунокомпетентных клеток влагалища при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Уральский медицинский журнал. - 2011. - №3. - С.44-49.

3. Сухих Г.Т., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Донников А.Е., Дуринян Э.Р., Бирюкова А.М. Профиль

экспрессии мРНК генов цитокинов в вагинальных мазках женщин репродуктивного возраста при неспецифическом вагините и бактериальном вагинозе. // Акушерство и гинекология. - 2011. - №7-2. - С.33-38.

4. Байрамова Г.Р., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Екимов А.Н. Состояние локального иммунитета при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Акушерство и гинекология. - 2011. - №1. - С.52-56.

5. Меджидова М.К., Бурменская О.В., Донников А.Е., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Тютюнник B.JL, Сухих Г.Т. Оценка локальной воспалительной реакции во влагалище по профилю экспрессии мРНК генов цитокинов у беременных накануне родов. // Акушерство и гинекология. 2012.-№3.-С.26-31.

6. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Муллабаева С.М., Екимов А.Н., Донников А.Е. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов у женщин с хроническим рецидивирующим вульвовагинальным кандидозом. // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». - 28 сентября - 1 октября, Москва, 2010. - С.531-532.

7. Байрамова Г.Р., Непша О.С., Бурменская О.В., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Прилепская В.Н., Трофимов Д.Ю. Локальная экспрессия мРНК генов цитокинов у женщин с хроническим вульвовагинальным кандидозом. // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье. Сборник материалов III междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия». - 3 июня, Санкт-Петербург,

Подписано в печать ¿0.11.12 Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеЬСору». Тираж 100 экз. Заказ №1095 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

2010. — С.15-16.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Непша, Оксана Сергеевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ НИЖНЕГО ОТДЕЛА ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ, ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ. СОСТОЯНИЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА И ЛОКАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Воспалительные заболевания влагалища. Условно-патогенные микроорганизмы как одна из причин развития инфекционно-воспалительных заболеваний.

1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища женщин репродуктивного возраста и беременных женщин, а также факторы, влияющие на его состояние.

1.3 Дисбиотические состояния микробиоценоза влагалища.

1.4 Состояние локального иммунитета влагалища.

1.5 Лабораторная диагностика инфекционно-воспалительных процессов, протекающих на слизистой влагалища.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Общеклинические методы исследования.

2.2 Специальные методы исследования.

2.3 Статистические методы исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Исследование микрофлоры влагалища небеременных женщин методом ПЦР.

3.3 Состояние локального иммунитета влагалища небеременных женщин репродуктивного возраста и беременных женщин.

3.4 Состояние локального иммунитета влагалища небеременных женщин репродуктивного возраста.

3.5 Состояние локального иммунитета влагалища беременных женщин.

3.6 Осложнения родов и послеродового периода.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое исследование местного иммунитета при вагинитах"

Актуальность

Проблема инфекционно-воспалительных заболеваний женской репродуктивной системы продолжает оставаться одной из самых важных в акушерско-гинекологической практике. В настоящее время, наряду со снижением доли абсолютных патогенов в развитии инфекционно-воспалительных процессов все большее значение приобретают условно-патогенные микроорганизмы (УПМ) - бактерии, грибы, микоплазмы, являющиеся составной частью нормальной микрофлоры влагалища [30; 33; 73].

Нарушение подвижного равновесия микрофлоры, сущность которого определяется характером качественных и количественных изменений в видовом составе микробных ассоциаций называется дисбиозом [8]. Результатом нарушений состава микрофлоры влагалища очень часто является развитие локального инфекционно-воспалительного процесса, характеризующегося рядом различных клинических проявлений: от бессимптомно носительства (например, кандидоносительство, мико-, уреаплазменная инфекция) до развернутой картины воспаления. Практическая диагностика таких состояний влагалища вызывает значительные трудности.

С развитием молекулярно-генетических методов, в частности количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР), задачи лабораторной диагностики дисбиотических состояний стали решаться более успешно [8; 11].

Вопрос определения степени реактивности и динамического изменения компонентов локального иммунитета при воспалительных состояниях, обусловленных, в том числе, и дисбиотическими нарушениями, остается нерешенным. Оценка локального иммунитета слизистой влагалища в рутинной практике в настоящее время осуществляется в большинстве случаев единственным способом - путем подсчета количества лейкоцитов в поле зрения микроскопа в нативном материале. Ввиду многообразия микроорганизмов и многогранности иммунного ответа, единичный показатель - количество клеток - не отражает в полной мере состояние мукозального иммунитета и является малоинформативным. Кроме того, результаты данного теста являются достаточно субъективными и во многом зависят от квалификации врача клинической лабораторной практики [14; 169]. В связи с этим поиск объективных маркеров, способных более полно отразить состояние локального иммунитета является крайне актуальным.

На сегодняшний день в научной литературе существует большое количество информации относительно диагностической и прогностической значимости иммунологических показателей в алгоритме диагностики воспалительных состояний влагалища [90; 122]. Однако данные научные наработки до сих пор не нашли широкого применения в практике врачей акушеров-гинекологов.

Учитывая преимущества метода ПЦР, а именно: его быстроту (в среднем для проведения анализа биологического материала методом ПЦР необходимо от 2-х до 4-х часов) и объективность, перспективным является изучение транскриптов генов иммунного ответа непосредственно в тканях, что позволит дать оценку динамическому состоянию организма, которое является результатом взаимодействия его генотипа, фенотипа и факторов внешней среды.

Цель работы

Целью настоящего исследования явилось изучение молекулярно-генетических особенностей местного иммунитета при вагинитах у беременных и небеременных женщин и оценка возможности использования транскрипционного профиля генов иммунного ответа для совершенствования методов диагностики локального воспаления.

Задачи

1. На основании клинической картины у небеременных женщин репродуктивного возраста и беременных женщин перед родами и оценки состояния биоценоза влагалища методом количественной ПЦР сформировать исследуемые группы.

2. С помощью количественной ПЦР и метода обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) охарактеризовать и сравнить профиль представленности транскриптов генов цитокинов (IL1B, IL6, IL8, ILIO, IL 12 A, IL 15, IL 18, IL23, TNF A, IFNG, TGFB1 и LIF), транскрипционных факторов (ТВХ21, GAT A3, FOXP3 и RORC), ТоН-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9), поверхностных клеточных молекул (CD45, CD68, CD69, IL2RA) и гранулизина (GNLY) в клетках слизистой влагалища здоровых небеременных женщин и здоровых беременных женщин и соответствующих женщин с вагинитами.

6. На основании экспериментальных данных и методов математической статистики предложить диагностическую модель оценки воспалительных состояний влагалища, основанную на определении количества мРНК генов иммунного ответа.

Научная новизна

Впервые получены данные об уровне экспрессии мРНК широкого спектра генов иммунного ответа (IL1B, IL6, IL8, ILIO, IL12A, IL15, IL18, IL23, IL2RA, GNLY, TNF A, TGFB1, LIF, IFNG, TLR2, TLR4, TLR9, ТВХ21, GATA3, RORC, FOXP3, CD45, CD68, CD69) в клетках слизистой влагалища здоровых небеременных женщин и здоровых беременных женщин и соответствующих женщин с вагинитами.

Выявлена ассоциация экспрессии 14 генов (IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF A, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC) из 24 исследуемых с проявлением местного воспаления.

В результате количественной оценки транскриптов генов провоспалительных цитокинов IL12A и IL 18, а также общего макрофагального рецептора CD68 и основного транскрипционного фактора Th2-клеток GATA3 показано достоверное снижение экспрессии этих генов в клетках слизистой влагалища при наличии местного воспаления, что не согласуется с представлениями классической иммунологии.

Разработан метод диагностики локального воспалительного процесса, протекающего на слизистых влагалища, на основании определения количества транскриптов генов IL1B, IL 18, ILIO, TLR4, CD68 и GATA3 для беременных и небеременных женщин репродуктивного возраста.

Практическая значимость

Установлены маркеры воспалительного процесса. При вагинитах в клетках слизистой влагалища беременных и небеременных женщин повышается количество транскриптов генов IL1B, IL8, ILIO, TNF A, TLR2, 9

TLR4, CD45, CD69, а количество транскриптов генов GATA3, CD68, TGFB1, IL 12А, RORC, IL18 уменьшается.

Предложен новый метод диагностики локального воспаления с использованием значений количества мРНК генов IL1B, IL18, ILIO, CD68, TLR4 и GATA3 с чувствительностью и специфичностью в области порогового значения 96% и 95% соответственно как для беременных женщин, так и для небеременных женщин.

Создана основа для разработки диагностических тест-систем с использованием предложенной модели.

Определены перспективы практического использования количественной ОТ-ПЦР для оценки состояния локального иммунитета путем измерения мРНК генов иммунного ответа: учитывая схожее строение слизистых оболочек организма, полученные результаты могут быть перенесены на другие участки слизистых, что позволит расширить границы применения полученных результатов.

По результатам диссертационной работы подана заявка на изобретение № 201147924 «Способ диагностики вагинитов у беременных ю женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках».

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 5 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций. Материалы исследований были представлены на Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011г.), VI Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012г.), V Российской конференции "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012г.).

Диссертация частично выполнена в рамках работ по государственному контракту №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011г.

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 74 русскоязычных источника и 123 источника на иностранном языке. Работа содержит 11 таблиц и 24 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Иммунология", Непша, Оксана Сергеевна

выводы

1. Получены новые научные данные, конкретизирующие предетравления о молекулярно-генетических особенностях местного иммунитета и его роли в иммунологии реподукции.

2. Впервые проведено систематическое исследование профиля экспрессии широкого спектра генов иммунного ответа (24 гена) и выявлена ассоциация экспрессии 14 из них (IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF A, G AT A3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC) с проявлением местного воспаления.

3. Воспалительные состояния влагалища беременных и небеременных женщин сопровождаются изменением уровня транскриптов генов иммунного ответа (экспрессия генов IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF А повышается, a GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC снижается), что позволяет использовать данные маркеры для оценки воспалительного процесса.

4. Установлено повышение экспрессии генов ILIO, IL 12A, TGFB1, CD68 и снижение - IL 18, TNF A, CD45 в клетках слизистой влагалища здоровых беременных женщин в сравнении со здоровыми небеременными женщинами.

5. На фоне локального изменения экспрессии генов IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF A, GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC в предродовом периоде установлено статистически значимое повышение частоты осложнения родов (преждевременное излитие околоплодных вод, разрыв мягких тканей родовых путей) и послеродового периода (раневая инфекция, послеродовой эндометрит) в группе беременных женщин с вагинитами.

107

Заключение

В результате проведенных исследований был предложен новый метод объективной оценки локального воспалительного процесса для беременных и небеременных женщин на основании определения количества транскриптов генов иммунного ответа, что может использоваться в качестве дополнительного диагностического критерия, позволяющего объективно различать бессимптомное носительство условно-патогенных микроорганизмов от проявлений вагинита.

