Физиологические активные экзометаболиты дрожжей Candida utilis ВСБ-651 и бактерий Corynebacterium Glutamicum 95

Подобрянский, Олег Семенович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиологические активные экзометаболиты дрожжей Candida utilis ВСБ-651 и бактерий Corynebacterium Glutamicum 95
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические активные экзометаболиты дрожжей Candida utilis ВСБ-651 и бактерий Corynebacterium Glutamicum 95"

Научно-исследовательский проектно-конструкторскнй институт прикладной биохимии

На правах рукописи

ПОДОБРЯНСКИЙ ОЛЕГ СЕМЕНОВИЧ

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТЫ ДРОЖЖЕЙ CANDID A XJTIL1S ВС Б-651 И БАКТЕРИЙ CORYtfEBACTERIlJM GLUTAMICUM 05

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щсщя — 1993

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д. И. Менделеева.

Научные руководители: доктор химических наук профессор М. Н. Манаков; кандидат технических наук, доцент А. Е. Кузнецов. .

Официальные оппоненты: доктор биологических наук; профессор Г. И. Эль-Регистан; кандидат биологических наук Е. П. Исакова.

Ведущая организация: ВНИЙГенетика.

Защита состоится $.5"-А1994 г.

г-

в (^ часов на заседании специализированного совета Д 098.09.01 в Научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии по адресу: 125299 г. Москва, улица Клары Цеткин, 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан ШаехАП, 1993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат биологических наук

И. И. ГУСЕВА

I Актуальность работы. Значительный прогресс в понимании основ би-

ологических процессов достигнут в последнее время в области изучения механизмов взаимодействия клеток. Эти успехи во многом связаны с обнаружением, выделением в индивидуальном состоянии, изучением химической природы и роли в процессах жизнедеятельности многочисленных специфических веществ, активно участвую^« в таких взаимодействиях. Вещества этого тина обычно объединяют термином ауторегуляторы.

Следует отметить, что ауторегулятори микроорганизмов изучены сравнительно слабо. Вместе с тем разработки теории культивирования, в т. ч. для промышленного производства, нуждается в выявлении закономерностей эндогенных механизмов регуляции жизнедеятельности микробных культур. Интенсивно разрабатываемые традиционные технологические приемы культивирования, контроля и управления жизнедеятельностью микроорганизмов-продуцентов такие, как изменения pH, температуры, концентрации компонентов питания и т. д. , не выявляют полностью потенциальные возможности культур. Реализацией этих возможностей может быть использование в процессе управления культивированием знаний о закономерностях образования и рол» экзометаболитов-ауторегуляторов.

Наличие в культуральной жидкости аутометаболитов с различными свойствами - активаторов и ингибиторов биосинтеза целевого продукта -повволяет поставить вопрос о селективном изменении их в среде культивирования в благоприятную для биосинтеза сторону. Такой подход может послужить основой для дальнейшего развития методов управляемого культивирования микроорганизмов.

Целью данной работы являлось: поиск физиологически активных эк-аометаболитов промышленных микроорганиэмоь дрожжей Gandida utilis ВСВ-661 и бактерий Corynebacterium eliitomicum 9Ь, ивучение их химической природы и влияния на рост и биосинтетическую активность культуры, разработка путей использования физиологически активных зкэоме-таболитов для интенсификации биосинтеза.

В задачи работы входило:

1. Исследование экэаметаболитов дрожжей С. utilis и бактерий С. glutami cum для обнаружения веществ, стимулирующих биосинтез целевого продукта и выявление их ауторегуляторной роли.

2. Исследование влияния, оказываемого ^.уторегулягорами на роет и биосинтетическую активность культуры микроорганизмов при различных условиях культняироааиии.

3. Шд<--до?ни<* и очистк-ч ¿шиэдогичеокп актипйгё »»¡»синтмГю-ш r> t; äjkm.-

л и i:tтс;jit-.aoi-:imiv их мнмическо-'i цриро/.i i.

4. Исследование влияния физиологически активных экэометаболитов на

метаболизм микроорганизмов. Б. Поиск путей практического использования экэометаболитов для улучшения показателей ферментационного процесса.

Научная новизна: Обнаружено, что в процессе роста дрожжей С. utills и бактерий С. glutamioum синтезируются и выделяются в среду метаболиты, оказывающие стимулирующее действие на рост соответствующих куль-тур(8-12%) и накопление лизина у С. glutamioum( 10-15%). Максимальная продуктивность аутостимуляторов у дрожлей сопряжена с экспоненциальной фазой роста культуры.

Впервые показано, что аутостимуляторы дрожжей и бактерий по своей химической природе представляют собой гликопротеины. Установлено, что активное начало стимуляторов дрожжей и бактерий локализовано в двух фракциях с KLM. для С. utiljs 9 и 39 кДа, а для С. glutamioum с 14 И 46 кДа.

Показано, что стимулирующий эффект экэометаболитов зависит от концентрации вносимых ауторегуляторов, условий культивирования, состава среды роста и количества вносимого инокулята. Эффект стимулирования роста и синтетической активности дрожжей и бактерий выражается в: а) сокращении лаг-фазы, б) увеличении экономических коэффициентов, в) увеличении выхода целевого продукта.

Установлен аминокислотный и углеводный состав аутостимуляторов, их биологическая и гемагглютишфуюдая активность.

Выдвинуто предположение, что стимуляция роста дрожжей под влиянием внеклеточных гликопротеинов опосредуется через одекилатциклааную систему.

Практическая ценность: Предложи возврат фракции культуралыюй жидкости, содержащей стимуляторы биосинтеза иа ст?:г,и» фермен-

тации в производстве кристаллического лизина. К«скотг?ии гугмояные технологические решения, обеспечивающие увеличении выхода лигина.

Рассматривается возможность для разработки технологического приема культивирования дрожжей, предусматривающего использование малых объемов инокулята с внесением ростстимулирукжих ауторегуляторов.

Объем и структура диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов. Работа изложена на / bS> страницах машинописного текста и иллгастрирова-на /^рисунками и ^таблицами. Библиография включает 240 названий работ, из них 178 на иностранных языках.

■ - Б -

ЗКСШ>ИШ!ТЛ.ПЫ1АЯ ЧАСТЬ Натериал* и методы

В работе использовались дрожжи итамм Candida util is БСБ-6Б1 к бактерии пгтамм Corynebaoterium glutanicum 05. Дрожжи С. utilis являются удобный объектом для исследования, так как они достаточно хорошо изучены, как с позиций биохимии и физиологии, так и в технологическом плане. Однако, роль специфических регуляторных экзометаболитов их жизнедеятельности не исследована. Другим изучаемым объектом был промышленный штамм лизинсинтезируюцих бактерий Corynebaoterium glutamicum. При изучении лиэинсштезирующего микроорганизма Brevibacterium sp. 22J1 било обнарукено(Куэноцов, 1968) , что фракция метаболитов НК с молекулярной массой 6-100 kD стимулирует синтез лизина. Однако данный штамм уже не используется. Поэтому, изучение ауто-регуляторов бактерий С. glutamicum мокет иметь как научное, та:-: и практическое применение.

Выращивание дрожжей Candida utilis ВСБ-6Б1 (любезно предоставленного на коллекции.ВНИИсинтезбелок) проводили на среде следующего состава, г/л: ( UH4) 2НР04. - 10; КН2Р04 - 6,8; NaH2P04 - 3,7; MgS04*7H20 - 0,7. Субстратом служили этанол или сахароза в количестве 10 г/Л. Температура культивирования 33t_lcC, рН 4,Б±0,2.

В качестве продуцентов лизина использовали штамм Corynebaoterium glutaniicum-9B (любезно предоставленный ВНИИГенетика). Среда для шю-кулята.%: меласса (48 PB) - 3; кукурузный экстракт - 10; NaCl - 0,4; подтитровка NaOH (Su) до рН 7,8-8,0.

Среда для основного культивирования,меласса 20-2Б (PB 10%); гидролизат БВК - Б (200г ВВК в 1л H2S04 (4н) в течение 60 мин прогид-ролиэованно при 12БоО); (NH4)2S04 - 2; К2НР04 - 0,1Б; MgS04*?H20 -0,06; подтитровка NH40H (2н) до рН 7,2-7.6; посевной материал 3-Б. Температура культивирования ЗОЛ о С. '

Выделение и очистку физиологически активных экзометаболитов проводили по схеме, приведенной на рис.1, с использованием техники ультрафильтрации с применением мембранн УПМ- 450 и УАМ-100. Степень отмывки этих фракций от низкомолекулярных компонентов доставляла 98-99Х. Отмывку фракций от низкомолекулярных веществ проводили диа-фильтрацией. Гельфильтрацию проводили на сефадексе G-50 с использованием прибора UN1C0RD III на колонке 8хБОО мм Для аналитических целей и 8x200 мм при препаративном разделении. с Электрофорез выполняли в 11,5% ■ полиакриламидном геле в присутствии додецйлсульфата натрия по

Лэмли( Ьаеотп11,1970).

О количестве биомассы судили по величине оптической плотности, намеренной на фотоэлекгроколориметре КФК-2 в кюветах толщиной Б мм приА=Б40 им или по весу абсолютно сухих клеток. Содержание этанола определяли с помощью гаэокидкостного хроматографа "СНЙОМ-Б" (ЧОФР); углеводов - по модифицированному методу Бертрана (Практикум, 1989); фенол - серным (Землянухин, 1985) и антроновым методами (Практикум, 1989); белок - методом Лоури (Ьоот-у, 1951) или калориметрическим методом Вольфа (\tolf, 1983); нуклеиновые кислоты - по Спирину (Практикум, 1989). Лизин и другие аминокислоты определяли методом тонкослойной хроматографии. Определение содержания внутриклеточных липидов проводили по методу Блайя и Дайера (Кейтс,1975).

Для определения нейтральных моносахаридов отмытые после гель-фильтрации вещества лиофильно высушивали и гидролиэовали 6 часов в Схема фракционирования культуральной жидкости рис. 1

I--1

| Культивирование | | микроорганизмов | 1-,-1

I КЯ

Центрифугирование

нативный раствор

Ультрафильтрация УГМ-450

биомасса(в трап)

концентрат (ВМФ) с М. М-> БОкД

пермеат

Ультрафильтрация I-;-*Н

УАМ-100 |пермеат с М.Ы.^бкД1-

----1

Упаривание . I -1-1

концентрат с М. М. -БкД-БОкД (СМФ) -1

НМФ

Гельфильтрация

высокомолекулярный препарат(ВП)

низкомолекулярный

препарат( Ш)

1н HCl при t-100oC. Определение выполняли на анализаторе "BIOTROMIK LC-2000" (ФРГ), колонка 3,8х12Б мм с анионитом Dionex Ахв-11 в 0,4 Ы Na-боратном буфере рН-0,8 при t-60oC. Детекция при 670 нм после реакции с 2'2-бицинхонинатом меди. Для определения аминокислотного состава и аминосахарсв отмытые и лиофилиэированные вещества гидролиэовали при t-110oC 22ч в 6н HCl, а для определения аминосахаров при t-100oC 6ч в 2н HCl. Оба анализа выполняли на приборе "BIOTRONIK АМШО ACID ANALYZER LC-БООО" (ФРГ) на колонке 4x200 со смолой ЕГО 2710.

Гемагглк/гинируюшую активность определяли в отношении свежеприготовленных эритроцитов крови человека (А(П) + группа) на агрегометре "THROMLITE-1006" (Россия) при длине волны 660 нм, термостатировании при 37оС в цилиндрической стеклянной кювете объемом 0,25 мл при постоянном перемешивании 2000 об/мин.

Ревультаты в проводимых экспериментах учитывали не менее, чем ив трех повторных опытов с тремя вариантами в каждом. Достоверность определяли по среднему квадратичному откланению.

Плкяшкэ различна фракций куга тураль ной нидаоети дрогаеей С. utilis ка рост культуры.

На первом этапе работы нами было исследовано влияние фракций КД С. utilis, полученных методом мембранного разделения, на скорость роста культуры. В качестве изучаемых параметров были выбраны величина лаг-фазы, скорость роста и уровень накопления биомасса Sa один условный объем было, принято такое количество биологически активной фракции, которое было выделено из, эквивалентного объема КЖ Например, на 1л исходной среды вносили количество фракции, полученное с 1л КН.

В таблице 1 представлены данные экспериментов с внесением в среду культивирования дронжей С. utilis различных экзометаболитов. Как видно иэ этих данных, высокомолекулярная фракция (ВМФ) не оказывала существенного влияния на уровень накопления биомассы и величину лаг-фаэы. Внесение ниэкомолекулярной фракцией (НМФ) в- питательную среду для ферментации угнетало рост культуры, что соответствует общепризнанному представлению о том, что ингибиторы роста культуры имеют низкомолекулярную природу . Наиболее ярко выраженный стимулирующий эффект на рост дрожжей оказывало внесение среднемолекурярной фракции (0Ш>). Эффект стимуляции выражался в увеличении экономического коэффициента трансформации субстрата в биомассу и сокращении лаг-фазы, но старость роста практически не изменялась. рПри внесении экаометаболи-тов СЬЙ> экономический коэффициент был блиэок к максимальному екачени»

для данной культуры (0,53-0,55). В дальнейших экспериментах иопольво- I валиоь Только ОМФ. СФМ дополнительно очищалось от низкомолекулярных веществ диафильтрацией на мембране УАМ-100 (степень очистки 100 pao I по объему).

Влияние различных фракций кульгуральной Таблица 1

жидкости дрожжей С. ut i lis на рост культуры дрожжей.

1 Контроль 1 | 60 4.7iû, 1 1

| ВМФ | 60 4,8+0,1 I

| СМФ | 40 5,3+0,1 |

I ШФ | 150 3,2±0,2 |

На рисукках 2 и 3 представлены данные по динамике накопления биомассы при внесении СМФ в исходную питательную среду. Существенный эффект наблюдался только при внесении СШ>, не подвергнутой автоклави-рованию, что позволяет сделать предположение о термолабильности веществ, содержащихся в СМФ (^ис.2). Кроме того, наибольшая разница в росте, при сравнении контрольного и опытного вариантов, наблюдается при отмывке клеток инокулята от среды роста. Это свидетельствует в пользу того, ;что существенное значение в картине роста имеют экзоме-таболиты, вносимые с инокулятом в среду культивирования. Поэтому во всех дальнейших экспериментах по исследованию влияния фракций на рост дрожжей инокулят отмывали от метаболитов питательной средой. Эффект стимулирования относительно контроля усиливается с увеличением количества вносимой фракции ( рис. 3 ) и уменьшением дозы посевного материала.

Таким образом эти данные подтверждают предположение, что внесение веществ приводит к сокращению лаг-фазы роста. В экспоненциальной фазе развития разница в удельной скорости роста яеэначигельна (рис.2 и 3). Можно предположить , что присутствие изучаемых экзометаболитов важно для развития культуры в начальной фазе роста. Для проверки этого предположения были проведены опыты в ферментере с микрофильтрационным модулем. Известно, что отвод экзометаболитов через микрофильтрационную мембрану приводит к удлинению лаг-фазы (Комарова и др. ,1985) . Ее продолжительность увеличивается с ростом скорости от-

рис. 2 Динаиика накопления биокассы дрожжей С.иННэ при внесении 1,5 объемов СФ в исходную среду

рис.3 Динаиика накопления бноцассы дрожжей С.иМКэ

при добавлении различного количества СМФ

вода фильтрата ив ферментера. Культивирование с отводом фильтрата че-. рев микрофильтрационную мембрану и высокой скоростью разбавления среды в ферментере испольэовали для определения влияния экаометаболитов на рост культуры при выращивании дрожжей на сахарозе и этаноле. В контрольных вариантах на вход ферментера подавали исходную питательную среду. В других вариантах в питательную среду добавляли среднюю фракцию в количестве 1,Б стандратных объема. Углеродный субстрат для получения посевного материале и иепольвуемый в реакторе был один и тот же. Полученные данные представлены на рис.4 и 6. Видно, что при культивировании С.util is на сахарозе эффект положительного влияния на рост дрожжей более ярко выражен при внесении фракции, полученной ив КЖ дрожжей, . выращенных на сахарозе. В экспериментах с выравниванием дрожжей в мембранном реакторе на этаноле положительный эффект также наиболее значителен, когда субстрат для ку/ьтивирования дрожжей и для получения фракции один и тот же.

Параллельно с экспериментами в мембранном биореакторе в этой серии исследований проводили эксперименты в колбах на ю,чалке. При выращивании в колбах определяли динамику накопления биомассы и потребления субстрата. Скорость роста к выход биомассы с единицы субстрата при этом возрастают (по сравнению с контролем), когда для получения целевой фракции используют тот же субстрат, что и для культивирования дрож2*ей(1'Ис. 6).

" Таким образом, можно сделать вывод, что фракция КЖ дрожжей С.-it il is, с -, молекулярной массой 5-БО кД, содержит ауторегуляторные факторы, которые при внесении ее с инокулятом ускоряет адаптацию дрожжей к новым условиям, что выражается в сокращении лаг-фаэы и увеличении экономического коэффициента усвоения субстрата на 10-12%.

Влияние фракции КМ лизиипродуцирукеоа бактерий на их ли гаакмнхевщ'укаук активность при различны: условия* культивировшшя.

Аналогичные выш?ог.исанным эксперименты были проведены о продуцентом лиэина Согупеbacterium glutamicüm 95, при выращивании его на среде с мелассой в колбах на качалке. На рисунке V представлены зависимости изменения выхода биомассы и лизина бактерий С. Blutami cum от внесения различного количества СШ> КЖ продуцентов С. gl utami cum и Brevibacterium sp.22L. Даже при небольших количествах вносимой СМ1 С. elutamioum уровень накопления лизина выше контрольного на 10-15%,. Уровень накопления биомассы также превышает контрольный. В опытах с внесением СМФ, полученной при культивировании продуценте

рис. 4Динамика накопления биоцассы С.иНИз

в мембранной биореакторе при росте на этанол®

-0.5

8п0

опт.ед.

-2.51

О 1 г 3 * 5 Б

1-контрол1 2- со СФ, полученной при выращивании дрожжей на сахароае 3-со СФ, полученной при выращивании на этаноле

рве. 5 Динаыика накопления биомассы С.иШз

в ыеыбрапнои биореакторе при росте на сахарозе

-0.5

0 1 Я 3 С р 6

1-хоьгрояь ¿-со Сч-. полученной при эиращиваиик дрожжей иь ог&нопе* 3-со СФ, полученной ггрк выращивении на с ¿¡сиропе'"

рис 6 Динамика потребления субстрата и накопления

биомассы С.иШв на колбах. . ^

(субстрат—этанол)

2.5

О 2 * „ 6 8 (О 12 и

1,2,3-биоиасса 4,5,0-оувотрат 1,4-коктрога 2,5-оо С®, полученной на сахарозе 3,в-со СФ, полученной наэгаяоле

рис.7 Накопление биомассы и лизина в зависимости от количества вносимой СФ

биокасса

120

115

110 -

105

100

Сопьгг

Сконт.

/ / / / ч ------- 4 1 2

! У

/ . V

----- 3

■ + 1 .. . . X. V , стан. ед. |

О 0.5 1 1.5 2 2.5

1.3-влияние СФ, иэКЖС. д1и1ат1сит-95. на куга туру С.дМот1сит-95

2.4-влияюю СФ, из КЖ 8гву1Ьос1вг1ит 221, на культуру С.д1и(ат1сит-95

Brevibacterium sp.2HL, в питательную среду продуцента С. glutamioum 96 количественная, зависимость доза -эффект аналогична ранее полученной зависимости (Кузнецов,1988)при выращивании продуцента Brevibacterium sp. 221 (рис.7). Интересно отметить, что характер зависимости эффекта от количества вносимой фракции определяется в первую очередь, кокой продуцент был взят для получения СМЗ>, а не свойствами продуцента на который действуют вещества данной фракции.

При добавлении ВМФ во всех вариантах опытов концентрации биомассы практически не изменялась, а лиаина - уменьшалась на 10-20%. При внесении НМФ наблюдалось вначительиое снижение уровня биомассы, а ливин практически не синтезировался.

Было изучено влияние факторов, содержащихся во фракции с М. М. 5-БО kD, на биосинтетическую активность С. glutamiouin при культивировании бактерий в режиме хемоотата. Хемостатное культивирование явля-зтся удобной моделью для изучения кинетических характеристик роста культуры. Вначале был осуществлен подбор режима непрерывного культивирования, обеспечивающего приемлемую биосинтетическую активность культуры. Устойчивый стационарный процесс роста культуры и биосинтева лизина в течение более 90 часов удалось получить при Д-0,03-0,05 ч-1. Дальнейшие исследования проводились в этом режиме.

В ходе дальнейших экспериментов культивирование начинали с контрольной средой (бев Сlii) или с опытной средой (с СМФ). После достигши стационарного состояния и его поддержания в течение 2-3 суток., фоводили смену подаваемой среды с контрольной на опытную или наобо-Культивирование бактерий С. glutamicurri в хемоетате Таблица 2

трация |трация трация |води- ребле- 1 дук- 1 коэфф. | коэфф. )

1 1 1 1.. .. I г/л |по личину, |г/л*ч 1 |стра-1 та, |г/л*ч |по би-|омассе |г/л*ч 1 1 1 1 1

Без 1 г 1 т 1 1 ......... 1

добавок 1 12,0 116,3 I 28 10,48 |2,62 |0,64 1 0,17 1 0,22 j

СМФ 1, б 1 13,0 1 11?,4 L . ...... I 67 1 10, 46 | 11,16 i-о ¡0,61 1 | 0,39 | 1 0, Б2 | 1 . . . 1

Концентрация РВ в исходной среде 100 г/л

'■'..."'...'.''"'"' - 14 -

рот. При этом не наблюдалось существенного иэменевия концентрации лизина R биомассы , но субстрат при подаче среды с начинал расходоваться намного экономичнее. Это приводило в значительному'увеличению, более чем в 2 раза, экономического коэффициента выхода биомассы и ли-вина с единицы субстрата (табл.2).

,Таким о&раэом установлено, что фракция КЖ бактерий С. glutamicum о M. М. Б-БОкДа содержит ауторегулягоры, которые при внесении ее вместе с инокулятом увеличивали выход лизина и биомассы на 10-15% при периодических условиях культивирования, а при хеиостатном культивировании экономические коэффициенты превращения субстрата в биомассу и лиэин увеличиваются более чем в 2 раза.

Вьщеление и очистка экаометаболкгов м изучение их химического строения.

Для выяснения химической природы активного начала ауторегуляторог дрожжей был проведен химический анализ всех фракций, полученных методом ультрафильтрационного разделения. В таблице 3 представлены результаты анализа фракций, полученных при росте С. utilis на этаноле. Средняя фракция состоит, в основном, из веществ протеиновой и углеводной природы. Она практически не содержит нуклеиновых кислот. Большая часть их остается в высокомолекулярной фракции (с ММ. вещест) больше 60 кДа). При химическом анализе препаратов, полученных npi ошгетке СШ> по схеме на рис.1, обнаружено, что соотношение - редуцк рующие вещества: белок в полученных препаратах не зависит от субстра та, на котором выращена культура дрожжей ( табл. 4).

Состав фракций КК дрожжей С. utilis табл.3

g-;-1-1-1-1-я

8 Исоле | мг/л | мг/л • | мг/л I мг/л 3

8 дуемые | | ( ! 8

В фракции | | I . | II

5-:-._—|-:-f---!--i--!l

^Нативный р-р КЖ | 200120 | 224+20 ( 27*3 ' | 510+32 Ц 5ВМФ М. R БОкД | 110±3 5 ) 120±Б | • 15±3 | 306+38 || |CM£ 5кД M. U. Б0КД1 Б, 4+1,0 I 22±.4 | 0,5+0,1 | 27±4 J Jfflß> Ы.М. БкД | Б0±10 | 7Q±11 | 6+1 | 1Б0+19 !] | ВП М. М.-37КД | 4,0±0, Б | 21±.4 i следы | - S J НП М.М.-9КЛ | 0,7±0,2 | 0,6±0,2 1 следы | - J « __;_i_i_!_i_i_u

• - IB -

Гельфильтрацией удалось разделить дрожжевую СМФ на два препарата. Для веществ, выделенных из КЖ С. utilis при выращивании как на этаноле, так и на Сахарове, данные гельфильтрации схожи: обнаружен высокомолекулярный препарате Щ1) с М. Е около 39 кДа и нивкомолекудяр-кый препарат (НП) с lili около 9 кДа (рис.8). Совпадение гельфильтра-ционных профилей по редуцирующим веществам и белку на рисунке 8 позволяет предположить, что пики с одинаковой М. М. принадлежат одному веществу или нескольким близким по строению и lili веществам. Предположение, что СМФ состоит иэ двух препаратов, было подтверждено ре-

зультатами, полученными при проведении гель-алектрофорева в присутствии додецилсулъфата натрия. /

Химический состав компонентов на разных стадиях табх .4 / очистки с 1л ЮН С. иЬШз ;

I---—I-:-;---——-----:-а

| Стадия | субстрат в

{ ОЧИСТКИ I-:--:-1---;---;-У

5 | IX этанол | б% сахароза 8

Е-—-1--,-:-,----)--г1---8

! | РВ |белок | РВ/белок|, РВ | белок |/РВ/беЛок 1 | | мг | мг | X / % | мг | мг |] % / % 8 I--1-1--1- I --}-Г

Ц |22,1+4,0|5,4±1,0180,3/19,7178,2±6,2|19,9±1,1 .179,7/20,3 {

[Концентрат | | | - I I / | I

в ДЛЯ гель- 121,6+4,014,9+1,0 (81,4/18,6162,7±.4,9| 18,ви,0|76,9/23,1 Ц

¡фильтрации | | | | | ' | II

I трации , | I I I I / I II

3 Ш | 0,7+0,1 |0,6±0,1163,8/46,2|.16,2*1,21 12,ЗД),9166,8/43,2 |

8 ВП |20,9+4,0|4,0+0,Б|83,9/16,1|44,2+2,11 6,Б±0,8187,2/12,8 ||

«-;-1--—л_1_ '____I_ '_а

Данные сравнительного анализа щэепаратов дрожжей, полученных ме- .

тодом гельфильтрации, представленны в табл. 5 и 6. Основными составляющими углеводной части у веществ, выделенных из КЖ дрожжей, оказались маиноза и глюкоза. При изучении биологической активности каждого препарата оценивали роетстимулирующий эффект. Результаты представлены в ■ таблице 7. У дроиякй максимальный эФЦлкт , учитываемый по увеличению конечной концентрации биомассы (а у бактерий и по концентрации лизина) наблюдался при внесении в среду культивирования ВП или смеси ВП и НП 13 количествах, соответствующих оптимальней! концентрации вносимой в

рис.S Гельфильтрация СМФ дрожжей С.utilis

1-белок., в опт.ед. 2 -PB, в мг/л

среду неочищенной СМФ. При инкубации па среде с этанолом б течение 24 часов он составлял соответственно 11,4X и 16,3% прироста ЛОВ по сравнению с контрольным опытом. Однако максимальная удельная активность (рассчитанная как отношение стимулирующего эффекта к концентрации вносимых препаратов) и степень очистки по биологической активности (ва единицу степени очистки в каждой серии экспериментов принята степень очистки по биологической активности средней фракции) наблюдалась при внесении Ш1 Величина удельной активности позволяет также оценить степень очистки препаратов. Относительная активность при внесении НП возросла в 16 раз по сравнению с внесением неочищенной СМ1>.

Аминокислотный анализ препаратов табл. б

г ■у------- -г- —8

» к 1 С. иЬ1113 1 с-1 е1и1аписит I л

н » | НП 1 вп 1 | НП " 1 ■■ 1 ВП II II

в I мол% | молХ | мол% I мол% 1

1 1 1

и 1 1 А

Я ЛИЗ 1 3,8 1 4,0 I 4,8 1 4,9 II

II гис 1 2,1 1 7,6 I 7,6 1 6,4 II

1 АРГ 1 9,5 1 10,8 | 12,3 1 5,5 1

1 АСП 1 9,5 1 9,7 1 11,6 1 12,3 в

1 ТРЕ I 13,6 1 9,7 1 8,7 1 9,9 II

1 СЕР 1 13,3 1 15,6 1 8,0 1 11,2 1

1 ГЛУ | 16,4 1 6,1 1 12,1 1 10.3 1

« ПРО 1 1,7 1 | 1

1 ГЛИ 1 8,9 1 13,4 1 10,6 1 14,6 1

1 АЛА 1 9,1 1 11,3 1 13,6 1 17,1 II

1 1/2 ЦИС | - | 1 " , | 1

1 ВАЛ 1 2,8 1 1,8 1 4,2 1 3,6 «

11 МЕТ | - 1 1,5 | | ' Л

II ИЛЕ 1 2,8 1 3,6 1 1.5 1 1,7 I

II ЛЕЙ 1 4,2 1 5,1 1 4,6 1 2.6 1

II ТИР | - | | - г - 1

1! ФЕН 1 2,7 | | 1 II

и t 1 г 1 л

■Для бактерий О. е1и1еитисиш были проведены аналогичные исследования. . Гельфильтрацией удалось также разделить экэаметаболиты СМФ бак-' терий на два препарата, содержащих белок и углеводы и соответствующих ММ. - 45 кДа(ВП) и М М. -14 кДа( НП) (рис. 9)! Был также проведен

рис.9 Гельфипьтр&ция СМФ Сог.д1и»ат1сипч

О, опт.ед.

о 5 10 15

1-<5елок, 0; 2-РВ, С в мг/л

С. иг/л

400

0У.ил

рис.10 Секреция ауторегуляторов СЫФ дрожжей

С,г/л _ ■■ __С,мг/л.

о 5 ,10 15 20 25 1,11

1-концентрация биоиасси.и г/п 2-концентрация акооиатабопитов СФ, в иг/а З-гтрирлсг кониенграцин эюоиераболитов СФ в единицу времени

электрофорез этих препараратов, их аминокислотный табл. Б), углеводный анвливы{ табл. 6) и исследована их биологическая активности табл. 0). У Содержание нейтральных Сахаров в препаратах табл. 6 я-1---1-:-л

5 Rha

I Man J Gal

II Xyl S Glc

•_:_

С. ut tils

С. glutrmicum I

ВП | НП 1 ВП 1 НП

молХ | 1 MOJIX 1 ЖЛХ 1 1 мол%

1 следы | следы 1 1 следы J 1.7

35,4 | 19,4 1 14.3 1 34,3

следы | следы 1 9,7 1 7,6

следы | следы I не обнар. 1 не обнар.

64,3 | 80,4 1 75,9 1 66,4

Эффект, удельная активность и степень очистки по биоак-швности препаратов СМФ КЖ дрожжей С. util is я-1-1-[-1-

табл. 7

АСВгсон. |концетра~| Эффект (Удельная

I г/л I

|ция препа| I рата I I мг/л I Ч-'-h

|актив-X |ность |%/мг/л --!-

5 Контроль|6,1б±0,20| i CW3> Я m 1 вл

1 нп+вп

|6,8i0,2 I 35±1 |10,5t3,21 0,30

|6.6t0,3 I 1,7±Q,3 |7,3i4,8 I 4,39

|6,85±0,30| 7,8+0,3 |11,4±4,8| 1,46

!7,16i0,30i 9,Б±0,3 |16,3t4,8| 1,72

j_I_i_I_!—

Степень J очистки 1 ! J

1,00 14,63 4,87 5,72

pl'itawicum увеличение конечной концентрации лизина при инкубации 'в 'чение 3 суток наблюдалось при внесении всех видов добавок. Актив-кость сказалось максимальной по лизину при внесении ВП.

ВП из га С. ut i lis и НП иэ КЖ С. glutonucum прс-тляли гемагглютики-руюшую наивность в отношении эритроцитов человека А(11) + группа

КрОВИ.

Таким образом, химческий анализ, описанной в этой главе и, в чпсности наличие в каждом препарате аминокислот, аминосахаров и углеводов, позволяет сделать вывод, что экэо!»етаболиты, содержащиеся в OMi дрожжей и бактерий, являются гликопротеинами.

Эффект, удельная активность по лизину и степень очистки по биоактивности препаратов СМФ КЖ бактерий С. е^атсит

Тоблиид <5

| Эффект | Эффект |Концентра

1. по лизину| по б/м ¡ция препа

| X | % |рата

| | | мг/л

СМФ | 22,316,9 | 0*3,2 171,8*2,0 НП | £0,6Ы,8 |33,1±3,Б |31,3±2,0 ВП | 29,7*4,5 |27,2±3,6 |19,Б+2,0 НП+ВП | 22,913,7 |-Б,0±4,1 |50,8±2,0 -1---I-1--

Удельная |Степень 9 активность¡очистки В по ливину |по лиеинуЦ %/мг/д | Ц --Н-1

0.31 0,62

1, Б2 0,45

1,00 | 2,00 Ц 4,90 | 1,4Б 1

Секреция экаометоболкгов СШ дрожжами и некоторые особенности их действия на клетку .

Для изучения закономерностей выделения изучаемых экзометаболитов , дрожжи выращивали на среде с С-этанолом(1,2) в качестве источника углерода и анергии. Это позволяет получать равномерно меченые биологически активные зкзометаболигы и дает возможность определять их концентрацию в среде культивирования. Результаты представление на рисунке 10, наглядно свидетельствуют, что максимальная скорость накопления искомых веществ наблюдается в экспоненциальной фазе роста (кривая 3), а их уровень в культуре коррелирует с концентрацией биомассы (кривые 2 и 1). Это может свидетельствовать в польэу того, что данные соединения накапливаются в среде роста в процессе деления клеток.

Известно(Кульберг,198?), что значительное оомоти1 зское давление '(1Б-1& атм) в дрожжевых клетках обуславливает попадание в среду куль-• тивирования фрагментов клеточной оболочки в процессе роста клето.; и отделения дочерних почек. Выло предположено, что изучаемые вещества СМФ являются фрагментамн-клеточных стенок. Для проверки этого предположения дрожжи выращивали в стандартных условиях, а в опытных вариантах в .среду культивирования вносили различные концентрации метаболи-тически инертного сорбита, что вызываю повышение осмотическое давления в среде роста И уменьшило разницу внутриклеточного и внеклеточного давления. В начале стационарной фазы роста из среды культивирования выделяли среднюю фракцию экзометаболитов. Повышение осмотического давления в среде культивирования резко снижало выделение анализируемых веществ в расчете на единицу биомассы (табл.9). Таким образом,на

копление в среде роста исследуемых экэометаболитов обусловлено, вероятнее всего, процессами происходящими в клеточной стенке дрожжей. Об этом свидетельствуют и данные, полученные при культивировании дрожжей в присутствии новокаина. Поскольку новокаин дезорганизует процессы в мембране, то в случае поступления веществ СМФ в окрутющую среду из цитоэоля присутствие новокаина резко бы замедлило процесс их выделения. Однако этого не происходит, наоборот наблюдалось некоторое стимулирование выделения искомых экэометаболитов( табл. 9).

табл. 9

Влияние на секрецию исследуемых экэометаболитов различных веществ.

1- ! 1 Виды I добавок 1 и -1- I АСВ 1 | г/л 1 1 1 | Саут | мг/л г — т Саут | АСВ | мг/г | .... ц Эффект 11 « X 1 11

11 8 Контроль г 1 6,1*0,2 Г 28,1 4,69 | II 100 1

5 сорбит-0,1М 1 7,2±0,Я | 23,8 3,31 | 72,1 1

к Ссрбит-0,8М |12,5ь0,4 1 26,7 2,14 | 46,8 1

Я Новокаин-0,5% и . _. , ..... I 5,8±0,2 ..1___________ 1 33,4 • .1 . .. 5,76 | 125,51! II

Как же происходит взаимодействие биологически активных гликопро-теинов с клеткой? При инкубации меченых С-экзометоболитов СМФ с дроздами было установлено, что сорбция этих веществ на клетках происходит очень быстро (менее б минут) и не изменяется существенно в процессе инкубирования в течение 1 часа . Сорбция описывается уравнением Ленгмюра с максиумом сорбции Зтах-1,24684*10 расп/мин и коэффициентом сорбции к-1,40909*10 1/мг/л . Тот факт, что сорбция происходит быстро и затем ее величина не меняется позволяет- предположить, что проникновение ауторегуляторов в клетку маловероятно.

Извеетне( В?гг*<3де, 1987) два основных способа передачи через мембрану сигнала поступающего в клетку: с- помош^к фосфодизстерааной системы (лротеинкиназа С) и аденилатциклэзкой системы. В первом случае фосфатидилиноэит посредством фосфодиэстераэы превращается в два вторичных мессендлгера (посредника), во втором, ЛТ<5 посредством адени--ют цикл азы в цАМФ. Изучая изменение концентрации этих веществ под воздействием экэометаболитов, можно установить каким путем осуществляется передача сигнала. Нами было изучено оба пути. Выли проведены л Ъ1

опыты с двойной меткой С/Р для изучения влияния экэометаболитов на

особенности метаболизма фоефатидилиноэита и других фоефодшшдов, Дроисжк постоянно выращивали на ^-субстрате, ватем инку б про вал к о меченым5^ ортофосфатом в течении 60 минуг^ и снова помешали не среду е немечеными фосфатами. Соотношения %/ р5 позволяет определить интенсиЕ-ность метаболизма индивидуальных фосфолипидов, нивелируя общую интенсивность роста (постоянный уровень О в биомассе). При. этом не- было обнаружено различий в метаболизме фосфатидилиновита в контроле к прк внесении экаометаболитов , Однако, обнаружены различия в интенсивности включения фосфора в фосфагидилхолии и фосфатидилэтаноламик , которые свидетельствуют о перестройке клеточного метаболизма под вов-действием веществ. Вероятнее всего передача сигнала не связана с фосфодиэстеразной системой., и дальнейшей нашей эадачей была проверка влияния веществ на аденилатциклаэную активность.

Выло установлено, что активность аденилатциклазы в клетках дрох-

лей после обработки веществами возрастает, что свидетельствует об участии фермента в процессах передачи сигнала(рис. 11). Эти данные , , позволяют предположить, что передача сигнала внутрь клетки осуществляется путем активизации аденилатциклаэной системы.

Изучение действия экаометаболитов СИ4 С. gl.utasii.oum ка продуктивность по биомассе и лизину при рааличиьк концентрациях Сахаров.

Из литературы иэвестно(Руклиша и др. ,1978), что повышение кон. центрации углеводов в среде более 10% при культивировании бактерий рода СогупеЬаоЬеПшп приводит к удлинению лаг-фазы, повышению скорости роста клеток и снижению лиэинсинтёвирующей активности культуры, а следовательно, к повышению продуктивности процесса по биомасе и снижению по лизину. Данное явление было объяснено тем, что соотноше-, ние активности ферментов гликолиза и цикла трикарбоноьлх кислот изменяется в пользу гликолиза . Учитывая данный факт, было предположено, что исследуемые экзометаболиты активируют цикл трикарбоновых кис.:от и ингибируют гликолиз, вызывая тем самым увеличение лиаинсинтеэирующей активности. Для' подтверждения этой гипотезы была проведена серия экспериментов по культивированию бактерий в периодических условиях в течение 72 часов с различной концентрацией.РВ (табл.10).

Было обнаружено, что прк концентрации РВ до 10% еквоиетйболзягы увеличивают выход • биомассы до 13Х и лизина до 20% по сравнению о • контролем. При РВ-15% концентрация лизина к биомассы при внесении зк-вометаболитов различной-степени очистки резко падает. Вероятнее всего, при концентрациях Сахаровы до 10% вещества ингибируют ферменты

рис.11 Влияние СМФ дрожжей на активность

аденилатциклаэы

1-контроль 2-концентрация цАМФ при обработке СМФ

- 24 -

Культивирование С. дЫЬаггисит с различной Таблица 10 концентрацией РВ в присутствии экэоыетаболитов.

1 в контроль СМФ 1 1 16,7 1 16,8 1 1 31,6 | 39,0 1 1 | 2,01 1 1 2,32 1 1 1

| 10 контроль СМФ о 1 1 16,Б 1 16,7 1 1 32,8 1 38,3 1 1 1 1,99 1 1 2,05 Г 1 1

1 13 контроль ОМФ 1 1 19,6 I 16,8 1 I 20,3 I 30,2 1 1 1 1,04 | 1 1,23 | 1 |

1 16 [ контроль НП ВП НП *■ ВН СМФ 1 1 19,7 1 12,6 1 И,6 1 11,1 1 13,5 1 1 8,1 1 4,6 1 6,2 1 6,1 1 5,2 1 | 0,41 | 1 . 0,37 | 1 0,46 | 1 0,46 | 1 0,39 | 1 ... I

гликолиза, а при высоких концентрациях Сахаровы более 13-14% происходит ингибирование ею цикла трикарбоновых кислот, в результате чего ингибируются оба пути утилизации углеводов в присутствии веществ , что приводит к резкому уменьшению выхода биомассы и лизина к 72 часу культивирования.

Таким образом, можно предположить, что увеличение выхода ливина и биомассы в присутствии ОМФ обусловлено ингибируюшнм действием ауто-регуляторов на ферменты гликолива, в результате чего соотношение активности гликолиза и ЦТК смещается в польбу последнего.

Перспективы использования работы на примере производства кристаллического лизина.

Результаты, представленные в предыдущей главе, свидетельствуют о возможности интенсификации производства лизина путем возврата на ферментацию компонентов культуральвой жидкости, не являющихся целевым продуктом. Очевидно, наиболее рационально использование эффекта оти-

мулирования синтева целевого продукта другими экзогенными метаболитами микроорганизма - продуцента в технологии, предусматривающей получение очищенного продукта. В этом случае культуральная жидкость разделяется на поток, содержащий целевой продукт, и побочные фракции, часть нэ которых может благотворно влиять на биосинтез. С этой точки зрения эффект стимулирования синтеза лиеина может найти практическое применение прежде всего в технологии получения кристаллического продукта.

Выли проведены эксперименты со средней фракцией культуральной жидкости, полученной с различных стадий очистки на опытной установке Трипольского БХЗ по производству кристаллического лизина. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 12.

Влияние средней фракции с различных стадий Таблица 12 выделения лизина на ливинсинтезирующую активность и концентрацию биомассы бактерий С. (»1иЬалисит.

I средней | рация рация |по лизину, биомассе, |

| фракции | лиэина, | биомассы, 1 2 1 X |

I г/л 1 I г/л 1 1 1 |

| контроль 1 1 36,7 1 1 21,6 | 100 1 100 1

| КУ-2х0 N3+ ! 36,9 23,0 1 100,6 106,5 |

| осветленный Г ; 1

| маточник 1 44.0 1 18.6 | 119,8 86,6 |

| неосветленныП* I 1 . I

I маточник 1 I 42,3 | 1 21,7 1 I 11Б,2 1 100 | 1

а- неосветлунный маточник получен из схемы выделения о отсуствием стадии очистки активированным углем.

Средняя фракция стока колонны КУ-2х8 На»- не пкагнваег стимуляции на биосинтез лизина. А Фрчкпии, полученные <•.:■. .х-г-етлешгаго и не-осветлеиного маточника, оказывают стимулирумщнй эФ.Ч-кт по биосинтеву лизина, что'позволяет сделать зывод о наличии в этик .ракииях списанных вы е стимуляторов. Полученные данные позволяет предложить усовершенствование технологии производства кристаллического лизина, путем введения стадии ультрафильтр-пшенной очистки маточника, полученного после кристаллизации лизина, и возврата концентрата мембранного разделения, маточника на стадию Ферментации. Использование данной схемы

позволит уь-личигь конечную концентрацию лизина в культуральной жидкости, а также утилизировать до 10% стоков.

Для обоснования экономической эффективности предлагаемого варианта усовершенствования схемы производства кристаллического лизина был произведен расчет. Расчет показал, что процесс возврата фракции культуральной жидкости в производстве лизина с использованием мембранной технологии, достаточно экономически эффективен, так как увеличивая выход лизина на 10%, приходим к уменьшению себестоимости продукции на 1,43%.

ВШОДУ '

1. Иэ культуральной жидкости дрожжей Candida utilis ВСБ-6Б1 и бактерий Corynebacterium glutamioum 96 методом ультрафильтрации была выделена фракция экзометаболитов с Я М. Б-БО КЦа, оказывающая стимулирую-

.щее действие на3рост продуцентов и биосинтез лизина у бактерий. Эффект аутостимуляции выражается в сокращении яаг-фазы и увеличении экономического коэфициента трансформации субстрата в целевой продукт, что приводит к увеличению конечной концентрации биомассы дрожжей С. util is на 8-12%., и конечной концентрации ливина в среде культивирования бактерий С. glutamioum на 10-15%. .

2. Проведена очистка дрожжевых и бактериальных экзометаболитов методами ультрафильтрации и гельфильтрации. Показано, что активные начала аутостимуляторов дрожжей Candida utilis и бактерий Carynebaoterium

. glutamicum локализованы в двух фракциях о молекулярной массой 9 кДа и 39 кДа, 14 кДа и 4Б кДа, соответственно! На основании химического анализа фракций, обнаружившего наличие аминокислот, углеводов и ами-носахаров, аутостимуляторы отнесены к гликопротеинам. . • 3. Показано, что максимум продуктивности дрожшми С. utilis физиологи, чески активных экзометаболитов сопряжен с экспоненциальной фазой роста.

4. Выдвинуто предположение, что стимуляция роста дрожжей под влйянн-ем внеклеточный гликопротеинов опосредуется через адешшатциклазную систему клеток.

6. Показана зависимость ростстимулирумцего и лиэинстимулирующего действия гликопротеинов. у бактерий С. glutamioum,от концентрации углеводного субстрата: при концентрации углеводов более 14-1Б2 з присутствии Физиологически активных экзометаболитов ингибируется рост культуры и биосинтез лизина, в то. же время при концентрации углеводов ниже 12-13% повышается выход лизина.

6. Показана принципиальная возможность использования результатов ра-

боты в процесса получения кристаллического лиэина, путем возврата стимуляторов па стадию ферментации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Подобрянекий О. С. , Кузнецов А. Е. Культивирование продуцентов лизина, в мембранном биореакторе. //Тезисы докл. Всее. научно-технической конференции " Основные направления совершенствования и создания• нового оборудования для медицинской и микробиологической промышленности".-!!.: ЩНГЮШЩ-ИЕМАШ, 1988.

2. Подобрянский О. С.Кузнецов A. Е., Манаков М. а , Зайцева 3. М.- .Особенности влияния фракций мембранного разделения нативных растворов продуцентов лиэина на накопление биомассы и синтез лизина. // Тезисы докл. Всее. конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроор-. ганпэмов". - Пущино,1990.

3. Подобрянский О. С., Кузнецов А. Е. , Манаков М. Н. Влияние фракций гембршшого разделения нативных растворов продуцентов лиэина на накопление биомассы синтез лиэина.// Тез. докл. международной школы ''¡/лкробный синтез биологически активных веществ и их применение". -Г>арна, 1990.

4. Подобрянский О. С. , Кузнецов А. Е. , Манаков М. а Влияние фракций культурзльной мадкостн на рост дрож*ей Candida utilis.// Тез: докл. ме.-кдунарсдной кколы "Микробный синтез биологически активных веществ и их применение". - Варна, 1990.

Подобрянский О. С. , Кузнецов !А. Е. Использование продуктов жизнедеятельности микробных продуцентов белка и аминокислот для повыпения эф-фектизноси. целевого, биосинтеза и уменьшения отходов производств.// Tea. докл. симпоз. " Микробиология и охрана биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия". - Оренбург,1991

6. Подобрянский 0. С. , Кузнецов А. Е. , Манаков Si Н. Влияние фракции культуральной жидкости 5-50 кД на рост дрожией 'Jandtda utilis. //Биотехнология, N6, 1991,с. 40-43.

7. ПодсОрянский О. С., Лахтин ЕМ., Кузнецов А. Е. , Цыряпкин В. А. , Ямс коп И. А. , Манаков М. Н. Изучение высокомолекулярных ауторегуляторов биосинтеза Candida utilis и бактерий Corynebacterium glutamioum.//Биотехнология, Н4, 1993,с. 10-13.

8. Подобрянский О. С. , Белов А. П. , Кузнецов А. Е. , Зинченко Г. А. Изучение закономерностей выделения и механизмов воздействия ауторегуляторос из дрокиэй Candida utilis.//Микробиология, N6, 1993, в печати.

Информация о работе

Подобрянский, Олег Семенович
кандидата биологических наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы