Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование сезонных изменений в микросомальной фракции, обогащенной Na,K-АТФазой, из почек сусликов Spermophilus undulatus

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование сезонных изменений в микросомальной фракции, обогащенной Na,K-АТФазой, из почек сусликов Spermophilus undulatus"

московский государственный университет

имени М.ВЛОМОНОСОВА

ИИ4613158

удк 577.352.33

На правах рукописи

Басевич Евгений Викторович

ИССЛЕДОВАНИЕ СЕЗОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В МИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ, ОБОГАЩЕННОЙ ^,К-АТФазой, ИЗ ПОЧЕК СУСЛИКОВ БрегторИПт ипйиЫт

03.01.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 НО Я 2010

Москва-2010

004613158

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Рубцов Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович

доктор биологических наук Авдонин Павел Владимирович

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится 6 декабря 2010 года в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 1 ноября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Медведева М.В.

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Многие мелкие млекопитающие северных широт (грызуны, насекомоядные, рукокрылые) проводят зиму в состоянии глубокого оцепенения. Зимняя спячка таких животных (гибернация) является природным приспособлением, позволяющим выживать в условиях низких температур, недостатка кормов и воды [Lyman, 1982; Калабухов, 1985]. Во время спячки наблюдается примерно стократное снижение уровня метаболизма относительно активного состояния [Galster, Morrison, 1970], сопровождающееся снижением потребления кислорода в 45140 раз [Ануфриев, 2008]. В результате замедления обмена веществ животные остывают, но и в таких условиях они продолжают контролировать температуру тела, не позволяя ей опускаться ниже точки замерзания биологических жидкостей [Ануфриев, Ахременко, 1990]. Замедление процессов обмена веществ при гибернации происходит вследствие сложного комплекса физиологических и биохимических перестроек, направленных на экономию энергетических запасов [Geiser, 1988; Heldmaier, Ruf, 1992; Geiser, Ruf, 1995]. В результате этого энергозатарты оказываются снижены на 80—90% (даже с учетом затрат на разогревание тела при периодических пробуждениях) по сравнению с энергозатратами на поддержание постоянной температуры тела при той же температуре окружающей среды [Калабухов, 1985; Шмидт-Ниельсен, 1982].

При гибернации наблюдается замедление дыхания и частоты сердцебиения, торможение нервной деятельности и других физиологических процессов [Ануфриев, 2008]. Тем не менее, протекающий на низком уровне обмен веществ приводит к накоплению в крови метаболитов, однако в состоянии гипотермии образование мочи в почках не происходит [Попова, 1979]. Восстановление гомеостаза осуществляется только в процессе спонтанных кратковременных пробуждений между баутами спячки, во время которых обязательно происходит формирование и выведение мочи [Ануфриев, 2008]. В почках, где расход энергии на единицу массы больше, чем в любом другом органе, основным потребителем АТФ является Ыа,К-АТФаза, на работу которой в клетках почечных канальцев в норме тратится до 80% АТФ [Березов, Коровкин, 2002]. Толстые восходящие ветви петель Генле, сосредоточенные преимущественно в наружной медулле и частично в коре почек, особенно богаты Na.K-АТФазой, которая обеспечивает реабсорбцию ионов, метаболитов и воды в почечных канальцах [Березов, Коровкин, 2002]. В условиях гипометаболизма, когда подавлены как гликолиз [El Hachimi et al., 1990; Brooks, Storey, 1992], так и окислительное фосфорилирование [Fedotcheva et al., 1985; Bronnikov et al., 1990], продукция и, соответственно, расходование АТФ снижены, поэтому особый интерес представляет исследование особенностей функционирования Ыа,К-АТФазы в почках при гипо- и нормотермии зимоспящих животных.

Несмотря на то, что в проведенных ранее зарубежных работах показано, что при гибернации активность Ыа,К-АТФазы (при 37°С) из почек зимоспящих животных заметно

снижается, причины падения активности фермента пока не ясны [Charnock, Simonson, 1978; Bennis et al., 1995]. Регуляция активности Ыа,К-АТФазы может осуществляться посредством изменения содержания фермента или его изоформ, что описано для разных ферментов [Storey, Storey, 2004], а также в результате посттрансляционных модификаций фермента, таких как фосфорилирование [MacDonald, Storey, 1999] и глутатионилирование [Yakushev et al., 2010; Petrushanko et al,, in press]. Помимо этого поскольку Ыа.К-АТФаза является интегральным мембранным ферментом, ее активность зависит от липидного микроокружения [Grisham, Barnett, 1973; Charnock et al., 1973; Kimelberg, Papahadjopoulos, 1974; Boldyrev et al., 1977], поэтому изменение свойств мембран (в частности, микровязкости липидного бислоя) при гибернации также может быть механизмом регуляции ферментативной активности.

Целью настоящей работы было определение сезонных изменений активности Na,K-АТФазы в микросомах из почек типичных гибернаторов - сусликов Spermophilus undulatus, а также выяснение возможных причин этих изменений. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать сезонные изменения активности и содержания №,К-АТФазы в микросомальных фракциях из почек активных и спящих сусликов,

2. Оценить уровень фосфорилирования и глутатионилирования Ш,К-АТФазы.

3. Определить состав и свойства липидной фазы мембран микросом.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые доподлинно показано, что падение активности Na.K-АТФазы в микросомальных препаратах из почек сусликов при гибернации только отчасти обусловлено уменьшением содержания фермента. Установлено, что во время зимней спячки остается стабильным изоферментный состав Na,K-АТФазы в почках и не наблюдается глутатионилирования а-субъединицы Na,K-ATOa3bi, а также изменения уровня ее фосфорилирования. Среди других фосфорилируемых белков не обнаружено потенциальных регуляторов Na.K-АТФазы. Установлено, что при гибернации в плазматических мембранах клеток почечных канальцев достоверно не изменяется соотношение липид/белок и степень ненасыщенности жирных кислот липидов. В то же время обнаружено, что во время зимней спячки увеличивается содержание холестерина в мембранах микросом, но это не влияет на их общую микровязкость, что определено с помощью спиновых и флуоресцентных зондов. Также впервые установлено, что при гибернации №,К-АТФаза в почках находится в более агрегированном состоянии. Предполагается, что агрегация натриевого насоса во время зимней спячки является основной причиной снижения его активности в почках.

Проведенные исследования значительно углубляют имеющиеся знания о молекулярных механизмах регуляции активности Ыа.К-АТФазы в почках при гибернации. Полученные результаты свидетельствуют в пользу существующего представления о возможной роли агрегации

ферментов в регуляции активности транспортных АТФаз, в частности, Na.K-АТФазы при гибернации.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах кафедры биохимии биологического факультета МГУ, XIII-XVII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006-2010), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), международных симпозиумах «Biological Motility» (Пущино, 2008, 2010), международных конференциях «Молекулярные механизмы адаптации» (Махачкала, 2008, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 190 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 11 таблицами. Список цитированной литературы включает 370 отечественных и зарубежных печатных и Web-источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. Взрослых длиннохвостых сусликов Spermophiliis undulatus отлавливали в Якутии и содержали в виварии Института биофизики клетки РАН (Пущино) в индивидуальных клетках при 20-25°С в условиях естественной длины светового дня и стандартного кормления. В ноябре сусликов помещали в темную комнату и содержали при температуре 2-4°С. Активных сусликов (температура тела 37°С) использовали в экспериментах в апреле-июле, а спящих (температура тела 2°С) - в феврале-марте в середине баута спячки [Игнатьев и др., 2001; Захарова и др., 2008]. Для транспортировки почки сусликов замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С до использования. Материал был любезно предоставлен к.б.н. Н.М. Захаровой (Институт биофизики клетки РАН, Пущино).

Мнкросомальную фракцию плазматических мембран получали из наружного медуллярного слоя почек сусликов методом дифференциального центрифугирования [Jorgensen, 1974; Charnock et al., 1977] с добавлением в соотношении 1:100 (по объему) коктейля ингибиторов протеаз (Amresco М221).

Концентрацию белка в микросомах определяли по методу Лоури в присутствии 1% дезоксихолата натрия [Lowry et al., 1951], используя в качестве стандарта БСА.

Активность Na,K-ATOajbi измеряли с помощью сопряженных ферментативных реакций [Norby, 1988] в среде, содержавшей 130 мМ NaCl, 20 мМ КС1, 5 мМ MgCI2, 1 мМ ЭГТА, 50 мМ имидазола-HCI, рН 7,2, 2,5 мМ АТФ, 2 мМ фосфоенолпирувата, 0,3 мг/мл НАДН, 5 ед./мл

3

пируваткиназы, 10 ед./мл лактатдегидрогеназы, 1,5 мкг/мл белка микросом, 10 мкг/мл каналообразователя аламетицина. Измерения проводили на спектрофотометре Ultrospec 2100 pro с термостатом Multitemp III (GE Healthcare) в диапазоне температур от 2,5° до 37°С.

Электрофорез в ПААГ проводили по методу Лэммли [Laemmli, 1970], используя 5% концентрирующий и 8-20% градиентный разделяющий гели [Shorina et al., 1997]. В качестве белков-маркеров использовали набор PageRuler, содержавший предварительно окрашенные белки с молекулярными массами от 10 до 250 кДа (Fermentas SMI 8И).

Иммунохимическое окрашивание белков [Долгова и др., 2007], иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране по методу Тоубина [Towbin et al., 1979], проводили с использованием моноклональных антител мышей, специфичных к al-субъединице Ыа,К-АТФазы (Clone С464.6, Millipore 05-369), к актину (JLA20) и к глутатиону (Clone D8, Millipore МАВ5310), а также поликлональных антител кроликов к а2-субъединице Na.K-ЛТФазы (Millipore АВ9094) и вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma АО 168 и А0545).

Степень агрегации №,К-АТФазы в микросомах оценивали посредством метода ковалентных сшивок. Для этого проводили обработку препаратов сшивающим агентом о-фенантролином в комплексе с ионами меди при 37°С. При приготовлении образцов для электрофореза в ПААГ использовали буфер, не содержавший p-меркаптоэтанол [Shorina et al., 2004].

Нативный уровень фосфорилирования белков микросомальных препаратов оценивали с помощью флуоресцентного красителя для фосфобелков в геле Pro-Q Diamond (Invitrogen). Для этого гель фиксировали в растворе 50% метанола и 10% уксусной кислоты (30 мин, 2 раза), отмывали в воде и окрашивали в десятикратном по отношению к объему геля объеме красителя в течение 1 ч во избежание яркого фона. Полосы фосфобелков визуализировали с помощью системы BioSpectrum (UVP) при верхнем УФ-освещении, регистрируя флуоресценцию в области 570-640 нм (диафрагма 1,2, выдержка 3,5 с). После этого краситель удаляли из гелей выдерживанием в растворе 50 мМ Na^CCb, рН 4,0, 20% ацетонитрила (3 раза по 30 мин), гели отмывали в воде и прокрашивали Кумасси R-250 для контрольной оценки содержания белка [www.invitrogen.com].

Фосфорилирование белков эндогенными протеинкиназами изучали методом авторадиографии. Для этого препараты инкубировали 10 мин при 37°С в среде, содержавшей 15 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ MgCl2, 0,1 мМ Na3V04, 5 мМ NaF, 1 мМ и-НФФ, 1:100 (по объему) коктейля ингибиторов протеаз (Amresco М221), 1 мг/мл белка, 1 мМ [у-32Р]АТФ (5 МБк/мкмоль) [Hawkins et al., 1994; Пелози, Донелла-Деана, 2000].

Идентификацию белков методом тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ВЭЖХ с нанопотоками (LC-MS/MS), с предварительной обработкой трипсином проводили на

хроматографе Ultimate Plus (LC Packings), соединенном с масс-спектрометром Esquire 6000 (Bruker Daltonic). Эксперименты были любезно выполнены к.х.н. Р.Х. Зиганшиным в лаборатории протеомики Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва).

Жирнокислотный состав липидов и содержание холестерина в мембранах микросом определяли методом масс-спекгрометрии, сопряженной с газовой хроматографией (GC-MS). Для этого 15 мкл микросомальной фракции (в среднем 85 мкг белка) высушивали после добавления равного объема метанола и подвергали кислому метанолизу (1 М HCl в метаноле, 400 мкл) в течение 1 ч при 80°С. Далее проводили экстракцию образовавшихся метиловых эфиров жирных кислот, альдегидов и стероидов гексаном (400 мкл) в течение 5 мин. Гексановый экстракт высушивали, и сухой остаток обрабатывали >1,0-бис-(триметилсилил)-трифторацетамидом (20 мкл) в течение 15 мин при 80°С для получения триметилсилильных эфиров. К смеси эфиров добавляли 80 мкл гексана и 1-2 мкл полученного раствора вводили в инжектор установки для GC-MS [Осипов, 2010]. Эксперименты были любезно выполнены д.б.н. Г.А. Осиновым в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН (Москва).

Спектры ЭПР спиновых зондов 5-доксилстеарата и метилового эфира 16-дйксилстеарата, встроенных в мембраны микросом, регистрировали на спектрометре ЭПР Varían Е-4 с постоянной рабочей частотой 9,2 ГГц в диапазоне температур от -60° до 40°С. Регистрацию проводили при ширине развертки постоянного магнитного поля 40 Э, амплитуде модуляции 2 Э, мощности СВЧ-излучения 10 мВт, скорости записи 2 мин, постоянной времени 0,1 с. Среда для измерений содержала 25 мМ имидазола-HCI, pH 7,0, 250 мМ сахарозы, 5 мг/мл белка микросом и 0,1 мМ зонда. По спектрам ЭПР 5-доксилстеарата рассчитывали параметр порядка S, по спектрам ЭПР метилового эфира 16-доксилстеарата вычисляли время вращательной корреляции зонда тс (не) [Marsh, 1981; Fung, Johnson, 1984]. Эксперименты проводили на кафедре биофизики физического факультета МГУ при любезном содействии к.ф.-м.н. Ю.А. Кокшарова.

Флуоресценцию гидрофобных зондов АНС и пирена измеряли на спектрофлуориметре Varían Сагу Eclipse с термоприставкой (ширина щелей составляла 5 нм). Титрование микросом различными концентрациями АНС (10—100 мкМ) проводили в среде, содержавшей 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCI, pH 7,4, 0,1 мг/мл белка микросом. Флуоресценцию АНС возбуждали при 375 нм и регистрировали при 480 нм при температурах 12°, 25° и 37°С. Среда для измерения флуоресценции пирена содержала 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 30 мМ PIPES-NaОН, pH 7,0, 0,2 мг/мл белка микросом, 7 мкМ пирена. Флуоресценцию зонда возбуждали при 285 нм («вызванная» флуоресценция) или при 335 нм (собственная флуоресценция), регистрировали флуоресценцию мономеров пирена при 394 нм, а эксимеров при 470 нм. Измерения проводили в диапазоне температур от 5° до 40°С [Владимиров, Добрецов, 1980].

Математическая обработка результатов. Все эксперименты, представленные в работе, были проведены не менее трех раз не менее чем на 3 разных препаратах микросом, после чего были рассчитаны средние значения и стандартные ошибки. Для оценки достоверности различий данных двух выборок (активные суслики, спящие суслики) использовали двухвыборочный Ь критерий Стьюдента для независимых выборок с неравными дисперсиями с двусторонним распределением. При этом исходили из предположения, что данные имеют нормальное распределение. Достоверными считали различия с уровнем значимостир<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика микросомальных препаратов из почек сусликов. При выделении микросомальных фракций из наружного медуллярного слоя почек сусликов, в котором содержится наибольшее количество Ыа,К-АТФазы с высоким уровнем активности [КаХ2 е1 а1„ 1979; Е! Мет^!, Ооисе(, 1984], было получено примерно по 20 препаратов из почек активных и спящих животных. В препаратах была определена концентрация белка (в среднем —5,5 мг/мл) и рассчитан выход белка микросомальных фракций (табл. I). Согласно полученным данным выход белка в расчете на вес почек (а также отдельно на ткань наружной медуллы, составляющей примерно 20% массы почек) не изменяется в зимний период у спящих сусликов. При этом также остается стабильным вес почек, что может свидетельствовать об отсутствии морфологических изменений в органе при гибернации.

Таблица 1. Вес пар почек активных и спящих сусликов и выход белка микросомальных

фракций в расчете на вес почек и ткань наружной медуллы.

Животные Вес пары почек, г * Выход белка из ткани, мг/г ткани *

целые почки наружная медулла

Активные (п=14) Спящие (п=13) 2,85 ±0,12 2,75 ±0,12 4,38 ± 0,46 4,24 ± 0,50 16,65 ±1,15 16,77 ±1,25

* р>0,5.

Относительный белковый состав микросомальных фракций из почек сусликов был проанализирован при электрофоретическом разделении белков в ПААГ. На полученных электрофореграммах можно выделить более 30 белковых полос (рис. 1). При расчете содержания индивидуальных белков по интенсивностям полос было установлено, что содержание 5 белков достоверно увеличивается при гибернации, а содержание других 6 белков наоборот достоверно уменьшается (табл. 2). Полоса с кажущейся молекулярной массой 95 кДа соответствует по электрофоретической подвижности каталитической а-субъединице Ка,К-АТФазы [Уап^исЫ, Топошига, 1979], что подтверждено с использованием моноклональных антител к данной субъединице фермента (данные представлены и обсуждаются ниже). При гибернации содержание

этого 95 кДа-белка в микросомальных фракциях из почек сусликов достоверно падает на 21% - на столько же, на сколько и содержание белка с кажущейся молекулярной массой 60 кДа, соответствующего по электрофоретической подвижности регуляторной р-субъединице Ма,К-АТФазы [Уап^исЫ, Топотига, 1979]. Расчет показал, что в микросомальных фракциях из почек как активных, так и спящих сусликов относительное содержание а- и Р-субъединиц (оцененное по интенсивностям соответсвующих белковых полос) не демонстрирует сезонных различий: их доли составляют 60,8 и 39,2% соответственно. Эти значения существенно не отличаются от теоретических (61,3 и 38,7%), что указывает на то, что во фракциях микросом каталитическая и регуляторная субъединицы МаД-АТФазы присутствуют в эквимолярном соотношении. Доля взятых вместе а- и р-субъединиц в микросомальных препаратах составляет более 10% от общего количества белка - таким образом, Ма,К-АТФаза является основным белком во фракциях микросом из почек сусликов.

Рис. 1. Электрофореграмма микросомальных препаратов из почек активных и спящих сусликов, прокрашенная Кумасси Я-250.

Сезонные изменения АТФазной активности в препаратах микросом из почек сусликов. Поскольку большая часть мембран микросом образует замкнутые везикулы [Walter, 1975], непроницаемые для АТФ и ионов, измерения активности Ыа,К-АТФазы проводили в присутствии каналообразователя аламетицина, добавление которого увеличивало активность фермента в 2-3 раза. В таких условиях активность №,К-АТФазы при 37°С в микросомах из наружной медулы почек активных и спящих сусликов составляла 146 ± 9 и 82 ± 4 мкмоль/ч на 1 мг белка микросом соответственно (р<0,00001). В отсутствие аламетицина значения активности Na,K-ATOa3bi в препаратах микросом из почек активных и спящих сусликов достоверно не различались (около 45 ± 3 мкмоль/ч на 1 мг белка микросом, р>0,1). Аламетицин практически не влиял на уабаин-нечувствительную Mg-АТФазу, активность которой с повышением концентрации ионофора падала на 5-6%.

Таблица 2. Сезонные изменения содержания белков в микросомальных препаратах из почек сусликов, определенные по электрофореграммам._

Белковая полоса, кДа Содержание белка во фракции, мкг/мг общего белка Спящие/Активные

Активные (п=8) Спящие (п~8)

365 31,3 ±2,1 42,0 ± 0,7 +34% **

245 8,2 ±0,1 10,9 ± 0,6 +33% *

165 15,2 ±0,9 18,6 ± 0,8 +22% *

95 86,5 ± 3,2 68,7 ± 1,4 -21%**

67 47,9 ± 0,9 69,8 ± 3,3 +46% *

60 55,8 ± 2,3 44,3 ± 3,5 -21%*

54 27,7 ± 1,6 23,7 ± 0,9 -14%*

47 53,1 ± 1,7 44,4 ± 2,5 -16% *

33 39,7 ± 2,2 29,8 ± 3,9 -25% *

15 22,3 ± 0,7 19,1 ± 0,9 -14% *

13 16,1 ± 0,7 22,1 ± 1,9 +37% *

*р<0,05, ** р<0,005.

Рис. 2. Графики Аррениуса для активности №,К-АТФазы (Л, мкмоль/ч на 1 мг белка) в препаратах микросом из почек активных и спящих сусликов. Стрелка указывает на критическую температуру, в области которой происходит структурный переход.

* р<0,0005, ** р<0,05, *** р>0,5.

Температурная зависимость активности Ыа,К-АТФазы в исследуемых препаратах, представленная в координатах Аррениуса, имеет характерный вид с перегибом в области 20°С (рис. 2). Такая зависимость хорошо известна для многих мембранных ферментов, в частности для

Ыа,К-АТФазы, а перегибы на графиках Аррениуса обычно связывают со структурными перестройками мембран [Болдырев, 1982]. Было установлено, что при температурах выше 20°С активность Ыа,К-АТФазы в микросомах из почек спящих сусликов в 1,8-2,0 раза ниже по сравнению с микросомами из почек активных сусликов. Графики Аррениуса в этом диапазоне температур практически параллельны, то есть энергия активации ЫаД-АТФазы из почек активных и спящих сусликов в этих условиях одинакова (около 11,5 ккал/моль). При понижении температуры с 20° до 2,5°С различия в активности Ыа,К-АТФазы становились менее выраженными. В этих условиях энергия активации Ыа,К-АТФазы в препаратах из почек спящих сусликов примерно на 7 ккал/моль меньше по сравнению с препаратами из почек активных животных (27,9 и 35,0 ккал/моль соответственно). Такое снижение энергии активации Ма,К-АТФазы при гибернации, по всей видимости, имеет особое значение, позволяя ферменту быстрее включиться в работу почек пробуждающихся сусликов, которым необходимо быстро восстановить гомеостаз. Активность К^-АТФазы в препаратах была существенно ниже активности Ыа,К-АТФазы почти во всем диапазоне температур и уменьшалась при гибернации лишь в 1,3-1,6 раза. Графики Аррениуса для К^-АТФазы линейны, то есть [^-АТФаза не реагирует на структурные перестройки мембранных липидов в области критических температур.

Рис. 3. Иммунохимическое окрашивание а 1-субъединицы №,К-АТФазы (95 кДа) и актина (43 кДа) в микросомальных фракциях из почек сусликов с использованием моноклональных антител.

Содержание >а,К-ЛТФазы в микросомальных фракциях из почек сусликов. Одной из причин снижения активности Ка,К-АТФазы в микросомах из почек сусликов при гибернации может быть уменьшение содержания фермента в плазматических мембранах [СЬагпоск, Бтопвоп, 1978; Вептз а1., 1995]. Для оценки содержания ИаД-АТФазы в препаратах микросом было проведено иммунохимическое окрашивание каталитической субъединицы ИаД-АТФазы (95 кДа) с использованием антител к а1-изоформе фермента (рис. 3). Было установлено, что при гибернации содержание Ка,К-АТФазы в микросомах из почек сусликов уменьшается лишь на 25% (р<0,0015), поэтому такое уменьшение содержания ЫаД-АТФазы в почках сусликов не может быть единственной причиной почти двукратного падения активности фермента. Также в качестве

кДа |Активные С п я щ и е |

250

130

95 Я»'«» «тш тт т» ^а» РЯЯЯ ММНК ^^^

72

55

43 _ __ .........

36

28

внутреннего контроля с помощью специфичных антител были визуализированы полосы мембраносвязанного актина (43 кДа), содержание которого не показало сезонных различий (р>0,15).

С использованием антител к а2-субъединице №,К-АТФазы было установлено, что в микросомах из почек как активных, так и спящих сусликов эта изоформа фермента отсутствует (данные не представлены). Это согласуется с тем, что во всех сегментах почек al-изоформа каталитической субъединицы Ыа,К-АТФазы является единственной [Mobasheri et al., 2000].

Ингибирование уабанном №,К-АТФазы в препаратах, выделенных из почек сусликов. Известно, что разные изоформы а-субъединицы Na.K-АТФазы характеризуются различной чувствительностью к уабаину [Bennis et al., 1997]. Исследование ингибирования фермента уабаином в препаратах показало, что чувствительность Ыа,К-АТФазы в почках сусликов к этому ингибитору при гибернации не изменяется (ICso = 1,2-10~5-1,3-10~5 М). Это означает, что при гибернации в почках сусликов не изменяется субпопуляционный состав фермента, а также не противоречит данным литературы о моноизоферментном (al, pi) составе Ыа,К-АТФазы из почек [Mobasheri et al., 2000]. Также установлено, что низкие концентрации уабаина (от Ю~10 до ~10"7 М) активируют Ка,К-АТФазу из почек активных и спящих сусликов (АС¡о = ~10~9 М), что отмечалось и ранее [Котлобай, 1989].

Посттрансляционные модификации белков микросомальных фракций из почек сусликов. Известно, что изменение активности многих ферментов при гибернации связано с их фосфорилированием протеинкиназами [Storey, 1997]. Результатом такого фосфорилирования белков плазматических мембран скелетных мышц сусликов является снижение активности Na,K-АТФазы в зимний период [McDonald, Storey, 1999]. Фосфорилирование же самой Ыа,К-АТФазы (а-субъединицы) различными протеинкиназами (А, С и G) может сказываться на ее ферментативной активности [Chibalin et al., 199В; Муртазина и др., 2001; Eklof et al., 2001].

Рис. 4. Идентификация фосфорилированных белков в геле с помощью флуоресцентного красителя Pro-Q Diamond. Для сравнения приведены фрагменты электрофореграммы, прокрашенной Кумасси R-250 (2 средние дорожки и дорожки с белками-маркерами). Точками отмечены наиболее интенсивные полосы.

Нативный уровень фосфорилирования белков в препаратах микросом из почек сусликов определяли с помощью флуоресцентного красителя для окрашивания фосфобелков в геле Pro-Q Diamond (Invitrogen). Из всех белковых полос на электрофореграммах этим красителем прокрасились лишь 10 полос, а наиболее интенсивно 5 полос, включая а-субъединицу Na,K-АТФазы (рис. 4). Поскольку интенсивность флуоресценции красителя, связавшегося с фосфобелком, зависит от содержания белка в полосе, было рассчитано отношение интенсивностей «Pro-Q/Кумасси» (табл. 3). Достоверных сезонных различий по этому параметру для полос фосфобелков обнаружено не было (р>0,2), за исключением одной полосы высокомолекулярного белка (365 кДа), уровень фосфорилирования которого при гибернации увеличивался на 16% (р=0,05).

Таблица 3. Относительный уровень фосфорилирования белков в препаратах микросом из почек активных и спящих сусликов._

Белковая Pro-Q/Кумасси, усл. ед. Спящие/Активные

полоса, кДа Активные (п=8) Спящие (п=8)

365 19,7 ± 1,3 22,9 ± 0,7 +16%*

270 14,9 ± 1,4 14,7 ± 1,4 -1% **

230 18,3 ±4,7 19,0 ± 1,7 +4% **

95 15,7 ± 0,3 14,7 ± 0,6 -6% **

67 15,6 ± 0,5 13,6 ±1,7 -12% **

51 12,3 ± 1,0 12,6 ±0,7 +3% **

43 4,7 ±0,3 4,8 ± 0,4 +3% **

24 15,2 ±0,9 12,9 ±1,2 -15%**

15 16,0 ± 1,4 13,5 ± 1,2 -15% **

14 10,9 ± 2,6 8,1 ± 2,0 -26% **

*р=0,05, *♦ р>0,2.

Авторадиографическое исследование фосфорилирования белков микросом эндогенными протеинкиназами в присутствии [у-32Р]АТФ не выявило фосфорилирования а-субъединицы Na,K-АТФазы in vitro (рис. 5). Белки, дающие наиболее интенсивные полосы на авторадиограммах и в гелях, окрашенных Pro-Q Diamond, были подвергнуты масс-спектрометрическому анализу, который не выявил среди фосфорилируемых белков потенциальных белков-регуляторов Na,K-АТФазы (данные не представлены). В полосе 365 кДа был идентифицирован белок мегалин (гликопротеид 330, gp330), принадлежащий семейству рецепторов к ЛПНП и участвующий в обмене липидов и процессах эндоцитоза [Christensen, Bim, 2002].

Известно, что во время спячки суслика Spermophüus tridecemlineatus нарушается баланс окисленного и восстановленного глутатиона (GSSG и GSH) в сторону увеличения его окисленной формы GSSG, что может быть следствием циркуляторной гипоксии и характерно для окислительного стресса. При этом общий пул свободного глутатиона снижается во время баутов

11

спячки и возрастает при периодических пробуждениях [Carey et al., 2003]. Также известно, что в условиях гипоксии в почках кроликов (а также в солевых железах уток) происходит неферментативное глутатионилирование Ыа,К-АТФазы, приводящее к ингибированию ее активности [Yakushev et al., 2010; Petrushanko et al., in press]. Поэтому можно предположить, что при гибернации в почках сусликов также происходит глутатионилирование Ыа,К-АТФазы, защищающее фермент от необратимого окисления активными формами кислорода и различными свободными радикалами, содержание которых в таких условиях может возрастать.

Рис. 5. Авторадиограмма микросомальных белков, фосфорилированных эндогенными протеинкиназами. Для сравнения приведен фрагмент электрофореграммы, прокрашенной Кумасси Я-250 (2 средние дорожки). Точками отмечены полосы, наиболее отличающиеся по уровню включения фосфата.

Для определения спектра глугатионшшрованных белков было проведено иммунохимическое окрашивание микросомальных белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране, с использованием моноклональных антител к глутатиону. В микросомальных препаратах из почек активных и спящих сусликов не было выявлено глутатионилирования Ыа,К-АТФазы (данные не представлены), а модифицированными глутатионом оказались две белковые полосы с кажущимися молекулярными массами около 43 и 250 кДа.

Таким образом, сезонная регуляция активности Ыа,К-АТФазы в почках сусликов не связана с фосфорилированием и глутатионилированием молекул этого фермента.

Состав липидной фазы микросомальных мембран из почек сусликов. Поскольку активность ЫаД-АТФазы зависит от липидного микроокружения [Болдырев и др., 1985], изменение микровязкости мембран при гибернации может быть механизмом регуляции натриевого насоса. Известно, что микровязкость мембран, являясь интегральным показателем, возрастает при повышении содержания в мембранах насыщенных жирных кислот и холестерина, а

также с увеличением содержания в них белка [Горошинская и др., 1999]. Методом СС-МЭ был исследован жирнокислотный состав липидов и содержание холестерина в мембранах микросом из почек сусликов (табл. 4). Было установлено, что в наибольшем количестве в мембранных липидах присутствуют 5 жирных кислот, типичных для липидов из плазматической мембраны [Лапинский, Невретдинова, 1987], на долю которых приходится более 85%. Было также установлено, что мольные доли некоторых жирных кислот при гибернации незначительно уменьшаются (16:0, 18:0, 20:4, 20:3), а мольные доли других незначительно увеличиваются (14:0, 18:2, 18:1). Расчеты показали, что суммарная мольная доля жирных кислот с двойными связями в препаратах из почек спящих сусликов по сравнению с препаратами из почек активных животных выше всего лишь на 3,3%, при зтом общая степень ненасыщенности жирных кислот при гибернации достоверно не изменяется (табл. 4).

Таблица 4. Жирнокислотный состав липидов и содержание холестерина в

микросомальных препаратах из почек активных и спящих сусликов.

Параметр Активные (п = 8) Спящие (п - 8)

Мольные доли жирных кислот и альдегидов, % 16:0 Пальмитиновая* 23,5 ±0,4 21,1 ± 0,3

18:2 Линолевая * 15,0 ± 0,8 17,7 ±0,7

18:1 Олеиновая * 12,3 ± 1,0 15,7 ± 0,8

18:0 Стеариновая * 17,6 ± 0,4 16,0 ±0,3

20:4 Арахидоновая ** 18,0 ±1,1 15,6 ± 0,9

14:0 Миристиновая * 0,7 ±0,1 2,0 ± 0,4

16:1 Гексадеценовая ** 2,6 ±0,5 3,1 ± 0,2

16а Пальмитиновый альдегид * 1,5 ±0,2 1,0 ±0,1

18а Стеариновый альдегид ** 3,1 ± 0,5 3,4 ± 0,2

20:3 Эйкозатриеновая ** 1,9 ± 0,3 1,1 ± 0,3

Другие в совокупности * 3,8 ±0,2 3,2 ±0,1

Ненасыщенные в совокупности * 50,7 ±3,3 54,0 ± 1,6

Общая степень ненасыщенности жирных кислот, количество двойных связей на молекулу жирной кислоты ** 1,22 ±0,03 1,20 ±0,03

Липид/белок, мг/мг ** 1,10 ±0,37 1,44 ±0,36

Холестерин/липид, мг/г * 40,1 ±10,2 75,2 ± 3,9

*р<0,05, **р>0,1.

По результатам анализа вС-МБ было рассчитано соотношение липид/белок в исследуемых препаратах (табл. 4). При гибернации наблюдается тенденция к уменьшению содержания белка в микросомах из почек сусликов. Однако из-за большого разброса данных сезонные различия в

соотношении липид/белок недостоверны, поэтому уменьшение содержания белка в препаратах из почек спящих сусликов по сравнению с препаратами активных животных вряд ли может быть причиной существенного изменения микровязкости мембран при гибернации. В то же время установлено, что содержание холестерина в мембранах микросом из почек спящих сусликов в 1,9 раза выше, чем в препаратах активных животных (р<0,05). Таким образом, из трех факторов, способных влиять на микровязкость мембран (степень ненасыщенности жирных кислот, содержание белка и холестерина), при гибернации достоверно изменяется только содержание холестерина.

Анализ структурного состояния липидной фазы микросом из почек сусликов. Чтобы выяснить, влияет изменение содержания холестерина в микросомах из почек сусликов на микровязкость мембран, их структурное состояние было оценено с использованием спиновых и флуоресцентных зондов.

Спиновый зонд 5-доксилстеарат позволяет охарактеризовать свойства поверхностного слоя мембран, в котором, в частности, локализован холестерин. Графики Аррениуса для величин Аж и параметра порядка 51, определяемых по положению экстремумов на ЭПР-спектрах 5-доксилстеарата, не выявили сезонных различий в подвижности зонда в мембранах микросом из почек активных и спящих сусликов. Графики Аррениуса для величины Атах характеризуются двумя перегибами при 0° и -19°С, обусловленными структурными переходами в мембранах (рис.

4,3

Рис. 6. Графики Аррениуса для величины Лщи, определенной по ЭПР-спектрам 5-доксилстеарата в мембранах микросом из почек сусликов. Стрелки указывают на области структурных переходов.

3,0 3,4 3,8

4,2 4,6 5,0

ЮУГ

6). На графиках Аррениуса для параметра порядка S, характеризующего структурированность мембраны (рис. 7), выявляется еще один перегиб в области 20°С - в той же области, что и перегиб на графиках Аррениуса для активности Na.K-АТФазы (рис. 2). Таким образом, несмотря на более высокий уровень холестерина, в микросомах из почек спящих сусликов с помощью данного спинового зонда не обнаружено изменения структурного состояния мембран по сравнению с препаратами микросом из почек активных животных. По всей видимости, это связано с тем, что в мембранах микросом холестерин находится в кластерах (рафтах), недоступных для данного спинового зонда [Simons, Ikonen, 1997].

Другой спиновый зонд - метиловый эфир 1 б-доксилстеарата, не имеет полярной группы и поэтому погружается вглубь липидного бислоя. Графики Аррениуса для времени вращательной корреляции тс данного зонда в мембранах микросом из почек активных и спящих сусликов также имеют практически одинаковый вид (рис. 8) и характеризуются перегибом при -30°С. Только при температурах выше 0°С можно видеть недостоверное уменьшение времени вращательной корреляции зонда в препаратах из почек спящих сусликов, обусловленное более свободным вращением зонда относительно препаратов активных животных. Таким образом, при гибернации наблюдается незначительное снижение микровязкости мембран микросом, связанное, скорее всего, с некоторым уменьшением содержания белка в мембранах (табл. 4).

Рис. 7, Графики Аррениуса для параметра порядка 1?, определенного по ЭПР-спектрам 5-доксилстеарата в мембранах микросом из почек сусликов. Стрелка указывает на область структурного перехода.

3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 103/т

107т

Рис. 8. Графики Аррениуса для времени вращательной корреляции Тс (не), определенного по ЭПР-спектрам метилового эфира 16-доксилстеарата в мембранах микроеом из почек сусликов. Стрелка указывает на область структурного перехода.

Связывание гидрофильного флуоресцентного зонда АНС с поверхностью мембран обеспечивается за счет как электростатических, так и гидрофобных взаимодействий [Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1986]. Параметры флуоресценции АНС при титровании зондом микроеом из почек сусликов (табл. 5) не показывали достоверных сезонных различий (р>0,1). Значения константы диссоциации К/ комплекса АНС с микросомами практически не зависят от температуры (р>0,25), однако с повышением температуры от 12° до 37°С достоверно уменьшаются значения ¡-'тах {р<0,0005), поскольку квантовый выход флуоресценции находится в обратной зависимости от температуры [Паркер, 1972]. Таким образом, отсутствие достоверных сезонных различий в значениях и Кл свидетельствует об одинаковых свойствах

микроокружения участков связывания АНС на поверхностности микроеом из почек активных и спящих сусликов.

Таблица 5. Параметры флуоресценции АНС в микросомальных препаратах из

почек активных и спящих сусликов при разных температурах.

Параметр Животные 12°С (п=3) * 25°С (п=5) * 37°С (п=5) *

Ршах, УМ- ад- Активные Спящие 819 ± 46 884 ±21 633 ±30 648 ± 16 440 ± 19 439 ±18

К/, мкМ Активные Спящие 54,7 ± 0,9 52,3 ±4,1 54,1 ± 1,4 52,6 ± 2,0 53,2 ± 1,3 50,1 ± 1,5

* р> 0,15.

Гидрофобный флуоресцентный зонд пирен встраивается в те области бислоя, где расположены жирнокислотные цепи липидов, и параметры его флуоресценции позволяют охарактеризовать микровязкость окружения зонда и гидрофобный объем мембраны [Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1986]. Наиболее чувствительным параметром является степень эксимеризации пирена - соотношение интенсивности флуоресценции эксимерной (димерной) и мономерной форм зонда, так как образование димеров пирена при его фиксированной концентрации контролируется скоростью диффузии, т.е. напрямую зависит от микровязкости и гидрофобного объема мембраны. Кроме того, пирен позволяет оценить свойства аннулярного слоя липидов, непосредственно контактирующих с гидрофобными участками интегральных белков мембраны, так как между триптофаном и пиреном возможен безызлучательный индуктивно-резонансный перенос энергии. При возбуждении флуоресценции остатков триптофана в гидрофобных доменах молекул белка часть энергии передается на расположенные в пределах радиуса Ферстера молекулы зонда, что приводит к появлению так называемой «вызванной» флуоресценции пирена [Владимиров, Добрецов, 1980; Лакович, 1986; Малышева и др., 2001].

Рис. 9. Графики Аррениуса для степени эксимеризации пирена (///„,) в общих и аннулярных липидах мембран микросом из почек сусликов. Стрелка указывает на область структурного перехода.

Достоверных различий в степени эксимеризации пирена, встроенного в мембраны микросом из почек активных и спящих сусликов, как для общих, так и для аннулярных липидов, находящихся в пределах радиуса Ферстера от белков мембраны, обнаружено не было (р>0,5). Графики Аррениуса для степени эксимеризации пирена в микросомах из почек активных и

спящих сусликов характеризуются перегибом при температуре около 20°С - той же, что и перегиб на графиках Аррениуса для активности №,К-АТФазы (рис. 2). При этом в мембранах микросом как активных, так и спящих сусликов степень эксимеризации пирена в области аннулярных лилидов на 20-25% меньше степени эксимеризации пирена для общих липидов мембраны, что, вероятно, обусловлено структурирующим действием белка на мембрану или тем, что белки находятся в так называемых рафтах, содержащих больше насыщенных жирных кислот и холестерина [Simons, Ikonen, 1997; Dalskov et al., 2005].

Таким образом, по совокупности данных, полученных с помощью спиновых и флуоресцентных зондов, можно сделать заключение, что при гибернации в почках сусликов не происходит существенных изменений структурного состояния липидной фазы мембран, которые могли бы привести к значительному снижению активности №,К-АТФазы.

Олигомерное состояние №,К-АТФазы в микросомах из почек сусликов. При гибернации в мембранах могут происходить иные изменения, способные влиять на функционирование интегральных ферментов. В частности, к таким изменениям относится латеральное разделение белков и липидов при гибернации, описанное для плазматических мембран и мембран эндоплазматического ретикулума нервной ткани сусликов [Azzam et al., 2000]. Такое разделение мембранных компонентов должно сопровождаться кластеризацией и агрегацией белков, что ранее описано для Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов, активность которой при гибернации снижается более чем в 2 раза [Малышева и др., 2001]. Образование агрегатов транспортных АТФаз может приводить к их ингибированию, предположения о чем высказывались и ранее [Mahaney, Thomas, 1991 ; Voss et al., 1995].

Косвенным признаком агрегации белков в мембранах может быть снижение миграции энергии с остатков триптофана белка на пирен за счет безызлучательного переноса энергии, определяемой как отношение «вызванной» флуоресценции пирена (возбуждение через триптофан при 285 нм) к собственной флуоресценции (возбуждение при 335 нм), так как значительная часть белков в составе агрегатов становится «недоступной» для пирена. Действительно, было обнаружено, что миграция энергии с остатков триптофана белка на пирен в препаратах микросом из почек спящих сусликов достоверно ниже на 11-14% (р<0,01), чем в препаратах из почек активных животных, что указывает на возможность агрегации белков и, в частности, Na,K-АТФазы при гибернации.

Для оценки олигомерного состояния №,К-АТФазы в микросомах из почек сусликов препараты обрабатывали сшивающим агентом о-фенантролином в комплексе с ионами меди, катализирующим образование ковалентных связей по цистеиновым остаткам между близко расположенными молекулами белков [Geimonen et al., 1994; Shorina et al., 1997]. При иммунохимическом окрашивании каталитической субъединицы Na.K-АТФазы в обработанных

сшивающим агентом препаратах из почек сусликов наблюдалось прогрессивное уменьшение интенсивности полосы мономерной формы о-субъединицы Ыа,К-АТФазы и появление полос олигомеров (рис. 10). При этом относительное количество сшитых за 1 ч молекул фермента в препаратах из почек спящих сусликов было в 1,7 раза больше (р<0,001), чем в препаратах из почек активных животных (рис. 11).

кДа >300

^^ ^ "ФШЙЙФ 1ЙУШФ ЦШвШЬ 4мямй0

О' 1' 2' 3' 4' 5'

>300

95

8' 15' 30' 60'

3 к с О

Рис. 10. Иммунохимическое окрашивание а1-субъединицы №,К-АТФазы в микросомальных препаратах из почек сусликов, обработанных ковалентно сшивающим агентом о-фенантролином в комплексе с ионами меди.

Рис. 11. Убыль мономерной формы а1-субъединицы ИаД-АТФазы (95 кДа) с течением времени инкубации препаратов со сшивающим агентом.

□ Активные (п=3) ■ Спящие (п=3)

10 20 30 40 50 60 Время, мин

Таким образом, при гибернации Ка,К-АТФаза в почках находится в более агрегированном состоянии, что наряду с обнаруженным уменьшением на 25% содержания фермента в мембранах является, по-видимому, основной причиной снижения активности натриевого насоса в почках спящих сусликов.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ микросомальных препаратов, обогащенных №,К-АТФазой, из почек активных и спящих сусликов.

2. Активность ИаД-АТФазы при гибернации снижается в 1,8-2,0 раза в диапазоне температур от 15 до 37°С. При более низких температурах различия менее выражены.

3. В препаратах присутствует только а1-изоформа каталитической субъединицы 1Ча,К-АТФазы, содержание которой при гибернации уменьшается на 25%. Чувствительность фермента к уабаину во время спячки не изменяется.

4. Не выявлено глутатионилирования а-субъединицы Ыа,К.-АТФазы и сезонного изменения уровня ее фосфорилирования.

5. Содержание холестерина в препаратах увеличивается при гибернации в 1,9 раза. Содержание белка, степень ненасыщенности жирных кислот липидов и структурное состояние липидной фазы мембран во время спячки не изменяются.

6. При гибернации 1Ча,К-АТФаза в мембранах находится в более агрегированном состоянии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Басевич Е.В., Лопина О.Д., Рубцов А.М. (2010) Сезонные изменения в обогащенной Na,K-АТРазой микросомальной фракции из почек сусликов Spermophilus undulatus. Биохимия, 75, 1601-1611.

2. Басевич Е.В., Лопина О.Д., Рубцов A.M. (2010) Исследование поспрансляционных модификаций белков в микросомах из почек эутермных и гипотермных сусликов. В сб. Молекулярные механизмы адаптации, ИПЦ ДГУ, Махачкала, в печати.

3. Basevich, E.V., Osipov, G.A., Lopina, O.D., Rubtsov, A.M. (2010) The composition of microsomal membranes hydrophobic area from kidney of active and hibernating ground squirrels detected by chromatography-mass spectrometry. In Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies, Synchrobook, Pushchino, 28-31.

4. Rubtsov, A.M., Basevich, E.V., Lopina, O.D. (2010) Seasonal changes of Na,K-ATPase activity in the kidney of ground squirrel. In Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies, Synchrobook, Pushchino, 228-229.

5. Басевич E.B. (2010) Использование моноклональных антител к al-субъединице Na,K-АТФазы в исследованиях механизмов адаптации фермента в почках гибернирующих сусликов Spermophûus undulatus. Тез. докл. XVII междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2010, сскц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 44-45.

6. Басевич Е.В. (2009) Использование Аламетицина и Луброла WX при определении активности Ка,К-АТФазы в микросомальных фракциях из почек суслика Spermophilus undulatus. Тез. докл. XVI междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2009, секц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 38-39.

7. Басевич Е.В., Лопина О.Д., Гончарова Н.Ю., Рубцов A.M. (2008) Биохимические механизмы адаптации №,К-АТФазы в почках гибернирующих сусликов Spermophilus undulatus к функционированию при низких температурах. В сб. Молекулярные механизмы адаптации, ИПЦ ДГУ, Махачкала, 21-25.

8. Basevich, E.V., Lopina, O.D., Rubtsov, A.M. (2008) Seasonal changes in microsomal membranes enriched with Na,K-ATPase from kidneys of hibernating mammals. In Biological motility: achievements and perspectives, Foton-Vek, Pushchino, 66-67.

9. Рубцов A.M., Лопина О.Д., Басевич E.B., Кондрашев-Луговский A.C. (2008) Сезонные изменения активности мембранных ион-транспортирующих АТФаз в скелетных мышцах и почках гибернатора, суслика Spermophilus undulatus. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Арта, Новосибирск, 157.

10. Басевич Е.В, (2008) Исследование фосфорилирования белков микросомальных препаратов, обогащенных Ыа,К-АТФазой, из почек суслика Spermophilus undulatus. Тез. докл. XV междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2008, секц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 29-30.

11. Басевич Е.В. (2007) Исследование сезонных изменений активности Na.K-АТФазы в микросомальных препаратах из почек суслика Spermophilus undulatus. Тез. докл. XIV междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2007, секц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 27.

12. Басевич Е.В. (2006) Исследование сезонных изменений физико-химических свойств микросомальных мембран, обогащенных №,К.-АТФазой, из почек суслика Spermophilus undulatus. Тез. докл. ХШ междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2006, секц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 21-22.

Подписано в печать: 30.10.10 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 769157 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Басевич, Евгений Викторович

I. Введение.

II. Обзор литературы

И. 1. Гибериация млекопитающих

II. 1.1. Отличительные особенности зимней спячки млекопитающих.

II.1.2. Внешние причины, вызывающие зимнюю спячку.

II .1.3. Энергетика зимней спячки млекопитающих.

II. 1.4. Годичный цикл гибернирующих млекопитающих.

II. 1.5. Стадии гибернации млекопитающих.

II. 1.6. Сезонные изменения, происходящие в органах и тканях животных-гибернаторов.

11.1.7. Регуляция активности ферментов при гибернации.

11.2. Ка,К-аденозинтрифосфатаза

11.2.1. Общая характеристика Na,К-АТФазы.

11.2.2. Структурная организация Na,К-АТФазы.

11.2.3. Изоформы субъединиц Na,К-АТФазы.

11.2.4. Na,K-ATOa3a почек: функции, локализация в сегментах нефронов и субпопуляции.

11.2.5. Регуляция активности Na,К-АТФазы.

11.2.6. Регуляция Na,К-АТФазы посредством фосфорилирования.

11.2.1. Глутатионилирование Na,К-АТФазы.

11.2.8. Белки, взаимодействующие с №,К-АТФазой.

11.2.9. Ингибиторы Na,К-АТФазы.

11.2.10. Влияние липидного окружения на функционирование транспортных АТФаз.

11.2.11. Олигомерная организация транспортных АТФаз.

11.2.12. Липидные микродомены (рафты) и локализация Na,K-АТФазы в плазматической мембране.

11.3. Функционирование Na,К-АТФазы в почках животных-гибернаторов (история исследований).

III. Материалы и методы

III. 1. Экспериментальные животные.

III.2. Получение микросомальных фракций.

111.3. Определение концентрации белка.

111.4. Регистрация АТФазной активности в сопряженной системе.

111.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

111.6. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране.

111.7. Анализ агрегации микросомалытых белков методом ковалентных сшивок.

III. 8. Определение нативного уровня фосфорилирования белков с использованием флуоресцентного красителя Pro-Q Diamond.

111.9. Авторадиография фосфорилированных эндогенными протеинкиназами белков.

111.10. Идентификация белков методом масс-спектрометрии.

III. 11. Определение жирнокислотного состава липидов и холестерина в микросомах методом масс-спектрометрии.

III. 12. Анализ структурного состояния липидной фазы микросом методом электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов.

III. 13. Анализ свойств микросомальных мембран методом флуоресцентной спектроскопии гидрофобных зондов.

111.14. Материалы.

III. 15. Математическая обработка полученных результатов.

III. 16. Программное обеспечение.

IV. Результаты и их обсуждение

IV. 1. Характеристика микросомальных препаратов из почек сусликов.

IV.2. Сезонные изменения АТФазной активности в препаратах микросом из почек сусликов.

IV.3. Содержание Na,K-ATOa3bi в микросомальных фракциях из почек сусликов.

IV.4. Ингибирование уабаином Na,K-ATOa3bi в препаратах, выделенных из почек сусликов.

IV.5. Посттрансляционные модификации белков микросомальных фракций из почек сусликов.

IV.6. Состав липидной фазы микросомальных мембран из почек сусликов.

IV.7. Структурное состояние липидной фазы микросом из почек сусликов, оцененные с помощью спиновых и флуоресцентных зондов.

IV.8. Олигомерное состояние Na,K-ATOa3bi в микросомах из почек сусликов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Басевич, Евгений Викторович

VI. выводы

1. Проведен сравнительный анализ микросомальных препаратов, обогащенных Ка,К-АТФазой, из почек активных и спящих сусликов.

2. Активность ИаД-АТФазы при гибернации снижается в 1,8-2,0 раза в диапазоне температур от 15 до 37°С. При более низких температурах различия менее выражены.

3. В препаратах присутствует только а1-изоформа каталитической субъединицы Ыа,К-АТФазы, содержание которой при гибернации уменьшается на 25%. Чувствительность фермента к уабаину во время спячки не изменяется.

4. Не выявлено глутатионилирования а-субъединицы №,К-АТФазы и сезонного изменения уровня ее фосфорилирования.

5. Содержание холестерина в препаратах увеличивается при гибернации в 1,9 раза. Содержание белка, степень ненасыщенности жирных кислот липидов и структурное состояние липидной фазы мембран во время спячки не изменяются.

6. При гибернации ИаД-АТФаза в мембранах находится в более агрегированном состоянии.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изложенные в настоящей работе результаты оригинальных исследований позволяют сделать несколько заключений и ряд предположений. При попытке разобраться в противоречивых данных литературы по сезонным изменениям активности №,К-АТФазы из почек зимоспящих животных [Fang, Willis, 1974; Charnock, Simonson, 1978; Bennis et al., 1995; McDonald, Storey, 1999] установлено на примере фермента из наружной медуллы почек сусликов, что при гибернации активность Ка,К-АТФазы (при 37°С) падает почти в 2 раза (р<0,00001).

Сезонное снижение активности Ыа,К-АТФазы из почек сусликов не связано с фосфорилированием или глутатионилированием молекул этого фермента и не является следствием изменения свойств и структуры мембран, несмотря на почти двукратное увеличение при гибернации содержания холестерина в микросомах, который, по-видимому, находится в рафтах [Simons, Ikonen, 1997]. Согласно полученным данным, основными причинами сезонного снижения активности натриевого насоса из почек сусликов является его более агрегированное состояние во время зимней спячки наряду с некоторым уменьшением содержания фермента в микросомах.

Иммунохимическое окрашивание а-субъединицы №,К-АТФазы (наиболее доступный и прямой метод сравнительной оценки количества фермента в препаратах) показало, что в микросомальных фракциях из почек сусликов содержание натриевого насоса уменьшается лишь на 25%. Полученный результат не согласуется с данными работ, авторы которых объясняли более чем двукратное падение при гибернации активности Na,K-ATOa3bi (при 37°С) из почек зимоспящих животных именно пропорциональным снижением содержания фермента в препаратах [Charnock, Simonson, 1978; Bennis et al., 1995]. К такому выводу исследователи пришли, установив, что отношение количества связавшегося [3Н]уабаина к активности №,К-АТФазы для препаратов из почек активных и спящих животных достоверно не различается. Однако нужно отметить, что в этих работах не применялись каналообразователи или детергенты, необходимые для обеспечения проницаемости лигандов внутрь замкнутых везикул [Walter, 1975; Jorgensen, Skou, 1971; Besch et al., 1977; Bonnafous et al., 1979], составляющих значительную часть (~75%) микросомальных препаратов плазматических мембран [Walter, 1975]. Применение подобных веществ принципиально важно, поскольку в молекуле ИаД-АТФазы центры связывания АТФ и уабаина расположены по разные стороны мембраны, из-за чего в замкнутых везикулах только один тип центров связывания (субстрата или ингибитора) доступен для присутствующих в среде инкубации лигандов (АТФ, уабаина).

В настоящей работе определение активности Na, К-АТФ азы проводили в присутствии каналообразователя аламетицина. Добавление данного ионофора в установленной оптимальной концентрации увеличивало активность Na,K-АТФазы при 37°С из почек активных сусликов в -3,2 раза. Это означает, что в данных препаратах значительная часть фермента (—70%) была неактивна и, по-видимому, находилась в замкнутых везикулах. Этот результат хорошо согласуется с упоминавшимися выше данными литературы о доле замкнутых везикул (-75%) в микросомальных препаратах, полученных из почек морских свинок, не способных гибернировать [Walter, 1975]. Однако в препаратах из почек спящих сусликов, находящихся в состоянии гипотермии, активность №,К-АТФазы в присутствии аламетицина увеличивалась лишь в 1,9 раза, притом что в отсутствие ионофора базовая активность Na, К-АТФ азы при 37°С в препаратах микросом из почек как активных, так и спящих сусликов не различалась (р=0,2).

Согласно общепринятым представлениям, базовая активность Na,K-АТФазы (в отсутствие активаторов) принадлежит ферменту, находящемуся в «разорванных» (поврежденных) мембранах [Walter, 1975], в которых также может быть нарушена и организация белков. Одинаковый уровень базовой активности в препаратах из почек активных и спящих сусликов может свидетельствовать о том, что микросомы в них повреждены в равной степени. Это неудивительно, так как использовался общий метод выделения.

Латентная» же активность обусловлена АТФазой, находящейся в нормальных неповрежденных мембранах. Однако, как установлено, при гибернации наблюдается агрегация Ка,К-АТФазы, приводящая, по всей видимости, к ингибированию фермента. Поэтому логично предположить, что и при добавлении аламетицина активность таких агрегированных молекул остается скрытой, что выражается в меньшем активационном эффекте ионофора в препаратах из почек спящих сусликов по сравнению с препаратами из почек активных животных.

При определении температурной зависимости активности №,К-АТФазы в препаратах из почек сусликов (в присутствии аламетицина) установлено, что активность фермента при гибернации ниже в 1,8-2,0 раза в диапазоне температур от 15° до 37°С (р<0,0005). Однако при более низких температурах различия менее выражены (р<0,05), а при температурах ниже 10°С становятся недостоверными (р>0,5). Это сказывается на характере графиков Аррениуса для активности №,К-АТФазы из почек сусликов при температурах выше и ниже критической (18-20°С), при которой наблюдается перегиб. Аномалии в области 20°С отмечены также на графиках Аррениуса для параметра порядка 5, определенного по ЭПР-спектрам спинового зонда 5-доксилстеарата, и на графиках Аррениуса для степени эксимеризации флуоресцентного зонда пирена в общих и аннулярных липидах мембран микросом из почек сусликов. Это согласуется с общепринятыми взглядами о связи между изменениями свойств интегральных ферментов и структурными перестройками мембранных липидов в критической области температур [СпзЬаш, Вашей, 1973; СЬагпоск й а1., 1973; Клте1Ьег& РараЬафроЫоб, 1974; ВоПугеу а1., 1977; ВоМугеу & а1., 1982].

При температурах выше критической (~20°С) графики Аррениуса практически параллельны, то есть энергия активации №,К-АТФазы из почек активных и спящих сусликов в этих условиях существенно не различается (11,2— 11,8 ккал/моль). При падении температуры с критической отметки (~20°С) до крайней точки температурной зависимости (2,5°С) сезонные различия в активности №,К-АТФазы становятся менее выраженными. Это находит отражение на характере графиков Аррениуса, наклон которых в данной области температур заметно различается. Рассчитано, что при температурах ниже критической энергия активации №,К-АТФазы в препаратах из почек спящих сусликов примерно на 7 ккал/моль меньше по сравнению с препаратами из почек активных животных (27,9 и 35,0 ккал/моль соответственно). По-видимому, такое изменение свойств фермента позволяет натриевому насосу быстрее включиться в работу почек при повышении температуры тела пробуждающихся сусликов, которым необходимо быстро восстановить гомеостаз.

Установленный вид графиков Аррениуса для активности ]^а,К-АТФазы из почек сусликов можно объяснить температурной зависимостью процесса агрегации натриевого насоса, происходящего в мембранах микросом. Повидимому, в крайней точке температурной зависимости (2,5°С) активность

Иа,К-АТФазы из почек активных и спящих сусликов находится на минимальном уровне, поскольку почти все молекулы фермента агрегированы и заингибированы в результате латерального разделения и кластеризации липидов, индуцированных низкой температурой [Ивков, Берестовский, 1982; Болдырев и др., 1985; Гулевский и др., 1990]. С повышением температуры до ~20°С влияние температуры на организацию липидов и белков в мембране, вероятно, снижается. Однако с ростом температуры в препаратах из почек спящих сусликов степень олигомеризации, видимо, снижается не так интенсивно, как в препаратах из почек активных сусликов. Вероятно, часть молекул натриевого насоса при гибернации организуется в особо прочные агрегаты (сохраняющие такую структуру в процессе выделения) [Skriver et al., 1980]. Скорее всего, такое состояние молекул фермента особым образом закрепляется, в чем может принимать участие примембранный цитоскелет, с которым посредством ряда белков способна взаимодействовать Na,K-ATOa3a [Kraemer et al., 1990; Devarajan et al., 1994; Manunta et al., 1998; Zhang et al., 1998; Батрукова и др., 2000; Lee et al., 2001; Kraemer et al., 2003]. Такое предположение о стабильной агрегации фермента при гибернации подтверждается полученными в настоящей работе данными, согласно которым №,К-АТФаза из почек спящих сусликов находится в более агрегированном состоянии по сравнению с препаратами из почек активных животных. Достижение температурной отметки в ~20°С сопровождается изменениями в организации мембран (например, распадаются кластеры и нарушается латеральное разделение лигсидов), в результате чего исчезает влияние со стороны липидного бислоя на организацию молекул натриевого насоса. Подтверждением этого служит характер графиков Аррениуса при температурах выше критической, линии которых в таких условиях параллельны.

Таким образом, основной причиной падения активности №,К-АТФазы из почек сусликов при гибернации является, по-видимому, более агрегированное состояние фермента в мембранах микросом наряду с некоторым уменьшением его содержания в препаратах во время зимней спячки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Басевич, Евгений Викторович, Москва

1. Абатуров Б.Д., Магомедов М.-Р.Д. (1982) Зависимость смертности малых сусликов (С i te I ¿us pygmaeus) от плотности популяции и обеспеченности кормом. Зоол. журн., 61, 123-127.

2. Ануфриев А.И. (2002) Динамика массы тела у сусликов (Citelhis undiilatus) в спячке. Экология, 33, 73-76.

3. Ануфриев А.И. (2008) Механизмы зимней спячки мелких млекопитающих Якутии (Соломонов Н.Г., ред.), Изд-во СО РАН, Новосибирск.

4. Ануфриев А.И., Архипов Г.Г. (2004) Влияние размеров и массы тела на характер перезимовки у зимоспящих семейства Sciuridae северо-востока России. Экология, 35, 189-194.

5. Ануфриев А.И., Ахременко А.К. (1990) Энергетическая стоимость зимней спячки длиннохвостого суслика. Экология, 21, 68-72.

6. Батрукова М.А., Бетин B.JL, Рубцов А.М., Лопина О.Д. (2000) Анкирин: строение, свойства и функции. Биохимия, 65, 469-484.

7. Белоусов А.Б. (1993) Роль центральной нервной системы в контроле зимней спячки. Успехи физиол. наук, 24, 109-127.

8. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. (2002) Биологическая химия, Медицина, Москва.

9. Блюдзин Ю.А., Осадчая Л.М., Болдырев A.A. (1986) Жирнокислотный состав суммарных липидов и фосфолипидов мембранных препаратов транспортных АТРаз. Биохимия, 51, 1499-1505.

10. Болдырев A.A. (1982) Na, K-зависимая АТФаза как олигомерная система. В сб. Итоги науки и техники. Биологическая химия (Кретович В.Л., ред.), 17, ПИК ВИНИТИ, Москва, 75-146.

11. Болдырев A.A. (1983) Роль межбелковых взаимодействий в регуляции Са-насоса саркоплазматического ретикулума. Укр. биохим. журн., 55, 677-688.

12. Болдырев A.A. (1985) Биологические мембраны и транспорт ионов, Изд-во МГУ, Москва, 208.

13. Болдырев A.A. (1988) Характеристика температурной зависимости Na,K-АТФазы. Укр. биохим. журн., 60, 107-113.

14. Болдырев A.A. (1998) Na/K-АТФаза свойства и биологическая роль. Сорос, обр. журн., 4,2-9.

15. Болдырев A.A., Лопина О.Д., Прокопьева В.Д. (1985) Мембранные липиды как регуляторы межбелковых взаимодействий. Нейрохимия, 4, 80-95.

16. Болдырев A.A., Лопина О.Д., Рубцов A.M., Свинухова И.А. (1983) Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы, Изд-во Московского университета, Москва, 46-59.17,18,19