Лабораторная оценка профиля экспрессии генов иммунного ответа во влагалище на базе стандартной ПЦР лаборатории позволяет существенно повысить объективность диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний и может быть использована для своевременной профилактики осложнений родов и послеродового периода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Непша, Оксана Сергеевна, Москва

1. Айламазян Э. К., Кулаков В. И., Радзинский В. Е., Савельева Г. М. Акушерство: национальное руководство. / М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2009. -1200 с.

2. Анкирская А. С. Исследование биоматериала при инфекциях женских половых органов.Методики клинических лабораторных исследований.Справочное пособие. / М.: "Лабора", 2009. 73 с.

3. Анкирская А. С., Муравьева В. В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2001 Т. 3 №2. С. 24-27

4. Анкирская А. С., Муравьева В. В. Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций влагалища. //Concilium medicum. 2005. С. 51-64.

5. Ахапкина И. Г. Микоплазмозы и хламидиозы современный взгляд //Consilium Medicum 2011 - Т. 13 №4. С. 7-11

6. Ахматова Н. К., Киселевский М. В. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противоинфекционный. / М.: "Практическая медицина", 2008. 256 с. с.

7. Баранов И. И. Экология влагалища и воспалительные заболевания половых органов. //Гинекология. 2010. Т. 12 №3. С. 4-6.

8. Болдырева М. Н., Липова Е. В., Витвицкая Ю. Г. Новый высокочувствительный способ диагностики дисбаланса нормо-и условно-патогенной биоты у женщин на ранних стадиях. //Consilium medicum. 2009. -№6. С. 47-51.

9. Воропаева Е. А., Афанасьев С. С., Кудрявцева М. В. Микроэкология и показатели гуморального иммунитета влагалища женщин с неспецифическими воспалительными заболеваниями гениталий. //Микробиология. 2005. -№3. С. 65-69.

10. Ворошилина Е. С., Плотко Е. Э., Хаютин Л. В. Применение молекулярных методов диагностики для профилактики инфекционнойпатологии у беременных женщин. //Вестник уральской медицинской академической науки. 2009. Т. 27 №4. С. 114-116.

11. Ворошилина Е. С., Тумбинская Л. В., Донников А. Е., Плотко Е. Э., Хаютин Л. В. Биоценоз влагалища с точки зрения количественной ПЦР: что есть норма? //Акушерство и гинекология. 2011. №1. С. 57-65.

12. Гиммельфарб Е. И., Липова Е. В., Колупаев В. Е. Взаимосвязь концентрации уреа- и микоплазмы и распространения инфекционно-воспалительного процесса урогенитального тракта у женщин. 2009 №1. С. 34-36

13. Горбасенко Н. В. Современный взгляд на проблему бактериального вагиноза. //Медицинские аспекты здоровья женщины. 2007. Т. 4 №1. С. 68.

14. Дмитриев Г. А., Глазко И. И., Савенков В. В. Ошибки в лабораторной диагностике ИППП. //Вестник последипломного медицинского образования. 2009. №1. С. 19-22.

15. Доброхотова Э. Ю., Затикян Н. Г. Микроэкология и защитные механизмы влагалища. //ОРЖИН. 2007. -№2. С. 11-12.

16. Доброхотова Э. Ю., Затикян Н. Г. Современные представления о механизмах развития дисбиоза влагалища. //ОРЖИН 2008. -№1. С. 7-9.

17. Долгушина В. Ф., Долгушин И. И. Состояние факторов местной иммунной защиты репродуктивного тракта при вагинозе у беременных. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001. -№4. С. 89-93.

18. Карапетян Т. Э., Муравьева В. В., Анкирская А. С., Емельянова А. И., Тютюн ник В. Л. Генитальные микоплазмы и исходы беременности //Проблемы репродукции 2012 -№3. С. 88-93

19. Касабулатов Н. М. Вагинальный кандидоз //Рус. мед. журн. 2003. Т. 11 №17. С. 985-989.

20. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С. Цитокины. / СПб.: ООО "Издательство Фолиант", 2008. 552 с. с.

21. Кира Е. Ф. Бактериальный вагиноз. / Москва: ООО «Нева-Люкс», 2001. -364 с.

22. Кира Е. Ф., Артымук Н. В., Гайтукиева Р. А., Муслимова С. 3. Биоценоз и функциональная активность эпителия влагалища при местном лечении аэробного вагинита полижинаксом и тержинаном. //Журнал акушерства и женских болезней. 2010. -№5. С. 127-135.

23. Кира Е. Ф., Муслимова С. 3. Неспецифический вагинит и его влияние на репродуктивное здоровье женщины. //Проблемы репродукции. 2008. №5. С. 8-14.

24. Колупаев В. Е., Гиммельфарб Е. И., Липова Е. В. Взаимосвязь концентрации уреа- и микоплазмы и распространения инфекционно-воспалительного процесса урогенитального тракта у женщин. //Вестник последипломного медицинского образования. 2009. №1. С. 34-37.

25. Кремлева Е. А., Константинова О. Д., Черкасов С. В. Микроэкологическое состояние вагинального биотопа пациенток, оппозитных по фертильности в программе ЭКО. //Медицинский альманах. 2010 Т. 13 №4. С. 95-97.

26. Кремлева Е. А., Черкасов С. В. Продукция цитокинов вагинальными эпителиоцитами в процессе взаимодействия с доминантными и ассоциативными микросимбионтами. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2012 -№4. С. 114-118

27. Кузнецова А. В., Данилова Т. И., Гладских О. П. и. д. Дендритные клетки и их использование в иммунотерапии. //Молекулярная медицина 2003 -№3. С. 3-17.

28. Кулаков В. И., Прилепская В. Н., Радзинский В. Е. Руководство по амбулаторно-поликлинической помощи в акушерстве и гинекологии. / Москва: «ГЭОТАР-Медиа», 2006. 1056 с.

29. Лебедева О. П., Рудых Н. А., Полякова И. С., Пахомов С. П., Чурносов М. И., Самборская Н. И. Антимикробные пептиды первая линия антиинфекционной защиты женских половых путей. //Научные ведомости

30. Белгородского государственного университета. Медицина. Фармация. 2010. -Т. 12. №22 (93). С. 25-31.

31. Липова Е. В. Роль условно-патогенной биоты в патологии урогенитального тракта женщин. //Вестник последипломного медицинского образования. 2008. №1. С. 13-16.

32. Липова Е. В. Инфекция, вызванная микоплазмой, неуточненная. //Вестник последипломного медицинского образования 2009. №1. С. 29-31.

33. Липова Е. В., Витвицкая Ю. Г. Особенности клинического течения урогенитальных инфекций женщин на современном этапе. //Вестник последипломного медицинского образования. 2009. -№1. С. 15-16.

34. Ломоносов К. М., Горячкина М. В. Бактериальный вагиноз: мифы и реальность. //Дерматология. 2009. №3. С. 50-53.

35. Лузан Н. В. К вопросу о смешанных урогенитальных инфекциях у женщин. //Гинекология. 2008 Т. 10 №4. С. 9-13.

36. Манько В. М., Девришов Д. А. Иммунология / М.: «Агровет», 2011. 751 с. с.

37. Межевитинова Е. А., Бровкина Т. В., Довлетханова Э. Р. Бактериальный вагиноз: как снизить число рецидивов? //Гинекология 2012 №4. С. 12-15

38. Мирзабалаева А. К., Долго-Сабурова Ю. В. Кандидоз гениталий и бактериальный вагиноз в практике акушера-гинеколога. //Проблемы медицинской микологии 2004 Т. 6 №3. С. 18-24

39. Миронов А. Ю., Терехова Ю. Б. Лечение вульвовагинального кандидоза у женщин детородного возраста. //Акушерство. 2009. Т. 11 №4. С. 36-39.

40. Мордвинов В. А., Фурман Д. П. Цитокины: билогические свойства и регуляция экспрессии гена интерлейкина-5 человека. //Вестник ВОГиС. 2009. Т. 13 №1. С. 53-67.

41. Нестеров И. М., Тотолян А. А. Иммунокорригирующая терапия инфекционно-воспалительных заболеваний женской половой сферы. / Санкт-Петербург: «Тактик-Студио», 2007. 53 с.

42. Никоненко А. Г. Слизистые оболочки важный участок защитного барьера организма. //Здоровье Украины 2005. -№114. С. 3-5.

43. Ноконов А. П., Белова А. В., Асцатурова О. Р., Иванова Т. А., Гущин А. Е. Генитальные микоплазмы в структуре оппортунистических инфекций влагалища и шейки матки у беременных //Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2010-7. 9 №5. С. 5-9

44. Ордженекидзе Н. В., Басиладзе Е. Н. Современные направления в диагностике, профилактике и лечении послеродовой инфекции. //Журнал Российского общества акушеров-гинекологов. 2005. -№4. С. 18-20.

45. Орлова В. В., Набережнев Ю. И. Нормоценоз влагалища у женщин репродуктивного возраста, механизмы его регуляции и дисбиотические варианты. //Российский вестник акушера-гинеколога. 2007. №4. С. 36-39.

46. Пестрикова Т. Ю., Молодцова Л. Ю. Принципы терапии бактериального вагиноза и вагинального кандидоза у беременных. //Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2006. Т. 5 №6. С. 7-12.

47. Пестрикова Т. Ю., Юрасов И. В., Юрасова Е. А. Воспалительные заболевания в гинекологии. / Москва.: «Литтерра», 2009. 256 с.

48. Подзолкова Н. М., Дамиров М. М., Сюч Н. И., Кузьмина Т. И., Липова Е. В., Полетова Т. Н. Диагностика и лечение бактериального вагиноза и урогенитального кандидоза (учебное пособие). / РМАПО: Москва., 2003. -53 с.

49. Подзолкова Н. М., Никитина Т. И., Некрасов П. И. Этиология, патогенез и особенности антибактериальной терапии воспалительных заболеваний у молодых женщин. //Гинекология 2011.-7. 13 №5. С. 30-36.

50. Прилепская В. Н., Байрамова Г. Р. Экзо- и эндоцервициты. Возможности терапии //Гинеколог : Научно-практический журнал. 2005 №2. С. 47-50

51. Прилепская В. Н., Байрамова Г. Р. Вульвовагинальный кандидоз. Клиника, диагностика, принципы терапии. / М.: ООО «ГЭОТАР-Медиа», 2010.- 80 с.

52. Прилепская В. Н., Байрамова Г. Р. Вульвовагинальный кандидоз: клинические и терапевтические аспекты. //Гинекология 2011. Т. 14 №4. С. 47-50.

53. Прилепская В. Н., Довлетханова Э. Р., Байрамова Г. Р., Фофанова И. Ю. Современный взгляд на вопросы этиологии, патогенеза и лечения бактериального вагиноза. //Гинекология 2010-7! 12 №2. С. 6-9

54. Прилепская В. Н., Кисина В. И., Соколовский Е. В., Савичева А. М., Гомберг М. А., Гущин А. Е., Забиров К. И. Ш., Е.В. К вопросу о роли микоплазм в урогенитальной патологии //Гинекология 2007 Т. 9 №1. С. 13-17

55. Рудакова Е. Б., Семенченко С. И., Панова О. Ю., Кучинская Н. В. Инфекционная патология нижнего отдела половых путей женщины и бесплодие. //Гинекология. 2004. Т. 6№3.

56. Савичева А. М., Башмакова М. А. Генитальные микоплазмы и вызываемая ими патология //Лечащий врач 2006 №2. С. 5-8

57. Савичева А. М., Шипицына Е. В. Генитальные микоплазмы. //Врач. 2009. №1. С. 9-12.

58. Саидова Р. А. Бактериальный вагиноз или бактериальный вагинит? //Русский медицинский журнал 2001 №19. С. 843-846.

59. Сафронова М. М., Гренкова Ю. М. Нарушение состояния влагалищного микробиоценоза: современные методы коррекции. //Клиническая дерматология и венерология. 2009. №6. С. 102-106.

60. Серов В. Н., Тихомиров А. Л., Олейник Ч. Г. Современные представления о бактериальном вагинозе. //Вопорсы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2005. Т. 4 №1. С. 66-71.

61. Сидорова И. С. Микробиоценоз половых путей женщин репродуктивного возраста. //Акушерство и гинекология 2005. -№2. С. 7-9.

62. Синчихин С. JL, Мамиев О. Б., Лахилова Е. В., Буров А. В. Некоторые современные аспекты этиологии, клинической картины и лечения острых воспалительных заболеваний придатков матки. //Гинекология. 2010. Т. 12 №5. С. 10-14.

63. Сметник В. П., Марченко Л. А., Чернуха Г. Е. Опыт применения микофлюкана (флуконазола) для лечения кандидозного вульвовагинита. //Лечащий врач. 2004. -№2. С. 73-76.

64. Спиридонова Н. В., Басина Е. И., Мелкадзе Е. В. Неспецифический вагинит у беременных: возможно ли лечение с сохранением вагинальных лактобацилл? //Акушерство. Гинекология. Репродукция» 2012 Т. 6 №1. С. 6-13

65. Стрижаков А. Н., Давыдов А. И., Баев О. Р., Буданов П. В. Генитальная инфекция. / М.: "Династия", 2003. 140 с.

66. Тихомиров А. Л. Бактериальный вагиноз. Всегда ли и только ли антибиотики? //Consilium Medicum 2011 Т. 13 №6. С. 37-41

67. Торчинов А. М., Мазуркевич М. В. Современные аспекты в лечении вульвовагинального кандидоза //Гинекология : Журнал для практических врачей. 2007. Т. 9 №2. С. 54-58.

68. Тютюнник В. Л., Карапетян Т. Э. Современные аспекты в лечении вульвовагинального кандидоза. //Русский медицинский журнал. 2004. -№13. С. 752-754.

69. Шабашова Н. В. Иммунодефицита при хроническом кандидозе кожи и слизистых оболочек //Проблемы медицинской микологии 2009 Т. 11 №1. С. 3-10

70. Шелковая Н. Г. Вульвовагинальный кандидоз: современный взгляд на проблему. //Новости медицины и фармации. 2008. Т. 252 №15. С. 12-16.

71. Шеманаева Т. В., Хосева Е. Н. Нарушения микробиоценоза влагалищной флоры у беременных на разных сроках гестации и особенности их коррекции //Гинекология 2011 №6. С. 36-40

72. Шипицына Е. В., Мартикайнен 3. М., Воробьева Н. Е., Ермошкина М. С., Степанова О. С., Донников А. Е., Скоркина Ю. А., Тумбинская Л. В.,114

73. Савичева А. М. Применение теста Фемофлор для оценки микробиоценоза влагалища. //Журнал акушерства и женских болезней 2009. №3. С. 38-44.

74. Ширева Ю. В., Сандакова Е. А., Карпунина Т. И. Неспецифический аэробный вагинит «новое» или «старое» заболевание? //Медицинский альманах. 2010. - Т. 13 №4. С. 164-168.

75. Ярилин А. А. Иммунология: учебник. / Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2010. -752 с.

76. ACOG Practice Bulletin. Clinical management guidelines for obstetrician-gynecologists, Number 72, May 2006: Vaginitis // Obstetrics and gynecology. -2006. Vol. 107. - №5. - P. 1195-1206.

77. Ahmad R., El Bassam S., Cordeiro P., Menezes J. Requirement of TLR2-mediated signaling for the induction of IL-15 gene expression in human monocytic cells by HSV-1 // Blood. 2008. - Vol. 112. - №6. - P. 2360-2368.

78. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity // Cell. 2006. - Vol. 124. - №4. - P. 783-801.

79. Anderson B. L., Cu-Uvin S., Raker C. A., Fitzsimmons C., Hillier S. L. Subtle perturbations of genital microflora alter mucosal immunity among low-risk pregnant women // Acta obstetricia et gynecologica Scandinavica. 2011. -Vol. 90. -№5. - P. 510-515.

80. Anderson M. R., Klink K., Cohrssen A. Evaluation of vaginal complaints // JAMA : the journal of the American Medical Association. 2004. - Vol. 291. -№11. - P. 1368-1379.

81. Anton G., Rid J., Mylonas I., Friese K., Weissenbacher E. R. Evidence of a TH1-shift of local vaginal inflammatory response during bacterial vaginosis // Infection. 2008. - Vol. 36. - №2. - P. 147-152.

82. Barton G. M., Kagan J. C. A cell biological view of Toll-like receptor function: regulation through compartmentalization // Nature reviews. Immunology. 2009. - Vol. 9. - №8. - P. 535-542.

83. Beagley K. W., Gockel C. M. Regulation of innate and adaptive immunity by the female sex hormones oestradiol and progesterone // FEMS immunology and medical microbiology. 2003. - Vol. 38. - №1. - P. 13-22.

84. Benoit M., Desnues B., Mege J. L. Macrophage polarization in bacterial infections // Journal of immunology. 2008. - Vol. 181. - .№6. - P. 3733-3739.

85. Biet F., Locht C., Kremer L. Immunoregulatory functions of interleukin 18 and its role in defense against bacterial pathogens // Journal of molecular medicine. 2002. - Vol. 80. - №3. - P. 147-162.

86. Bohbot J. M., Sednaoui P., Verriere F., Achhammer I. The etiologic diversity of vaginitis. // Gynecologie, obstetrique & fertilite. 2012. - Vol. 40. - №10. - P. 578-581.

87. Brincks E. L., Woodland D. L. Novel roles for IL-15 in T cell survival // F1000 biology reports. 2010. - Vol. 2. - P. 67.

88. Campos A. C., Murta E. F., Michelin M. A., Reis C. Evaluation of Cytokines in Endocervical Secretion and Vaginal pH from Women with Bacterial Vaginosis or Human Papillomavirus // ISRN obstetrics and gynecology. 2012. - Vol. 2012. - P. 342075.

89. Caramalho I., Lopes-Carvalho T., Ostler D., Zelenay S., Haury M.,

90. Demengeot J. Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are116activated by lipopolysaccharide // The Journal of experimental medicine. 2003. -Vol. 197. - №4.-P. 403-411.

91. Cassone A., De Bernardis F., Santoni G. Anticandidal immunity and vaginitis: novel opportunities for immune intervention // Infection and immunity. 2007. - Vol. 75. - №10. - P. 4675-4686.

92. Chaturvedi A., Pierce S. K. How location governs toll-like receptor signaling // Traffic. 2009. - Vol. 10. - №6. - P. 621-628.

93. Chou J., Provot S., Werb Z. GATA3 in development and cancer differentiation: cells GATA have it! // Journal of cellular physiology. 2010. -Vol. 222. -№1. - P. 42-49.

94. Colonna M., Trinchieri G., Liu Y. J. Plasmacytoid dendritic cells in immunity //Nature immunology. 2004. - Vol. 5. - №12. - P. 1219-1226.

95. Couper K. N., Blount D. G., Riley E. M. IL-10: the master regulator of immunity to infection // Journal of immunology. 2008. - Vol. 180. - №9. - P. 5771-5777.

96. Creagh E. M., O'Neill L. A. TLRs, NLRs and RLRs: a trinity of pathogen sensors that co-operate in innate immunity // Trends in immunology. 2006. -Vol. 27. - №8. - P. 352-357.

97. Cummins J. E., Jr., Doncel G. F. Biomarkers of cervicovaginal inflammation for the assessment of microbicide safety // Sexually transmitted diseases. 2009. -Vol. 36. - №3 Suppl. - P. S84-91.

98. Doaa M. Mahgoub, Nermine H. EL-Eishi, Rashed L. A. A Quantitative Study of the Antimicrobial Peptide Granulysin and its Possible Role in Atopic Dermatitis // J Egypt Women Dermatol Soc. 2010. - Vol. 7. - №2. - P. 117-122.

99. Donati L., Di Vico A., Nucci M., Quagliozzi L., Spagnuolo T., Labianca A., Bracaglia M., Ianniello F., Caruso A., Paradisi G. Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy // Archives of gynecology and obstetrics. 2010. - Vol. 281,-№4.-P. 589-600.

100. Donders G. G., Vereecken A., Bosmans E., Spitz B. Vaginal cytokines in normal pregnancy // American journal of obstetrics and gynecology. 2003. -Vol. 189. - №5. - P. 1433-1438.

101. Dongari-Bagtzoglou A., Fidel P. L., Jr. The host cytokine responses and protective immunity in oropharyngeal candidiasis // Journal of dental research. -2005. Vol. 84. - №11. - P. 966-977.

102. Fan A. P., Xue F. X. Clinical characteristics of aerobic vaginitis and its mixed infections. // Zhonghua fii chan ke za zhi. 2010. - Vol. 45. - №12. - P. 904-908.

103. Farage M., Maibach H. Lifetime changes in the vulva and vagina // Archives of gynecology and obstetrics. 2006. - Vol. 273. - №4. - P. 195-202.

104. Farage M. A., Maibach H. I. Morphology and physiological changes of genital skin and mucosa // Current problems in dermatology. 2011. - Vol. 40. -P. 9-19.

105. Fazeli A., Bruce C., Anumba D. O. Characterization of Toll-like receptors in the female reproductive tract in humans // Human reproduction. 2005. - Vol. 20. - №5. - P. 1372-1378.

106. Fidel P. L., Jr. History and update on host defense against vaginal candidiasis // American journal of reproductive immunology. 2007. - Vol. 57. -№1. - P. 2-12.

107. Forsum U., Hallen A., Larsson P. G. Bacterial vaginosis~a laboratory and clinical diagnostics enigma // APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 2005. - Vol. 113. - №3. - P. 153-161.

108. Fredricks D. N., Fiedler T. L., Marrazzo J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis // The New England journal of medicine. 2005. - Vol. 353. - №18. - P. 1899-1911.

109. Gene M. R., Onderdonk A. Endogenous bacterial flora in pregnant women and the influence of maternal genetic variation // BJOG : an international journal of obstetrics and gynaecology. 2011. - Vol. 118. - №2. - P. 154-163.

110. Hamza T., Barnett J. B., Li B. Interleukin 12 a key immunoregulatory cytokine in infection applications // International journal of molecular sciences. -2010. Vol. 11. - №3. - P. 789-806.

111. Hedges S. R., Barrientes F., Desmond R. A., Schwebke J. R. Local and systemic cytokine levels in relation to changes in vaginal flora // The Journal of infectious diseases. 2006. - Vol. 193. - №4. - P. 556-562.

112. Home A. W., Stock S. J., King A. E. Innate immunity and disorders of the female reproductive tract // Reproduction. 2008. - Vol. 135. - №6. - P. 739-749.

113. Hornef M. W., Bogdan C. The role of epithelial Toll-like receptor expression in host defense and microbial tolerance // Journal of endotoxin research. 2005. - Vol. 11. - №2. - P. 124-128.

114. Hyman R. W., Fukushima M., Diamond L., Kumm J., Giudice L. C., Davis R. W. Microbes on the human vaginal epithelium // Proceedings of the National120

115. Academy of Sciences of the United States of America. 2005. - Vol. 102. - №22.- P. 7952-7957.

116. Iwasaki A. Antiviral immune responses in the genital tract: clues for vaccines //Nature reviews. Immunology. 2010. - Vol. 10. - №10. - P. 699-711.

117. Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses //Nature immunology. 2004. - Vol. 5. - №10. - P. 987-995.

118. Izcue A., Powrie F. Special regulatory T-cell review: Regulatory T cells and the intestinal tract—patrolling the frontier // Immunology. 2008. - Vol. 123. -№1. - P. 6-10.

119. Janeway C. A., Jr., Medzhitov R. Innate immune recognition // Annual review of immunology. 2002. - Vol. 20. - P. 197-216.

120. Juuti-Uusitalo K. M., Kaukinen K., Maki M., Tuimala J., Kainulainen H. Gene expression in TGFbeta-induced epithelial cell differentiation in a three-dimensional intestinal epithelial cell differentiation model // BMC genomics. -2006. Vol. 7. - P. 279.

121. Kelsall B. L., Rescigno M. Mucosal dendritic cells in immunity and inflammation //Nature immunology. 2004. - Vol. 5. - №11. - P. 1091-1095.

122. Kouros-Mehr H, Slorach E. M., Sternlicht M. D„ Werb Z. GATA-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland // Cell.- 2006. Vol. 127. - №5. - P. 1041-1055.

123. Krensky A. M., Clayberger C. Biology and clinical relevance of granulysin

124. Tissue antigens. 2009. - Vol. 73. - №3. - P. 193-198.121

125. Kumar H., Kawai T., Akira S. Toll-like receptors and innate immunity // Biochemical and biophysical research communications. 2009. - Vol. 388. - №4. -P. 621-625.

126. Larsen B., Hwang J. Mycoplasma, Ureaplasma, and adverse pregnancy outcomes: a fresh look // Infectious diseases in obstetrics and gynecology. 2010. - Vol. 2010.

127. LeBlanc D. M., Barousse M. M., Fidel P. L., Jr. Role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis // Infection and immunity. 2006. - Vol. 74. - №6. - P. 3213-3221.

128. Linhares I. M., Giraldo P. C., Baracat E. C. New findings about vaginal bacterial flora. // Revista da Associacao Medica Brasileira. 2010. - Vol. 56. -№3. - P. 370-374.

129. Mares D., Simoes J. A., Novak R. M., Spear G. T. TLR2-mediated cell stimulation in bacterial vaginosis // Journal of reproductive immunology. 2008. -Vol. 77. -№1. - P. 91-99.

130. MasCasullo V., Fam E., Keller M. J., Herold B. C. Role of mucosal immunity in preventing genital herpes infection // Viral immunology. 2005. -Vol. 18. -№4. - P. 595-606.

131. Mashburn J. Etiology, diagnosis, and management of vaginitis // Journal of midwifery & women's health. 2006. - Vol. 51. - №6. - P. 423-430.

132. Mege J. L., Mehraj V., Capo C. Macrophage polarization and bacterial infections // Current opinion in infectious diseases. 2011. - Vol. 24. - №3. - P. 230-234.

133. Nasu K., Narahara H. Pattern recognition via the toll-like receptor system in the human female genital tract // Mediators of inflammation. 2010. - Vol. 2010.- P. 976024.

134. Patel M. A., Nyirjesy P. Role of Mycoplasma and ureaplasma species in female lower genital tract infections // Current infectious disease reports. 2010. -Vol. 12. -№6. - P. 417-422.

135. Philpott D. J., Girardin S. E. The role of Toll-like receptors and Nod proteins in bacterial infection // Molecular immunology. 2004. - Vol. 41. - №11. - P. 1099-1108.

136. Piccinni M. P. T cells in normal pregnancy and recurrent pregnancy loss // Reproductive biomedicine online. 2006. - Vol. 13. - №6. - P. 840-844.

137. Pudney J., Quayle A. J., Anderson D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone // Biology of reproduction. 2005. - Vol. 73. -№6.-P. 1253-1263.

138. Quan M. Vaginitis: diagnosis and management // Postgraduate medicine. -2010. Vol. 122. - №6. - P. 117-127.

139. Quayle A. J. The innate and early immune response to pathogen challenge in the female genital tract and the pivotal role of epithelial cells // Journal of reproductive immunology. 2002. - Vol. 57. - №1-2. - P. 61-79.

140. Raska M., Belakova J., Krupka M., Weigl E. Candidiasis—do we need to fight or to tolerate the Candida fungus? // Folia microbiologica. 2007. - Vol. 52. - №3. - P. 297-312.

141. Roeder A., Kirschning C. J., Rupee R. A., Schaller M., Korting H. C. Tolllike receptors and innate antifungal responses // Trends in microbiology. 2004. -Vol. 12. -№1. - P. 44-49.

142. Rydstrom A., Wick M. J. Monocyte recruitment, activation, and function in the gut-associated lymphoid tissue during oral Salmonella infection // Journal of immunology. 2007. - Vol. 178. - №9. - P. 5789-5801.

143. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Ono M. Regulatory T cells and immune tolerance // Cell. 2008. - Vol. 133. - №5. - P. 775-787.

144. Say P. J., Jacyntho C. Difficult-to-manage vaginitis // Clinical obstetrics and gynecology. 2005. - Vol. 48. - №4. - P. 753-768.

145. Schellenberg J. J., Plummer F. A. The Microbiological Context of HIV Resistance: Vaginal Microbiota and Mucosal Inflammation at the Viral Point of Entry // International journal of inflammation. 2012. - Vol. 2012. - P. 131243.

146. Schwiertz A., Taras D., Rusch K., Rusch V. Throwing the dice for the diagnosis of vaginal complaints? // Annals of clinical microbiology and antimicrobials. 2006. - Vol. 5. - P. 4.

147. Sherrard J., Donders G., White D., Jensen J. S. European (IUSTI/WHO) guideline on the management of vaginal discharge, 2011 // International journal ofSTD& AIDS. -2011. Vol. 22. - №8. - P. 421-429.

148. Spear G. T., St John E., Zariffard M. R. Bacterial vaginosis and human immunodeficiency virus infection // AIDS research and therapy. 2007. - Vol. 4. -P. 25.

149. St John E. P., Martinson J., Simoes J. A., Landay A. L., Spear G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis // Clinical immunology. 2007. - Vol. 125. - №1. - P. 95102.

150. Stevens A., Lowe J. S. Human histology. /. Philadelphia: Elsevier Mosby, 2005.: -464 c.

151. Strober W. Epithelial cells pay a Toll for protection // Nature medicine. -2004. Vol. 10. - №9. - P. 898-900.

152. Strobl H., Knapp W. Myeloid cell-associated lysosomal proteins as flow cytometry markers for leukocyte lineage classification // Journal of biological regulators and homeostatic agents. 2004. - Vol. 18. - №3-4. - P. 335-339.

153. Tchilian E. Z., Beverley P. C. Altered CD45 expression and disease // Trends in immunology. 2006. - Vol. 27. - №3. - P. 146-153.

154. Tempera G., Furneri P. M. Management of aerobic vaginitis // Gynecologic and obstetric investigation. 2010. - Vol. 70. - №4. - P. 244-249.

155. Tezuka H., Abe Y., Iwata M., Takeuchi H., Ishikawa H., Matsushita M., Shiohara T., Akira S., Ohteki T. Regulation of IgA production by naturally occurring TNF/iNOS-producing dendritic cells // Nature. 2007. - Vol. 448. -№7156. - P. 929-933.

156. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity // Nature reviews. Immunology. 2003. - Vol. 3. - №2. - P. 133-146.

157. Underhill D. M. Toll-like receptors and microbes take aim at each other // Current opinion in immunology. 2004. - Vol. 16. - №4. - P. 483-487.

158. Viscardi R. M. Ureaplasma species: role in diseases of prematurity // Clinics in perinatology. 2010. - Vol. 37. - №2. - P. 393-409.

159. Witkin S. S., Linhares I. M., Giraldo P. Bacterial flora of the female genital tract: function and immune regulation // Best practice & research. Clinical obstetrics & gynaecology. 2007. - Vol. 21. - №3. - P. 347-354.

160. Yamamoto M., Takeda K. Current views of toll-like receptor signaling pathways // Gastroenterology research and practice. 2010. - Vol. 2010. - P. 240365.

161. Yamamoto T., Zhou X., Williams C. J., Hochwalt A., Forney L. J. Bacterial populations in the vaginas of healthy adolescent women // Journal of pediatric and adolescent gynecology. 2009. - Vol. 22. - №1. - P. 11-18.

162. Yasodhara P., Raghunath M., Sreeramulu D., Venu L., Hemalatha R., Krishna T. P. Local immunity in Indian women with bacterial vaginosis // Journal of reproductive immunology. 2006. - Vol. 70. - №1-2. - P. 133-141.

163. Zhang D., Liu Z. H., Liao Q. P., Ma J. M., Sun Y. F., Fan S. R., Hu L. N., Jia H. J., Di W., Wang W. Study of local immunity of lower genital tract infections. // Zhonghua fu chan ke za zhi. 2009. - Vol. 44. - №1. - P. 13-15.

164. Zhou X., Bent S. J., Schneider M. G. Characterization of vaginal microbial communities in adult healthy women using cultivation-independent methods // Microbiology. 2004. - Vol. 150. - №8. - P. 2565-2573.

165. Zhou X., Westman R., Hickey R., Hansmann M. A., Kennedy C., Osborn T. W., Forney L. J. Vaginal microbiota of women with frequent vulvovaginal candidiasis // Infection and immunity. 2009. - Vol. 77. - №9. - P. 4130-4135.

Информация о работе

Непша, Оксана Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.03.03

Диссертация

Молекулярно-генетическое исследование местного иммунитета при вагинитах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы