Физиологически активные экзометаболиты дрожжей CANDIDA UTILIS ВСБ-651 и бактерий CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 95

Подобрянский, Олег Семенович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиологически активные экзометаболиты дрожжей CANDIDA UTILIS ВСБ-651 и бактерий CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 95
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Физиологически активные экзометаболиты дрожжей CANDIDA UTILIS ВСБ-651 и бактерий CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 95"

С'

, Л

Научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии

т—1 1 I 1 1 III I I

На правах рукописи

ПОДОБРЯНСКИЙ ОЛЕГ СЕМЕНОВИЧ

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ЗКЗОМЕТАБОШЫ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA UTIL1S ВСБ-651 И БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 95

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мрскра — 1993

"Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д. И. Менделеева.

Научные руководители: доктор химических наук профессор М. Н. Манаков; кандидат технических наук, доцент А. Е. Кузнецов.

К.'.' •

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г. И. Эль-Регистан; кандидат биологических наук Е. П. Исакова.

Ведущая организация: ^ШИИГенетика.

Защита состоится с^ 1994 г.

в УО часов на заседании специализированного совета Д 098.09.01 в Научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии по адресу: 125299 г. Москва, улица Клары Цеткин, 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан ^ г.

Ученый секретарь циализированного кандидат биологических наук

специализированного совета <

И. И. ГУСЕВА

Актуальность работы. Значительный прогресс в понимании основ биологических процессов достигнут в последнее время в области изучения механизмов взаимодействия меток. Эти успехи во многом связаны с обнаружением, выделением в индивидуальном состоянии, научением химической природы и роли в процессах жизнедеятельности многочисленных специфических веществ, активно участвующих в таких взаимодействиях. Вещества этого типа обычно объединяют термином ауторегуляторы.

Следует отметить, что ауторегуляторы микроорганизмов изучены сравнительно слабо. Вместе с тем разработка теории культивирования, в т. ч. для промышленного производства, нуждается в выявлении закономерностей эндогенных механизмов регуляции жизнедеятельности микробных культур. Интенсивно разрабатываемые традиционные технологические приемы культивирования, контроля и управления жизнедеятельностью микроорганизмов- продуцентов такие, как изменения рН, температуры, концентрации компонентов питания и т. д. , не выявляют полностью потенциальные возможности культур. Реализацией этих возможностей монет быть использование в процессе управления культивированием знаний о закономерностях образования и роли экзометаболитов-ауторегуляторов.

Наличие в культуральной жидкости аутометаболитов с различными свойствами - активаторов и ингибиторов биосинтеза целевого продукта -позволяет поставить вопрос о селективном изменении их в среде культивирования в благоприятную для биосинтеза сторону. Такой подход может послужить основой для дальнейшего развития методов управляемого культивирования микроорганизмов.

Целью данной работы являлось: поиск физиологически активных эк-эометаболитов промышленных микроорганизмоь дрожжей Candida utilis ВСБ-661 и бактерий Corynebactenum glutumicum 9Ь, изучение их химической природы и влияния на рост и биосинтетическую активность культуры, разработка путей использования физиологически активных экзоме-таболитов для интенсификации биосинтеза.

В задачи работы входило:

1. Исследование экааметаболитов дрожжей С. utilis и бактерий С.glutamioum для обнаружения веществ, стимулирующих биосинтез целевого продукта и выявление их ауторегуляторной роли.

2. Исследование влияния, оказываемого ауторегуляторами на рост и биосинтетическую активность культуры микроорганизмов при различных условиях культивирования.

3. Выделение и очистка физиологически активных йкоометаболик н дролле й й бактерий и исследование их химической природы.

4. Исследование влияния физиологически активных экаометаболитов на

метаболизм микроорганизмов. Б. Поиск путей практического использования экаометаболитов для улучшения показателей ферментационного процесса.

Научная новизна: Обнаружено, что в процессе роста дрожжей С.иЫНз и бактерий С. е1иЬа1Моит синтезируются и выделяются -в среду метаболиты, оказывающие стимулирующее действие на рост соответствующих куль-тур(8-12%) и накопление лизина у С. д1иЬал11оит( 10-15%). Максимальная продуктивность аутостимуляторов у дрожжей сопряжена с экспоненциальной фазой роста культуры.

Впервые показано, что аутостимуляторы дрожжей и бактерий по своей химической природе представляют собой гликопротеины. Установлено, что активное начало стимуляторов дрожжей и бактерий локализовано в ^двух фракциях о ИМ. для С. иЬШэ 9 и 39 кДа, а для С. д1иЬат1сит с 14 и 4Б кДа.

Показано, что стимулирующий эффект экаометаболитов зависит от концентрации вносимых ауторегуляторов, условий культивирования, состава среды роста и количества вносимого инокулята. Эффект стимулирования роста и синтетической активности дрожжей и бактерий выражается в: а) сокращении лаг-фазы, б) увеличении экономических коэффициентов, в) увеличении выхода целевого продукта.

Установлен аминокислотный и углеводный состав аутостимуляторов, их биологическая и гемагглютинирующая активность.

Выдвинуто предположение, что стимуляция роста дрожжей под влиянием внеклеточных гликопротеинов опосредуется через аденилатциклоэную систему.

Практическая ценность: Предложен возврат фракции культуральнэй жидкости, содержащей стимуляторы биосинтеза .-:!.";:на, на стад:;» феруен-тации в производстве кристаллического лизина. ; г.эпмотрены ^сзмз.пше технологические решения, обеспечивавшие увеличо:!;ш выхода лизина.

Рассматривается возможность для разработки технологического приема культивирования дрожжей, предусматривающего использование малых объемов инокулята с внесением ростсти.чулирующих ауторегуляторов.

Объем и структура диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов. Работа изложена на^_ страницах машинописного текста и иллюетрирова-на ^рисунками и^таблицами. Библиография включает 240 названий работ, из них 178 на иностранных языках.

- Б -

ЗПСПКРИКИГГЛЛЬНАЯ ЧАСТЬ !£ггеркалы н истоды

В работе использовались дрожжи штамм Candida utilis ВСБ-6Б1 и бактерии штамм Corynebaoterium glutamicum 95. Дрожжи С. utilis являются удобный объектом для исследования, так как они достаточно хорошо изучены, как с позиций биохимии и физиологии, так и в технологическом плане. Однако, роль специфических регуляторных экзометаболитов их жизнедеятельности не исследована. Другим изучаемым объектом был промышленный штамм лизинсинтезируюшдх бактерий Corynebaoterium glutamicum. При изучении лизинсинтезирующего микроорганизма Brevibacterium sp. 22Л было обнаружено( Кузнецов, 1988), что фракция метаболитов ЮК с молекулярной массой Б-100 kD стимулирует синтез лизина. Однако данный штамм уже не используется. Поэтому, изучение ауто-регуляторов бактерий С. glutamicum может иметь как научное, так и практическое применение.

Выращивание дрожжей Candida utilis ВСБ-6Б1 (любезно предоставленного из коллекции ВНИИсинтеэбелок) проводили на среде следующего состава, г/л: (НН4)2НР04 - 10; КН2Р04 - 6,8; NaH2P04 - 3,7; MgS04*7H20 - 0,7. Субстратом служили этанол или сахароза в количестве 10 г/л. Температура культивирования 33+loC, рН 4,5+0,2.

В качестве продуцентов лизина использовали штамм Corynebaoterium glutamicum-ЭБ (любезно предоставленный ВНЖГенетика). Среда для ино-кулята,%: меласса (48 РВ) - 3; кукурузный экстракт - 10; NaCl - 0,4; подтитровка NaDH (2н) до рН 7,8-8,0.

Среда для основного культивирования,%: меласса 20-2Б (РВ 10%); гидроливат БВК - Б (200г БВК в 1л H2S04 (4н) в течение 60 мин прогид-ролиэовакно при 12БоС); (NH4)2S04 - 2; К2НР04 - 0,16; MgS04*7H2Q -0,05; подтитровка NH40H (2н) до рН 7,2-7.6; посевной материал 3-Б. Температура культивирования 30-ЫоС. '

Выделение и очистку физиологически активных экэометаболитов проводили по схеме, приведенной на рис.1, с использованием техники ультрафильтрации с применением мембранн УПМ-450 и УАМ-100. Степень отмывки этих фракций от ниэкомолекулярных компонентов составляла 98-99%, Отмывку фракций от ниэкомолекулярных веществ проводили диа-фильтрацией. Гельфильтрацию проводили на сефадексе G-БО с использованием прибора IJNIC0RD 111 на колонке 8x500 мм для аналитических целей и 8x200 мм при препаративном разделении. 0 Электрофорез выполняли в 11,6% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия но

Лэмли( Laemml i, 1970).

О количестве биомассы судили по величине оптической плотности, измеренной на фотоэлектроколориметре КФК-2 в кюветах толщиной Б мм приД=Б40 нм или по весу абсолютно сухих клеток. Содержание этанола определяли с помощью гаэожидкостного хроматографа "CHROM-Б" (ЧСФР); углеводов - по модифицированному методу Бертрана (Практикум, 1989); фенол - серным (Землянухин, 1985) и антроновым методами (Практикум, 1989); белок - методом Лоури (Lowry, 19Б1) или калориметрическим методом Вольфа (Wolf, 1983); нуклеиновые кислоты - по Спирину (Практикум, 1989). Лизин и другие аминокислоты определяли методом тонкослойной хроматографии. Определение содержания внутриклеточных липидов проводили по методу Блайя и Дайера (Кейте,197Б).

Для определения нейтральных моносахаридов отмытые после гель> фильтрации вещества лиофильно высушивали и гидролиэовали 6 часов в Схема фракционирования культуралыюй жидкости рис. 1

Культивирование | микроорганизмов |

| КМ

Л_

-1

Центрифугирование |-биомасса( в трап)

-1-

| нативный раствор

-1

Ультрафильтрация |-— концентрат (ВМФ)

УПМ-450 I с М. М.>БОкД _1

I пермеат J-,

Ультрафильтрация |—:-Н Упаривание

УАМ-100 |пермеат с М. М.^5кД'-1—

----J t

концентрат с М. М.-СкД-БОкД (СМФ) НМФ -1

Гель филь трация

1-!

высокомолекулярный ниэкомолекулярный

препарат( ВП) препарат( НП)

1h HCl при t-100oC. Определение выполняли на анализаторе "BIOTRONIK LC-2000" (ФРГ), колонка 3,8x126 мм с анионитом Dionex Ах8-11 в 0,4 M Na-боратном буфере рН-0,0 при t-6ОоС. Детекция при Б70 ни после реакции с 2'2-бицинхонинатом меди. Для определения аминокислотного состава и аминосахаров отмытые и лиофилиэированные вещества гидролизовали при t-110oC 22ч в 6и HCl, а для определения аминосахаров при t-100oC 6ч в 2н HCl. Оба аналиаа выполняли на приборе "BIOTRONIK AMINO ACID ANALYZER LC-БООО" (ФРГ) на колонке 4x200 со смолой ETC 2710.

Гемагглютинирующую активность определяли в отношении свежеприготовленных эритроцитов крови человека (А(П) + группа) на агрегометре "THR0MLITE-1006" (Россия) при длине волны 660 нм, термостатировании при 37оС В цилиндрической стеклянной кювете объемом О,25 мл при постоянном перемешивании 2000 об/мин.

Результаты в проводимых экспериментах учитывали не менее, чем ив трех повторных опытов с тремя вариантами в казкдом. Достоверность определяли по среднему квадратичному откланению.

Ояслпгэ различив фракцкЯ кульгуральной гзадкостм zpoxzssü С. utilia ка рост культуры.

На первом этапе работы нами было исследовано влияние, фракций КЛ С. utilis, полученных методом мембранного разделения, на скорость роста культуры. В качестве изучаемых параметров были выбраны величина лаг-фазы, скорость роста и уровень накопления биомассы. За один условный объем было принято такое количество биологически активной фракции, которое было выделено ив эквивалентного объема КЖ. Например, на 1л исходной среды вносили количество фракции, полученное с 1л КН.

В таблице 1 представлены данные окспериме itob с внесением в среду культивирования дрслжй С. utilis различных экзометаболитов. Как видно из этих данных, высокомолекулярная фракция (ВМЙ не оказывала существенного влияния на уровень накопления биомассы и величину лаг-дозы. Внесение низкомолекулярной фракцией (1Ш) в питательную сроду ■ для ферментации угнетало рост культуры, что соответствует общепризнанному представлению о том, что ингибиторы роста культуры имеют ниакомолекулярную природу . Наиболее ярко выраженный стимулирующий эффект на рост дрожжей оказывало внесение ореднемолекурярной фракции (СМФ). Эффект стимуляции выразкался в увеличении экономического коэффициента трансформации субстрата в биомассу и сокращении лаг-фазы, но скорость роста практически не изменялась. <JIpn внесении акаометаболи-тов СШ экономический коэффициент был близок к максимальнрму эначению

для данной культуры (0,63-0,55). В дальнейших экспериментах использовались Только СМФ. СФМ дополнительно очищалось от низкомолекулярных веществ диафильтрацией на мембране УАМ-100 (степень очистки 100 раз по объему).

Влияние различных фракций кульгуралыгой Таблица 1

жидкости дрожжей С. иЬ 111 з на рост культуры дрожжей.

I Контроль 1 | 60 4,7±0,1 |

| ВМФ | 60 4,8+0,1 |

| СМФ | 40 Е,3±.0,1 |

| НМФ | 150 I 3,2±0,2 | |

На рисунках 2 и 3 представлены данные по динамике накопления биомассы при внесении СМФ в исходную питательную среду. Существенный эффект наблюдался только при внесении СМФ, не подвергнутой автоклави-рованию, что позволяет сделать предположение о термолабильности веществ, содержащихся в СМФ (>ис. 2). Кроме того, наибольшая разница в росте, при сравнении контрольного и опытного вариантов, наблюдается при отмывке клеток инокулята от среды роста. Это свидетельствует в пользу того, . что существенное значение в картине роста имеют экэоме-таболиты, вносимые с инокулятом в среду культивирования. Поэтому во всех дальнейших экспериментах по исследованию влияния фракций на рост дрожжей инокулят отмывали от метаболитов питательной средой. Эффект стимулирования относительно контроля усиливается с увеличением количества вносимой фракции ( рис.3 ) и уменьшением дозы посевного материала.

Таким образом эти данные подтверждают предположение, что внесение веществ приводит к сокращению лаг-фазы роста. В экспоненциальной фаве развития разница в удельной скорости роста незначительна (рис.2 и 3). Можно предположить , что присугствие изучаемых экзометаболитов важно для развития культуры в начальной фазе роста. Для проверки этого предположения были проведены опыты в ферментере с микрофильтрационным модулем. Известно, что отвод экзометаболитов через микрофильтрационную мембрану приводит к удлинению лаг-фаэы (Комарова и др.,198Б) . Ее продолжительность увеличивается с ростом скорости от-

рис. 2 Динаишса накопления Йиоиассы дроаикей С.иННэ при внесении 1,5 объемов СФ в исходную среду

рис.3 Динаиика накопления биомассы дрожжей С.и(Шз при добавлении различного количества СМФ

1-контроль 2-0,5объеыа СМФ 3-1,боб. СМФ 4-3,Ооб. СМФ

вода фильтрата ив ферментера. Культивирование с отводом фильтрата че-. рев микрофильтрационную мембрану и высокой скоростью разбавления среды в ферментере испольвовали для определения влияния экзометаболитов на рост культуры при выращивании дрожжей на Сахарове и этаноле. В контрольных вариантах на вход ферментера подавали исходную питательную среду. В других вариантах в питательную среду добавляли среднюю фракцию в количестве 1,6 стандратных объема. Углеродный субстрат для получения посевного материала и используемый в реакторе был один и тот же. Полученные данные представлены на рис. 4 и 6. Видно, что при культивировании С. utilis на сахарозе эффект положительного влияния на рост дрожжей более ярко выражен при внесении фракции, полученной иэ КЖ дрожжей, выращенных на сахарозе. В экспериментах с выращиванием дрожжей в мембранном реакторе на этаноле положительный эффект также наиболее значителен, когда субстрат для ку.гг.тивирования дрожжей и для пс1учения фракции один и тот же.

Параллельно с экспериментами в мембранном биореакторе в этой серии исследований проводили эксперименты в колбах на к*.чалке. При выращивании в колбах определяли динамику накопления биомассы и потребления субстрата. Ci >рость роста и выход биомассы с » ицн субстрата при этом возрастают (по срапнснию с контролем), когда для получения целевой фракции испольэуют тот же субстрат, что и для культивирования дрожжей(1-ис. Ь).

Таким образом, можно сделать вывод, что фракция КЖ дрожжей С.'itilis, с •. молекулярной массой 5-БО кД, содержит ауторегулягорные факторы, которое при внесении ее с инокулятом ус коря "/г адаптации: дрожжей к новым условиям, что выражается в сокращении лаг-фазы и увеличении экономического коэффициента усвоения субстрата на 10-12%.

Влияние CSiti фракции 1Ш -i>ta И1 гпродуцируктгих бактерий на их ли зинсюггеаирукдую активность при различны.' условиях культивирования.

Аналогичные вышеописанным эксперименты были проведены с продуцентом лиаина Corynebacterium glutamicum 95. при выращивании его н*. среде с мелассой в колбах на качалке. На рисунке 7 представлены еа-виоимости изменения выхода- биомассы и лизина бактерий С. glutamicum ог внесения различного количества СМФ КЖ продуцентов С. glutamicum i Brevibaoterium sp.i!2L. Даже при небольших количествах вносимой СМ< С. glutamicum уровень накопления лизина выш? контрольного на 10-15% Уровень накопления биомассы также превышает контрольный. В опытах внесением СМФ, полученной при культивировании продуцент

рис. 4Динамика накопления биомассы С.иШ!.'

п мембранном Йиореакторл пог роете на этаноля

0 12 3 4 3 5

1-контрол* 2-со СФ, полученной при виращипаиии дрожжей на сахарозе 3-со СФ, полученной при выращивании на этаноле

рис. 5 Динаиика накопления биомассы С.иШЬ

в иеибраннои бкореакторе при росте на сахароза

рис 6 Динамика потребления субстрата и накопления

биомассы С.и*111з на колбах. , „ ,

(субстрат-этанол)

0.3

-0.5

0 2 4 в 8 (0 12 <4

1,2,3-виоиасса 4,5,6-суботрат 1,4-контрот 2.5-оо СФ, полученной на сахароав 3,в-со СФ, полученной наэтаяоле

рис.7 Накопление биомассы и лизина с зависимости от количества вносимой СФ

биомасса

120

115

110

105

100

С опыт Сконт.

/' / / / 2

- / ! /С / // ч.

+ ■ V , стан. ед. > 1

0 0.5 1 1.5 2 2.5

1.3-влияние СФ, иэ КЖС. д1и1ат1сит-95. на культуру С.д1и1огг.1сит-95

2.4-влияние СФ, иэ КЖ 8г«у1Ьос(вг1ит 22Ц на культуру С.д1и»от1сит-95

Srevibaoterium sp. 22L, в питательную среду продуцента U. glutamicum 96 юличественная, зависимость доза -эффект аналогична ранее полученной зависимости (Кузнецов,1968)при выращивании продуцента Previbacterium зр. 22L (рис.7). Интересно отметить, что характер зависимости эффекта эт количества вносимой фракции определяется в первую очередь, какой фодуцент был взят для получения СШ>, а не свойствами продуцента на готорый действуют вещества данной фракции.

При добавлении 'ВМФ во всех вариантах опытов концентрации биомассы практически не изменялась, а лизина - уменьшалась на 10-20%. 1ри внесении НМФ наблюдалось значительное снижение уровня биомассы, а 1И8ИН практически не синтезировался.

Было изучено влияние факторов, содержащихся во фракции с М. М. >-Б0 KD, на биосинтетическую активность С. glutamioum при культивиро-)ании бактерий в режиме хемостата. Хемостатное культивирование являйся удобной моделью для изучения кинетических характеристик роста сультуры. Вначале был осуществлен подбор режима непрерывного культи-шрования, обеспечивающего приемлемую биосинтетическую активность сультуры. Устойчивый стационарный процесс роста культуры и биосинтеза шзина в течение более 90 часов удалось получить при Д-0,03-0,05 ч-1. [альнейшие исследования проводились в этом режиме.

В ходе дальнейших экспериментов культивирование начинали с контрольной средой (без СМФ) или с опытной средой (с СМФ). После достиже-1ия стационарного состояния и его поддержания в течение 2-3 суток, роводили смену подаваемой среды с контрольной на опытную или наобо-Культивирование бактерий 0. glutamioum в хемостате Таблица 2

трация |трация трация води- ребле- 1дук- | коэфф. | коэфф. 1

| г/л |сы,г/л Сахаров но^ть |суб- |ность, I зину ¡массе |

1 г/л по ли- |стра- |по би- 1

1 зину, |та, |омассе 1

1 1 Г/ЛАЧ |г/л*ч |г/л*ч 1

Без 1 1 1 1

добавок 1 12,0 116,3 28 0,42 12,52 10,54 | 0,17 1 0,22 |

СМФ 1,6 1 13,0 117,4 67 0,46 |1,16 )0,61 | 0,39 | 0,62 |

| 1 | 1 1-о— 1 I 1. .1

Концентрация РВ п исходной среде 100 г/л

рот. Цри этом не наблюдалооь существенного изменения концентрации лизина П биомассы , но субстрат при подаче среды с начинал расходоваться намного экономичнее. Это приводило к значительному увеличению, более чем в 2 раза, экономического коэффициента выхода биомассы и ли-вина с единицы субстрата (табл.2).

.Таким образом установлено, что фракция ЮК бактерий С. glutamlcun о M. М. 6-БОкДа содержит ауторегуляторы, которые при внесении ее вместе с инокулятом увеличивали выход лизина и биомассы на 10-16% npi-периодических условиях культивирования, а при хемостатном культивировании экономические коэффициенты превращения субстрата в биомассу i лиэин увеличиваются более чем в 2 раза.

Выделение и очистка экэометаболнтов м изучение их химического строения.

Для выяснения химической природы активного начала ауторегуляторо1 дрожжей был проведен химический анализ всех фракций, полученных методом ультрафильтрационного разделения. В таблице 3 представлены результаты анализа фракций, полученных при росте С.utilis на этаноле. Средняя фракция состоит, в основном, из веществ протеиновой и углеводной природы. Она практически не содержит нуклеиновых кислот. Боль тая часть их остается в высокомолекулярной фракции (с М.М. вещест больше 60 кДа). При химическом анализе препаратов, полученных пр оиистке СМФ по схеме на рис.1, обнаружено, что соотношение - редуци рующие вещества: белок в полученных препарате« не зависит от субстра та, на котором выращена культура дрожжей (табл.4).

Состав фракций КЛ дрожжей С. utilis табл.3

V ......... ----------- ,-7 В Аналиэизуемые | Белок Редуцирующие ... — Нуклеиновые АСВ il 1

8 вещества | вещества Кисдотн !|

S Иссле | мг/л мг/л мг/л мг/л »

В дуемые | и il

В фракции | 1 1 II

1 1 ЦНативный р-р КЖ | 200±20 22-1+20 27i3 ' 510+32 8

|ВШ> Ы.Ы. БОкД ! 110±15 120±5 - 15*3 306+38 II

|Clffi БкД М. Ы. Б0кД| Б, 4*1,0 22t4 0,5+0,1 27±4 1

|НШ> ЫМ- БкД | 50il0 70±11 6+1 1Б0+19 1

I ВП Ы. М.-37КД | 4,0±0,Б 21 ¿4 следы - II

В НП М.М.-9КД | в.................... ...____1 0,7±0,2 0,6i0,2 ....... ........ следы - II и

• - 1Б -

Гельфильтрацией удалось разделить дрожжевую СМФ на два препарата. Для веществ, выделенных из КЯ С. utilis при выращивании как на этаноле, так и на Сахарове, данные гельфильтрации схожи: обнаружен высокомолекулярный препарат( ВП) с liH около 39 «Да и низко молекулярный препарат (НП) с M. M. около 9 кДа (рис.8). Совпадение гельфиль-рра-ционных профилей по редуцирующим веществам и белку на рисунке 8 позволяет предположить, что пики с одинаковой M. М. принадлежат одному веществу или нескольким близким по строению и ЕМ. веществам. Предположение, что СЫФ состоит из двух препаратов, было подтверждено результатами, полученными при проведении гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия.

Химический состав компонентов на разных стадиях табл. 4 очистки с 1л КМ С. utilis

в-;-1-—-7-»

I Стадия | субстрат в

1 очистки |-1--;-1

9 | \% этанол . | 5% сахароза И

5-н--:-,-ц-(-^-5

| | мг | мг | % / % | мг | мг | X / % Ц

\-1-1-1-1—:—|-(-1

I СЫФ 122,1+4,015,4*1,0180,3/19,7178,2±6,2119,9*1,1 . 179,7/20,3 5 {Концентрат | | | • | | / | Ц ВДля гель- |21,6+4,014,9+1,0)81,4/18,6|62,7+4,9| 18,8*1,0|76,9/23,1 Ц {фильтрации | | | | I ' I II 5 трации .11 | I 1/1 II [ НП | 0,7+0,110,6*0,1¡53,8/46,2|16,-2*1,2| 12,3+0,9156,8/43,2 | 1 ВП |20,9+4,0|4,0+0,Б|83,9/16,1|44,2+2,1| 6,6±0,8187,2/12,8 | в-1-1_1_:_i_i_i_ii

Данные сравнительного анализа препаратов дрожмей, полученных ме-

тодом гельфильтрации, представленны в табл. 5 и 6. Основными составляющими углеводной части у веществ, выделенных из ЮН дрожжей, оказались манноза и глюкоза. При изучении биологической активности каждого препарата оценивали ростстимулирующий эффект. Результаты представлены в таблице 7. У дрожжей максимальный эффект , учитываемый по увеличении конечной концентрации биомассы (а у бактерий н по концентрации лизн-на) наблюдался при внесении в среду культивирования ЬП или смеси ВП и НИ з количествах, соответствующих оптимальней! концентрации вносимой в

рис.8 Геш.фильтрация СМФ дрожжей С.иШ18

0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01

О, опт.ед.

субстрат—этанол 1 %

С,мг/л

39кй • 9кР X

\УД V 1

^ч2

• 1 1 1 У.мл

во

субстрат—сахароза 5 % „ , • Р, опт.ед у 1___С, ыг/л

0.25

0.15

0.05

о 5 10 15 20 25 30

1-белок, в опт.ед. 2--РВ, в мг/л

среду неочищенной СМФ. При инкубации на среде с этанолом в течение 24 часов он составлял соответственно 11,4% и 16,3% прироста ЛОВ по сравнению с контрольным опытом. Однако максимальная удельная активность (рассчитанная как отношение стимулирующего эффекта к концентрации вносимых препаратов) и степень очистки по биологической активности (эа единицу степени очистки в каждой серии экспериментов принята степень очистки по биологической активности средней фракции) Наблюдалась при внесении НИ. Величина удельной активности позволяет также оценить степень очистки препаратов. Относительная активность при внесении НП возросла 'в 15 раз по сравнению с внесением неочищенной СМФ.

Аминокислотный анализ препаратов табл.Б

г 1- -т" . ... ,

I 1 я 1 с. ut.il ¡3 1 с. 1 д1иЬаписит |

I НП 1 I ВП 1 | НП 1 II 1 ВГ1 |

II I мол% | молХ | молЖ | мол% 1

ii с 1 1 1 1

И 1 1 1

И ЛИЗ 1 3,2 1 4,0 1 4,8 1 4,9 I

I гис 1 2,1 1 7,6 1 7,6 1 6,4 |

5 АРГ 1 9,6 1 10,8 1 12,3 1 5,5 |

8 ДСП 1 9,6 1 9,7 1 И.6 1 12,3 |

В ТРЕ 1 13,6 1 7 1 8,7 1 9,9 |

I СЕР 1 13,3 1 1Б, 6 1 8,0 1 И.2 |

1 ГЛУ 1 16,4 1 6,1 1 12,1 1 ю.з |

1 ПРО 1 1,7 | | 1 1

1 гли 1 8,9 1 13,4 1 10,6 1 14.6 |

И АЛА 1 ^.l 1 11.3 1 13,6 1 17,1 |

1 1/2 ЦИС | - | 1 " 1

I ВАЛ 1 2,8 1 1.8 1 4.2 1 3,6 |

1 МЕТ | - 1 1.5 | 1 - 1

II ИЛЕ 1 2,8 1 3,6 1 1.5 1 1,7 1

II ЛЕЯ 1 4,2 1 5,1 1 4,6 1 2,6 |

« II ТИР ФЕН 1 2,7 1 1 1 - !

п.. 1 ______ | ' «

•Для бактерий С. е1иЬаписит были Проведены аналогичные исследования. Гельфильтрацией удалось также разделить зкзаметаболиты СМФ бак- ' терий на дин препарата, содержащих белок и углеводы и соответствующих М. М. - 45 кДа(ВП) и М.М. -14 кДа(1Ш)(рис. 9)! Был также проведен

рис.9 Гельфильтрацкя СМФ Cor.glutamlcum

рис.10 Секреция ауторегуляторов СМФ дроаккей

3-прирост kcii'.ieiii |'о!;ии зкзииераболитов СО п единицу vpeueiui

электрофорез этих препараратов, их аминокислотный табл. Б), углеводный аналиэы( табл. 6) и исследована их биологическая активность (табл. 0). У Содержание нейтральных Сахаров в препаратах табл. 6

I-

| рта

1 Мал

| (За1

1 Ху1

5 61с

С.

иЪШв -

вп молХ

следы ЗБ, 4 следы следы 64,3

НП мол%

следы 19,4 следы следы 80,4

С. (^ииго'оит

ВП молХ

НП мол*

следы 14,3 9,7 не обнар. 76,9

1,7

34.3 7,6

не обнар.

56.4

_1_

Эффект, удельная активность и степень очистки по биоактивности препаратов СМФ КЖ дрожжей С. иЫ112

~г

АСВкон.

! г/л

1-г

концетра-ция препа рата мг/л

Эффект |Удельная |актив-7. |ность |%/мг/л

-!-

10,513,2| 0,30 7,3+4,8 | 4,39 11,414,8| 1,46 16,3+4,8| 1,72

табл. 7

Степень К очистки |

3 I

-1

Контроль!6,15+0,20

СМ1> НП ВП

нп+вн

16.840.2

16.610.3 16,85+0,30 \У,1Б±0,30

3511 1,71.0,3 7,8+0,3 9,610,3

- 8

1,00 Ц

14,63 я

4,87 3

6,72 . 5

1;1и1а1Л1сит увеличение конечной концентрация лизина при инкубации 'в з суток наблюдалось при внесении всех видов добавок. Активность оказалось максимальной по лизину при внесении ВП.

ЕП из ИД С. иНЬз и НП из КЖ С. с»1иЬатсит проявляли гемагглютини-руюшую активность в отношении эритроцитов человека А(11) + группа крови.

Таким образом, химческий анализ, описанный в этой главе и, в чпс.ности наличие в каждом препарате аминокислот, аминосахзров и углеводов, позволяет сделать вывод, что экэо(летаболиты, содержащиеся в дрожжей и бактерий, являются гликопротеинами.

Эффект, удельная активность по лизину и степень очистки Таблица<5 по биоактивности препаратов СМФ КЖ бактерий С. д1и1аш1сиш __

| Эффект | Эффект |Концентра

|. по лизину | по б/м |ция препа

| X | % |рата

| | | мг/л

| СМФ | 22,3±6,9 | 0*3,2 [71,812,0

I НП | 20,6±.4,2 |33,1±3,Б |31,3±2,0

| ВП | 29,7±4,Б |27,213,6 |19,Б+2,0

| НП+ВП | £2,9±3,7 |-Б,0М,1 |Б0,8±2,0

Удельная активность по лизину %/мг/л

Степень | очистки || по лизину!

-1

1,00 2,00 4,90 1,4Б

Секреция экзометаболитов СМФ дрожками и некоторые особенности их действия на клетку .

Для изучения вакономерностей выделения изучаемых зкзометаболитов , дрожжи выращивали на среде с С-зтанолом(1,2) в качестве источника углерода и энергии. Это позволяет получать равномерно меченые биологически активные экэометаболиты и дает возможность определять их концентрацию в среде культивирования. Результаты представленые на рисунке 10, наглядно свидетельствуют, что максимальная скорость накопления искомых веществ наблюдается в экспоненциальной фазе роста (кривая 3), а их уровень в культуре коррелирует с концентрацией биомассы (кривые 2 и 1). Это может свидетельствовать в пользу того, что данные соединения накапливаются в среде роста в процессе деления клеток.

Иэвестно(Кульберг,1987), что значительное осмоти'гское давление " (16-18 атм) в дрожжевых клетках обуславливает попадание в среду куль-■ тивирования фрагментор клеточной оболочки в процессе роста кдето.: и отделения дочерних почек. Выло предположено, что изучаемые вещества СМФ являются фрагментами-клеточных стенок. Для проверки этого предположения дрожжи выращивали в стандартных условиях, а в опытных вариантах в 'Среду культивирования вносили различные концентрации метаболи-тически инертного сорбита, что вызывало повышение осмотическое давления в среде роста и уменьшило разницу внутриклеточного и внеклеточного давлении. В иачиле стационарной фазы роста из среды культивирования выделили среднюю фракцию экзометаболитов. Повышение осмотического давлении п среде культивирования резко снижало выделение анализируемых веи^стл ь р:юч-те т единицу биомассы (табл.9). Таким образом, на

копление в среде роста исследуемых экзометаболитов обусловлено, вероятнее всего, процессами происходящими в клеточной стенке дрожжей. Об этом свидетельствуют и данные, полученные при культивировании дрожжей в присутствии новокаина. Поскольку новокаин дезорганизует процессы в мембране, то в случае поступления веществ СМФ в окружающую среду из цитоэоля присутствие новокаина резко бы замедлило процесс их выделения. Однако этого не происходит, наоборот наблюдалось некоторое стимулирование выделения искомых экаометаболитов(табл. 9).

табл. 9

Влияние на секрецию исследуемых экзометаболитов различных веществ.

I-1-1-1-1-л

Виды добавок

АСВ

| г/л

Саут

мг/л

Контроль I 6,1*0,2 | 28,1 4,59 | 100 К

Сорбит-0 1М I 7,2*0,2 | 23,8 3,31 | 72,1 |

Ссрбит-0 8М 112,5*0,4 1 26,7 2,14 | 46,8 |

Новокаин- 0,5% | 5,8*0,2 1 33,4 5,76 | 125,5 f

Саут

АСВ мг/г

Эффект) I

% I в

-1

Как же происходит взаимодействие биологически активных гликопро-теинов с клеткой? При инкубации меченых С-экзометоболитов СМФ с дрожками было установлено, что сорбция этих веществ на клетках происходит очень быстро (менее 5 минут) и не изменяется существенно в процессе инкубирования в течение 1 часа . Сорбция описьшается уравнением Ленгмюра с максиумом сорбции Smax-1,24684*10 расп/мкн и коэффициентом сорбции к-1,40909*10 1/мг/л . Тот факт, что сорбция происходит быстро и затем ее величина не меняется позволяет- предположить, что проникновение ауторегуляторов в клетку маловероятно.

ИзвестноеBerridge,1987) два основных способа передачи через мембрану сигнала поступающего в клетку: с помощь*" фосфодиэстераэной системы (протеинкиноза С) и аденилатциклазкой системы. В первом случае фосфатидилинозит посредством фосфодиэстераэы превращается в два вторичных мессенджера (посредника), во втором. ЛТФ посредством ацени-латциклаэы в цА№1>. Изучая изменение концентрации этих веществ под воздействием экзометаболитов, можно установить каким путем осуществляется передача сигнала. Нами было изучено оба пути. Были проведены

А V

опыты с двойной меткой С/Р для изучения влияния экзометаболитов на

особенности метаболизма фосфатидилиноэите н друг к:; щоофолипвдоз.

Ярожкзг постоянно выращлв&ш из и-субстрьте» вахеы шжуг,к£ оь&ек а мз-ченьаЛ? opTo<¿oa£«ioH о течении 60 кшуг4 к снова воюцгхк на среду о немечеными фосСрлчжи. Соотнесения 6/ Р повьохзе® определи:-. кдездима-нооть иотьСохтьыа индиькду&г.ъиш <рое£лиашвдсо, ншалл^з сС^у» вк-«енсйвкость роста (постоянный уровень О в бдомеюсе). Црк »ив не бшэ обнаружено раалнчий в метьбох.я»® фос^аткдклкноеита в коь Ер;-; внесении эквометаболитов . Однако, обмфудекы раохичка э юягваскЕ-ностк включения фосфора в фозйювдилхошш к фоофагаддалзтаяслаша , кот optó свидетельствуй о перестройке к£8Точ>:ся!о шта2ьЕ£с«& иод tc¿>-дейотвкем веществ. Берояткеэ всего передача сигнала а® свкваас а фосфодиэетераэноЯ системой в; дальнейшей нашей вадачей а проьекгз влиянкл веществ ¡¡а аденплатипклазную активность.

Было устанадлено» что активность аденклатциклавы в шеткш дрсн-

язей после обработки веществами возрастав", что свидетельству®? сЗ участии фермента в процессах передач!! сигнала(рис. 11). &тп данкьк. j позволяют предположить, что передача сигнала внутрь клеткл осуществляется путем активизации аденилатциклазной систеш.

Кэучсико действия зшзомет&Золнгов CUO di glu^aaioue ks. кродуктю,-ность по йиомассо к лизину при рашшчти концентрация» сахароз

Из литературы иэвестно(Руклиша и др.,1976), что повышение концентрации углеводов в среде более 10% при куль-ивировании бактерий рода Corynebacterium приводит к удлинению лаг-фазы, повышению скорости роста клеток и снижению лизинсинтевирующей активности культуры, а следовательно, к повышению продуктивности процесса по биомасе к снижению по лиэину. Данное явление было объяснено тем, что соотноше-, ние активности ферментов гликолиза и цикла трикарбоноьлх кислот изменяется в пользу гликолиза . Учитывая данный факт, было предположено, что исследуемые экзометаболиты активируют цикл трикарбоновых кислот и ингибируют гликолиз, вызывая тем самым увеличение лиэинсинтеэирующей активности. Для подтверждения этой гипотезы была проведена серия экспериментов по культивированию бактерий в периодических условиях в течение 72 часов с различной концентрацией РВ (табл.10).

Было обнаружено, что при концентрации РВ до 10% зкаометаболиты увеличивают шкод биомассы до 13% и лизина до 20% по сравнению с контролем. При .РВ-15% концентрация лизина и-биомассы при внесении эк-зометаболитов различной степени очистки резко падает. - Вероятнее всего, при концентрациях сахарозы до 10% вещества ингибируют ферменты

pite. 11 Влияние СМФ дрожжей на активность аденилатциклаэы

1-контроль 2-концентрация цАМФ при обработке СМФ

- 24 -

Культивирование С. Заласит с различной Таблица 10 концентрацией РВ в присутствии экэометаболитов.

1 1 |РВ, х- Вариант 1 | Концент- Концент- 1 — ■■ ...... 1 |Продуктивность |

рация рация |биомассы по |

|биомассы, лизина, |лизину, |

| г/л 1 г/л 1 г/Г | I 1

1 в контроль 1 1 15,7 31,6 1 1 1 2,01 1

СМФ 1 16,8 1 33,0 1 2,32 1 1 1

| 10 контроль 1 1 16,Б 32,8 1 1 1 1.99 1

СМФ о 1 18,7 1 38,3 1 2,05 | 1 |

1 13 контроль 1 1 19,6 20,3 1 1 1 1.04 |

СМФ 1 16,8 1 30,2 1 1.23 | 1 |

контроль 1 1 19.? 8,1 1 1 1 0,41 |

Ш 1 12,6 4,6 1 . 0.37 |

1 1Б ВП 1 11.6 Б,2 1 0,45 |

НП + ВН 1 11,1 Б, 1 1 0,46 |

1 СМФ 1 13,5 I Б,2 | 1 0,39 | I 1

гликолиза, а при высоких концентрациях сахарозы более 13-14Х происходит ингибирование ею цикла трикарбоновых кислот, в результате чего ингибируются оба пути утилизации углеводов в присутствии веществ , что приводит к резкому уменьшению выхода биомассы и лизина к 72 часу культивирования.

Таким образом, можно предположить, что увеличение выхода лизина и биомассы в присутствии СМФ обусловлено ингибирующим действием ауто-регуляторов на ферменты гликолиза, в результате чего соотношение активности гликолиза и ЦТК смещается в пользу последнего.

• Перспективы использования работы на примере производства кристаллического лиаино.

Реэультсты, представленные в предыдущей главе, свидетельствуют о возможности интенсификации производства лизина путем возврата на ферментацию компонентов культуральцой жидкости, не являющихся целевым продуктом. Очевидно, наиболее рационально использование эффекта сти-

мулирования синтеза целевого-продукта другими экзогенными метаболитами микроорганизма - продуцента в технологии, предусматривающей получение очищенного продукта. В этом случае культуральная жидкость разделяется на поток, содержащий целевой продукт, и побочные фракции, часть из которых может благотворно влиять на биосинтез. С этой точки зрения эффект стимулирования синтеза лигина может найти практическое применение прежде всего в технологии получения кристаллического продукта.

Выли проведены эксперименты со средней фракцией культуральной жидкости, полученной с различных стадий очистки на опытной установке Трипольского БХЗ по производству кристаллического лиэина. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 12.

Влияние средней фракции с различных стадий Таблица 12 выделения лизина на лизинсинтезирующую активность и концентрацию биомассы бактерий С. бг1иЬаШсит.

I | Вариант 1 о I Концент- 1 (Концент- 1 Эффект 1 Эффект по |

| средней I рация рация по лизину, биомассе, |

| фракции | лиэина, | биомассы, % г |

I г/л 1 I г/л 1

| контроль 1 1 36,7 1 21,6 1 10Q 100 |

| КУ-2Х8 Na+ | 36,9 I' 23,0 100,5 | 106,5 |

| осветленный 1

| маточник 1 44,0 1 18,6 119,8 85,6 !

| неосветленный* 1

| маточник 1 1 42,3. | 1 21,7 I 115,2 | 100 | |

а,- неосветленный маточник получен из схемы выделения с

отсуствием стадии очистки активированным углем.

Средняя Фракция стока с колонны КУ-2х8 N;i<- ме оказывает стимуляции на биосинтез лиэина. А Фракции, полученные '■•.'< ссгет.яешюго и не-осветленного маточника, оказывают стимулирующий эффект по биосинтезу лизина, что позволяет сделать зывод о наличии в ?тик г.ракцкях списанных вы е стимуляторов. Полученные данные позволяют предложить усовершенствование технологии производства кристаллического лизина, путем введения стадии ультрафильтрационной очистки маточника, полученного после кристаллизации лиэина, и возврата концентрата мембранного разделения маточника на стадию ферментации. Использование данной' схемы

позволит уьоличить конечную концентрацию лизина в культуральной жидкости, а также утилизировать до 10% стоков.

Для обоснования экономической эффективности: предлагаемого варианта усовершенствования схемы производства кристаллического лизина был произведен расчет. Расчет показал, что процесс вовврата фракции культуральной жидкости в производстве лизина с использованием мембранной технологии, достаточно экономически эффективен, так как увеличивая выход лизина на 10%, приходим к уменьшению себестоимости продукции на 1,43%.

вызэдк

1. Из культуральной жидкости дрожжей Candida util is ВСБ-6Б1 и бактерий Corynebacteriurn glutomicum 96 методом ультрафильтрации была выделена фракция экзометаболитов с М. Ы. Б-БО кДа, оказывающая стимулирующее действие hep рост продуцентов и биосинтез лизина у бактерий. Эффект аутостимуляции выражается в сокращении лаг-фазы и увеличении .экономического коэфициента трансформации субстрата в целевой продукт, что приводит к увеличению конечной концентрации биомассы дрожжей С.utilis на 8-12%, и конечной концентрации лизина в среде культивирования бактерий С. glutamioum на 10-15%. .

2. Проведена очистка дрожжевых и бактериальных экзометаболитов методами ультрафильтрации и гельфильтрации. Показано, что активные качала аутостимуляторов дрожжей Candida utilis И бактерий Corynebooterium •glutamicum локализованы в двух фракциях с молекулярной массой 9 кДа п 39 кДа, 14 кДа и 45 кДа, соответственно! На основании химического анализа фракций, обнаружившего наличие аминокислот, углеводов и амн-носахаров, аутостимуляторы отнесены к гликопротеина;,;. .

' 3. Показано,что максимум продуктивности дрожжами С. utilis физиологически активных экзометаболитов сонряжен о экспоненциальной фазой росте.

4. Выдвинуто предположение, что стимуляция роста дрогззй под шойгса-ем внеклеточных гликопротеинов опосредуется через аденилатцнклаану.: систему клеток.

6. Показана зависимость ростстимулирующего и лиэинаткмулирующеге, действия гликопротеинов у бактерий С. glutamicum от 1Ю1щентрацин углеводного субстрата: при концентрации углеводов более 14-16% h присутствии фиеиологиче'еки активных экзометаболитов ингибируется рост культуры и биосинтез лиэина, в то же время при концентрации углеводов ниже 12-13% повышается выход лизина.

6. Показана принципиальная возможность использования результатов ра-

боты в процесса получения кристаллического лизина, путем возврата стимуляторов на стадию фэрментации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Подобрянский О. С., Кузнецов А. Е. Культивирование продуцентов лизина, в мембранном биореакторе. //Тезисы докл. Всес. научно-технической конференции " Основные направления совершенствования и создания нового оборудования для медицинской и микробиологической промышленности". -М.: ЦИНТИХИМНЕФГЕМАШ, 1988.

2. Подобрянский О. С. ,. Кузнецов А. Е. , Манаков М. R , Зайцева 3. М,- Особенности влияния фракций мембранного разделения нативных растворов продуцентов лизина на накопление биомассы и синтез лизина. // Тезисы до1и. Всес. конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов". - Пущино, 1990.

3. Подобрянский О. С., Кузнецов А. Е. , Манаков М. Н. Влияние фракций мембранного разделения нативных растворов продуцентов лизина на накопление биомассы ij¡ синтез лизина.// Тез. докл. международной школы "Микробный синтез биологически активных веществ и их применение". -Bipna, 1990.

4. Подобрянский О. С. , Кузнецов А. Е. , Манаков М. Н. Влияние фракций культуральной жидкости на рост дрожжей Candida utilis.// Теп. докл. международной школы "Микробный синтез биологически активных веществ и их применение", - Варна, 1990.

5. Подобрянский O.G., Кузнецов'А. Е. Использование продуктов жизнедеятельности микробных продуцентов белка и аминокислот для повышения эф-фективноси. целевого биосинтеза и уменьшения отходов производств. // Тез. докл. симпоз." Микробиология и охрана биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия". - Оренбург,1991

6. Подобрянский О.С., Кузнецов А. Е. . Манаков М. Н. Влияние фракции культуральной жидкости 5-50 кД на рост дрожжей dandida utilis.//Биотехнология, N6, 1991,0. 40-43.

7. ¡Ьдсбрянский О. С. , Лахтин В. М. , Кузнецов А. Е. , Цыряпкин а А. , Ямсков И. А. , Манаков М. Н. Изучение высокомолекулярных ауторегуляторов биосинтеаа Carril da utilis и бактерий Corynebacter ium glutamioum.//Биотехнология, N4, 1993,с. 10-13.

8. Подобрянский О. С. , Белов А. П. , Кузнецов А. Е. , Зинченко Г. А. Изучение закономерностей выделения и механизмов воздействия ауторегуляторов из дрожжей Candida utilis. //Микробиология,N6, 1993, в печати.

Информация о работе

Подобрянский, Олег Семенович
кандидата биологических наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы