Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменчивость длительной непрерывной промышленной культуры дрожжей рода CANDIDA

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изменчивость длительной непрерывной промышленной культуры дрожжей рода CANDIDA"

г п

., - ^

; I

\ \ НОЯ

На правах рукописи

ЛАЛОВА }МРГАРЙТА ВИТАЛЬЕВНА

!!2!ЗИЧГ!ВС(Ш> ДПТЗШЮЯ 1ЕПИЗРИЗК0Й ЙР0!55ШШ!0Й ПОДДОН! ДРОЖИ! рода спаям.

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете ш. Д.К.Менделеева на кафедре промышленной биотехнологии и в Государственном научно-исследовательском институте биосинтеза белковых веществ

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Грздава Нина Борнсозиа

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор

Псзиагова Крина Николаевна

кандидат биологических наук Исакова Елона Павлоша

Кафедра биотехнологии Московской медицинской Академии им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится в 40 часов на заседании диссертационного Совета по биотехнологии Д.054.34.13 в РХТУ им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл.. дом 9.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан " 1996 г.

Уче1Ш секретарь

диссертгцмониого Совета Д. 053.34.13 /

кандидат биологических наук 4-/ Гусева И.И.

ВЕШНИЕ

В результате широких исследований, проведенных в 50-80-ые годы нашего столетия, разработаны основные положения теории и практики непрерырного культивирования.Теоретически обосновано и рядом авторов в лабораторных условиях подтверждено экспериментально проявление автоселекционных процессов при непрерывном культивирований микроорганизмов, отбор ферм, имеющих селективное преимущество при условиях культивирования, обладающих большей удельной скоростью роста и более низким значением величины Кг [Печуркин, 1878]. В то же время, другими авторами наблюдалась стабильность длительной непрерывной культуры в течение времени, соответствующего нескольким тысячам генераций. Однако, системные исследования изменчивости популяции микроорганизмов при длительном хемостатном культивировании практически отсутствуют.

Актуальность исследований эволюционных процессов в настоящее время определяется общим повышенным интересом к переходу от их познания к управлению с целью сохранения существования большего числа видов [НегЬег* еЬ а1, 1956; Печуркин, 18783.

В области биотехнологии практический интерес к автоселекционным процессам при непрерывном культивировании определяется необходимостью разработки режимов, обеспечивающих стабильность по-каэателей производительности процессов и получение популяции микробных клеток селекционированного штамма с заданными физиоло-го-биохимическими свойствами, а также микробной биомассы стабильного состава.

Одним из наиболее освоенных промышленных биотехнологических производств, основанных на использовании длительного непрерывного культивирования, является производство белка одноклеточных (ЗСР), в том числе и кормовых дрожжей, получаемых из к-парафинов (торговое наименование продукта - паприн). Ряд особенностей технологии производства паприна, таких как использование незащищенных условий ферментации, периодичность замены культуры б ферментерах, мойки и дезинфекции оборудования, используемый единый поток рециркулируемой культуральной жидкости, а также длительный период работы по такому регламенту предприятий дает основание определить производство получения паприна как специфическую тех-

нологическую экосистему, как уникальную модель для изучения изменчивости популяции микроорганизмов в условиях длительного непрерывного культивирования.Исследование вектора отбора и степени изменчивости популяции непрерывной промышленной культуры в биотехнологическом производстве необходимо для разработки режимов культивирования.

Цель» настоящих исследований являлось изучение автоселекционных процессов при длительном непрерывном культивировании микроорганизмов. Данная цель достигалась изучением изменчивости морфолого-физиологичееких свойств популяции длительной непрерывной промышленной культуры микроорганизмов в сравнении с исходными музейными штаммами.

В задачу исследовании входило изучение идентификационных признаков доминирующих в промышленных ферментерах штаммов,сравнительное изучение промышленно ценных свойств культур, таких как вирулентность, скорость роста, кинетика потребления углерода, отношение к продуктам метаболизма и состав биомассы.

В качестве модели были исследованы длительные непрерывные промышленные культуры производства кормовых дрожжей на Киришс-ком, Новополоцком и Светлоярском заводах.

Научная иашвна. Впервые при использовании в качестве модели техногенной длительной непрерывной культуры дрожжей (более 20 тыс. генераций) с высокой плотностью популяции (более 104В клеток) показано проявление микрозволюционных процессов отбора форм, отличающихся от культивируемых штаммов рядом количественно варьирующих признаков, которые определяются вектором и давлением отбора. Показан отбор форм с повышенной активностью окислительного метаболизма и повышенной потребностью в факторах роста. Впервые показана возможность идентификации штаммов дрожжей рода Candida при использовании комплекса методов: дифференциальных питательных сред, иммунохимического метода, пульс-электрофореза. Полученные данные дают возможность оценить масштабы микроэволюционных процессов в длительной непрерывной культуре микроорганизмов.

Практическая значимость. Практически подтверждено доминирование промышленных селекционированных штаммов дрожжей рода Candida в неасептических условиях длительного непрерывного куль-

тивирования при использовании элективной среды (pH среды, источник углерода, температура и др.5, Впервые экспериментально доказана стабильность практически ценных свойств в процессе длительного непрерывного культивирования промышленных штаммов дрожжей рода Candida, характеризующих их санитарно-гигиенические свойства и свойства, обеспечивающие производительность технологических процессов и состав получаемой биомассы.

Полученные данные обосновывают возможность использования длительных непрерывных процессов для получения микробной биомассы стабильного состава и физиологических свойств.

Показана возможность использования эритроцитарного диагностику}^, полученного к одному штамму дрожжей Candida maltosa для микробиологического контроля при работе с дрожжами других штаммов Candida ml tosa и других видов р. Candida.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзоре литературы, описания объектов и методов исследования. результатов экспериментальных исследований. Работа завершается общими выводами и заключением. Работа изложена на 131 страницах машинописного текста и иллюстрирована 10 рисунками и 25 таблицами. Библиография содержит 160 наименований, из них 45 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты я методы исследования

В работе использовались промышленные штаммы дрожжеподобных грибов рода Candí efe из коллекции института ГосНИИеинтезбелок: С. mi tosa ВСЕ-744, С.maltosa ВСБ-777, С.maltosa ВСБ-899, С. tropicalis ВСБ-928, С.rugosa БСБ-925, а также выделенные из промышленных ферментеров Киришского, Светлоярского и Еовополоц-кого заводов доминирующие штаммы дрожжей. Для идентификации дрожжей кроме стандартных методик (Дяодер, 1980) использовали разработанные дифференциальные среды (Ряпис и др., 1990, 1991, 1992), позволяющие идентифицировать штамм С.maltosa БСБ-744 и видовую принадлежность дрожжей С.mi tosa и С. tropicalis.

Исследовали иммунологические свойства штаммов с иепользова-

нием эритроцитарного диагностикума, полученного к штамму дрожжей С. mal tosa ВСБ-SSQ в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) в соответствии с "Методическими указаниями" (1984), а также сравнение ДНК дрожжей методом пульс-злектрофорева.

Вирулентность доминирующих в промышленных ферментерах штаммов исследовалась на кроликах породы Шиншилла совместно с сотрудниками Российского Государственного Медицинского Университета.

Характер потребления углерода исследовался при использовании метода радиоактивных индикаторов.

Кинетика роста определялась при периодическом культивировании дрожжей в асептических условиях в ферментере "Фермуе".

Результаты исследований и их обсуждение.

Выделение и идентификация дрожжей, доминирующих в промышленных ферментерах.

Из изолятов, отобранных из промышленных ферментеров трех заводов, были получены в виде чистых культур 12 доминирующих штаммов дрожжей. Изучение идентификационных признаков выделенных культур проводилось в сравнении с промышленными штаммами.

Сравнительные исследования идентификационных признаков в соответствии е руководством Ллодер (1980) показало, что среди дрожжевой микрофлоры в промышленных ферментерах доминируют дрожжи рода Candida, видовая принадлежность которых аналогична дрожжам, используемым для получения и подсева инокулята из отделения чистой культуры. При этом было показано, что результаты ассимиляционного теста одинаковы как для коллекционных промышленных штаммов, так и для доминирующих в промышленных ферментерах. В то же время все выделенные из промышленных ферментеров культуры по тесту сбраживания Сахаров характеризуются значительно меньшей активностью, чем музейные штаммы, что свидетельствует об автоее-лекции форм с большей активностью окислительного метаболизма. Однако, различия по данному признаку не выходят за рамки идентификационных свойств определяемых видов.

При использовании дифференциальных питательных сред, содер-

- Б -

Таблица 1.

ЙЛбЖЕЗфзшдаа игашоз дрозксЗ, дошзщрукзяа в прошгалетпог фэрызяторах.

Штаммы, используемые для получения иноку-ля та (последние 5 лет)

Новополоцкий завод БШ С.maltosa ВСБ-744

Киршский ВХЗ С. mi tosa БСБ-899

Светлоярский завод БЕК С.tropicalis ВСЕ-928 С.rugosa ВСВ-925

Доминирую-щй

ВИШМ

пг

N1

N3 N4 N5

Результаты идентификации

по

Ллодер

С. maltosa

С. ml tosa

С. tropicalis C.rugosa

дифференциальные питательные среды

С. mi tosa ВСБ-744

С,maltosa

С. tropicalis ___i»___

шмуно-химический метод

С. maltosa ВСБ-889

пульс электрофорез

С.mal tosa ВСБ-899

жащих бромкрезоловый зеленый, родамин 63 и акрифлавин в различных концентрациях, была подтверждена принадлежность доминирующих в промышленных ферментерах дрожжей к видам С.tropicalis и С. mi tosa, а также идентифицирован штамм N2 как С. mi tosa ВСБ-744. Идентичность штамма N2 и иташа С. mal tosa ВСБ-744 была показана также при исследовании их ДНК методом пульс-электрофореза.

Результаты исследования экстрактов биомассы промышленных штаммов дрсшсей. и изалятов, выделенных из промышленных ферменте-

- б -

ров методом РИГА с зритроцитарным диагноетикумом полученным на основе штамма C.mltosa ВСВ-899, показывают, что изученные штаммы различаются по содержанию специфического белка, определяемого методом РИГА. Равные показатели с базовым штаммом ВСБ-899 по содержанию специфического белка, что свидетельствует об общности их антигенных компонентов, были получены при тестировании штамма N1, что подтверждает полученные ранее результаты о том, что штамм N1 является аналогом штамма ВСВ-899.

Гомологичность антигенных компонентов штамма C.mltosa ВСВ-744. и его промышленного аналога штамма N8 составляет только 50% по отношению к таковым штамма C.mltosa ВСБ-899.

По идентификационным признакам дрожжи С. tropicalis близки к представителям дрожжей C.mltosa (различия в способности ассимилировать крахмал). Особенность дрожжей этого вида штаммов С. tropicalis ВСБ-928, N3 и N4 была определена при тестировании диагностических препаратов на уровне 50% общности антигенных структур. Эти данные подтверждают аналогичность промышленных штаммов N3 и N4 и штамма BCS-928. Ранее было показано (Ряпие И.В. и др., 1992), что изученные штаммы дрожжей C.mltosa ВСБ-899 и ВСБ-744 характеризуются рядом штаммовых различий и могут быть идентифицированы на индикаторной среде с бромкрезоловым зеленым. При использовании зритроцитарного диагностикума подтверждены различия этих штаммов при определении 50Z гомологичкос-ти их антигенных компонентов.

Что касается дрожжей C.rvgosa, то они значительно отличаются по идентификационным признакам от дрожжей вида C.mltosa и С.tropicalis, и гомологичность антигенного состава штамма C.rugosa BCB-3S5 и его промышленного аналога штамма N5 определена на уровне 12,5%.

Результаты проведенных исследований показали возможность использования стандартного зритроцитарного диагностикума, несмотря на его недостаточную специфичность и чувствительность, для иммунодиагностики не только разных видов дрожжей рода Candida, но и штаммов одного вида на основании определения относительного содержания общих антигенов в экстрактах целых клеток дрожжей.

Таким образом, полученные результаты по изучению идентификационных признаков штамыоЕ, выделенных из изолятов, отобранных

из промышленных ферментеров показали, что несмотря на незащищенные условия выращивания, в промышленных условиях доминируют селекционированные штаммы дрожжей, которые используются для получения инокулята. Скорость роста этих дрожжей при условиях культивирования, определяемых регламентными параметрами (оптимальная для роста температура, рН 4,2-4,5, D - 0,16 - 0,17 i/час. концентрация в среде культивирования азота, фосфора и углеводородов), обеспечивает их конкурентоспособность по отношению к посторонним штаммам дрожжей.

Изучение кинетики роста культуры.

Результаты исследования кинетики роста доминирующих в промышленных ферментерах культур в сравнении с музейными штаммами показали, что при использовании глюкозы в качестве единственного источника углерода удельная скорость роста музейных и соответствующих им доминирующих промышленных штаммов близки. Б то же время, продолжительность лаг-фазы музейных штаммов меньше, чем у доминирующих в промышленных ферментерах.

При изучении активности роста дрожжей на н-парафинах показано, что добавление к среде дрожжевого автолизата приводит к сокращению лаг-фазы и не влияет на удельную скорость роста как музейных, так и доминирующих промышленных штаммов. Показатели удельной скорости роста музейных штаммов и соответствующих км промышленных штаммов близки между собой (таблица 2).

Показано, что удельная скорость роста доминирующих промышленных штаммов не превышает таковую исходных музейных при использовании как глюкозы, так и н-парафияов в качестве единственного источника углерода на среде с добавлением и без добавления дрожжевого автолизата. Однако,отмечается увеличение продолжительности лаг-фазы у выделенных из промышленных ферментеров штаммов, как при их культивировании на среде с глюкозой, так и на среде с н~парафинами- без добавления дрожжевого автолизата.

Исследование структуры популяции исходного музейного штамма С.maltosa БСБ-744 и его промышленного аналога С.mi tosa N£ по признаку активности роста не выявило различий в гистограмме аз-

Таблица 2.

Показатели роста дрожжей при использовании н-парафинов в качестве единственного источника углерода и энергии иа среде с добавлением дрожжевого автолизата (1) и без него (2)

Музейные и выделен- ¡темпе- ¡продолжи- ¡Удельная скорость ные промышленные ¡ратура ¡тельность ¡роста культуры/!, доминирующие ¡культи-1лаг-фазы, I 1/час

штаммы 1вирова-1 час I

1ния, С I_

I i I 2 1 1 12

С.maltosa ВСБ-744 32 N2 32

С.maltosa BCB-89S 32 NÍ 32

С. tropicalis ВСБ-928 SS НЗ 32

N4 39

3,5 0,34+0,05 0,33+0,05 4,С 0,38+0,05 0,32+0,05

3,0 4,5 0,33+0.05 0,32+0,05 3,2 5,0 0,32+0,04 0,32+0,05

8,0 0,33±0,05 0,32+0,04 8,5 0,3310,04 0,33+0,05 7,5 0,32±0,03 0,32i0,04

3,0 4,5 4,0

2,8

менчивостй этих штаммов. Отсутствие сдвига модального класса (рис.1) гистограммы показывает отсутствие перестроек в популяции промышленного штамма N2 по сравнению с- популяцией исходного музейного штамма по изучаемому признаку. Это свидетельствует об отсутствии проявления мжрсзволюционных процессов отбора положительных мутаций по признак скорости роста.

Учитывая непрерывный рецикл кулътуральной жидкости в промышленных условиях, что приводит к присутствие в среде выращивания гаммы продуктов метаболизма и автолиза дрожжей, изучено влияние водорастворимых продуктов метаболизма на рост штаммов дрожжей С.maltosa ВСБ-744, BCB-88Q, N2 и NS, Для этого культуры вы-

ращивали в среде с добавлением супернатанта культуралыюй жидкости, полученной после выращивания дрожжей в течение 30 часов, в количестве 10Х, 30£, 60% (70%) ( таблицы 3. 4).

В результате эксперимента было выявлено, что добавление к среде продуктов метаболизма приводит к значительному сокращению лаг-фазы дрожкей и не оказывает значительного влияния на удельную скорость роста изученных штаммов.

Так, при добавлении в среду метаболитов культуры С.да!¿аза ¿СБ-В99 (60% фильтрата культуральной жидкости) продолжительность лаг-фазы данного штамма снизилась с 4,5 час дс 2.0 час, штамма "1 ~ с 5,0 до 1,5 час, а удельная скорость роста ВСБ-899 повысилась е 0,33 до 0,35 1/час. Продукты метаболизма штамма ВСБ-899 оказывают аналогичное влияние на рост ВСБ-744 и N2, продолжительность лаг-фазы для БСВ-744 снизилась, соответственно, с 3,5 до 2,5 час, для N2 - с 4,5 до 2,С Характер воздействия

фильтрата культуральнсй жидкости штамма ВСБ-744 на рост этих же дрожкей не отличается от такового фильтрата культуралькой жидкости штамма ВСБ-899. Полученные результаты показали практическое отсутствие влияния водорастворимых метаболитов углэводсродо-кислящих дрожжей на скорость роста доминирующих в промышленных ферментерах итаммов М1 и N2. Характер влияния фильтрата культу-ральной жидкости на продолжительность лаг-фазы аналогичен влиянию дрожжевого автолизата.

Проведенные исследования по изучен»® влияния фильтрата культуральной жидкости ка рост дрожжей, с одной стороны, свидетельствует об адаптации доминирующих в промышленных ферментерах штаммов к повышенному содержанию продуктов метаболизма в среде

го

iо

2О

Ю

<аШ.

3 Ч Ь~

f S 9 Ю

ОПСУ,

< 234*6 /о

Рис.1. Изменчивость по признаку "скорость роста" дрожжей Candida, maltosa.

I - С, mal tosa ВСБ-744;

II - доминирующий в ферменте-

ре штамм С.maltosa N2.

ОПа,

Таблица 3.

Влияние фильтрата куяьтуражькоЯ жидкости штамма С. mal tosa ВСБ-WV на удельную скорость роста и продолжительность лаг-фазы дрожжевых штамыст Ш, И2, ВСБ-744 и ВСБ-899.

Содержание фильтрата I Удельная скорость ¡Продолжительность в среде роста, 7, I роста, р, 1/час 1 лаг-фазы, час

ВСБ-899 N1 ВСБ-899 N1

0 0,33+0,05 0,32+0,02 4,5 5,0

10 0,34±0,03 0,34+0,04 3,5 3,5

30 0,34+0,04 0,34±0,03 2,5 2,5

60 0,35+0,03 0,3510,03 2,0 1.5

ВСБ-744 N2 ВСБ-744 NS

0 0,34¿0,04 0,32±0,03 3,5 4,5

10 0,33±0,05 0,31±0,03 3,0 4,0

30 0,31±0,04 0,30±0,04 £,5 3,0

60 0,3310,03 0,31¿0,04 2,5 2,0

культивирования, с другой стороны, о нейтральном типе взаимодействия между изученными культурами. Последнее дает основание полагать наличие пассивного антагонизма между ними, что было исследовано при совместном культивировании изучаемых культур.

Совместное культивирование штаммов (исходное соотношение 1:1) проводилось как на среде с добавлением дрожжевого автолиза-та, так и без него (таблица 5). Результаты подтверждают выявленный ранее характер влияния дрожжевого автолизата на рост культур. т.е., его воздействие на сокращение продолжительности лаг-фазы смешанных культур с 5,5 - 6,0 час до 3,5 час, и при этом отсутствие влияния на удельную скорость роста как индивидуальных культур, так'и составленных консорциумов.

При культивировании консорциума музейных штаммов С.maltosa ВСВ-744 и ВСБ-899 и их промышленных аналогов штаммов С.maltosa N1 и N2 наблюдалось постоянное вытеснение дрожжей C.mltosa

Таблица 4.

Ешшкз фильтрата кулвтурааной вэдкссти штамма С. aal tosa ВСБ-744 на удаганум скорость роста и продолягзтольмость лаг-фаза дрожшзнж штанмоз .41, 112, ВСБ-744 я БСБг-899.

Содержание фильтрата I Удельная скорость I Продолжительность в среде роста,% I роста, .уи, 1/час I лаг-фазы, час

ВСБ-899 N1 ВСБ-899 N1

0 0,33±0,02 0,32+0,02 4,5 5,0

10 0,3310,03 0,33+0,04 4,5 3,5

30 0,3410,03 0,34±0.03 4,0 3,5

70 0,35+0,05 0,33+0,03 4,0 3,5

ВСБ-744 N2 ВСБ-744 N2

0 0,34±0,04 0,3210,04 3,5 4,5

10 0,33±0,05 0,33±0,04 3,0 4,0

30 0,32±0,03 0,3210,03 2,5 3,0

70 0,32±0,03 0,31+0,05 2,0 2,5

ВСБ-899 и N1, соответственно, штаммами ВСБ-744 и И2, характеризующимися незначительно большей удельной скоростью роста, соответственно, 0,33 и 0,34 1/ч (таблица 5).

Результаты проведенных исследований по изучению автоселекционных процессов, происходящих при длительном непрерывном культивировании в промышленных условиях подтверждают теоретически обоснованный ранее и экспериментально показанный рядом исследований отбор форм, обладающих большей скоростью роста и имеющих селективное преимущество в условиях культивирования.

Выбранные для исследования в качестве модели два штамма С.maltosa ВСЕ-899 и ВСБ-744, для которых выявлены индифферентные взаимоотношения и разработаны надежные идентификационные системы, позволили проследить проявление пассивного антагонизма при непрерывном культивировании этих штаммов. Так, популяция дрожжей С. mal tosa ВСБ-744, удельная скорость роста которых незначительно превышает удельную скорость роста штамма С. mal tosa ВСБ-899, со-

- 1л ~

Таблица 5.

Показатели роста индивидуальных к смешанных культур дрожжей на среде с н~парафинам» с добавлением дрожжевого авюлизата (1) и бег добавления дрожшвого ззтолизата (2),

Компоненты смешанной кули, туры дрожжей Удельная скорость роста, JU, l/час Длительность лаг-фазы, час £еодер-i жания j штамма ! ВСБ-893'i черзв |

1 ; 9 2. 1 л, 1 i i i r? ¿s 24 час | КУ/lbT. i

0. mi tosa BCS-744 С. ml tosa EVE-399 !■ ¡ 0,34+0,0410,33x0,04 ....... i......... ! ! 3,5 i . J 5,5 35 i

С. ml tosa ВСБ-744 *■ С. ml tosa N1 ; 0,34±0,03I0,34+0.08 í 3,5 I 1 5,6 36 i

С. ¡mi tosa ВСЕ-899 -С.mal tosa N£ ! 0,34+0,0210,33^0,08 i ! £',51 i 6,0 Г--Г- } Ot 1

С,m1 tosa БСБ-744 0,34+0,0210,34+0,08 1 3,0| i 3,5

C. ml toss БСБ-89У 0,3310,04»0,32+0,03 i 3,0! ! 4,5

С.mal tosa № 0,33+0,03!0,33+0,04 i 3,5! í 4.5

C. mi tosa N2 0(34±0.03!0,33+0,08 ¡ 3,0! 1 4,0

ответственно, 0,34 к 0,35 !/ч, вытесняет популяцию последнего штамма как в промышленных условиях Ково-Полоцкого завода, так и б модельных лабораторных условиях.

Исследование активности роста исходных мувейных штаммов и дошшфрзщих в зроаьшшенвых ферментерах, а также изучение изменчивости их популяций по признаку активности роста свидетельству-

ет об отсутствии изменения структуры популяции культивируемых штаммов по данному признаку в процессе длительного непрерывного культивирования, что, следовательно, дает основание говорить об отсутствии проявления микрозволюционных процессов по изучаемому признаку на протяжении времени равного ~25-30 тыс. генераций популяции дрожжей з условиях, когда скорость протока среды в промышленных ферментерах CD - 0,17 -- 0,20 1/ч) значительно ниже максимальной удельной скорости роста этих штаммов (ju ~ 0,3 - 0,4 1/ч).

Исследование характера потребления углерода С14-н-октадекана дрожжами рода Candida.

Можно предполагать, что вектор отбора в промышленных условиях может быть направлен на отбор форм с измененной кинетикой потребления н-парафинов, активного окисления алканов. При использовании С14-н-сктадекака была изучена кинетика роста и потребления алкана соответствующими музейными и промышленными штаммами. Результаты исследования показали, что эффективность потребления углерода н-октадекана доминирующим в промышленном ферментере штаммом NB несколько снижена по сравнению с коллекционным штаммом ВСБ-744 (таблица 6). Коэффициент использования углерода, соответственно, 82,8 и 89,0%, что связано с большим выделением С02 штаммом N£ (12,9 и 8,3%, соответственно), а также л зкзацеллюлярных водорастворимых продуктов метаболизма (Ч ,3 и Я соответственно).

Аналогичная закономерность наблюдалась при сравнительном культивировании дрожжей С.maltosa ВСБ-899 и промышленного штамма Ml на среде без добавления дрожжевого автолизата.

Данные таблицы 6 показывают, что при добавлении дрожжевого автолизата в среду роста увеличивается количество углерода, идущего на построение биомассы, у штаммов С.maltosa ВСВ-8Э9 и N1 с 67,7 до 69,1 % и с 50,8 до 68,4%, соответственно. Причем, влияние автолизата на усиление конструктивного обмена у штамма N1, выделенного из промышленного ферментера, выражено в большей степени, чем у исходного штамма.

Присутствие автолизата в среде приводит к некоторому увели-

Таблица 6,

Баланс углерода при развитии дрожжей на С14~к-октадекаие

(в 7. от заданного (1) и потребленного (2) источника углерода)

Исследуемые Присутствие Содержание углерода

штаммы автолизата в_____

среде куль- остаточные С02 водорас биомасса тивирования углеводо- творимые

роды продукты

в кужьту-ральной жидкости

1 2 1 2 1 2 А П 1 &

С. та!Ьоза с автолизатом 3,4 - сс о 1 ¿.О, Ь Ы , А 1.3 1.3 69,1 71,6

ВСВ-839 без автолизата 4,5 - 25,5 18,5 2,2 2,57 67,7 77,9

N1 с автолизатом 5,7 - 23,9 25,3 2,0 2.1 68,4 72,5

без автолизата 32,1 - 14,3 21,1 2,7 4,1 50.8 74,8

С. та1 Юэа без автолизата 10,0 - 7,5 8,3 2,4 2,7 80,1 83,0

ВСБ-744

№ без автолизата 8,2 - 11,8 12,9 4,0 со 76,0 82,8

С. 1гор1саН£ с автолизатом 10,5 - 26,0 29,0 8,1 6,8 57,4 64,2

ВСБ-928

N3 е автолизатом 3,0 - 24,1 24,6 А Г> .1 12,5 60,8 62,6

N4 с автолизатом 2,4 - 29,2 30,5 16,5 17,2 50,1 52,3

чешш потребления н-октадекана, но существенно не повышает эффективности потребления углеродного субстрата. При этом отмечалось повышение интенсивности дыхания (доли углерода, выделяемого з виде С02) у обоих сравниваемых штаммов - с 21,1 до 25,3% для С.т1Ьоза А'2 и е 18,5 дс 27,1% - для С.т1 1ов& ВСЕ-889. Добавка автолизата, в известной мере, нивелировала отмеченные выше различия метаболизма между исходным и выделенным штаммами, что свидетельствует о большей потребности в факторах роста дрожжей, доминирующи б промышленных ферментерах, по сравнению е музейными.

Данные изучения состава биомассы показывают, что содержание низкомолекулярншс веществ в биомассе доминирующего в ферментере штамма N1 несколько выше по сравнению с исходным музейным штаммом ВСБ-899, 27,2 и 24,8%, соответственно. Однако, при добавлении . автолизата сглаживаются различия по содержанию низкомолекулярных веществ в биомассе обоих штаммов - снижаются до 24,1 и 23,71, соответственно.

Показано влияние дрожжевого автолизата на состав липидов исходного штамма ВСБ-899 и промышленного штамма N1. Содержание фосфолипидов в биомассе обоих штаммов на среде с ав~ ■толизатом выше, чем на среде без автолизата, соответственно, 40,4 и 26,6%. для ВСБ-893 и 41,4 и 33,5% для h'i. Присутствие автолизата в среде приводит к снижению содержания триглицеридов, повышению содержания жирных кислот. Т.о., добавление дрожжевого автолизата к среде роста оказывает существенное влияние на метаболизм изученных штаммов дрожжей, при -этом на доминирующий в промышленности штамм дрожжевой автолизат оказывает более выраженное влияние, чем на коллекционный. Из анализа распределения углерода между компонентами дрожжей С, tropicalis ВСЕ-928, N3 и N4 (таблица 6) отмечена некоторая тенденция к увеличению экза-целлюлярных водорастворимых продуктов, хотя эффективность потребления углерода изменяется незначительно. Так, содержание метаболитов в культуральной жидкости штамма ВСБ-928, Л'З, N4 -6,8%, 12,5%, 17,2Z, соответственно. Дыхательная активность у штамма N3 снижена по сравнению с ВСБ-928 и практически не различается для штаммов ВСБ-928 и N4.

Следовательно, результаты изучения фракционного состава биомассы термотолерантных дрожжей показывают, что штаммы, выделенные ив промышленных ферментеров, выделяют з среду большее количество метаболитов, чем исходные музейные штаммы. Состав биомассы изученных дрожжей различается незначительно.

Т.о., результаты проведенных исследований показывают, что присутствие б среде роста дополнительных питательных веществ за счет рециркуляции культуральной жидкости (продукты метаболизма и автолиза дрожжей в рециркулируемом потоке) приводит к изменениям в метаболизме выделенных доминирующих штаммов по сравнению с исходными музейными культурами.

Исследование степени патогенности дрожжей, выделенных из промышленных ферментеров.

Рециркуляция культуральной жидкости при непрерывном культивировании приводит к обогащению среды продуктами неполного окисления субстрата и белковыми продуктами ферментативного гидролиза и автолиза дрожжей. Такое изменение состава среды предполагает возможность отбора форм, характеризующихся не только сложными потребностями, но и возможной различной степенью вирулентности.

Результаты исследования вирулентности штаммов дрожжей, выделенных из промышленных ферментеров N1, N2. N3, N5, в сравнении с двумя патогенными штаммами С.albicans показали отсутствие патогенных свойств и не выявили их токсического воздействия на опытных животных (ни одно животное не погибло на девятый день эксперимента). Не обнаружено патологических изменений, не высеяно "ретро" культуры внутренних органов опытных животных, которым вводили инъекции выделенных исследуемых культур С.maltosa N1 и N2, С. tropicalis N3, С. rugosa N5.

Полученные результаты подтвердили данные, полученные ранее об отсутствии отбора вирулентных форм дрожжей в процессе длительного непрерывного культивирования на средах с углеводородам при рециркуляции культуральной жидкости.

Влияние длительности непрерывного культивирования на качество получаемого продукта.

При сравнительном изучении содержания белка в биомассе коллекционных штаммов и доминирующих в промышленных ферментерах не выявлено значимых различий. Анализ данных, полученных в институте ГосНИИсинтезбелок по содержанию белка в готовом продукте за 1988-1991 гг. также не выявил различий по содержанию сырого протеина в продукте заводов. Так, в паприне Новополоцкого завода содержание сырого протеина на протяжении ряда лет определялось на уровне 63-64Х, Киришского БХЗ - 62-63Х, Светлоярского завода - 61%.

Т.о., использование популяционного морфофизиологического

подхода к исследованию длительной непрерывной культуры дрожжей (-20-25 тыс.генераций), характеризующейся высокой плотностью популяций (2;-:lG K3sток), псзеолило лолужгь данные о действии естественного отбора в техногенной аейрзрьансй культуре, определить вектор и эффективность отбора.

вывода

1. Из длительной непрерывной культуры парафинокисляющих дрожжей рода Candida, ив промышленных Ферментеров трех разных заводов выделены доминирующие штаммы дрожжей, исследования идентификационных признаков которых (в соответствии е определителей Ллодер) показали, что их зидовая принадлежность аналогична штаммам, используемым для получения инокулята.

Z. Использование комплекса методов: дифференциальных питательных оред, иммунохимического метода и метода пульс-электрофореза, позволило идентифицировать доминирующие в промышленных ферментерах штаммы С.maltosa Vi и N2, соответственно, как музейные промышленные шташы С.maltosa БСЕ-SSS и ВСБ--744.

3. Показана возможность использования стандартного зритро-цитарногс диагнсстикума, полученного :< штамму С. ml toss ВСБ-83Э для микробиологического контроля при работе- с разными пташаш Candida maltosa и дрожжами других зидоз рода Candida.

4. При сравнении фенотипических признаков исходных музейных штаммов и штаммов, доминирующих в промышленных ферментерах, показана стабильность основных практически ценных признаков промышленных штаммов:

- практически равные значения удельной скорости роста при периодическом культивировании на среде с н-парафинами и с глюкозой;

- отсутствие различий з структуре популяции по признаку активности роста;

- идентичные показатели, характеризующие процесс пассивного антагонизма исходных парзфшгеккелящдх пташез С. nial tosa BCB-8Q9 и БСБ-744 к соответствующих кы промышленных аналогов С.maltosa N1 и ,"2 при совместном культивировании;

- отсутствие патогенных свойств и токсического воздействия на опытных животных пяти дошнирукшх в прсьаилекных ферментерах штаммов дрожжей;

- отсутствие различий в содержании сырого протеина и истинного белка в биомассе сравниваемых штаммов, в содержании липидов и изменений в составе липидной фракции при культивировании на С14~н-ок?адекане в присутствии дрожжевого автолизата;

- сопоставимые показатели эффективности потребления углерода С14-н-октадекана на срэде е дрожжевым автолизатом;

- одинаковый характер воздействия продуктов метаболизма уг-леводородокисляющих дрожей (фильтрат культуральной жидкости) на показатели их роста;

о. Выявлен ряд количественно варьирующих признаков у сравниваемых музейных и доминирующих в промышленных ферментерах штаммов, что свидетельствует с формировании интегрально приспособленкой промышленной популяции, о проявлении микрозволюшонных процессов;

- меньшзя сбраживающая активность ряда индивидуальных Сахаров доминирующими в промышленных ферментерах штаммами, что, однако, не выходит за рамки идентификационных свойств определяемых видов;

- повышенная потребность доминирующих штаммов в факторах роста. Показано влияние дрожжевого автолизата на сокращение лаг-фазы при их росте на среде с н-парафинами и на повышение эффективности потребления углерода С14--н-сктадекана.

6. Экспериментально подтверждена практическая стабильность промышленно ценных свойств длительной непрерывной техногенной культуры дрожжей, что обосновывает возможность использования длительного непрерывного культивирования для получения биомассы стабильного состава и стабильной физиологической активности в микробиологических производствах.

Осковкыз результаты диссертации опубликованы в работах:

1. ЛаловаК.В., Градова Н.В., Парфенова Е,В. Использование иммунсглобулинового зритроцитарногс диагностикума для щентнфи-

кации штаммов разных видов рода Candida. Сб. научно-практических трудов объединения "Биомедицинские технологии", вып.4, 1996.

2. DJemina A.M., Suckova I.G., Chodorovskaya V.A., Lalova M.V., Lasareva l.V., Radlushina I.V., Slnaev Y.A., Studies of the metabolites of yeast Candida according to the growth conditions// 15-th Int. Spec. Symp. on Yeast: Riga, Sept.30 -Oct.6, 1991, Abstr. - Riga, 1991, p.36.

3. ЛаловаМ.В., Градова Н.Б. Исследование микроэволюционных' процессов в промышленных популяциях дрожжей в условиях длительного непрерывного культивирования. - Биотехнология,1996, N7, с.26-31.

4. Лалова М.В., Градова Н.Б., Давидова Е.Г., Сазонова Л.П. Изучение стабильности свойств промышленных штаммов дрожжей при длительном непрерывном культивировании.- Биотехнология, 1996, N9.