Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы

Бурменская, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы
ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы"

На правах рукописи

БУРМЕНСКАЯ Ольга Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

03.03.03 - иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

31 ИЮЛ 2014

МОСКВА - 2014

005551432

Работа выполнена в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России.

Научные консультанты: Сухих Геннадий Тихонович

доктор медицинских наук, профессор, академик РАН

Трофимов Дмитрий Юрьевич доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Кадагидзе Заира Григорьевна

доктор медицинских наук, профессор, заведующая централизованным клинико-лабораторным отделом ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» РАМН

Наровлянский Александр Наумович доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией цитокинов ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Афанасьев Максим Станиславович доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Факультет фундаментальной медицины

Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова»

Защита состоится «24 » сентября 2014 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте http://nrcii.ru/dissertacionnyj-sovet/ ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан « 14 » ЧЮлЗу 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук^/

/Г

Гудима Георгий Олегович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Открытие и внедрение в практику в конце 80 годов метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) внесло огромный вклад в развитие современной биологии и медицины. В настоящее время данный метод широко используется для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач, включающих в себя определение генетических заболеваний, вариантов полиморфизма генов, функциональной активности генома, а также изучение воздействия на организм человека биотических факторов окружающей среды (бактерий, грибов, вирусов). Следует отметить, что каждая из выше перечисленных задач может решаться как самостоятельно, так и в составе комплексного исследования. В данной работе комплексный подход предложен для решения фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на примере воспалительных процессов, сопровождающих заболевания органов женской репродуктивной системы.

Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей (вульвиты, вагиниты) являются одной из наиболее распространенных причин обращения женщин к врачу акушеру-гинекологу [Натег В.Ь., 2011]. От неспецифического вагинита страдает почти каждая пятая пациентка гинекологической практики (19,2%), а среди пациенток с патологическими белями частота его выявления возрастает в 4 раза [Анкирская А. С., 2005]. Известно, что в основе репродуктивных неудач (трубно-перитонеальный фактор бесплодия, самопроизвольные выкидыши), акушерских осложнений родов и послеродового периода, таких как преждевременное излитие околоплодных вод, внутриутробное и интранатальное инфицирование плода и новорожденного, мертворождение, хориоамнионит в родах, послеродовые гнойно-септические осложнения, также лежат те или иные воспалительные заболевания половых органов [Кира Е. Ф., 2008].

изучение мукозального иммунитета представляет чрезвычайный интерес. В то же время, спектр методов исследования мукозального иммунитета остается весьма ограниченным из-за малого количества материала и наличия слизи в образцах. В ходе исследований возникают вопросы, связанные с нормировкой материала, способов его взятия и транспортировки. Вследствие этого существующие знания об изменении различных иммунологических показателей (цитокинов, дефензинов, иммуноглобулинов, рецепторов иммунокомпетентных клеток и др.) при вагинитах не получили должного применения в клинической практике. Основным, и зачастую, единственным методом оценки состояния локального иммунитета в рутинной практике в настоящее время остается микроскопия мазка с подсчетом числа лейкоцитов. Альтернативой подсчету числа лейкоцитов может служить оценка иммунологических показателей (как пример, транскрипционный профиль генов цитокинов).

В настоящее время накоплены многочисленные данные о зависимости экспрессии цитокинов не только от влияния внешних патогенных факторов, но и от генетической вариабельности кодирующих их генов. В частности, получены данные об ассоциациях отдельных полиморфизмов генов цитокинов с такими нозологическими формами как вульвовагинальный кандидоз [Johnson М. D., 2012] и бактериальный вагиноз [Cauci S., 2007; Gene М. R., 2004, Gomez L. М., 2010]. Оригинальность настоящего исследования состоит в том, что различные нозологические формы вагинитов были исследованы в совокупности, включая случаи воспаления неустановленной этиологии. Использование такого подхода обосновано тем, что зачастую воспалительная реакция является неспецифической в отношении инициирующего патологического агента.

Кроме того, большое внимание исследователей привлечено к проблеме воспалительных заболеваний органов малого таза, среди которых хронический эндометрит (ХЭ) является наиболее распространенным. ХЭ выявляется примерно у 10% женщин репродуктивного возраста, но у пациенток с нарушениями генеративной функции частота его обнаружения увеличивается до 23-57% [Назаренко Т. А., 2007]. Среди женщин с ХЭ 80-90% составляют женщины детородного возраста. ХЭ обуславливает у них нарушения менструальной и репродуктивной функций, приводя, в конечном итоге, к развитию бесплодия, неудачам в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО),

невынашиванию беременности и осложненному течению гестационного процесса и родов [Унанян А. Л., 2012].

Все предложенные в данной работе молекулярно-генетические маркеры (транскрипты генов иммунной системы, полиморфизмы генов, а также возбудители воспалительных заболеваний) могут быть идентифицированы в одном и том же образце с использованием одного универсального метода - полимеразной цепной реакцией, что сокращает время для проведения исследований.

Цель и задачи работы

Цель работы:

Разработать комплексный подход к характеристике воспалительных процессов органов женской репродуктивной системы на основе молекулярно-генетических маркеров, включающих количественную идентификацию инфекционных агентов, определение транскрипционного профиля генов иммунной системы и генетических особенностей организма.

Задачи:

1. Для оценки профиля экспрессии генов иммунного ответа разработать тест-системы на основе метода количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. Выявить особенности экспрессии мРНК генов иммунного ответа (цитокины, рецепторы, транскрипционные факторы и др.) при вагинитах и хроническом эндометрите.

3. Установить распределение аллельных вариантов генов иммунного ответа, ассоциированных с предрасположенностью к развитию вагинитов у женщин репродуктивного возраста.

4. Провести характеристику состава микроорганизмов, способствующих развитию воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы (вагиниты, хронический эндометрит).

5. Разработать способы идентификации локальной воспалительной реакции при вагинитах и хроническом эндометрите на основе интегральной оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа.

6. Определить наиболее важные молекулярно-генетические маркеры воспалительного процесса, позволяющие одновременно получать информацию о полиморфизмах и активности генов иммунной системы, а также вирусологическом и бактериологическом фоне.

Научная новизна исследования

Впервые разработан и апробирован метод комплексной оценки клинического биоматериала на молекулярно-генетическом уровне при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы, позволяющий одновременно получать информацию о вирусологическом и бактериологическом фоне, а также полиморфизмах и активности генов иммунной системы.

Впервые при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы на основе метода ОТ-ПЦР проведено исследование представленности транскриптов широкого спектра генов иммунного ответа (цитокины IL IB, IL2, IL4, IL6, IL8, ILIO, IL12A, IL12B, IL15, ILI8, IL23, TNF, TGFB1, 1FNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционные факторы (TBX21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобные-рецепторы (TLR2, TLR4, TLR9), клеточные маркеры иммунной системы (IL2Ra, CD45, CD68, CD69), а также гранулизин GNLY). Выбраны наиболее информативные маркеры воспалительного процесса при вагините (TNF, IL18, TLR4, GATA3) и хроническом эндометрите (ILIB, IL2, ILIO, Foxp3, TLR9,1L2RÔ).

Впервые применен способ интегральной оценки представленности транскриптов генов иммунного ответа при вагинитах и хроническом эндометрите, позволивший охарактеризовать состояние локального иммунитета и предложить новый молекулярно-генетический метод определения воспалительных процессов слизистой влагалища и эндометрия.

Впервые при исследовании транскрипционных профилей использован метод определения индекса соотношения уровня экспрессии генов, позволяющий осуществлять анализ без нормировки на референсные гены, что существенно упрощает и снижает стоимость исследования, делает его доступным для рутинной диагностики.

Впервые получены данные об ассоциации Lactobacillus iners с состоянием локального иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L. iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, ILIO, CD69, CD45 и снижению уровня экспрессии мРНК IL 18 по сравнению с образцами, в которых доминирует L.crispatus.

Определены генетические предикторы предрасположенности к развитию вагинитов. Впервые установлено, что генетическая предрасположенность к

пониженной экспрессии TNF-a и TGF-ßl, обусловленная генотипом GG локуса TNF -238 G>A и генотипом СС локуса TGFB1 -509 ОТ, является фактором риска развития вагинита.

Научно-практическая значимость

Представленная работа является фундаментально-прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для развития как фундаментальных, так и прикладных аспектов иммунологии, молекулярной биологи и медицины.

Созданный в ходе работы методический подход позволяет получить более полную информацию об активности генов иммунной системы при воздействии на организм женщин биотических факторов (бактерий, грибов, вирусов) при вагинитах и хроническом эндометрите.

Определены перспективы использования комплексного подхода к диагностике воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы в гинекологической практике для объективной оценки локальных воспалительных реакций, индивидуального прогноза развития заболевания, для количественного определения микроорганизмов с целью выбора оптимальных схем терапии. В акушерской практике предлагаемый подход может быть использован для предупреждения и профилактики родовых и послеродовых осложнений.

В работе использована отечественная приборная и технологическая база с целью импортозамещения в области инновационных прикладных молекулярно-генетических исследований.

По результатам диссертационной работы поданы 2 заявки на патент и 1 на регистрационное удостоверение:

• Патент на изобретение №201147924 от 25.11.2011 г.: «Способ диагностики неспецифических вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Меджидова М.К., Непша О.С., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.

• Патент на изобретение №2013145241 от 9.10.2013 г.: «Способ определения локальной воспалительной реакции у женщин репродуктивного возраста по уровню экспрессии мРНК генов цитокинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Тютюнник B.JI., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.

• Регистрационное удостоверение № 3756 от 7.02.2014 г. на Набор реагентов для оценки локальной воспалительной реакции влагалища методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Экспрессия генов. Воспаление влагалища) по ТУ производства ООО «Научно-производственного объединение ДНК-Технология».

Положения, выносимые на защиту

1. Для исследования функциональной активности генов иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы разработаны 32 тест-системы на основе количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF, снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, ILJ2A, IL18, TGFB1, RORC.

3. Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей аллеля С локуса TGFB1-509 0T и протективная роль аллеля А локуса TNF -238 G>A в развитии вагинитов.

4. Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышена экспрессия мРНК генов IL IB, IL6, IL8, ILIO, IL12A, TNF, TGFB1, Foxp3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFA, TLR2. Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, IL8, IL12A, TGFB1, Foxp3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFA, TLR2, IL18, IFNG и TLR4.

5. Определены ассоциации различных видов лактобактерий с состоянием микробиоты влагалища и местного иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L.iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, ILIO, CD69, CD45 и снижению ILI8.

6. При хроническом эндометрите в полости матки определена ведущая роль бактериального фона, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp./ Porphyromonas spp., Ureaplasma spp).

7. Предложены способы оценки функционального состояния местного иммунитета при вагинитах и хроническом эндометрите с фиброзом стромы эндометрия по транскрипционному профилю генов иммунного ответа, основанные на методах многофакторного анализа.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007 г.); XI и XII Всероссийские научные форумы «Мать и дитя» (Москва, 2010 г., 2011г.); VI Региональный научный форум «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012 г.); Всероссийский конгресс «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва, 2011 г.); 1П и IV междисциплинарные научно-практические конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2010 г.; Москва, 2011 г.); 54 научная конференция МФТИ «Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе. Молекулярная и биологическая физика». (Москва, 2011 г.); XXIV Международный Конгресс с курсом эндоскопии (Москва, 2011 г.); V и VI Международный конгресс по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи» (Москва, 2011 г., 2012 г.); V Российская конференция "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012 г.); 7 и 8 Европейские конгрессы по иммунологии репродукции (Афины, Греция, 2009 г.; Мюнхен, Германия, 2010 г.); 14 Всемирный конгресс по репродукции человека (Австрия, 2011г.); 4 Международный конгресс 1У1-клиник (Валенсия, Испания, 2011 г.); I Конференция по биомаркерам в репродуктивной медицине: возникновение нового направления исследования (Валенсия, Испания, 2012 г.); Всемирный конгресс по гинекологии, бесплодию и перинатологии (Барселона, Испания, 2012 г.).

Диссертация частично выполнена в рамках работ по Государственным контрактам Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011 года и №16.512.11.2093 от 22 февраля 2011 года.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 54 печатные работы, в том числе 30 статей в 11 рецензируемых научных изданиях, 3 патента, 21 публикация в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 249 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы, 46 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Библиография включает 336 источников, из них 60 — на русском, 276 - на иностранных языках.

Личный вклад автора

Личный вклад автора состоит во включенном участии на всех этапах процесса, непосредственном участии соискателя в получении исходных данных и научных экспериментах, личном участии в апробации результатов исследования, обработке и интерпретации экспериментальных данных, выполненных лично автором, подготовке основных публикаций по выполненной работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы исследования. В качестве биоматериала для исследований использовали соскобы отделяемого слизистой влагалища, периферическую кровь, биоптаты тканей эндометрия. Взятие биоматериала и обследование пациентов осуществлялось медицинским персоналом ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России при подписании пациенткой информированного согласия на проведение исследования.

Объем исследования. Всего исследовано 1684 образца: из них 1168 образцов соскобов отделяемого слизистой влагалища, 210 образцов крови, 306 образцов тканей эндометрия. Исследовано и проанализировано в общей сложности 90 молекулярно-генетических маркеров (табл.1).

Группы исследования при вагинитах. Проведено клинико-лабораторное исследование 411 пациенток научно-поликлинического отделения в возрасте от 18 до 45 лет и 101 беременной женщины в возрасте от 18 до 40 лет на сроках от 37 до 40 недель беременности без родовой деятельности с целым плодным пузырем.

Таблица 1. Материалы и объем исследования.

биоматериал Молекулярно-генетнческие маркеры количество маркеров количество образцов

соскобы отделяемого слизистой оболочки влагалища Общая бактериальная масса, Lactobacilus spp, факультативно-анаэробные (,Enterobacteriaceae, Streptococcus spp, Staphylococcus spp), облигатно-анаэробные микроорганизмы (Gardnerella vaginalis, Prevotella spp., Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp., Leptotrihia spp., Fusobaclerium spp., Megasphaera spp., Veilonella spp., Dialister spp., Lachnobacterium spp., Clostridium spp., Mobiluncus spp., Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae), а также Candida spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium патогены Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, вирусы ВПГ1,2 типа, ЦМВ, другие УПМ Enterococcus spp, E.coli, Streptococcus agalactiae, Klebsiella spp. Staphylococcus aureus, Candida albicans. Типирование лактобактерий: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. jonsonii, L. vaginalis, L. acidophilus, L. casei/L. rhamnosus, L. plantarum, L.fermentum. 37 584

мРНК генов цитокинов (¡LIB. IL6, IL8, ILIO, IL12A, 1L15, IL18, IL23, TNF, IFNG, TGFB1, LIF), транскрипционных факторов (TBX21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9) и поверхностных маркеров клеток иммунной системы (lL2Ra, CD45, CD68, CD69), гранулизина (GNLY) 24 584

кровь одиночные олигонуклеотидные замены (SNP): ILIA (rsl800587), IL1B (rsl 143627, rsl 143634, rsl6944), ILIRImh IL1RA (rs2234650), IL1RN (rs315952), IL6 (rsl800795), IL8 (rs4073), ILIO (rsl800871, rsl800872, rsl800896), 1L12B (rs3212227), 1L18 (rsl87238, rsl946518, rsl946519), INFG (rs2430561), TNF (rsl800629, rs361525) и TGFB1 (rsl800469, rsl982073=rsl800470), TLR2 (rs4986790), TLR4 (rs3804099), CCL2 (rsl024611) 23 210

биоптаты тканей все микроорганизмы, за исключением типирования лактобактерий 27 153

эндометрия мРНК генов цитокинов (HIB, IL2, 1L4, 116, IL8, ILIO, IL12A, IL12B, IL18, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционного фактора Foxp3, а-цепи рецептора ИЛ-2 (IL2RA) и толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9) 21 153

ИТОГО 90 1684

На основании результатов клинико-лабораторного исследования были сформированы следующие группы.

Небеременные женщины: 1А - группа сравнения или условно здоровых женщин (n=95); 1В подгруппа - наличие Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/мл (п=19); 1С подгруппа - кандидоносительство (п=27); 2-ая группа - пациентки с вагинитом (п=215); 3-я группа- пациентки с бактериальным вагинозом (п=55).

Беременные женщины: 1А - группа сравнения или условно здоровых женщин (n=50); 2В подгруппа - наличие Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/мл (п=16); 1С подгруппа - кандидоносительство (п=11); 2-ая группа - пациентки с вагинитом (п=24).

Критерии включения: репродуктивный возраст, для беременных женщин сроки от 37 до 40 недель беременности без признаков родовой деятельности.

Критерии исключения: наличие патогенов (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis), применение антибактериальных препаратов за месяц до обследования. В отношении беременных женщин - наличие у пациенток тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологии, исцмико-цервикальная недостаточность с ее хирургической коррекцией, наличие вирусных инфекций.

Группы исследования при хроническом эндометрите. Проведено клинико-лабораторное исследование 110 пациенток отделения клинической эндокринологии ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России в возрасте от 18 до 45 лет. Критерии включения: гистологически подтвержденный диагноз хронического эндометрита. Критерии исключения: тяжелая соматическая патология; миома матки, аденомиоз или образования в яичниках, требующих оперативного лечения; наличие онкологических заболеваний; гормонотерапия в течение последних 3 месяцев. На основании результатов клинико-лабораторного исследования были сформированы следующие группы: 1-ая - группа сравнения или условно здоровых женщин (п=31); 2-ая группа - женщины с хроническим эндометритом (п=79).

Методы исследования. Базовый метод исследования - ПЦР в режиме реального времени, включающий определение состава микрофлоры влагалища, определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа, определение полиморфизмов генов иммунного ответа. Все ПЦР-исследования выполнены с использованием реактивов и приборов производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия согласно Инструкциям производителя.

Определение состава микрофлоры влагалища

Для выделения ДНК микроорганизмов использовали наборы «Проба ГС». Метод основан на сорбции ДНК на носителе (сорбенте), отмывке от примесей с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента.

При количественной оценке биоценоза влагалища учитывали: общее количество бактерий, количество Lactobacillus spp. и 14 основных групп микроорганизмов, представляющих условно-патогенную флору, включая факультативно-анаэробные, облигатно-анаэробные микроорганизмы, Candida spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis. Mycoplasma genitalium («Фемофлор 16»).

Результаты ПЦР исследования были интерпретированы на основании рекомендаций "Применение метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для оценки микробиоценоза урогенитального тракта у женщин (тест Фемофлор)", разработанных НЦАГиП им. В.И.Кулакова и НИИАиГ им. Д.О. Отта (2012 г.) с незначительной модификацией: наличие Candida spp. рассматривалось, как вульвовагинальный кандидоз (ВВК), и трактовалось либо, как бессимптомное кандидоносительство при отсутствии воспалительной реакции, либо как вагинит при наличии симптомов заболевания и количестве лейкоцитов в мазке более 10 для небеременных женщин и более 20 для беременных.

Под абсолютным нормоценозом понимали вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры (Lactobacillus spp.) в его составе была более 80% по отношению к общему количеству бактерий, количество Ureaplasma spp., М. hominis - менее 104ГЭ/мл. Условный нормоценоз расценивали как вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры в составе общей бактериальной массы была более 80%, но количество Ureaplasma spp., М. hominis - могло быть более 104ГЭ/мл. Под анаэробным и аэробным дисбиозом понимали дисбаланс биоты, обусловленный одним или несколькими УПМ соответственно в количестве более 20% по отношению к общему количеству бактерий, и долей нормофлоры менее 80%. Смешанный дисбиоз - дисбаланс, вызванный сочетанием бактериальной биоты и Candida spp. на фоне снижения количества нормофлоры.

У всех пациенток исследуемых групп методом ПЦР в режиме реального времени также определяли наличие патогенов, вирусов, выполнено типирование лактобактерий (табл.1).

При исследовании бактериального фона в эндометрии определяли те же самые

микроорганизмы за исключением типирования лактобактерий.

Определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа

Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК». Метод основан на лизисе клеток в 4M растворе гуанидинтиоцианата и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя с последующими отмывками этанолом и ацетоном. При наличии в образце большого количества материала (ткани эндометрия) использовали метод фенол-хлороформной экстракции [Sambrook, 1989]. Реакцию обратной транскрипции (синтез кДНК из полученной РНК) проводили в объеме 40 мкл. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали оригинальные специфичные олигонуклеотиды и обратную транскриптазу M-MuLV. Реакцию проводили при температуре 40°С в течение 30 минут, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 5 минут. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM на каждом цикле при температуре отжига праймеров. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки.

Нормировка осуществлялась методом сравнения пороговых циклов (метод AACq) по 4 референсным генам (В2М, GUSB, ТВР и HPRT1) и значению медианы уровня экспрессии в группе сравнения, которую принимали равной 1.

Определение замен одиночных нуклеотидов (SNP)

Для определения SNP ДНК выделяли из ядер лимфоцитов. Метод основан на разрушении лимфоцитов с помощью лизирующего буфера, не влияющего на целостность мембран ядер лимфоцитов. ДНК из ядер выделяли с использованием наборов «Проба ГС». Для типирования однонуклеотидных полиморфизмов генов иммунного ответа использована ПЦР с плавлением продуктов реакции в присутствии «примыкающих» олигонуклеотидов (вариант метода adjacent probes, kissing probes). Высокая достоверность полученных результатов обеспечивалась получением кривых плавления по двум каналам флуоресценции (FAM и HEX).

Дополнительные клинико-пабораторные методы исследования при вагинитах: сбор анамнестических данных, жалоб пациентки; осмотр вульвы, слизистых влагалища и шейки матки в зеркалах, бимануальное гинекологическое исследование; микроскопия мазков, окрашенных по Граму; культуральное исследование.

Дополнительные клинико-лабораторные методы исследования при хроническом эндометрите: клинические (анализ жалоб, анамнеза, определение гинекологического статуса); гистероскопия, диагностическое выскабливание эндометрия; гистологическое исследование; ультразвуковое исследование органов малого таза.

Дополнительные клинико-лабораторные исследования были выполнены врачами и сотрудниками ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.

Статистика. Статистическую обработку результатов исследования уровней экспрессии генов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представлены в виде Me (L-H), где Me -медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний квартиль. Значения Me в группе сравнения были приняты за 1, а значения Me в исследуемых группах показывала во сколько раз уровень экспрессии гена выше или ниже по отношению к группе условно здоровых пациенток. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использован U-критерий Манна-Уитни. Различие между группами полагали статистически значимым при р<0,05. Для выявления взаимосвязи переменных проводили расчет коэффициента ранговой корреляции по Спирмену. Обработку полученных результатов проводили с использованием программ StatSoft Statistica 6.0 и SPSS Statistics версия 17.0. Отношение шансов (OR) и значимость различий в частоте встречаемости аллелей и качественных признаков рассчитывали с помощью программного продукта WINPEPI. OR приведено с 95% доверительным интервалом (CI).

Для дискриминации образцов в группах использовался многофакторный анализ (бинарная логистическая регрессия), который позволил вычислить вероятность «классификации в группу наличия признака или заболевания» (Р) для каждого клинического образца. Для расчёта оптимального значения величины порога отсечения Р (точки cut off) использовали ROC-анапиз (Receiver Operator Characteristic).

Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону Харди-Вайнберга проводили по критерию /2-квадрат в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка систем для определения транскрипционных профилей генов иммунной системы

Задача данного этапа диссертационной работы состояла в формировании, разработке и клинической адаптации тест-систем для количественного определения уровня экспрессии мРНК выбранных генов-маркеров, включая оптимизацию методов выделения РНК и ДНК, метода обратной транскрипции, подбор, проверку и оптимизацию температур отжига олигонуклеотидных праймеров и проб, характеристику используемых тест-систем.

Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб

Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб (ДНК-зондов) осуществляли путем анализа последовательностей ДНК и мРНК генов базы данных ЫСВ1 (Ьир//\у\¥\у.псЫ.п1т.тЬ^оу). В реакции обратной транскрипции использовали специфичные олигонуклеотиды 12-15 п.н., которые обеспечивали более высокую эффективность реакции по сравнению со случайными гексамерами и поли-Т-нуклеотидами. При подборе праймеров и зондов учитывали структурную организацию генов, кодирующих мРНК, чтобы исключить отжиг праймеров на геномной ДНК, а также наличие псевдогенов и различные варианты альтернативного сплайсинга.

Проверка праймеров и зондов

Проверку праймеров и зондов для ПЦР проводили на панели образцов, включающей: образцы, прошедшие реакцию обратной транскрипции (кДНК); отрицательный контрольный образец, прошедший пробоподготовку и реакцию обратной транскрипции; образцы, не прошедшие реакцию обратной транскрипции (геномная ДНК).

Критерии приемлемой тест-системы были следующие: 1. Наличие амплификации в образцах, прошедших реакцию обратной транскрипции. 2. Отсутствие на форезе дополнительных неспецифичных полос. 3. Амплитуда разгорания флуоресцентно-меченных проб не менее чем в 2 раза по отношению к фону. 4. Эффективность амплификации не менее 90%. 5. Отсутствие амплификации в отрицательном контрольном образце. 6. Отсутствие амплификации на геномной ДНК.

Отсутствие амплификации на геномной ДНК позволило в рутинной практике значительно упростить методику: выделять суммарный пул нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), не использовать дополнительный этап обработки проб ДНК-азой, сократить число пробирок при постановке реакции амплификации за счет исключения из контроля образцов, не проходящих реакцию обратной транскрипции.

Всего было разработано 28 тест-систем для определения экспрессии генов иммунного ответа (1L1B, IL2, IL4, IL6, IL8, ILIO, IL12A, IL12B, ILI5, IL18, IL23A, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189, TBX21, GATA3, RORC, Foxp3, TLR2, TLR4, TLR9, IL2Ra, CD45, CD68) и 4 референсных генов (В2M, HPRT1, TBP и GUSB).

Разработанные тест-системы были апробированы на образцах тканей секреторного и пролиферативного эндометрия. Выбор был обусловлен наличием четких гистологических критериев, позволяющих различать эндометрий пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла.

Апробация метода исследования транскрипционных профилей в образцах тканей эндометрия двух стадий менструального цикла

Задача данного этапа работы состояла в оценке возможности сравнительного анализа транскрипционных профилей в пролиферативном и секреторном эндометрии, а также поиске способов дискриминации образцов в зависимости от стадии менструального цикла на основе изучаемых маркеров.

В соответствии с полученными результатами для эндометрия секреторной фазы характерно повышение таких маркеров, как LIF в 2,5 (р=0,031), IL6 в 2,7 (р=4,7х10"4), TLR4 в 2,7 (р=1,8х10"5), VEGFA изоформа 189 в 3,1 (р=0,002), TNF в 2,2 (р=0,004), IL4 в 1,4 раза (р=Ю"10) и снижение таких маркеров, как ЕохрЗ в 2,6 (р=8,7х10 ), IL2 в 8,1 раз (р—0,015) по сравнению с пролиферативным эндометрием (рис.1).

На основании экспериментальных данных по экспрессии генов с помощью методов статистического анализа были выбраны 5 наиболее информативных маркеров, которые позволили различить пролиферативный и секреторный эндометрий, рассчитаны индексы соотношения экспрессии генов. Основное требование к паре показателей, составляющих индекс, состояло в разнонаправленном характере изменения экспрессии в группе исследования.

О £

п. С

¡►.а. & г

з а 0,5 5 а

—

0,05

{

о о и о

ш ш ш

> > >

ст.пролиферации О ст.секреции

Рисунок 1. Экспрессионный профиль мРНК генов иммунной системы в

образцах эндометрия в зависимости от стадии менструального цикла.

Отмечены медианы и межквартильный размах.

Индексы могут быть определены напрямую без использования референсных генов по формуле:

[ГенI]/[Ген2] = Сц2 - Сд1 (формула 1), где

и Сц2- значения пороговых циклов для соответствующих генов.

Исключение из исследования референсных генов снимает вопросы нормировки, нивелирует ошибки нормировки, упрощает обработку результатов исследования, сокращает количество маркеров и дает возможность внедрения данного метода в рутинную практику. Однако основное преимущество использования индексов состоит в повышении чувствительности и специфичности метода при дискриминации двух групп образцов (рис.2, табл.2). Использование индекса [ТЫ14]/[РохрЗ] позволило в 30 из 31 случая отличить эндометрий пролиферативной фазы менструального цикла от секреторной фазы (чувствительность 96.8%).

Прикладные аспекты идентификации молекулярно-геиетических маркеров с использованием ПЦР в реальном времени

Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей

Основные направления исследования данного этапа работы состояли в определении особенностей состояния микробиоценоза влагалища, включая количественную оценку УПМ и нормофлоры с типированием лактобактерий;

изучении особенностей профиля экспрессии мРНК генов иммунного ответа и разработке способа оценки локальной воспалительной реакции; определении ассоциаций полимофизмов генов цитокинов с предрасположенностью к развитию воспалительных заболеваний. Кроме этого, в работе представлены результаты исходов родов и послеродового периода у женщин с вагинитами.

IL6 IL2 TLR4 Foxp3 VEGF189

3 -

с. в

транскрипты

Ост.пролиферации Ост.секреции

35 Д

I s

5 s

X w £ u

§ I ы s

- а

S с^ я :s

100

TLR4/Foxp3

j <

О ст. пролиферации (n=31) О ст. секреции (n= 19) -cut-off

Рисунок 2. Дискриминация двух групп образцов с помощью индивидуальных маркеров и их соотношений (индексов).

Таблица 2. Чувствительность и специфичность метода дискриминации образцов эндометрия пролиферативной фазы менструального цикла

\ К-.ка iai e n. Чувствительность Специфичность Значение cut off

IL6 89,5% 64,5% 1,5

IL2 87,1% 84,2% 0,5

TLR4 73,7% 83,9% 1,7

Foxp3 83,9% 84,2% 0,5

VEGFA189 73,7% 83,9% 1,8

IL6/IL2 84,2% 93,5% 4,4

TLR4/Foxp3 96,8% 100% 16,3

VEGFA189/IL2 84,2% 93,5% 322

*3начение порогов отсечек определено с помощью ЯОС-анализа, как требование наибольшей суммарной чувствительности и специфичности метода

Характеристика состава микробиоценоза влагалища небеременных женщин

На основании клинико-анамнестических данных и результатов лабораторных методов исследования были сформированы группы пациенток и охарактеризован состав микробиоценоза влагалища.

Первая группа - условно здоровых женщины с отсутствием жалоб и признаков воспаления на момент обследования (п=141). По результатам микроскопии число лейкоцитов в мазке не превышало 10 в поле зрения. В составе микробиоценоза влагалища у всех женщин доминировали лактобактерии. У 95 женщин выявлен абсолютный нормоценоз (группа сравнения, подгруппа 1А), у 19 - выявлена Ureaplasmaspp. в количестве более 104ГЭ/мл (условный нормоценоз, подгруппа 1В), а у 27 - Candida spp. более 103ГЭ/мл на фоне сохраненной нормофлоры (кандидоносительство, подгруппа 1С).

Вторая группа - пациентки с признаками вагинита (п=215). Во 2-ой группе пациенток выявлено наличие воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища и шейки матки, количество лейкоцитов в мазке более 10 в поле зрения. Пациентки предъявляли жалобы на обильные выделения из половых путей (77.2%), зуд (41,4%), жжение (32,6%) во влагалище, неприятный запах (13%), диспареунию (9,8%), дизурические расстройства (3,3%). По структуре биоценоза в группе женщин с вагинитами выделено несколько вариантов состояния биоценоза (рис.3): абсолютный нормоценоз (п=42), вульвовагинальный кандидоз (п=51), аэробный дисбиоз (п=16), облигатно-анаэробный дисбиоз (п=31), аэробно-анаэробный дисбиоз (п=18) и смешанный дисбиоз (п=42). У 7 пациенток выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104ГЭ/мл, которая рассматривалась, как возможный этиологический агент вагинита; у 8 - вирус простого герпеса (ВПГ I или 2 типов).

3% 4%.

□ ВВК

□ анаэробы

□ аэробы

□ аэробы+анаэробы

□ смешанный дисбиоз

□ абсолютный нормоценоз

□ уреаплазма>4^/мл

□ ВПГ

Рисунок 3. Типы дисбиозов при вагинитах у небеременных женщин

Третья группа - пациентки с бактериальным вагинозом (п-55) (согласно критериям Амсела, при количестве лейкоцитов в мазке менее 10 в поле зрения).

Пациентки этой группы предъявляли жалобы на обильные выделения из половых путей (58,2%), наличие неприятного запаха (25,5%), зуд (10,9%), жжение (7,3%) во влагалище. Диспареуния отмечена в 3,6% случаев. В 32,7% случаев БВ протекал бессимптомно без жалоб со стороны пациенток.

Характеристика состава микробиоценоза влагалища беременных женщин

Первая группа - условно здоровых беременных женщин с отсутствием жалоб и признаков воспаления на момент обследования (п=77). По результатам микроскопии число лейкоцитов в мазке не превышало 20 в поле зрения. В составе микробиоценоза влагалища у всех женщин доминировали лактобактерии. У 50 женщин выявлен абсолютный нормоценоз (группа сравнения, подгруппа 1А), у 16 - выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (условный нормоценоз, подгруппа 1В), а у 11 - Candida spp. в количестве более 103 ГЭ/мл (кандидоносительство. подгруппа 1С).

Вторая группа - пациентки с признаками вагинита (п=24). Во 2-ой группе пациенток выявлено наличие воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища и шейки матки, количество лейкоцитов в мазке более 20 в поле зрения. По структуре биоценоза в группе женщин с вагинитами различали несколько вариантов состояния биоценоза: абсолютный нормоценоз (п=9), ВВК (п=9), облигатно-анаэробный дисбиоз (п=6).

Таким образом, этиологическими агентами воспалительных заболеваний наиболее часто являются грибы рода Candida и анаэробные микроорганизмы, ассоциированные с БВ, что согласуется с данными IUSTI. Согласно данным IUSTI 2011 года основными причинами инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища являются бактериальный вагиноз (22-50%), вульвовагинальный кандидоз (17-39%) и трихомониаз (4-35%), а также аэробный вагинит [Sherrard J., 2011].

Типирование и количественная оценка лактобактерии

При исследовании лактобактерий было выявлено, что основными/ преобладающими видами в составе лактофлоры (более 50 % по отношению к суммарному количеству лактобактерий) были только 4 вида лактобактерий из 11 исследованных: L. crispatus, Liners, L.jensenii, L. gas sen (рис.4). Доля других видов в составе лактофлоры в подавляющем большинстве случаев была незначительной. Только в нескольких случаях при вагините и БВ в составе

лактофлоры доминировали L. vaginalis, L .jonsonii и L. acidophilus.

Полнота выявления отдельных видов лактобактерий подтверждалась

родоспецифичными праймерами для Lactobacillus spp.

группа сравнения вагинит OL.cnspatus

□ L.iners

□ L.jensenii

□ L.gasseri

□ другие виды

□ Lactobacillus не выявлено

кандидоносительство

Ureaplasma spp: 41{*/мл

Рисунок 4. Основной вид Lactobacillus в составе лактофлоры в зависимости от состояния микробиоценоза влагалища.

Установлено, что преобладание L. crispatus в ^ составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища. Преобладание L. crispatus составило 50% и было статистически более значимым в группе сравнения, чем в группе женщин с вагинитами - 17% (OR=0,2 (0,12-0,34), р=2,5х10 9) и бактериальным вагинозом - 17% (OR=0,21 (0,09-0,5), р=1,3х10"4).

Напротив, доля образцов с преобладанием L. iners в составе лактофлоры была выше при дисбиотических процессах и составила 48% - при вагините (OR=4,4 (1,99,9), р=2,2х10"4), 38% - при кандидоносительстве (OR=2,9 (1-8,5), р=0,046), 48% - при условном нормоценозе (OR=5 (1,5-13,1), р=6,2х10"3) и 27% - в группе сравнения. Аналогичная тенденция была получена и для группы женщин с бактериальным вагинозом (р=0,09).

Кроме того, с неблагоприятным состоянием микробиоты, вероятно, ассоциировано и преобладание в составе лактофлоры L. gasseri■ В группе женщин с БВ достоверно чаще отмечено наличие L. gasseri, как основного вида в составе нормофлоры - 30% (OR=5,4 (2,1-13,6), р=1,3х10"4), чем в группе сравнения (8%).

Аналогичная тенденция получена и для группы с вагинитом (р=0,08). При вагините и

БВ выявлены образцы без лактобактерий. Их доля составила 4% - при вагините и 9% при БВ.

Полученные результаты о преимущественном распространении 4 видов лактобактерий: L. crispatus, L.iners, L.jensenii, L. gasseri согласуются с данными литературы [Donati L. 2010; Yan D.H., 2009]. Частоты распространения и преимущественного количественного доминирования в составе нормофлоры различных видов лактобактерий в группе сравнения (рис.4) приблизительно соответствуют данным Дж. Равель [Ravel J., 2011] для белой популяции женщин. Полагают, что лучшая защитная функция L. crispatus обеспечивается поддержанием наиболее кислой среды рН= 4,0±0,3 [Ravel J., 2011] и выработкой Н202 [Antonio М.А., 2005]. При доминировании других типов лактобактерий среда менее кислая: рН=4,4±0,6 — L .iners, рН=5,0±0,7 - L. gasseri [Ravel J., 2011]. Большинство штаммов L. iners не синтезируют Н202 [Antonio MA, 2005]. Кроме того, Rampersaud R. выделил и охарактеризовал токсин инеролизин, выделяемый L .iners, аналогичный интермедилизину Streptococcus intermedins и вагинолизину Gardnerella vaginalis, роль которых в патогенезе дисбиотических процессов доказана [Rampersaud R., 2011].

Разработка способа диагностики локальной воспалительной реакции

С целью наиболее оптимальных маркеров был исследован широкий спектр генов (30 маркеров).

Характеристика уровней представленности транскриптов генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища. По количеству копий мРНК в биологическом материале все гены можно было условно разделить на 3 группы (рис.5): гены с высоким уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 107 до 105 копий мРНК/мл (IL8, IL1B, IL18, TGFB1, CD68, GATA3)', гены со средним уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 105 до 103 копий мРНК/мл (TNF, CD45, 1L12A, 1123, TLR2, TLR4, CD69, ILIO, RORQ и гены с низким уровнем экспрессии - менее 103 копий мРНК/мл (IL15, Foxp3, L1F, TLR9, GNLY, ТВХ21, IFNG, IL6, IL2Ra). Следует отметить, что экспрессия последней группы генов не всегда детектировалась в клетках соскобов слизистой влагалища. В качестве потенциальных маркеров воспаления было целесообразно использование генов с высоким и средним уровнем экспрессии. Маркеры с низким уровнем экспрессии

были исключены из дальнейшего рассмотрения.

7,0 6,0

s —

I Ч 1

я с

е. S 3,0

И 2,0

I 1,0

4,0

I ' f т средний ' ? $ I I I

?чн§}, низкии

1 ? § ЧН Л|!1

j^tt.QjpQgjjJ - OU <UCHt-

H о

JO-g- §но

S и

^ m

ajSHgH

Рисунок 5. Уровень представленности транскриптов генов иммунного ответа в клетках вагинальных соскобов. Отмечены медианы и межквартильный размах.

Особенности экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов в норме, при вагините и БВ

Уровень мРНК генов IL8, TLR2, TLR4, IL1B, ILIO, CD69, CD45, TNFA при вагинитах был существенно выше, a IL18, GATA3, CD68, IL12A, TGFB1 - снижен по сравнению со своими группами сравнения (табл.3). Изменений в уровне экспрессии мРНК гена IL23 не выявлено.

Таблица 3. Изменения уровней экспрессии генов при вагинитах и БВ

Транскрипт небеременные беременные

вагинит БВ вагинит

изменение экспрессии р-уровень изменение экспрессии р-уровень изменение экспрессии р-уровень

ПОВЫШЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ, во сколько раз

IL8 5,7 1,3 х 10"2и 3,3 4,2 х 10"3 6,2 9,5 х 10"s

TLR2 4,4 6,9 х 10"* 3,1 0,054 8,2 2,0 х 10"5

TLR4 4,1 1,3 х 10"' 1,5 0,014 7,1 1,7 х 10"6

ILIВ 3,9 3,4 х 10"" 2,5 2,5 х 10"4 9,2 1,3 х 10"3

ILIO 3,9 1,3 х 10"и 2,1 2,0 х 10"" 3,8 0,011

CD69 3,4 7,3 х 10"" 1,5 1,8 х 10"'3 3,0 0,017

CD45 2,9 2,2 х 10"13 1,7 0,035 5,7 1,4 х 10"'

TNF 1,5 0,014 без изменений 2,4 2,6 х 10"4

ПОНИЖЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ, во сколько эаз

TGFB1 2,2 1,5 х 10 1,4 0,053 2,6 1,8 х 10"4

IL12A 4,0 4,1 х Ю"40 1,5 2,3 х 10"" 2,0 0,018

RORC 4,2 0,041 без изменений 4,8 6,3 х 10""

CD68 4,3 8,2 х 10"21 1,9 7,4 х 10"4 2,9 1,0 х 10"'

GATA3 9,1 1,3 х Ю"33 4,5 1,2 х 10"' 4,5 3,9 х 10"*

IL18 10 6,0 х 10"32 4,2 1,7 х 10"9 5,6 8,3 х 10""

Полученные данные для беременных женщин и небеременных женщин были аналогичными. Похожие изменения в профиле экспрессии генов, но менее

выраженные, были и в группе женщин с БВ (за исключением TNF и RORQ, что свидетельствует об участии одних механизмов реализации воспалительного процесса вне зависимости от типа возбудителя, в первую очередь, механизмов врожденного иммунитета.

Корреляция Lactobacillus iners с уровнем экспрессии генов. Учитывая ассоциацию L. iners с воспалительными заболеваниями слизистой влагалища, была проанализирована зависимость транскрипционного профиля от типа лактобактерий. При анализе данных было установлено, что в образцах группы сравнения с доминированием L. iners достоверно повышены уровни экспрессии мРНК генов IL8 в 1,7 (р=0,026), TLR4 в 2 (р=0,033), IL10 в 3,8 (р=0,01), CD69 в 2,5 (р=0,005), CD45 в 1,7 (р=0,049) раза и снижен IL18 в 1,7 (р=0,005) раза, чем в образцах с доминированием L. crispatus (рис.6), ю

!i , A J йЛ J J ^ __ _

II 11 ч ТП1

II 0,1 L 1

i I u

= m IL1B IL8* IL10* CD69* CD45* TLR4* IL12A CD68 TGFB1 IL18* GATA3

0,01

□ группа сравнения доминирует L.iners □ бактериальный вагиноз Овагинит

Рисунок 6. Транскрипционный профиль генов иммунной системы в зависимости от типа лактобактерий. Представлены медианы значений в группах. Значение Me в группе сравнения с доминирование L. crispatus принято за 1.

Изменения в транскрипционном профиле генов, ассоциированные с L .iners, аналогичны изменениям, характерным для вагинитов и БВ, хотя и существенно менее выраженные. Полученные данные согласуются с лучшей протективной функцией L. crispatus.

Разработка способа оценки локальной воспалительной реакции. При

разработке способа оценки воспалительной реакции во влагалище был выполнен регрессионный анализ (метод бинарной логистической регрессии).

Анализ проводился в два этапа. На первом этапе случайным образом были отобраны две группы пациенток (обучающая выборка): 43 небеременных и

dfl J fli qD ni оЛ

ТТЧ

IL1B IL8* IL10* CD69* CD45* TLR4* IL12A CD68 TGFB1 IL18* GAT A3

□ группа сравнения доминирует L.iners □ бактериальный вагиноз Овагинит

50 беременных женщин из группы сравнения (п=93) и 115 небеременных и 24 беременных пациенток из группы с вагинитами (п=139). На втором этапе была исследована проверочная выборка: 52 пациентки из группы сравнения и 100 женщин из группы с вагинитами.

Для статистического анализа вместо значений уровней экспрессии мРНК генов использовали их соотношения (индексы), т.к. это обеспечивало лучшую чувствительность и специфичность метода (рис.7, табл.4).

1.Е+02

и X

S-ä

U ц

S U Е О.

S с

— V

1.Е+02 1.Е+01 1.Е+00 1.Е-01 1.Е-02 1.Е-03 1,Е-04 1.Е-05

I i

_______J

TLR4/GATA3 О группа сравнения

TNF/EL18 о вагинит

TLR4 GATA3 TNF IL18 О группа сравнения □ вагинит Рисунок 7. Индивидуальные показатели уровней экспрессии и индексов в обучающей выборке образцов небеременных женщин.

Таблица 4. Чувствительность и специфичность метода при использовании индивидуальных маркеров и индексов.

Показатель Чувствительность Специфичность Cut-off

TLR4 85,2% 86% 2,50

GATA3 95,3% 92,2% 0,28

TNF 53% 74,4% 1,53

IL18 88,4% 94,8% 0,49

TLR4/GATA3 95,7% 95,3% 0,06

TNF/IL18 94,8% 90,7% 0.04

Уравнение линейной функции, подобранное с помощью метода регрессионного анализа включало два индекса и имело вид:

г=1,4*1п ([ТШ4]/[СА ТАЗ]) + 1,3*1п([ТШ]/[1Ы8,]) + 7,8 (формула 2) где [ТЬЯ4]/[вАТАЗ] и [ТИЕ]/[И18] - индексы соотношения уровней экспрессии соответствующих генов.

Для беременных и небеременных женщин было подобрано одно линейное уравнение. Далее вероятность локальной воспалительной реакции определяли по формуле:

Р = l/(l+e"z) * 100% (формула 3), где

z - значение функции для каждого конкретного образца, рассчитанное по формуле 2.

Полученные результаты по повышению уровней экспрессии мРНК генов TNF TLR4 согласуются с данными литературы. TNF-a является одним из ключевых цитокинов воспалительного процесса. Взаимодействие липополисахаридов клеточных стенок грамотрицательных бактерий с TLR-4, что приводит к активации макрофагов и синтезу целого ряда провоспалительных цитокинов (IL-lp, IL-6 , IL-8, IL-12 , TNF-a и интерферонов I типа (IFN-a и (3) [Kawai Т, 2011]. Ожидалось повышение уровня экспрессии GATA3h IL 18, т.к. GATA3 представляет собой фактор транскрипции и широко известен, как позитивный регулятор дифференцировки Th2-лимфоцитов [Mjosberg J, 2012], a IL-18 в сочетании с IL-12 участвует в дифференцировке Thl- лимфоцитов. Получены результаты по снижению данных маркеров при вагинитах. Возможно, это связано с тем, что дифференцировка наивных Т-лимфоцитов осуществляется в регионарных лимфатических узлах, а не локально в очагах инфекции. Известно, что GATA3 экспрессируется не только иммунокомпетентными, но и некоторыми другими типами клеток, в частности, он играет важную роль в поддержании структуры эпителия [Но I.C., 2007]. Показано, что воспалительные процессы в коже при псориазе сопровождаются активной пролиферацией эпидермиса и понижением уровня экспрессии мРНК гена GATA3 [Racz Е., 2011]. По аналогии, снижение уровня экпрессии мРНК GATA3 при вагинитах, вероятно связано с процессами десквамации и физиологической регенерации эпителия влагалища. Таким образом, функции GATA3 и IL-18 в местном иммунитете слизистой влагалища могут отличаться от функций в региональных лимфатических узлах и требуют дальнейшего исследования.

Оптимальное значение величины порога отсечения (точки cut off) определено с помощью ROC-анализа, для беременных и небеременных женщин определены разные пороги отсечек. Для небеременных женщин площадь под ROC-кривой составила AUC=0,989±0,007 (р=3,4х10"21). Пороговое значение вероятности воспаления составило 57% (Р=57%). Значения показателей Р выше 57% классифицировали, как маркер вагинитов для небеременных женщин.

Для беременных женщин площадь под ROC-кривой составила

AUC=0,985±0,015 (р=1,9х10"п). Пороговое значение вероятности воспаления - 68,5%

(Р=68,5%). Значения показателей Р выше 68,5% классифицировали как маркер вагинитов для беременных женщин.

Чувствительность и специфичность предложенного метода оценки локальной воспалительной реакции в области порогового значения составила 96,4% (134 из 139) и 96,8% (90 из 93) соответственно для обучающей выборки. Прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value PPV) и прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value NPV) составили PPV=97,8% и NPV=94,7%.

Чувствительность и специфичность предложенного метода оценки локальной воспалительной реакции в области порогового значения для проверочной выборки составила 94% (94 из 100) и 90,4 (47 из 52) соответственно, PPV=94,9%, NPV=88,7%.

Все исследованные мазки были проанализированы на наличие локальной воспалительной реакции (табл.5).

Таблица 5. Классификация мазков по наличию воспаления в группах женщин с дисбиозами и в норме

Группа Наличие воспаления

нет воспаление

1А. Группа сравнения (п=145) 137 94,5% 8

1В. нормоценоз, Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/мл (п=35) 21 14 40%

1С. Кандидоносительство (п=38) 36 94,7% 2

2.Вагинит (п=239) 11 228 95,4%

З.БВ (п=55) 29 26 47,3%

Обращает на себя внимание, что при кандидоносительстве большая часть

образцов (94,7%) определены как норма. В то время как при условном нормоценозе с

Ureaplasma spp. в количестве более 104ГЭ/мл в 40% случаев отмечено наличие

локальной воспалительной реакции. Вопрос о роли уреаплазм в патогенезе

воспалительных заболеваний половых органов до сих пор остается неоднозначным.

В период с 1986 по 1998 года данный микроорганизм рассматривался как инфекция,

передающаяся половым путем [Hunjak В., 2014]. Ureaplasma spp. может вызывать

уретриты, циститы, с уреаплазмой по-прежнему связывают преждевременные роды.

Данный микроорганизм выявляется и у здоровых женщин. Однако некоторые авторы

полагают, что присутствие уреаплазмы в количестве более 104 КОЭ, может свидетельствовать об инфекционном процессе [Hunjak В., 2014].

Согласно полученным данным и в соответствии с предложенной моделью, бактериальный вагиноз в половине случаев (47,3%) сопровождается изменением цитокинового профиля, характерным для воспалительного процесса. Наши данные не подтверждают представление о бактериальном вагинозе, как невоспалительном синдроме, однако соответствуют данным IUSTI, согласно которым бактериальный вагиноз рассматривается, как этиологический фактор вагинита [Sherrard J., 2011].

Полагаем, что разработанный нами способ определения локальной воспалительной реакции может быть полезным инструментом определения воспаления при БВ и наличии Ureaplasma spp.

Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с микроскопическим методом подсчета числа лейкоцитов

По результатам сравнения результатов микроскопии мазков и предлагаемого способа оценки локальной воспалительной реакции коэффициент корреляции составил rS=0,61 (р = 1,6х10"28) (рис.8).

а 2 60

2 й в"

5 Ё 5 40

¡- 5 5

о ^ -

° 2 2 20

Ü ü —

§ i о

дф ш о дшп а □ □ □ д о В

5 -U- Li 0 П nD . □

оо О <> а □

к? □ п □

i о ° 8 о —■-Т-Г-Т-Т-

& О 10 20 30 40 50 60 70 80

со число лейкоцитов

❖ группа сравнения □ вагиниты

Рисунок 8. Корреляция предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с микроскопическим методом подсчета числа лейкоцитов

Сравнение результатов микроскопии мазков и предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции в группе сравнения и при вагинитах представлены в таблице 6.

По положительным результатам совпали 82,3% образцов, по отрицательным -84,2%. Доля ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР методом составила 5.6%. в то время как по результатам микроскопии с подсчетам числа лейкоцитов она была выше

и составила 12,1%. Доля ложноположительных результатов ОТ-ПЦР методом составила 6,3%, в то время как по результатам микроскопии с подсчетам числа лейкоцитов она была выше и составила 9,5%. Таким образом, предлагаемый способ оценки локальной воспатительной реакции на основе метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени по транскрипционному профилю генов иммунного ответа обеспечивает лучшую чувствительность и специфичность метода.

Таблица 6. Результаты микроскопии мазков и ОТ-ПЦР

Лейкоциты L Вагиниты Группа сравнения

Вероятность воспаления, Р %

Р<57 Р>57 Р<57 Р>57

L<10 0 26 (12,1%) 80 (84,2%) 6 (6,3%)

1>10 12 (5,6%) 177 (82,3%) 9 (9,5%) 0

Осложнения родов и послеродового периода у пациенток с вагинитами и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл

Использование предлагаемого способа оценки локальной воспалительной реакции представляет интерес для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений. Наличие вагинита и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода. Наиболее значимые осложнения родов и послеродового периода у обследованных беременных представлены в таблице 7.

Таблица 7. Осложнения родов и послеродового периода

Осложнения Группа 1 Группа 2 (п=24)

Подгруппа 1А (п=50) Подгруппа 1В (п=16) Подгруппа 1С («=И)

Кол. % Кол. % Кол. % Кол. %

Преждевременное излитие околоплодных вод 8 16 5 31,3 0 0 7 29,2

Разрывы мягких тканей родовых путей 3 6 3 18,8 0 0 7 29,2* (р-о,ооб)

Послеродовые осложнения Всего 3 6 3 18,8 0 0 6 25,0* (р-0,019)

| Из них:

Субинволюция матки, раневая инфекция 3 6 2 12,5 0 0 4 16,7

Послеродовой эндометрит - - 1 6,3 0 0 2 8,3

Всего женщин с осложнениями 12 24 9 56,3 (р=0,016) 0 0 13 54,2* (р-0,01)

* - достоверные различия по сравнению с подгруппой 1А

Осложнения родов и послеродового периода достоверно чаще отмечены в группе беременных с признаками воспаления слизистой (OR=3,7 (1,3-10,5), р=0,01) и подгруппе 1В с Ureaplasma spp. в количестве более 104ГЭ/мл (OR=4,l (1,2-13,3), р=0,016) по сравнению с подгруппой 1А. У женщин с бессимптомным носительством грибов не было ни одного случая осложнений родов и послеродового периода. В то время как у женщин с кандидозным вагинитом осложнения родов и послеродового периода отмечались у 7 из 9 (77,8%) пациенток (OR=73,5 (2,9-1882), р=7,6х10"4).

Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что во время беременности более, чем в 40% случаях ВВК, носит характер бессимптомного кандидоносительства и не вызывает осложнений [Jensen J.S., 2011]. Таким образом, Candida spp. может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода только при наличии локальной воспалительной реакции.

Как видно из данных, представленных в таблице 7, наиболее часто встречающимся осложнением родового акта явилось преждевременное излитие околоплодных вод с тенденцией к повышению в подгруппе 1В и группе 2 (р=0,18).

Разрывы мягких тканей родовых путей достоверно чаще наблюдались во 2-ой группе - у 7 (29,2%) по сравнению с 3 (6%) в 1А подгруппе (OR=6,5 (1,5-27,8), р=0,006). При анализе подгрупп наблюдалась тенденция к повышению частоты разрывов мягких тканей родовых путей у женщин подгруппе 1В (р=0,12).

Общее количество осложнений послеродового периода в группе с признаками воспаления слизистой было статистически значимо более высоким и составило 6 (25,0%) случаев по сравнению с беременными подгруппы 1А, где осложнения пуэрперия наблюдались у 3 (6%) (OR=5,2 (1,2-23), р=0,019). Отмечена тенденция к повышению послеродовых осложнений при наличии Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (р=0,12).

Определение ассоциаций полимофизмов генов иммунного ответа с предрасположенностью к развитию вагинитов

Вышеизложенные данные свидетельствуют о влиянии УПМ на экспрессию медиаторов локального иммунитета - цитокинов. Вместе с тем известно, что уровень экспрессии генов зависит не только от влияния персистирующих микроорганизмов, но также определяется генетическими особенностями организма хозяина. В связи с этим были выполнены исследования ассоциации полиморфизмов генов иммунного ответа с предрасположенностью к развитию воспалительных заболеваний нижних

отделов половых путей женщин.

Распределение частот генотипов для всех полиморфизмов в группе сравнения соответствовало закону Харди-Вайнберга. При сравнении частот встречаемости аллелей в группе женщин с вагинитами выявлены достоверные различия для аллеля А локуса ТОР-238 ОА (СЖ=0,21 (0,07-0,68), р=0,004) и аллеля С локуса ТСРВ1-509 ОТ (СЖ=1,8 (1,1-2,9), р=0,015) (рис.9).

к -

1й

гЬ-Ь

С т A G С Т С Т С Т С Т С G А Т

ILIA плв IL1В IL1B IL1R1 IL1RN IL6 IL8 rs4073

rsl800587 rs 16944 rsl 143634 rsl 143627 rs2234650 rs315952 rsl 800795

5 60

ч -

я я

ё 30 н

100

„ 80 :

\ 60 ; 40 j 20 0

ffl

lift

1Й

A G A G А С С Т А С С G G Т А С

CCL2 1L10 IL10 IL10 IL12B IL18 EL18 1L18

rsl 024611 rsl 800896 rsl 800872 rsl 800871 rs3212227 rsl 87238 rsl 946518 rsl 946519

й-

йа

№

lift

i¥i

A G A G С Т С Т А Т A G С ! Т

TNFrs361525 TNF TGFB1 TGFB1 IFNG TLR4 TLR2

rsl 800629 rsl 800470 rsl 800469 rs2430561 rs4986790 rs3804099

□ группа сравнения □ вагинит Рисунок 9. Частоты распределения аллелей при вагинитах.

В группе женщин с вагинитами достоверно реже отмечен гетерозиготный генотип GA локуса TNF -238 G>A (OR=0,19 (0,06-0,64, р=0,0035, аутосомно-доминантная модель), чем в группе сравнения (рис.10).

TNF(G-238A) rs361525

X - 100

S о5 во

5 еч 60

ч я Н 40

я н о О Z 20

н и

и я 0

ft-

А*

аллели

A A AG*

5 n? 60

P -

4 § 40

5 =

я 2 20 p £

£ u 0 ES

□ группа сравнения

□ пациентки с вагинитами

TGFB1(C-509T) rsl800469

ir 1

С* T CC* CT TT аллели генотип

□ группа сравнения

□ пациентки с вагинитами

Рисунок 10. Частота выявления аллелей генотипов локусов TNF -238 G>A и TGFB1 -509 ОТ.

Ген TNF картирован на хромосоме 6р21.3. имеет размер 2762 п.н. и содержит 4 экзона. Известны более 30 полиморфных вариантов гена, но только около половины из них влияют на экспрессию TNF-a in vitro. Полиморфизм в промоторной области гена TNF-238 G>A (rs361525) содержит замену гуанина на аденин, что приводит к повышению экспрессии TNF-a в ответ на стимуляцию липополисахаридами in vitro [J. Bidwell, 1999; Liu Ch., 2010]. В проведенном нами исследовании установлено, что аллельный вариант А локуса TNF -238 G>A является протективным и встречается реже в группе женщин с вагинитами, чем в группе сравнения. По-видимому, высокая экспрессия TNF-a приводит к эффективной стимуляции иммунокомпетентных клеток и способствует своевременной элиминации возбудителей на ранних стадиях заболевания.

В группе женщин с вагинитами достоверно чаще отмечен гомозиготный

генотип СС локуса TGFB1-509 0T (OR=2,3(l,2-4,4), р=0,016, аутосомно-

рецессивная модель), чем в группе сравнения (рис.10). Ген TGFB1 картирован на

хромосоме 19ql3.1, имеет размер 23403 п.н. и содержит 7 экзонов. Продукт этого

гена регулирует клеточные процессы пролиферации, дифференцировки, адгезии,

апоптоза, миграции, воспаления, фиброза, заживления ран и ангиогенеза [Massague J,

2006]. По отношению к иммунным клеткам ведет себя, как иммуносупрессорный

фактор. Полиморфный вариант Т локуса TGFB1-509 ОТ (rs 1800469) содержит замену цитозина на тионин и приводит к повышению уровня экспрессии этого цитокина [Grainger D. J., 1999]. По-видимому, высокая экспрессия TGF-B1 способствует своевременной остановке воспалительного процесса и не дает ему перейти в разряд патологических на поздних стадиях заболевания.

Полученные нами данные позволяют рассматривать генетическую предрасположенность к пониженной экспрессии TNF-a и TGF-B1 как факторы риска развития вагинита. Таким образом, факторы риска развития вагинита ассоциированы с "дикими" и более распространенными в популяции генотипами, что возможно и обуславливает широкое распространение данной гинекологической патологии.

Хронический эндометрит

Идентификация микроорганизмов в полости матки

Полость матки защищена естественными физиологическими барьерами и остается малодоступной для микроорганизмов, обитающих в окружающей среде. Вместе с тем, нижние отделы половых путей обильно заселены микроорганизмами. Суммарная бактериальная масса во влагалище у женщин репродуктивного возраста может составлять до 10^ микроорганизмов. При этом полость матки остается защищенной благодаря анатомическому и функциональному строению половых путей: наличию эндоцервикса и слизистой пробки. Вместе с тем, данная защита остается относительно проницаемой, в том числе в случае нарушения строения шейки матки и при прохождении сперматозоидов и семенной жидкости, которая может содержать различные микроорганизмы.

При идентификации микроорганизмов в полости матки возникают некоторые затруднения. Во-первых, необходимо исключить контаминацию микроорганизмами из нижних отделов половых путей, что требует определенной техники взятия биоматериала [Гомболевская Н., 2012]. Во-вторых, концентрация микроорганизмов может быть очень низкой и недостаточной для идентификации, полагают, что в некоторых случаях инфекционный возбудитель остается не выявленным. С другой стороны, инфекционные агенты зачастую запускают воспалительный процесс, который продолжается в отсутствии самого возбудителя.

Согласно полученным данным степень бактериальной обсеменности полости матки составила около 10 ГЭ/мл (табл.8). В основном бактериальная масса была представлена лактобактериями. При ХЭ частота выявления различных

микроорганизмов составила: Enterobacteriaceae (E.coli, Klebsiella spp и др.) — 25,3%, Gardnerella vaginalis/Prevotella spp./Porphyromonas spp. - 17,7%, Ureaplasma spp. -15,2%, идентифицированы также такие возбудители урогенитальных инфекций, как С. trachomatis, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus spp., Enrerococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma spp., Peptostreptococcus spp. и другие.

Таблица 8 . Спектр выявленных микроорганизмов в биоптатах эндометрия

возбудитель Группа сравнения ХЭ

Кол-во, lg, % Кол-во, lg, % р-уровень

С. trachomatis 1,3

CMV 2,6

ОБМ 3,8 (3,4-4,1) 100 4,0 (3,4-4,7) 100

Lactobacillus spp 3,6 (3,0-4,0) 83,9 3,7 (3,2-4,5) 81

Enterobacteriaceae 3,2 (3,2-3,3) 6,5 3,3 (3,2-3,4) 25,3 р=0,0022

Streptococcus agalactiae менее 3 2,6

Staphylococcus spp 3,5(3,3-3,7) 3,8

Enrerococcus spp менее 3 2,6

Gard/Pre/Porph 3,1 3,2 3,5 (3,2-3,7) 17,7 р=0,046

Eubacterium spp 3,3 (3,2-3,6) 6,3

Lachno/Clost 3,5 1,3

Peptostrept 4,7 1,3

Atopobium vaginae менее 3 5,1

Mycoplasma spp менее 3 2,6

Ureaplasma spp менее 3 6,5 менее 3 15,2

Candida spp 3,7 (3,6-3,9) 2,6

Всего положительных 13 45,6 р=0,0014

Локальный транскрипционный профиль при хроническом эндометрите

На основе результатов гистологического исследования эндометрия пациентки были разделены на следующие группы: 1. Группа сравнения (п=31) - эндометрий ранней, средней или поздней стадии пролиферации. 2. Женщины с хроническим эндометритом (п=79), из них: 2А- полный симптомокомплекс ХЭ (п=44) с наличием в строме эндометрия очагового фиброза стромы. склеротических изменений стенок I спиральных сосудов эндометрия, воспалительных лимфоидных инфильтратов в сочетании с плазматическими клетками; 2В - неполная форма ХЭ с очаговой и рассеянной инфильтрацией стромы лимфоцитами и плазмоцитами (п=20); 2С -неполная форма ХЭ с фиброзом стромы эндометрия и склеротическими изменениями стенок спиральных сосудов эндометрия (п=15) (рис. 11 А-Г).

А. Хронический эндометрит с крупным лимфоидным фоликулом (2А подгруппа) увеличение х 250

Б. Хронический эндометрит с рассеяной лимфоидной инфильтрацией (2В подгруппа) увеличение х 400

Г. Эндометрий стадии пролиферации (1-ая группа - группа сравнения) увеличение х 400 ХЭ и эндометрия стадии пролиферации.

ШЩйШЩ

щтШвшш

it -:;«.- iv;••

В. Хронический эндометрит с фиброзом стромы (2С подгруппа) увеличение х 250

Рисунок 11. Морфологическая картина Окраска гематоксилином и эозином.

При наличии полного симптомокомплекса ХЭ (подгруппа 2А) и при неполной форме ХЭ с лимфоидной инфильтрации стромы (подгруппа 2В) были отмечены сходные изменения транскрипционного профиля, связанные с повышением уровня экспрессии мРНК генов IL1B, IL6, TNF, LIF, ILIO, TLR9, TGFBI, IL12A, IL2Ra, VEGFA (табл. 9, рис.12). Изменения профиля экспрессии биомаркеров в подгруппе женщин с лимфоидной инфильтрацией стромы лимфоцитами и плазмоцитами позволяют рассматривать данную патологию, как ХЭ, что согласуется с данными литературы о наличии полного симптомокомплекса и неполной формы ХЭ [Шуршалина А. В., 2007]. Пациентки, у которых в результате гистологического исследования тканей эндометрия выявлена только лишь лимфоидная инфильтрация, можно рассматривать, как женщин с ХЭ.

Таблица 9. Уровень экспрессии мРНК генов иммунного ответа в тканях эндометрия при хроническом эндометрите

Ген Группа сравнения п=31 Ме (ЬН) 2А подгруппа (п=44) 2В подгруппа (п=20) 2С подгруппа (п=15)

Уровень экспрессии Ме (Ь-Н) Р Уровень экспрессии Ме (Ь-Н) Р Уровень экспрессии Ме (Ь-Н) Р

1ЫВ 1 (0,56-1,62) 2,1 (1,0-5,3) 0,006 2,0 (0,8-7,1) 0,005 26,0(11,4-49,7) 9,6 х 10"8

1Ь6 1 (0,32-3,12) 1,9(1,2-5,9) 0,023 2,9 (0,8-5,8) 0,023 16,6 (2,7-24,2) 0,0014

ТИР 1 (0,68-1,59) 1,5 (1,2-2,8) 0,007 1,8(1,1-4,9) 0,007 16,0 (9,1-22,1) 6,6 х 10'7

1Ь8 1 (0,37-2,88) 1,6(1,0-6,0) 0,043 2,2(0,6-10,3) 0,096 7,9 (4,7-179,5) 6,7 х Ю-5

ЬШ 1 (0,40-1.74) 1,5 (1,0-3,9) 0,002 2,4 (1,0-4,7) 0,009 6,3 (3,2-9,7) 1,4 хЮ"6

1Ы0 1 (0,62-1,68) 2,0 (1,0-4,1) 0,014 1,9 (0,7-2,9) 0,035 5,9(3,1-21,0) 4,1 х 10*

ТЬЯ9 1 (0,45-1,72 1,6 (0,7-4,3) 0,014 2,3 (0,6-3,1) 0,050 5,0 (2,8-10,3) 4,3 х КГ6

ТСРВ1 1 (0,65-1,43) 1,5 (1,0-2,3) 0,042 1,5 (0,9-2,3) 0,012 4,7 (2,2-6,2) 3,5 х 10"6

1Ы2А 1 (0,86-1,34) 1,5 (1,1-1,8) 0,019 1,6(1,0-1,8) 0,032 4,3 (2,9-7,4) 7,4 х 10'6

11.18 1 (0,74-1,34) 1,3 (0,8-2,0) 0,228 1,3 (0,8-2,0) 0,146 3,5 (1,9-5,7) 6,3 х 10"6

№N0 1 (0,47-1,33) 1,0(0,7-1,9) 0,186 1,0 (0,6-1,6) 0,726 2,8 (1,0-4,6) 2,1 х 10~5

ТЬЯ2 1 (0,82-1,40) 1,4 (1,3-2,9) 0,003 1,5 (0,701,9) 0,145 2,6(1,5-8,0) 8,3 х 10"5

РохРЗ 1 (0,62-1,52) 1,4(1,1-2,0) 0,019 1,6 (0,8-2,6) 0,062 2,6 (2,0-3,6) 3,5 х Ю-5

ГЬ2Яа 1 (0,69-1,60) 1,7(1,3-3,0) 0,002 1,8(0,09-2,9) 0,014 2,3 (1,3-4,1) 2,5 х Ю"2

11.12В 1 (0,70-1,83) 1,0 (1,0-3,2) 0,107 1,6 (0,7-2,3) 0,970 2,3 (1,1-5,5) 0,1

1Ь4 1 (0,51-1,78) 1,6 (0,9-3,7) 0,054 1,9 (0,7-2,9) 0,068 2,2 (0,4-2,8) 0,34

УЕвРАШ 1 (0,62-1,35) 1,4 (0,9-1,8) 0,049 1,2 (0,9-2,0) 0,012 2,2(1,3-3,3) 1,8 х 10"'

УЕОРА189 1 (0,65-1,36) 1,5 (1,2-2,1) 0,006 1,7(1,1-2,4) 0,006 2,1 (0,9-2,7) 0,054

1 (0,65-1,50) 1,1 (1,0-1,6) 0,267 1,2 (0,8-1,7) 0,260 1,7(1,2-4,8) 3,2 х 10"3

УЕОРА165 1 (0,56-1,46) 1,4(1,1-1,8) 0,009 1,3 (1,0-2,1) 0,004 1,3 (0,9-3,0) 0,082

1Ь2 1 (0,62-1,53) 0,7 (0,6-1,0) 0,137 0,7 (0,4-1,2) 0,116 0,9 (0,8-1,4) 0,76

„ юо,о

□ полный симптомокомплекс ХЭ (п=44) И инфильтрация стромы лимфоцитами (п=20)

в фиброз стромы (п=15)

Рисунок 12. Профиль экспрессии мРНК генов иммунной системы в тканях эндометрия у женщин с хроническим эндометритом.

Представлены медианы значений в группах. Значение Ме в группе сравнения принято за 1.

Более выраженные изменения в уровне экспрессии мРНК отмечены при неполной форме ХЭ с фиброзом стромы эндометрия (подгруппа 2С), связанные с повышением экспрессии мРНК генов IL1B, IL6, TNF, IL8, LIF, ILIO, TLR9, TGFB1, IL¡2A, IL 18, IFNG, TLR2, Foxp3, IL2Ra, VEGF121, TLR4 (табл.9, рис.12).

Полученные нами данные позволяют расширить представление о патогенезе хронического эндометрита, и связать их не только с влиянием инфекционных агентов, но и с нарушениями иммунологических механизмов нормального функционирования и репарации поврежденных тканей эндометрия.

Фиброз стромы и склероз сосудов эндометрия могут рассматриваться, как более тяжелые формы ХЭ, требующие наибольшего внимания. В связи с этим на основании полученных данных проведен регрессионный анализ с целью дискриминировать группу с фиброзом стромы эндометрия.

Уравнение линейной функции имело следующий вид: z=3,6*ln([ILlB]/[IL2])+5,5*ln([ILI0]/[Foxp3])+3,5*ln([TLR9]/[IL2Ra])-10 (формула 3), где [IL1B]/[IL2], [IL10]/[Foxp3], [TLR9]/[lL2Ra] - индексы соотношения уровня экспрессии соответствующих маркеров.

В результате ROC- анализа выбрано значение точки cut off= 63%. Площадь под кривой составила AUC=0,995±0,007 (р=6,3х10"7). Чувствительность и специфичность предложенной модели составили 93,3% и 100% соответственно. При значении вероятности более 63% образцы следует рассматривать, как наличие фиброза стромы эндометрия.

100 80 60 40 20 0

.................."...........................................да--------------

а о

оо В

....._................... 0...................

...................ж 1(Гтп /ПЛ о

О 1 группа сравнения □ подгруппа 2А Л подгруппа 2В О 2С фиброз -линия cut off

Рисунок 13. Распределение образцов эндометрия при ХЭ в зависимости от фиброзирования стромы

В соответствии с предложенной статистической моделью все образцы группы сравнения были определены, как образцы без фиброза. Как образцы с фиброзом эндометрия, были определены 12 пациенток (27%) подгруппы 2А (полный симптомокомплекс хронического эндометрита), 7 пациенток (35%) - подгруппы 2В (лимфоидная инфильтрация) и 14 пациенток (93%) - подгруппы 2С с фиброзом эндометрия (рис.13).

Данные литературы по фиброзированию стромы эндометрия очень ограничены, однако патогенез фиброза в независимости от места локализации процесса, вероятно, достаточно универсален. Известно, что TGF-ßl является одним из основных медиаторов формирования фиброза [Ueha S., 2012]. Другой механизм фиброза может начинаться через активацию TLR-9, что было доказано для пациентов, склонных к быстро прогрессирующему идиопатическому фиброзу легких [Hogaboam СМ, 2012]. Согласно полученным нами данным оба этих маркера повышены. Возможно, что женщины, попадающие в группу фиброза эндометрия, составляют группы риска неблагоприятного течения заболевания с прогрессирующим процессом фиброза.

ВЫВОДЫ

1. Для оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа разработаны 32 тест-системы на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени (ILIß, IL2, IL4, 1L6, IL8, ILIO, ILI2A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189, TBX21, GATA3, RORC, Foxp3, TLR2, TLR4, TLR9, IL2Ra, CD45, CD68, B2M, HPRTI, TBP и G USB).

2. Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток: повышается экспрессия мРНК генов IL IB, IL8, ILIO, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF от 1,5 до 9 раз (р<0,05), снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, ILI2A, IL18, TGFB1, RORC от 2,2 до 10 раз (р<0,001).

3. Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей генотипа СС локуса TGFB1 -509 С>Т (OR=2,3(l,2-4,4), р=0,016, аутосомно-рецессивная модель) и протективная роль аллеля А локуса TNF-238 G>A в развитии воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей (OR=0,21 (0,07-0,68), р=0,004, аутосомно-доминантная модель).

4. Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышен уровень экспрессии мРНК генов 1L1B, IL6, TNF, LIF, ILIO, TLR9, TGFB1, IL12A, IL2Ra, VEGFA от 1,5 до 2,9 раз (р<0,05). Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, TNF, IL8, LIF, ILIO, TLR9, TGFB1, IL 12A, IL 18, IFNG, TLR2, Foxp3, IL2Ra, VEGF121, TLR4 от 1,7 до 16,6 раз (p<0,05).

5. Преобладание L. crispatus в составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища. Доминирование в составе нормофлоры L. iners чаще отмечено при вагинитах (OR=4,4 (1,9-9,5), р=2,2х10'4), L. gasseri - при бактериальном вагинозе (OR=5,4 (3,1-13,6), р=1,3х10'4). У условно здоровых женщин при доминировании L. iners в составе лактофлоры повышены уровни экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, ILIO, CD69, CD45 от 1,7 до 3,8 раза (р<0,05) и снижен ¡LI8 в 1,7 (р=0,005) раза по сравнению с образцами, в которых доминирует L. crispatus.

6. При хроническом эндометрите общая бактериальная обсемененность полости матки составляет около 104 ГЭ/мл. Чаще всего флора представлена лактобактериями и условно-патогенными микроорганизмами, такими как Enterobacteriaceae (25,3%), Gardnerella vaginalis/Prevotella spp/Porphyromonas spp. (17,7%), Ureaplasma spp. (15,2%).

7. К практическому использованию предложен способ оценки вероятности наличия воспалительного процесса нижних отделов половых путей по двум индексам соотношения экспрессии мРНК 4 генов: [TNF]/[IL18] и [TLR4]/[GA ТАЗ]. Чувствительность и специфичность предложенного метода составляет 95,4% и 94,5% соответственно.

8. К практическому использованию предложен способ оценки фиброза стромы эндометрия. Данная форма хронического эндометрита может быть определена по 3 индексам отношения экспрессии мРНК 6 генов: [IL1B]/[IL2], [IL10]/[Foxp3] и [TLR9]/[IL2Ra], Чувствительность и специфичность предложенного метода составляет 93,3% и 100% соответственно.

9. Разработан комплексный подход к диагностике вагинитов и хронического эндометрита, установлены наиболее показательные молекулярно-генетические маркеры воспалительного процесса, включающие количественную идентификацию широкого спектра микроорганизмов (30 маркеров), определение транскрипционного профиля генов иммунной системы (4 маркера при вагинитах и 6 маркеров при хроническом эндометрите) и генетические особенности организма (2 полиморфизма генов цитокинов).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых научных изданиях:

1. Донецкова А.Д., Шарова Н.И., Литвина М.М., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Ярцев М.Н., Алексеев Л.П., Ярилин A.A. Регуляторные Т-клетки при аллергии у детей. // Медицинская иммунология. - 2008. - Т.10. - №2-3. -С.159-166.

2. Ярилин A.A., Козлов В.А., Бурменская О.В., Аметов A.C., Никонова М.Ф., Трофимов Д.Ю. Естественные регуляторные Т-клетки и связанные с ними цитокины при хроническом аутоиммунном тиреоидите. // Иммунология. - 2008. - №6. -С.357-361.

3. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Батенева Е.И., Алексеев Л.П., Насонов Е.Л., Александрова E.H., Новиков A.A. Разработка комплекса тест-систем на основе ОТ-ПЦР в режиме «реального времени» для определения цитокинового профиля в мононуклеарных клетках крови и синовиальной жидкости при ревматоидном артрите. И Медицинская иммунология. - 2008. - Т.10. - №6. -С.563-570.

4. Савилова A.M., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Алексеев Л.П., Хаитов P.M. Метод оценки результатов РБТЛ с помощью количественной полимеразной цепной реакции. // Иммунология. - 2008. — Т.29. - №3. - С.178-182.

5. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Донецкова А.Д., Батенева Е.И., Ярилин A.A., Алексеев Л.П. Разработка тест-системы для определения уровня экспрессии мРНК Foxp3 на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени. // Иммунология. - 2008. - Т.29. - №3. - С.182-187.

6. Шарова Н.И., Донецкова А.Д., Топтыгина А.П., Митин А.Н., Литвина М.М., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т., Алексеев Л.П., Ярилин A.A. Экспрессия цитокиновых генов и секреция цитокинов эпителиальными и лимфоидными клетками тимуса человека. // Иммунология. - 2008. - Т.29. - №6. -С.329-334.

7. Ярилин A.A., Козлов В.А., Бурменская О.В., Аметов A.C., Никонова М.Ф., Трофимов Д.Ю. Влияние терапии человеческим рекомбинантным ИЛ-2 (ронколейкином) на естественные регуляторные Т-клетки и связанные с ними цитокины при хроническом аутоиммунном тироидите. // Иммунология. - 2009. -№ 2.- С.120-123.

8. Байрамова Г.Р., Муравьева В.В., Донников А.Е., Бурменская О.В., Ворошилина Е.С., Тумбинская JI.B. Оценка эффективности комплексной терапии больных с хроническим рецидивирующим вульвовагинальным кандидозом. // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2011. - №2. - С.86-89.

9. Fedenko E.S., Elisyutina O.G., Filimonova T.M., Boldyreva M.N., Burmenskaya O.V., Rebrova O.Y., Yarilin A.A., Khaitov R.M. Cytokine gene expression in the skin and peripheral blood of atopic dermatitis patients and healthy individuals. // SelfTNonself. - 2011. - Vol.2. - №2. - P. 120-124.

10. Филимонова T.M., Елисютина О.Г., Феденко E.C., Бурменская О.В., Болдырева М.Н. Влияние топических глюкокортикостероидов на экспрессию генов цитокинов в коже и периферической крови больных атопическим дерматитом. // Российский аллергологический журнал. - 2011. - №3. - С.19-30.

11. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р. Непша О.С. Донников А.Е. Цитокиновый профиль иммунокомпетентных клеток влагалища при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Уральский медицинский журнал. - 2011. - №3.

- С.44-49.

12. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Екимов А.Н. Состояние локального иммунитета при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Иммунология.

- 2011. - №3. - С.154-159.

13. Филимонова Т.М., Елисютина О.Г., Ниязов Д.Д., Болдырева М.Н., Бурменская О.В., Реброва О.Ю. Локальный и системный иммунный ответ у больных тяжелым атопическим дерматитом. // Российский аллергологический журнал. -2011. - №5. - С.10-15.

14. Сухих Г.Т., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Донников А.Е., Дуринян Э.Р., Бирюкова A.M. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов в вагинальных мазках женщин репродуктивного возраста при неспецифическом вагините и бактериальном вагинозе. // Акушерство и гинекология. - 2011. - №7-2. - С.33-38.

15. Кудинова Е.А., Бурменская О.В., Боженко В.К., Васкевич В.Ф., Непша О.С., Мельникова Н.В., Троценко И.Д., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Экспрессия маркеров

апоптоза при раке молочной железы. // Технологии живых систем. - 2011. - Т.8. -№7. - С.40-44.

16. Смольникова В.Ю., Краснощока O.E., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Калинина Е.А., Сухих Г.Т. Возможности прогнозирования исходов вспомогательных репродуктивных технологий по уровню спермальных мРНК. // Акушерство и гинекология. - 2012. - №2. - С.36-40.

17. Меджидова М.К., Бурменская О.В., Донников А.Е., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Тютюнник B.JL, Сухих Г.Т. Оценка локальной воспалительной реакции во влагалище по профилю экспрессии мРНК генов цитокинов у беременных накануне родов.// Акушерство и гинекология. - 2012. - №3. -С.26-31.

18. Сухих Г.Т., Бурменская О.В., Смольникова В.Ю., Краснощока O.E., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е., Калинина Е.А. мРНК протаминов и фертилина как потенциальные биомаркеры исхода программ вспомогательных репродуктивных технологий. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. -Т.153. - №4, —С.513-515.

19. Болдырева М.Н., Царев C.B., Чулкина М.М., Савилова A.M., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Ильина Н.И., Шартанова Н.В., Алексеев Л.П. Исследование экспрессии генов иммунной системы у спортсменов высших достижений методом ПЦР в реальном времени. // Иммунология. - 2012. - №5. -С.231-236.

20. Чернуха Г.Е., Думановская М.Р., Бурменская О.В., Шубина Е.С., Коган Е.А., Трофимов Д.Ю. Экспрессия генов, регулирующих апоптоз, при разных типах гиперплазии эндометрия и эндометриоидной карциноме. // Акушерство и гинекология. - 2013. - №1. -С.63-69.

21. Думановская М.Р., Чернуха Г.Е., Бурменская О.В., Непша О.С., Павлович C.B., Коган Е.А., Трофимов Д.Ю. Особенности экспрессии маркеров пролиферации в гиперплазированном эндометрии. // Гинекология. - 2013. - №2. -С.4-8.

22. Бестаева Н.В., Назарова Н.М., Прилепская В.Н., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Суламанидзе Л.А. Папилломавирусная инфекция: новые взгляды на диагностику и лечение. // Гинекология. - 2013. -№3. - С.4-7.

23. Прилепская В.Н., Назарова Н.М., Новикова Е.П., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Безнощенко О.С. Иммунологические и молекулярно-биологические маркеры, ассоциированные с хроническим цервицитом. // Гинекология. - 2013. - №3. - С.46-51.

24. Bourmenskaya О., Shubina E., Troflmov D., Rebrikov D., Sabdulaeva E., Nepsha O., Bozhenko V., Rogovskaya S., Sukhikh G. Host gene expression profiling of cervical smear is eligible for cancer risk evaluation. // Journal of Clinical Pathology. -

2013. - Vol.66. - №4. - P.282-285.

25. Бестаева H.B., Назарова H.M., Прилепская B.H., Трофимов Д.Ю., Бурмеиская О.В., Павлович C.B. Папилломавирусная инфекция, обусловленная ВПЧ 52 и 58 типов и ее роль в развитии цервикальных интраэпителиальных неоплазии. // Акушерство и гинекология. - 2013. - №7. - С.45-50.

26. Думановская М.Р., Чернуха Т.Е., Бурменская О.В., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю. Вероятность неопластической трансформации при различных типах гиперплазии эндометрия. // Акушерство и гинекология. -2013. - №8. - С.56-62.

27. Тютюнник B.JI., Карапетян Т.Э, Донников А.Е., Кан Н.Е., Бурменская О.В. Изменения локального и системного иммунитета при оппортунистических инфекциях влагалища у беременных. // Акушерство и гинекология. - 2013. - №8. -С.25-29.

28. Ионов О.В., Никитина И.В., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е., Митрохин Д.С., Припутневич Т.В., Любасовская Л.А., Дегтярев Д.Н. Роль метода ПЦР в диагностике врожденных и нозокомиальных инфекции у новорожденных. // Акушерство и гинекология,- 2013. - №11. - С.59-64.

29. Гомболевская H.A., Бурменская О.В., Демура Т.А., Марченко Л.А., Коган Е.А., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Оценка экспрессии мРНК генов цитокинов в эндометрии при хроническом эндометрите. // Акушерство и гинекология. - 2013. — №11.- С.35-40.

30. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Муравьева В.В., Абакарова П.Р., Стрельченко Д.А., Кряжева B.C., Сухих Г.Т. Видовой состав лактобактерий при неспецифических вагинитах и бактериальном вагинозе и его влияние на локальный иммунитет. // Акушерство и гинекология,-

2014. - №1. - С.41-45.

31. Пат. 2464570 Российская Федерация, МПК G01N33/53. Метод диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий. / Боженко В.К., Кудинова Е.А., Близнюков О.П., Мельникова Н.В., Бурменская О.В.; заявитель и патентообладатель ФГУ "РНЦРР" Минздравсоцразвития России (RU). - №2010147074/15; заявл. 19.11.2010; опубл. 20.10.2012, Бюл. №29 - 9 с.

32. Пат. 2417263 Российская Федерация, МПК C12Q1/68. Способ диагностики воспалительного процесса при раннем ревматоидном артрите. / Ребриков Д.В., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю.; заявитель и патентообладатель Закрытое

акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (RU). -№ 2009101460/15; заявл. 20.01.2009; опубл. 27.04.2011, Бюл. №12 - 20 с.

33. Пат. 2492244 Российская Федерация, МПК C12Q1/68, C12N5/00. Способ оценки степени пролиферации клеток с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции. / Савилова A.M., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Ребриков Д.В.; заявитель и патентообладатель Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (RU). - № 2008100303/10; заявл. 15.01.2008; опубл. 10.09.2013, Бюл. №25 - 16 с.

Материалы симпозиумов и конференций:

34. Папуашвили М.Н., Петрова Т.В., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю. Диагностическая значимость количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) при альтернативной терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов методом ОТ-ПЦР в режиме «реального времени». // Труды XIII Конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 2006. - Т.2.

35. Донецкова А.Д., Шарова Н.И., Бурменская О.В., Топтыгина А.П., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Ярилин A.A. Выработка цитокинов эпителиальными клетками тимуса человека. // Российский аллергологический журнал. - 2007. —№3-1.

— С.10.

36. Донецкова А.Д., Бурменская О.В., Ярцев М.Н., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Ярилин A.A. Регуляторные Т-клетки при аллергии у детей. // Российский аллергологический журнал. - 2007. — №3-1 . — С. 17.

37. Донецкова А.Д., Бурменская О.В., Ярцев М.Н., Трофимов Д.Ю., Ярилин A.A. Анализ экспрессии молекулярного маркера регуляторных клеток FOXP3 в норме и при аллергопатологии у детей. // Медицинская иммунология. - 2007. — Т.9. - № 2-3.

— С.180.

38. Насонов Е.Л., Александрова E.H., Новиков A.A., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В, Ребриков Д.В. Разработка комплексной технологии ранней диагностики воспалительных заболеваний на основе молекулярных маркеров иммунного ответа. // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». — Москва, 2007. - С.124-125.

39. Trophimov D.Y., Burmenskaya O.V, Ebzeeva M. V., Kalinina E.A., Mullabaeva S.M, Kuzjmichev L.N., Sukhikh G.T. Markers associated with success and

failure of embryo transfer (ET) during IVF program. // 7th European Congress on Reproductive Immunology. / J Reprod Immunol. - 17-20 September, Marathon, Greece, 2009.-Vol.81.-P. 157.

40. Vasilyev E.V., Burmenskaya O.V., Khoroshkeeva O.V., Tetruashvili N.K., Trofimov D.Y., Sukhikh G.T. Parental killer Ig-like receptor and HLA-C genotypes in couples with recurrent miscarriage.// 8th European Congress on Reproductive Immunology. / J Reprod Immunol. - 10-13 November, Munchen, Germany , 2010. - Vol.86. - P.108.

41. Байрамова Г.Р., Непша O.C., Бурменская O.B., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Прилепская В.Н., Трофимов Д.Ю. Локальная экспрессия мРНК генов цитокинов у женщин с хроническим вульвовагинальным кандидозом. // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье. Сборник материалов III междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия». - 3 июня, Санкт-Петербург, 2010. - С.15-16.

42. Краснощока О.Е., Бурменская О.В., Непша О.С., Смольникова В.Ю., Калинина Е.А., Трофимов Д.Ю. Роль спермальных мРНК генов PRM-1, PRM-2, ADAM-2 в прогнозировании исхода программ ВРТ. // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». - 28 сентября - 1 октября, Москва, 2010. -С.411-412.

43. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Муллабаева С.М., Екимов А.Н., Донников А.Е. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов у женщин с хроническим рецидивирующим вульвовагинальным кандидозом. // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». — 28 сентября - 1 октября, Москва, 2010. - С.531-532.

44. Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю. Молекулярные маркеры в диагностике цервикальной неоплазии шейки матки. // XI Всероссийский научный форум «Мать и дитя 2010».

28 сентября - 1 октября, Москва, 2010. - С.491.

45. Смольникова В.Ю., Трофимов Д.Ю., Краснощока О.Е., Бурменская О.В., Калинина Е.А. Молекулярно-генетический профиль образцов фолликулярной жидкости, полученной при проведении программ ВРТ при селективном переносе одного эмбриона. // Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний: материалы XXIV Международного Конгресса с курсом эндоскопии. -Москва, 2011. - С.168-169.

46. Шубина Е.С., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Непша О.С., Роговская С.И., Сабдулаева Э.Х., Сухих Г.Т. Маркеры предраковых состояний шейки матки. // Труды

54-й научной конференции МФТИ «Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе». Молекулярная и биологическая физика. - Москва: МФТИ, 2011. - С. 34-35.

47. Эбзеева М.В., Калинина Е.А., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю. Экспрессия мРНК генов иммунной системы (цитокинов и HLA-G) в клетках фолликулярной жидкости. // Тезисы V Международного конгресса по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи». - Москва, 2011,-С.119-120.

48. Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Назарова Н.М., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Непша О.С., Екимов А.Н., Оламова О.А. Выявляемость генотипов ВПЧ при предраковой патологии шейки матки. // IV междисциплинарная научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия»- 17-18 марта, Москва, 2011. - С.69-70.

49. Smolnikova V.Yu., Trofimov D.Yu., Krasnoschoka O.E., Bourmenskaya O.V., Kalinina E.A. Diagnostic and predictive value of sperm mRNA profile. // Reproductive medicine and beyond: the best poster abstract and oral presentation on The 4,h International IVI Congress. - 7-9 April, Valencia, Spain, 2011. - P.28, P-13.

50. Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Назарова H.M., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Непша О.С., Екимов А.Н., Бадалова JI.A. Генотипирование ВПЧ у женщин с различными проявлениями ПВИ шейки матки. // Всероссийский конгресс «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы». - 22-25 мая, Москва, 2011.-С.318-319.

51. Smolnikova V.Yu., Trofimov D.Yu., Krasnoschoka O.E., Bourmenskaya О.V., Kalinina E.A. Prognostic impact of sperm mRNA profile. // The 14th World Congress on Human Reproduction. - 30 November - 3 December, Melbourne, Australia, 2011. -P.71.

52. Smolnikova V.Yu., Trofimov D.Yu., Bourmenskaya O.V., Krasnoschoka O.E., Kalinina E.A., Sukhikh G.T. Prognostic impact of the follicular fluid mRNA profiling. The Ovary, Gametes, Embryo and Endometrium: poster abstract. // The 1st Biomarker Meeting in Reproductive medicine: emergence of a new field. - 30-31 March, Valencia, Spain, 2012,- P.5.

53. Мельникова H.B., Боженко B.K., Ашрафян JI.A., Антонова И.Б., Алешикова О.И., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Кудинова Е.А, Хунова JI.3., Двинских Н.Ю. Оценка экспрессии мРНК гена р16 при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки. // Вестник РНЦРР. -2012. -№12.

54. Смольникова В.Ю., Краснощока О.Е., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В.,

Калинина Е.А., Сухих Г.Т. Спермальные мРНК как прогностические маркеры исхода программ ВРТ. // Материалы VI международного конгресса по репродуктивной медицине. Проблемы репродукции. - Москва, 2012. - С.48.

Список сокращений

БВ — бактериальный вагиноз

ВАК - Высшая аттестационная комиссия

ВВК — вульвовагинальный кандидоз

ВПГ - вирус простого герпеса

ГЭ - геном-эквивалент

ДИ (CI) - доверительный интервал (confidence interval)

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК — комплементарная ДНК

КОЕ — колониеобразующие единицы

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

ПЦОР (NPV)- прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value)

ПЦПР (PPV) - прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value)

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РНК — рибонуклеиновая кислота

РФ - Российская Федерация

ТУ - технические условия

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ХЭ - хронический эндометрит

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

cut off - порог отсечки положительного результата

IUSTI - International Union against Sexually Transmitted Infections (Европейский Международный союз по борьбе с инфекциями, передаваемыми половым путем) Me - медиана

NCBI - National Center for Biotechnology Information OR - odds ratio, отношение шансов (Olli) ROC - Receiver Operator Characteristic

SNP -single-nucleotide polymorphism, замены одиночных нукпеотидов

Подписано в печать 02.06.14

Объем 2,0 пл. Тираж: 100 экз. Заказ № 350 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Бурменская, Ольга Владимировна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

05201451387

Бурменская Ольга Владимировна

03.03.03 - иммунология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАН Сухих Геннадий Тихонович; доктор биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич

Москва-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ...........................................................11

1. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ ВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).......................................................21

1.1 КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЛИЗИСТОЙ ВЛАГАЛИЩА И ЭНДОМЕТРИЯ......................................................................................................21

1.1.1 Воспалительные заболевания слизистой влагалища: распространение, симптомы, этиология и факторы риска развития заболевания........................21

1.1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин репродуктивного возраста....................................................................................24

1.1.3 Хронический эндометрит: распространение, патогенез и факторы риска развития заболевания............................................................................................29

1.2 МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ ПОЛОВЫХ ПУТЕЙ ЖЕНЩИН .................................................................................................................................32

1.3 КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВУЛЬВОВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА.............................................................53

1.3.1 Диагностика воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы......................................................................53

1.3.2 Клинико-лабораторная диагностика хронического эндометрита...........60

1.4 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МАРКЕРОВ ЛОКАЛЬНЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ.................................................................62

1.4.1 Микроскопия мазков с подсчетом числа лейкоцитов..............................64

1.4.2 Метод лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител.....................................................................................65

1.4.3 Метод иммуноферментного анализа..........................................................66

1.4.4 Технология мультиплексного иммуноанализа для исследования цитокинового профиля генов иммунного ответа...............................................68

1.4.5 Методы иммуногистохимического исследования....................................69

1.4.6 Определение транскрипционных профилей генов...................................70

1.4.7 Полиморфизмы генов иммунной системы и современные методы их идентификации......................................................................................................72

1.4.8 Ассоциация полиморфизмов генов иммунной системы с предрасположенностью к развитию инфекционно-воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы.... 81 Резюме....................................................................................................................84

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................85

2.1 Материалы исследования...............................................................................85

2.2 Объем исследования.......................................................................................85

2.3 Методы исследования.....................................................................................88

2.3.1 Определение состава микрофлоры влагалища.........................................88

2.3.2 Определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа.... 90

2.3.3 Определение замен одиночных нуклеотидов............................................91

2.3.4 Дополнительные клинико-лабораторные методы....................................91

2.4 Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени.........92

2.5 Нормировка......................................................................................................92

2.6 Статистика.......................................................................................................93

2.7 Метод бинарной логистической регрессии..................................................94

2.8 ЕЮС-анализ......................................................................................................95

2.9 Характеристики диагностических тестов.....................................................95

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................97

3.1 Разработка систем для оценки профиля экспрессии мРНК генов иммунной системы................................................................................................97

3.1.1 Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб..........................97

3.1.2 Проверка праймеров и зондов...............................................................101

3.1.3 Выбор референсных генов и разработка алгоритмов нормировки, оптимальных для оценки уровней экспрессии мРНК генов человека в тканях эндометрия и влагалища.....................................................................................106

3.1.4 Апробация метода исследования транскрипционных профилей на

образцах тканей эндометрия двух стадий менструального цикла.................107

3.2 Прикладные аспекты идентификации молекулярно-генетических

маркеров с использованием ПЦР в реальном времени...................................113

3.2.1 Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей........113

3.2.1.1 Характеристика состава микробиоценоза влагалища небеременных женщин.................................................................................................................114

3.2.1.2 Характеристика состава микробиоценоза влагалища беременных женщин ...............................................................................................................116

3.2.1.3 Типирование и количественная оценка лактобактерий..................119

3.2.1.4 Транскрипционные профили генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища....................................................................123

3.2.1.5 Характеристика уровней представленности транскриптов генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища................123

3.2.1.6 Зависимость транскрипционных профилей от стадии менструального цикла.........................................................................................125

3.2.1.7 Сравнение транскрипционных профилей генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов у беременных и небеременных женщин.....126

3.2.1.8 Особенности экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов в норме, при вагините и БВ........................................127

3.2.1.9 Корреляция ЬаМоЪасИш \ners с уровенем экспрессии генов.........131

3.2.1.10 Разработка способа оценки локальной воспалительной реакции ............................................................................................................133

3.2.1.11 Преимущества использования индексов и интегральной оценки локального воспаления.......................................................................................136

3.2.1.12 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с клиническими данными.......................................139

3.2.1.13 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с методом подсчета числа лейкоцитов в мазке .... 143

3.2.2 Осложнения родов и послеродового периода у пациенток с вагинитами и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл........................144

3.2.3 Определение ассоциаций полимофизмов генов цитокинов с предрасположенностью к развитию вагинитов...............................................146

3.2.4 Хронический эндометрит......................................................................154

3.2.4.1 Идентификация микроорганизмов в полости матки...........................154

3.2.4.2 Локальный транскрипционный профиль при хроническом

эндометрите.........................................................................................................156

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................164

4.1. Молекулярно-генетические маркеры при вагинитах.............................164

4.1.1. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа в норме и его зависимость от фазы менструального цикла в тканях эндометрия...............164

4.1.2. Зависимость транскрипционных профилей генов иммунного ответа в клетках соскобов из влагалища от беременности............................................167

4.1.3. Доминирование в составе биоценозов влагалища лактобактерий -механизм защиты плода и новорожденного от условно-патогенных микроорганизмов.................................................................................................168

4.1.4. Ассоциация L. iners и L.gasseri с дисбиотическими и воспалительными процессами во влагалище...................................................................................170

4.1.5. Транскрипционные профили в клетках соскобов слизистой влагалища при вагинитах......................................................................................................173

4.1.6. TNF, TLR4, GATA3 и IL18 - маркеры объективной интегральной оценки локальной воспалительной реакции во влагалище............................180

4.1.7. Актуальность определения дисбиотических и воспалительных процессов во влагалище для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений..........................................................................................................183

4.1.8. Генетически обусловленная пониженная экспрессия TNF-a и TGF-ßl - фактор предрасположенности к развитию вагинитов..................................184

4.2. Молекулярно-генетические маркеры при хроническом эндометрите.........................................................................................................187

4.2.1. Особенности транскрипционного профиля генов иммунного ответа при фиброзе стромы эндометрия..............................................................................187

4.2.2. Роль инфекционных агентов в патогенезе хронического эндометрита.........................................................................................................189

4.2.3. Особенности транскрипционных профилей при полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации

стромы..................................................................................................................190

ВЫВОДЫ.............................................................................................................193

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................204

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген

АПК - антигенпрезентирующие клетки AT - антитело

БВ - бактериальный вагиноз

ВАК - Высшая аттестационная комиссия

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВВК - вульвовагинальный кандидоз

ВМС - внутриматочная спираль

ГЭ - геном-эквивалент

ДИ (CI) - доверительный интервал (confidence interval)

ДК - дендритные клетки

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИППП - инфекции, передаваемые половым путем

кДНК - комплементарная ДНК

КОЕ - колониеобразующие единицы

JIB - локальное воспаление

J1BP - локальная воспалительная реакция

JIPC (CLR) - лектиновые рецепторы С- типа (C-type lectin receptor)

МКА - моноклональные антитела

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

МФ - макрофаг

НВ - неспецифический вагинит НК - натуральные киллеры

HJIP (NLR) - нод-лайк рецепторы (nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor)

ОБМ - общая бактериальная масса

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция ПАМП (РАМР) - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular patterns)

ПРР (PRR) - паттерн-распознающие рецепторы (pathogen recognition receptors)

ПЦОР (NPV)- прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value)

ПЦПР (PPV) - прогностическая ценность положительного результата

(positive predictive value)

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РВВК - рецидивирующий вульвовагинальный кандидоз

РНК - рибонуклеиновая кислота

РФ - Российская Федерация

США - Соединенные Штаты Америки

ТУ - технические условия

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ХЭ - хронический эндометрит

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

CD - cluster of differentiation, дифференцировочные антигены

cut off- порог отсечки положительного результата

HLA - Human Leucocyte Antigens, группа антигенов гистосовместимости IgA - иммуноглобуллины класса А IgG - иммуноглобуллины класса G

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay, метод твердофазного иммуноферментного анализа

IUSTI - International Union against Sexually Transmitted Infections (Европейский Международный союз по борьбе с инфекциями, передаваемыми половым путем)

MHCI - major histocompatibility complex class I, главный комплекс гистосовместимости I класса

MHCII - major histocompatibility complex class И, главный комплекс гистосовместимости II класса Me - медиана

NCBI - National Center for Biotechnology Information OR - odds ratio, отношение шансов (ОШ) ROC - Receiver Operator Characteristic

SNP - single-nucleotide polymorphism, замены одиночных нуклеотидов WHO (ВОЗ) - World Health Organization (Всемирная организация здравоохранения) Маркеры

АСТВ - референсный ген Р-актин

В2М- референсный ген P-2-микроглобулин

CD45 (PTPRC) - ген кодирующий общий лейкоцитарный антиген

CD68 - ген, кодирующий трансмембранный белок CD68

CD69 - ген, кодирующий транмембранный белок CD69

ESR - ген эстрогенового рецептора

Foxp3 - ген, кодирующий транскрипционный фактор скурфин GAPDH-референсный ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа GATA3 - ген, кодирующий транскрипционный фактор GATA-связывающий протеин 3

GNLY- ген гранулизина

GUSB - референсный ген Р-глюкоронидаза

HPRT1 - референсный ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза IFNG - ген, кодирующий интерферон гамма (IFN-y) ILIA - ген интерлейкина 1 альфа (IL-la) IL1B - ген интерлейкина 1 бета (IL-113)

IL1RN- ген, кодирующий антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA) IL2 - ген интерлейкина 2 (IL-2)

IL2Ra - ген, кодирующий a-цепь рецептора интерлейкина 2 (IL-2Raj IL4 - ген интерлейкина 4 (IL-4)

IL6 - ген интерлейкина 6 (IL-6) IL8 - ген интерлейкина 8 (IL-8) ILIO - ген интерлейкина 10 (IL-10)

IL12A- ген, кодирующий субъединицу р35 интерлейкина 12 (IL-12) IL12B - ген, кодирующий субъединицу р40 IL-12 и IL-23 IL 15- ген интерлейкина 15 (IL-15) IL18- ген интерлейкина 18 (IL-18)

IL23- ген, кодирующий субъединицу pl 9 интерлейкина 23 (IL-23)

LIF- ген, кодирующий лейкемия-ингибирующий фактор (LIF)

PGR - ген прогестеронового рецептора

RORC - ген, кодирующий транскрипционный фактор RORC

ТВР - референсный ген ТАТА-связывающий протеин

ТВХ21 - ген, кодирующий транскрипционный фактор ТВХ21

TGFB1 - ген, кодирующий трансформирующий ростовой фактор бета 1

(TGF-ßl)

TLR2 - ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-2) TLR4- ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-4) TLR9 - ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-9) TNF - ген фактора некроза опухоли альфа (TNF-a)

VEGFA - ген, кодирующий сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-A)

18SrRNA - референсный ген 18S рибосомальной РНК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Открытие и внедрение в практику в конце 80 годов метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) внесло огромный вклад в развитие современной биологии и медицины. В течение следующих 20 лет были разработаны способы флуоресцентной детекции результатов амплификации. Помимо этого модификация и совершенствование методики шло по пути автоматизации процесса, уменьшения объема реакционных смесей и возможности амплификации в одной пробирке нескольких фрагментов ДНК (мультиплексирование), что способствовало широкому внедрению данного метода в рутинную практику.

В настоящее время метод ПЦР широко используется для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач, включающих в себя определение генетических заболеваний, вариантов полиморфизма генов, функциональной активности генома, а также изучение воздействия на организм человека биотических факторов окружающей среды (бактерий, грибов, вирусов). Следует отметить, что каждая из выше перечисленных задач может решаться как самостоятельно, так и в составе комплексного исследования. В данной работе комплексный подход предложен для решения фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на примере исследования воспалительных процессов, сопровождающих заболевания органов женской репродуктивной системы.

Воспалительные заболевания органов женской репродуктивной

системы занимают лидирующие позиции в акушерско-гинекологической

практике. Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей

(вульвиты, вагиниты) являются одной из наиболее распространенных причин

обращения женщин к врачу акушеру-гинекологу [142]. От неспецифического

вагинита (НВ) страдает почти каждая пятая пациентка гинекологической

практики (19,2%), а среди пациенток с патологическими белями частота его

выявления возрастает в 4 раза [4]. Известно, что в основе репродуктивных

неудач (трубно-перитонеальный фактор бесплодия, самопроизвольные выкидыши), акушерских осложнений родов и послеродового периода, таких как преждевременное излитие околоплодных вод, внутриутробное и интранатальное инфицирование плода и новорожденного, мертворождение, хориоамнионит в родах, послеродовые гнойно-септические осложнения, также лежат те или иные воспалительные заболевания половых органов [21].

Воспаление чаще всего вызвано действием патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, идентификация которых чрезвычайно важна при выборе терапии. Однако в значительной степени развитие инфекционного процесса определяется состоянием локального (мукозального) иммунитета и зависит от иммунологической реактивности макроорганизма. В патогенезе заболевания микробный фактор играет такую же роль, как и состояние макроорганизма, и те обстоятельства, которые изменяют его иммунобиологические свойства [48]. Поэтому изучение мукозального иммунитета представляет чрезвычайный интерес. В то же время, спектр методов исследования мукозального иммунитета остается весьма ограниченным из-за малого количества материала и наличия слизи в образцах. В ходе исследования возникают вопросы, связанные с нормировкой материала, способов его взятия и транспортировки. Вследствие этого существующие знания об изменении при вагинитах разли�

Информация о работе

Бурменская, Ольга Владимировна
доктора биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.03.03

Диссертация

Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы