Механизмы регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих

Накипова, Ольга Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих"

На правах рукописи

Накипова Ольга Васильевна

Механизмы регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих

Биофизика 03.01.02

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

ти-ш—

Пущино - 2014

2 О ФЕВ 2014

005545335

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, лаборатория механизмов природных гипометаболических состояний.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор.

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, зав. кафедрой физиологии и общей патологии.

доктор биологических наук, НИИ прикладной электродинамики, фотоники и живых систем Казанского национального исследовательского технического университета им. А.Н.Туполева, зав. лабораторией механизмов передачи информации в живых системах.

доктор биологических наук. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук ведущий научный сотрудник лаборатории структуры и функций мышечных белков.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский Кардиологический Научно-производственный комплекс» Минздрава РФ, НИИ экспериментальной кардиологии, лаборатория электрофизиологии сердца.

Защита диссертации состоится « 24 » 04 2014 года в 14 ч. 00 мин

на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290,

г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН. г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

Кошелев Владимир Борисович

Гришин Сергей Николаевич

Вихлянцев Иван Милентьевич

Автореферат разослан <¿>6* <Яй? 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного совета /

кандидат биологических наук / Й 1// Л Смолихина Татьяна Ивановна

/ / / /1 Х--«--'/ '

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Известно, что ключевую роль в регуляции сократимости миокарда играют особенности кальциевого гомеостаза, который формируется, как результат функционирования различных Са2+-транспортирующих систем, управляемых нейрогуморальной системой и обеспечивающих, как вход Са2+ из внеклеточной среды, так и поступление из внутриклеточных депо. Нарушения кальциевого гомеостаза являются причиной большинства патологий сердца. Особое внимание исследователей привлекают зимоспящие млекопитающие, а именно - уникальная пластичность их кальциевого гомеостаза, которая расширяет адаптационные возможности к воздействиям внешних и внутренних факторов среды (Johansson 1996, Carey et al., 2003; Wang and Zhou, 1999, 2000, 2002; Opthof and Rook, 2000; Storey, 2003). Изучение особенностей функционирования сердца зимоспящих может приблизить нас к пониманию механизмов активации стресс-факторов и их роли в повышении адаптационных возможностей высших млекопитающих и человека.

Частота сердцебиений - жизненно важный модулятор, обеспечивающий способность сердца влиять на сердечный выброс и силу сокращений (Bowditch, 1871; Koch-Weser, Blinks, 1963; Endoh, 2004, Janssen 2010; Xu et al., 2011; Dvomikov et al., 2012). Ионам кальция принадлежит ведущая роль в реализации связи «частота-сила» (ритмоинотропные отношения). Изменения динамического баланса ионов Са2+ (кальциевый гомеостаз) в цитоплазме являются основной причиной нарушений сократительной способности и зависимости частота-сила при патологиях миокарда. Анализ ритмоинотропных явлений позволяет оценивать состояние системы поддержания кальциевого гомеостаза в клетках и тканях лабораторных животных и человека, как в норме, так и при патологиях миокарда [Мархасин и др., 1994; Reuter et al., 1999; Maier et al., 2000; 2002; Pieske et al„ 1996; 2002; Benitah et al., 2003].

В сердце зимоспящих доля участия различных источников кальция в активации сокращения обратимо меняется при смене сезонного состояния животных (активность, спячка, пробуждение). Показано, что при этом также изменяется и характер ритмоинотропных отношений [Kondo, Shibata, 1984, Zhou et al., 1987]. Тем не менее, имеющиеся данные об особенностях частотной регуляции силы сокращения сердца зимоспящих животных малочисленны и противоречивы. Полностью отсутствуют сведения о

характере ритмоинатропии в переходных состояниях животных: в процессе вхождения в состояние спячки и выхода из нее.

Сердце зимоспящих обладает удивительной способностью при периодическом входе в оцепенение и выходе из этого состояния в сезон гибернации значительно изменять и полностью восстанавливать уровень метаболизма, активность симпато-адренаповой системы и гормонального статуса, являющихся компонентами системы эндогенной регуляции (Kolaeva, 1964; Слоним, 1979; Колаева, 1979; 1993; Игнатьев и соавт. 1998; Nürnberger, 1995, обзоры Carey et al., 2003; Gaiser, 2004; Storey, 2010; Epperson et al., 2011). В этой отношении особую значимость приобретает исследование нейрогормональной регуляции функции сердца зимоспяших животных при смене их физиологического состояния. Известно, что инсулин играет ключевую роль в сезонных изменениях характера метаболизма гибернантов. Нами впервые предложена и теоретически обоснована возможность использования зимоспящих животных в качестве природной модели обратимости состояния инсулинорезистентности - явления, свойственного зимоспящим животным и уникального по своей значимости (Накипова и соавт, 1997). Понять механизмы, лежащие в основе данного явления - значит сделать важнейший шаг к решению проблемы преодоления диабета и его осложнений, среди которых одним из самых грозных является диабетическая кардиомиопатия (Thackeray et al., 2012). Использование зимоспящих животных в качестве природной экспериментальной модели обратимости инсулинорезистентности в последнее время вызывает все больший интерес (Wu et al., 2013), однако конкретного изучения роли инсулина в регуляции функции сердца гибернантов пока не получает должного внимания. Исследование этого вопроса представляется нам особенно актуальным и в связи с малым пониманием роли инсулина в регуляции сократительной активности миокарда обычных млекопитающих в норме и в условиях диабета. Решение проблемы осложняется и множественностью функций, выполняемых данным гормоном, и переплетением внутриклеточных и внешних факторов, определяющих взаимодействие между инсулином и другими рецепторными системами. В частности, показано, что в условиях инсулинорезистентности (при диабете II типа) наблюдается понижение чувствительности ß-адренорецепторов к действию агонистов. В этой связи использование сердца суслика открывает возможности изучения механизмов перекрестного взаимодействия сигнальных путей инсулиновых и ß-адренергических рецепторных систем животных. Сердце зимоспящих животных может стать источником важной информации о механизмах развития инотропных нарушений, связанных с

ремоделированнием кальций-транспортируюших систем и изменением нейрогормонального статуса в условиях диабетической кардиомиопатии [Semple et al., 2012].

Взаимодействие симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы играет особую роль в регуляции сократимости миокарда и кальциевого гомеостаза, как зимоспящих, так и обычных млекопитающих (Mattera et al., 2011). В сердце гибернантов соотношение активности симпатической и парасимпатической систем претерпевает значительные сезонные изменения [Kondo and Shibata, 1984; Kondo, 1986; O'Shea and Evans, 1985; Pleschka et al„ 1996; Harris and Milsom, 1995; Milsom et al., 1999; Milsom et al„ 2001; Elvert and Heldmaier, 2005]. Общий характер этих взаимодействий в сердце зимоспящих животных при смене их физиологического состояния практически не изучен.

Цель исследования: выявление особенностей регуляции сократительной функции миокарда зимоспящих животных в процессах сезонной адаптации.

Основные задачи исследования:

1. Выяснение особенностей зависимости силы сокращения от частоты стимуляции (ритмоинотропные отношения) в сердце суслика.

2. Создание феноменологической картины изменений ритмоинотропных явлений в папиллярных мышцах сердца суслика при смене сезонов активности животных и в условиях зимней спячки.

3. Установление корреляции характера ритмоинотропной связи и активности кальцийтранспортирующих систем при смене физиологического состояния животных.

4. Выявление роли инсулина в регуляции сократительной активности папиллярных мышц сердца суслика в зависимости от физиологического состояния животных.

5. Установление механизмов действия инсулина в сердце суслика.

6. Выяснение особенностей влияния p-адренергической и мускариновой рецепторных систем в регуляции сократимости миокарда суслика в различные фазы годового цикла.

7. Установление возможного пути перекрестного взаимодействия сигнальных механизмов рецепторов тирозинового типа (инсулиновые) и Р-адренергических рецепторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Характер изменений физиологического состояния сусликов при смене сезона активности сопряжен со значительными трансформациями ритмоинотропных явлений в папиллярной мышце сердца животных.

2. Вклад внутриклеточных и внеклеточных источников кальция в регуляцию силы сокращений сердца суслика является определяющим фактором, обуславливающим различия между обнаруженными типами ритмоинотропии.

3. Депо-акгивируемые Са каналы (Store operated Са2+ channels, SOC -каналы) обеспечивают альтернативный путь поступления внеклеточного Са2+ в сердце зимоспящих в периоды активных функциональных перестроек.

4. Величина и направленность инотропного действия инсулина при изменении физиологического состояния животных зависят от исходного типа ритмоинотропии сердца суслика.

5. В клетках миокарда зимоспящих животных эффект инсулина реализуется через стандартный сигнальный механизм действия рецепторов тирозинового типа и включает активацию PI3- и АКТ- киназ.

6. Инотропный эффект изопротеренола проявляется по-разному у активных летом животных и животных периода гибернации.

7. Характер взаимодействия мускариновой и p-адренергической рецепторных систем зависит от функциональной активности животных, состояния кальциевого гомеостаза клеток миокарда и активности NO-зависимой сигнальной системы.

Научная новизна и теоретическая ценность

В работе впервые проведено систематическое изучение особенностей частотной регуляции сократительной функции миокарда зимоспящих животных (ритмоинотропная связь). Исследовано действие специфических блокаторов различных кальцийтранспортирующих систем, проведена оценка их взаимосвязи с параметрами ритмоинотропии.

Впервые исследовано влияние инсулина на силу сокращения и особенности ритмоинотропных явлений в сердце суслика. Показано, что чувствительность миокарда к инсулину, а также направленность инотропного действия этого гормона варьирует в течение годового цикла жизнедеятельности зимоспящих и зависит от физиологического состояния животных, частоты стимуляции и исходного характера ритмоинотропных отношений.

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о возможности существования в сердце суслика альтернативного пути поступления Са2+ в SR, реализующегося через депо-активируемые кальциевые каналы (Store operated Са2+ channels, SOC-каналы). Появляются основания полагать, что SOC-каналы могут играть определенную важную роль в сезонных изменениях кальциевого гомеостаза у зимоспящих животных. Таким образом, открываются новые возможности изучения компенсаторной роли данного типа каналов у высших теплокровных (в частности, человека) в норме, патологии или в условиях действия стрессорных факторов внешней и внутренней среды.

Впервые показано, что характер взаимодействия (3-адренергической и мускариновой рецепторных систем проявляется по-разному в зависимости от функциональной активности животных, состояния кальциевого гомеостаза миокардиальных клеток и активности МО-зависимой сигнальной системы. Впервые обнаружено модулирующее действие инсулина на проявление эффектов изопротеренола и карбохолина в сердце суслика.

Проведенные исследования расширяют представления о физиологических и биохимических основах функционирования сердца зимоспящих животных. Создаются предпосылки для более детального изучения механизмов действия на миокард гормонов и нейротрансмитгеров, влияния которых реализуются через рецепторы с тирозинкиназной активностью и рецепторы, связанные с в-белками. Через данные типы рецепторов оказывают свое действие многие фармакологические препараты, влияющие на сердце и сосуды и, таким образом, полученные результаты могут иметь значение и при разработке научно обоснованных методик лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Практическая ценность. Выявленные зависимости инотропных воздействий от сезона года и функционального состояния животных, различающихся типологическими особенностями ритмоинотропии, существенно дополняют уже имеющиеся сведения о механизмах регуляции сократительной функции сердца. Так, известно, что действие кардиотропных веществ по-разному проявляется в условиях нарушений кальциевого гомеостаза и метаболизма миокарда при различных заболеваниях. Установление характера этой взаимосвязи - необходимый этап фармакологического тестирования новых препаратов. Как правило, для этой цели используются генетически модифицированные животные, искусственно воспроизводящие черты различных нарушений. Сердце зимоспящих -уникальная природная модель, воссоздающая при смене физиологического состояния животных черты различных нарушений, свойственных патологически измененному миокарду высших теплокровных, в частности, человеку. Полученные результаты позволяют установить прямую связь между состоянием кальциевого гомеостаза и характером действия инотропных стимулов, влияющих на силу сокращений. Детализация ритмоинтропных явлений создает основу для использования сердца зимоспящих животных в качестве модели, позволяющей проводить экспериментальный поиск механизмов, которые обеспечивают устойчивость миокарда незимоспящих млекопитающих и человека к условиям гипоксии, гипотермии и ишемии. Полученные нами экспериментальные факты могут найти практическое применение, например, при создании математической модели, позволяющей дифференцированно

отслеживать вклад различных источников кальция (как внеклеточного, так и внутриклеточного) в регуляцию силы сокращения при изменении физиологического состояния зимоспящих животных.

До настоящего времени не проводилось последовательных работ, посвященных раскрытию механизмов влияния инсулина на функцию сердца зимоспящих животных, поэтому наши исследования могут служить основой для лучшего понимания возможных взаимодействий инсулин-зависимых сигнальных путей с системами других вторичных посредников. Изучение эволюционно «отработанных» механизмов, обеспечивающих удивительную пластичность сердца зимоспящих животных, могут приблизить нас к пониманию механизмов активации стресс-факгоров и их роли в повышении адаптационных возможностей высших млекопитающих, в частности, человека. Выявленная картина изменений особенностей ритмоинотропных характеристик и характера влияния гормонов и нейротрансмитгеров в весенний и осенний периоды позволяет рассматривать гибернантов как удобную природную модель сезонно-обусловленной инсулинорезистентности и эмбриолизации миокардиальной ткани, перспективную для анализа функциональной значимости и молекулярных механизмов их формирования в условиях патологий.

Представленная работа носит фундаментальный характер. Результаты исследований могут иметь практическую значимость как для биофизиков и физиологов, так и для биохимиков и фармакологов. Изученные особенности регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих могут найти применение в качестве своеобразной «мишени» для фармакологических средств, которая может быть использована при создании лекарств с принципиально новым механизмом действия.

Личный вклад автора.

Автору принадлежат постановка проблемы и решение её в целом, планирование и непосредственное участие в проведении экспериментов, обработке результатов, написании статей. Функциональный контроль за состоянием животных и исследование их биохимических особенностей осуществлялись совместно с сотрудниками Лаборатории природных гипометаболических состояний: Игнатьевым Д.А., Захаровой Н.М., Андреевой Л.А. и Амерхановым З.Г. Исследования по изучению экспрессии белков в сердце суслика методом вестерн-блота проводились в сотрудничестве с Институтом кардиологии и

пневмологии Гетгингенского университета (Германия), а в настоящее время проводятся в сотрудничестве с Институтом теоретической и экспериментальной биофизики.

Апробация работы. 43 Annual Meeting of the Society for Cryobiology Hamburg, 2006; Georg-August University Goettingen, 2005; 2007; «XX съезд физиологического общества имени И. П. Павлова» (Москва, 2007); «VIII международный конгресс «Здоровье и образование -XXI век. Современные концепции болезней цивилизации»», (Москва, 2007); XXXth international congress on electrocadiology. 2008, St. Petersburg; Международные конференции «Биологическая подвижность» (Пущино, 2004-12).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 26 печатных работах, среди которых 17 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, 9 в сборниках трудов и тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 217 страницах, проиллюстрирован 41 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 593 цитируемых источника

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Основные эксперименты проводились на папиллярных мышцах (ПМ), изолированных из правого желудочка сердца сусликов Spermophilus undulatus. Для сравнения использовались ПМ сердца крыс породы Wistar. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите животных, 1986, 86/609/ЕЕС.

Суслики отлавливались в Республике Саха (Якутия) Российской Федерации в течение августа-сентября. В период активности животные содержались индивидуально в специальном помещении, с соблюдением естественного фотопериода при достаточном количестве пищи и воды. В период спячки животные также содержались в индивидуальных клетках в специальном темном помещении при температуре 0 - 4°С. В исследовании использовались взрослые животные обоих полов, близкие по массе тела (400 - 500 г летом и 650 - 550 г зимой).

Опыты на сусликах проводились в следующих группах животных: I группа - активные летнего периода (июнь-июль); II группа - активные периода подготовки к спячке (октябрь-

ноябрь) и животные сезона зимней спячки (гибернации) (декабрь-февраль), состоящего из повторяющихся баутов и включающих в себя смену состояний животных, разделенных на следующие группы: III группа: активные между баутами спячки (ЧСС 150-200 уд/мин, 7ь~36°С, 14-18 часов); IV группа: входящие в спячку (падение частоты сердечных сокращений (ЧСС) от 200-150 до 6-8 уд/мин, снижение температуры тела (7ь) до 5-6 °С); V группа: спящие (3-5 уд/мин, 7ь~4-6 °С в середине баута спячки); VI группа: пробуждающиеся (повышение ЧСС до 350-400 уд/мин в фазе повышенного термогенеза, при 7ь ~ 35-36 "С суслики открывают глаза).

Физиологические методы: Выделение папиллярных мышц (ПМ), стимуляцию и измерение силы сокращения проводили по ранее описанной методике (Накипова и соавт, 2000). Поперечное сечение ПМ составляло 0,8±0,07мм2. Изолированные препараты ПМ помещали в термостатируемую камеру с раствором Тироде следующего состава (в гпМ): 150 Na+; 4.0 К+; 1,8 Са2+; 1,0 Mg2+; 14 НСОз"; 1,8 Н2Р04'; 148,4 СГ; 11,0 глюкозы; pH раствора составлял 7,4. Раствор оксигенировали карбогеном: 02 (95 %) и С02 (5 %). Механическую активность мышц регистрировали с помощью механотрона 6Х-2М. В начале каждого опыта препарат стимулировали с частотой 0.3 Гц в течение 2 часов. Силу сокращения (F) папиллярной мышцы определяли как отношение силы изометрического сокращения к поперечному сечению несокращающейся мышцы (вычисляемой путем деления массы волокна на его длину) и выражали в mN/mm2. Время цикла повышения и понижения напряжения (сокращение-расслабление) (t, мс) оценивали по следующим параметрам: время достижения максимума сокращения (ВДМ) и время расслабления на уровне, соответствующем спаду изометрического напряжения до 50% и 95% от своей максимальной величины (ВР50, ВР95).

Для оценки вклада различных источников Са2+ (вне- и внутриклеточных) в регуляцию силы сокращений ПМ использован физиологический подход, основанный на моделировании ритмоинотропных эффектов (зависимость силы сокращения от частоты стимуляции и эффект паузы) в перфузируемых мышечных препаратах сердца (Lukas and Bose, 1986; Bers & Christensen, 1991; Maier et al., 2000; Pieske et al., 1996, 2005; Jansssen 2011). Анализ эффекта паузы использован как качественный показатель содержания Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме (Lukas and Bose, 1986; Pieske et al., 1996, 2000). Известно, что потенциал действия (APD) в сердце суслика очень короткий (Egorov et al., 2012), аналогичный тому, который регистрируется в сердце крысы. Это обеспечивает существенные преимущества использования сердечных мышц данных животных для изучения ритмоинотропных

феноменов, так как параметры их потенциала действия практически не меняются при изменении частоты стимуляции (Lukas and Bose, 1986).

По силе изометрического сокращения (F) оценивали стационарную зависимость «частота-сила» и эффект паузы по следующим протоколам: 1. Регистрация зависимости «частота-сила» (ЧС). Папиллярная мышца растягивалась до 95% от максимальной длины препарата, соответствующей максимальной силе изометрического сокращения. После полной механической стабилизации на частоте стимуляции 0.1Гц, частота скачкообразно увеличивалась до 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5 и 6.0Гц. В зависимости от задачи исследования эксперименты проводили при 37°С либо при 30°С перфузирующего раствора. 2. Регистрация эффекта паузы. Кривые механической реституции. После полной стабилизации сократительной функции ПМ на базовой частоте стимуляции (0.3 или 1.0Гц в настоящей работе), стимуляцию останавливали на фиксированное время от 2 до 120 секунд, а затем возобновляли на той же самой частоте. Эффект паузы оценивали, как отношение максимальной величины силы первого сокращения после периода покоя (тестовое сокращение, Fi) к силе ритмического сокращения на базовой частоте (F0). Полная корреляция между величиной изометрического сокращения и светового сигнала, отражающего уровень кальция в клетке, однозначно указывает на то, что концентрация свободного кальция в цитоплазме коррелирует с изменениями силы сокращения в ответ на внесение паузы (Maier et al., 2005). Ингибиторный анализ подтверждает, что данный параметр, действительно, является качественным показателем содержания кальция в СР. Эффект паузы сохраняется при обработке нифедипином (блокатором Ca каналов L-типа), и полностью подавляется рианодином, - блокатором каналов, через которые происходит выброс Ca из СР.

Протоколы 1 и 2 применяли после обработки папиллярных мышц специфическими ингибиторами различных кальцийтранспортирующих систем (см. ниже) и фармакологическими агентами.

Процесс автоматического управления ходом эксперимента, регистрацию тестируемых параметров и их обработку проводили с помощью специально разработанного программного обеспечения (авторы Н. Карпук и С. Тарлачков). Оценка статистической значимости изменения параметров сокращения проводилась с помощью анализа вариаций ANOVA (различия считали достоверными при р < 0,05). Данные представлены в виде средних значений исследуемых параметров. Во всех случаях указывается стандартная ошибка среднего.

Фармакологические подходы. Оценка роли различных источников кальция в регуляции силы сокращения основывалась на использовании специфических ингибиторов различных капьций-транспортирующих систем. Роль внеклеточных источников кальция оценивалась с помощью ингибиторов L- типа Са2+- каналов (нифедипин, 2 мкМ, Sigma); обратной формы Na+-Ca2+ - обменного механизма (KB-R7943, 10 мкМ, Tocris), а также путем изменения содержания концентрации кальция в составе перфорирующего раствора (от 0.18 до 7.2 мМ). Активность прямой формы Na+/Ca2+ - обменного механизма оценивалась с помощью замены ионов Na+ на Li*. Для исследования роли внутриклеточных источников Са2+ использовались ингибиторы: рианодиновых рецепторов (рианодин, 1 мкМ, Sigma) и Са2+-АТФ-азы CP (циклопиазоновая кислота, от 10-до 30 мкМ, Sigma).

йэШПААГэлектрофора и Вестерн блот анализ: Электрофоретическое разделение белков осуществлялось стандартным методом в денатурирующе-восстанавливающих условиях (SDS-PAGE). После электрофореза белки переносились на нитроцеллюлозную мембрану. Для специфического связывания с исследуемыми белками использовались поликлональные кроличьи антитела к соответствующим белкам мыши. В качестве вторичных антител использовались поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. В качестве контроля нагрузки белковых полос использовали GAPDH. Определение содержания белка в тканях сердца суслика проводилось по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Зависимость силы сокращения миокарда от частоты стимуляции (ритмоинотропные отношения) связана с функционированием внутриклеточных систем, ответственных за сопряжение возбуждения с сокращением (Е-С coupling, электромеханическое сопряжение -ЭМС). В сердечных клетках сопряжение возбуждения с сокращением регулируется механизмом, известным как кальций-зависимое высвобождение кальция (Fabiato, Fabiato, 1975; Fabiato 1989), согласно которому небольшое количество кальция, поступившее в клетку во время возбуждения через Са2+ -каналы L-типа (при некоторых условиях возможен также вход Са2+ через обратную форму Na+/Ca2+- обменника), вызывает высвобождение большого количества Са2+ из саркоплазматического ретикулума (SR) через рианодин-чувствительные каналы SR, достаточное для активации актин-миозинового комплекса и запуска сокращения (Bers, 2000, Weiss et al., 2013; Hoffman et al., 2014). В процессе расслабления Ca2+ из области сократительных белков частично выводится за пределы клетки через сарколемму (за счет

активности Са2+ -АТФазы сарколеммы и прямой формы Na+/Ca2+ - обменного механизма), частично вновь поглощается ретикулумом (за счет активности Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума) и может участвовать в активации следующего сокращения (обзоры: Berridge et al., 2003; Lehnart et al., 2009; Trafford, Eisner et al., 2010].

В сердце большинства видов млекопитающих и человека в области физиологических частот стимуляции в норме зависимость «частота - сила» (ЧС) имеет положительную направленность: увеличение частоты стимуляции увеличивает силу сокращений (рис. 1А, Б). При патологиях зависимость ЧС приобретает на начальных стадиях заболеваний полифазную форму (положительно - отрицательную), а по мере углубления процесса становится полностью отрицательной (рис. 1В) [Мархасин и др, 1994; Pieske et al., 1996; Somura et al., 2001; Lehnart et al., 2009].

Мореная свинка

Человек

Крыса

!г

0.1 03 3

1Гц

0.3 0.5 0.8 1 1.5 2 3 4

Частота стимуляции. Гц

кадиомиопатия

) Нифедилин

IPbskea aU 1996:2005)

Частота стимуляции. Гц (Swyvcra or at. 2002)

Рисунок 1. Сравнительная картина особенностей ритмоинотропных явлений в миокарде различных видов животных и человека (в норме и при патологии). А - положительный тип зависимости ЧС в ПМ морской свинки (п=8) и Б - двухфазный тип в сердце крысы (п=7), зарегистрированные в условиях наших экспериментов (при 30°С). В - положительная зависимость ЧС в сердце человека в норме и отрицательная - при патологии (по данным Р1е5ке е! а1., 1996).

В миокарде крыс и мышей зависимость ЧС имеет двухфазный характер: отрицательный в области низких частот стимуляции (до 1.0 Гц) и положительный - в области высоких (физиологических) частот (1-14 Гц) (рис. 1Б,Г). Сила сокращения в области низких частот зависит от внутриклеточных источников Са2+ (блокируется рианодином), а в области высоких частот - от внеклеточных (блокируется ингибитором Са2+-каналов, нифедипином) (Рис. 1Г, по Stuyvers et а!., 2002). Положительная направленность ЧС выражена сильнее у крупных млекопитающих (человек, собака, кролик), чем у мелких грызунов (крысы и мыши). В то время как у первых сила сокращения увеличивается в 2 и более раз, у крыс (в области физиологических частот) наблюдается лишь незначительное увеличение силы сокращения.

Особенности ритмоинотропных явлений (зависимость «Частота-сила» и эффект паузы) в сердце зимоспящих животных в сравнении с миокардом незимоспяших животных и человека.

В исследованиях Кондо и Шибата (Kondo & Shibata, 1984; Kondo, 1986, 1987) было впервые показано, что в сердце зимоспящих (на примере бурундуков Tamias sibiricus) характер ритмоинотропии меняется в зависимости от функционального состояния животных. По данным этих авторов, бурундуки в состоянии активности, подобно обычным теплокровным животным, имеют положительный тип ритмоинотропии, а в состоянии спячки - отрицательный, как в сердце крыс и мышей (Рис. 1Б). Такая точка зрения в литературе до сих пор является преобладающей, так как подробных исследований особенностей ритмоинотропии в сердце зимоспящих животных не проводилось. Принципиально новым результатом, полученным в настоящей работе, является то, что ритмоинотропные характеристики миокарда активного суслика претерпевают значительные сезонные изменения к представляют собой сочетание свойств миокарда крысы в норме и высших теплокровных животных в условиях патологий.

Известно, что физиологический диапазон частот для сердца суслика варьирует в широких пределах: от 3-5 уд/мин (в спячке, при ректальной температуре 1-4°С) до 360-420 уд/мин (летом, в моменты бегства от опасности или в процессе пробуждения в сезон спячки) [Lyman et al., 1982; Калабухов, 1985; Игнатьев и др., 1992]. Исследование зависимости силы сокращения от частоты стимуляции в диапазоне, охватывающем физиологический (0.1- 4.0 Гц, 30°С, Са2+ 1.8 мМ) показало, что, вне зависимости от функционального состояния

животных, характер зависимости ЧС в ПМ сердца суслика, в основных проявлениях, относится к отрицательному типу: сила сокращения на высоких частотах (от 1.0 до 4.0 Гц) всегда меньше ее величины на низких частотах (в области 0.1 Гц) (Рис. 2). Однако в каждой функциональной группе животных выделяются 2 типа зависимости ЧС, имеющие ряд отличительных особенностей.

Лето

(июнь - июль)

Осень (сентябрь - ноябрь)

1к Активные!

Я пя9

Ч . А

Активные Ii * n= 10

X . -j Активные I

Активные II п=7

Период гибернации (декабрь - март)

: Активные I

«j январь п=9 , „

\\т Спящие

\ \ | п=8

Частота стимуляции, Гц -Активные! -о- Активные II -

-Спящие

Рисунок 2. Типы зависимости «Частота- сила» в папиллярных мышцах сердца активных летних (п=19); осенних (п=16); зимних (п=12) и спящих (п=8) сусликов (30°С ; Са2+ 1.8 мМ). Статистические кривые 2 типов зависимости силы сокращения от частоты стимуляции. Здесь и на последующих рисунках с представлением зависимости ЧС: по оси ординат: сила стационарного изометрического сокращения в % по отношению к частоте стимуляции на 0.1 Гц, принимаемой за 100 %. По оси абсцисс: частота стимуляции, Гц. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего (*-достоверное отличие от 0.1Гц Р < 0,05).

Можно видеть, что кривые частотной зависимости значительно различаются по величине спада силы сокращения при увеличении частоты стимуляции от 0.1 до 0.5 Гц. Выбрав данную величину за критерий оценки (AF), мы построили гистограмму распределения встречаемости папиллярных мышц с разным значением AF в сердце сусликов летнего периода (Рис. ЗБ). Она подтверждает, что ПМ сердца «летних» животных действительно разделяются на 2 отдельные группы: со слабой (AF<40%, тип 1) и выраженной (AF>50%, тип 2) крутизной спада кривой зависимости «Частота-сила» (ЧС зависимость). Для всех исследованных групп сусликов, независимо от исходного типа ритмоинотропии, характерно ускорение временных параметров цикла сокращение-расслабление с ростом частоты стимуляции. Это согласуется с данными литературы о том, что положительный лузитропный эффект (ускорение временных параметров сокращения при увеличении частоты стимуляции) является базисной, видонеспецифической реакцией сердечных мышц на частоту стимуляции (Janssen, 2010).

Таким образом, результаты наших исследований на сердце суслика показали, что положительный тип ритмоинотропии, в классическом проявлении свойственный миокарду высших теплокровных животных и человека (Рис. 1А,В), отсутствует в сердце зимоспящих животных.

Г Тип 1

0.017 0.1 0.2 0.3 0.4 В.5 0.6 0.В 1.0 1.5 2.0 3.0 Гц

^ Нх Тип 1

■■ИИИи

Тип 2 * * ♦ ♦ ♦ *

тип г

0.017 0.1 0.2 0.3 0.5 0.6 0.0 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 Гц

с.1 а з 0.4 0,5 е,е о.в 1 1.6 I 1 «

Частота стимуляции, Гц

Рисунок 3. А - типы зависимости «Частота-сила» в ПМ сердца сусликов летнего периода со слабой - (тип 1) и выраженной (тип 2) отрицательной зависимостью. А- суперпозиции силы сокращения при разных частотах стимуляции. Б - Гистограмма распределения числа ПМ с различной степенью снижения силы сокращения при увеличении частоты стимуляции от 0.1 до 0.5 Гц (¿У?) у сусликов летнего периода (июнь-июль 2005-2010г.г., п=47). По оси абсцисс: ДР (30°С, [Са2+]о 1.8 мМ), в %. По оси ординат - количество сусликов. В- статистические кривые 2 типов зависимости силы сокращения от частоты стимуляции. Данные представлены как средние значения + ошибка среднего (п>5 в каждой группе животных »-достоверное отличие от 0.1Гц Р < 0,05). Г - оригинальные записи изменений силы сокращения при увеличении частоты стимуляции с ленты самописца. Типичные примеры зарегистрированы на ПМ летних сусликов одинакового диаметра, выделенных из сердца животных одного пола (самцы).

ПМ сердца суслика с 1 типом ритмоинотропии, сходны с типами, которые наблюдаются в миокарде больных врожденными и приобретенными пороками сердца (Рис. 1В) (Р1езке й а1., 1996, Ма1ег е! а1., 2005; Зотига е! а1., 2001). ПМ сердца суслика со 2 типом ритмоинотропии, преобладающим у активных животных весенне-летнего периода (Рис. 2, 3), обнаруживает сходство с особенностями ритмоинотропии сердца крысы (рис., 1Б).

При условии, что вход внеклеточного кальция является необходимым триггером сокращения для миокарда любых видов животных, у видов с двухфазным типом

ритмоинотропии (крысы, мыши) до

90% 15

активаторного Са поступает

саркоплазматического ретикулума. В миокарде с положительной зависимостью ЧС, характерной для большинства высших теплокровных животных и человека в норме, вход внеклеточного Са2+ через каналы L-типа играет не только триггерную, но и активаторную роль. Т. е. в данном случае сила сокращения в значительной степени зависит как от внеклеточных, так и внутриклеточных источников кальция [Bers, 2001].

Основываясь на данных литературы о взаимосвязи особенностей ритмоинотропных явлений и состояния кальциевого гомеостаза, мы предположили, что ПМ с 1 и 2 типами ритмоинотропии в сердце суслика будут существенно различаться соотношением активности различных кальцийтранспортирующих систем. Для проверки этой гипотезы мы провели исследование роли различных источников Са2+ в регуляции силы сокращения сердца суслика с использованием специфических ингибиторов различных кальцийтранспортирующих систем.

Исследование роли различных источников кальиия (вне - и внутриклеточных) в регуляции силы сокращения ПМ сердиа сусликов с разными типами ритмоинотропии. Известно, что гомеостаз кальция регулируется динамикой баланса кальция, поступившего в клетку из внеклеточной среды и вышедшего из клетки, и кальция, поступившего из внутриклеточных источников и вновь поглощенного в них. Однако вопрос о роли различных источников кальция в сезонных перестройках сердца зимоспящих животных до сих пор не решен окончательно. Предполагается, что у гибернирующих животных существует особая регуляция Са2+ -каналов сарколеммы, которая позволяет предотвратить усиленный вход кальция в клетку во время гипотермии и избежать кальциевых перегрузок. Известно, что в период спячки в потенциале действия спящего животного отсутствует фаза плато, в формировании которой, как известно, существенную роль играет Саг+ ток (Kondo and Shibata, 1984, Egorov et al., 2012). На препарате папиллярной мышцы негибернирующих бурундуков входящий Са2+ ток практически не отличается от токов на том же препарате животных других видов (Kondo and Shibata, 1984). У спящего суслика базальный уровень Са2+ тока примерно в 2 раза ниже, чем у активного [Alekseev et al., 1996; Yatani et al., 2004]. Идея о том, что в основе сезонных перестроек кальциевого гомеостаза сердца зимоспящих лежит снижение активности кальциевых каналов прослеживается в большинстве (Alekseev etal., 1996; Yatani et al., 2004; Dibb et al., 2005; Wang et al., 2002; Li et al., 2011), но далеко не во всех работах, касающихся данного вопроса (Zhou et al., 1991; Herve et al. 1992). Имеются факты, которые свидетельствуют о том, что роль внеклеточного Са2+ и Са2+-каналов остается значительной и в период гибернации (Zhou et al., 1991; Herve et al. 1992). Таким образом, вопрос о роли

внеклеточных источников кальция в адаптационных перестройках сердца зимоспящих животных остается дискуссионным.

Роль внеклеточных источников кальция.

Влияние изменения концентрации калышя 1Са2+[ов перфузируюшем растворе. С целью оценки роли [Са2+]о в реализации ритмоинотропной связи в сердце суслика нами была исследована зависимость силы сокращения от концентрации кальция [Са2+]о в перфузирующем растворе. Оказалось, что активные суслики со вторым типом ритмоинотропии в большей степени зависят от [Са2+]о (рис. 4А,Б,В).

Снижение [Са24]о закономерно вызывает подавление силы сокращений во всех исследованных группах сусликов. Однако наибольший эффект наблюдается в группе активных сусликов 2 типа. При [Са2+]о 0.45 мМ сила сокращения в данной группе практически полностью подавляется во всей области исследованных частот (рис. 4). В ПМ сердца сусликов с первым типом ритмоинотропии в области низких частот стимуляции остаются значительные сокращения (около 40% от контрольных). Аналогичный результат получен в группе спящих сусликов (п=4).

120%

(Г X

§=г8°

о° "г* 40 го С

Рисунок 4 Зависимость силы сокращения от концентрации ионов Са2+ (|Са2+]0) в проточном растворе в ПМ сердца активных сусликов с разными типами ритмоинотропии (30°С). А -По оси

ординат', амплитуда стационарного изометрического сокращения. За 100 % принимали значение амплитуды сокращения при частоте стимуляции 0.1 Гц. По оси абсцисс: частота стимуляции, Гц. Данные представлены, как средние значения ± стандартная ошибка среднего ('-достоверное отличие от контроля [Са2+]0 1.8мМ ( Р < 0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что определяющую роль в активации

сокращения ПМ сердца сусликов со 2 типом ритмоинотропии играют внеклеточные

источники Са2+

Активные I п-7

Активные II

п=6

Са 1.8 мМ

,Са 0.45 мМ Ф ^

Са 1.8 мМ

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1 1.5 2 3 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1 1.5 2 3 Частота стимуляции, Гц Концентрация Са, мМ 1.8 -0-0.45

Са2+ ток Ь-типа С1г„г+). С целью выяснения роли Са + - каналов Ь-типа в характере проявления ритмоинотропной связи в сердце суслика, мы исследовали влияние нифедипина (специфического ингибитора данного типа каналов) на ритмоинотропные характеристики ПМ сердца спящих и активных сусликов разных сезонных периодов (лето, осень, зима). По нашим данным (Рис. 5), нифедипин оказывает выраженный отрицательный инотропный эффект в сердце во всех исследованных группах животных, включая спящих. В ПМ сердца осенних, зимних активных и спящих сусликов эффект нифедипина, независимо от частоты стимуляции, составлял в среднем 25-30% и не вызывал значительных изменений характера ритмоинотропии.

# Рисунок 5. Влияние нифедипина (2 мкМ) на силу сокращения

- л«тние па? ? папиллярных мышц сердца сусликов разных сезонных периодов,

а ос«»«»» пи ;'] р| По оси ординат - % подавления силы сокращения по отношению

а зимние и« . Н И к контролю для указанных частот стимуляции). Данные . 1 11 |:! . представлены как средние значения ± ошибка среднего. * -, р N , I ] 1 П! статистические значимые отличия от 0.1Гц в группе, Р < 0,05.

Частота стимуляции. Гц

Отличительной чертой действия нифедипина в ПМ сердца сусликов летнего периода, независимо от исходного типа ритмоинотропии, является выраженная зависимость эффекта от частоты стимуляции (0.1 Гц: 28.0 ± 2.2 %, п = 7, Р < 0.05; 1.0 Гц: 66.7 ± 5.6 %, п = 5, Р < 0.05). В области частот стимуляции свыше 1.0 Гц нифедипин вызывал сильное ингибирующее действие, как у животных с первым, так и со вторым типами ритмоинотропии. Отсутствие частотной зависимости и меньшая выраженность эффекта нифедипина у животных периода гибернации в соответствии с данными литературы (Kondo, 1986; Wang et al., 1995, Alekseev et al., 1996, Kokoz et al., 2000, Li et al., 2011) указывают на то, что Са2+ ток L-типа играет меньшую роль в непосредственной активации сокращения и служит «триггером» выброса Са2+ из СР.

Na/Ы* - обменный механизм (NCX). NCX — АТФ-независимый ионный транспортер сарколеммы обменивает один ион кальция на три иона натрия. Роль NCX в поддержании гомеостаза ионов Са2+ недостаточно изучена, что во многом обусловлено его способностью функционировать в двух режимах — прямом и обратном. Направленность функционирования NCX зависит от градиента ионов Na+ и Са2++ и мембранного потенциала. Действуя в прямом режиме, NCX (NCXforward) играет важную роль в процессе расслабления, удаляя кальций из

цитоплазмы после того, как произошло сокращение. Однако, при определенных условиях, например, при искусственном понижении внеклеточной концентрации Na+ или при повышении внутриклеточной концентрации ионов Na+, может закачивать Са2+ внутрь клетки и быть триггером сокращения [Bers et al., 2006]. Обратный режим функционирования (NCXreverse) в большей степени характерен для миокарда крыс и мышей, а также патологического миокарда человека [Weisser-Thomas et al., 2003; Neco et al., 2010]. Роль NCX в сезонных изменениях кальциевого гомеостаза зимоспящкх животных до настоящего времени неясна [Lyman et al., 1982; Wang, 1988; Mackiewicz, Lewartowski, 2006]. Мы провели исследование роли прямой и обратной форм NCX в регуляции ритмоинотропных явлений в сердце суслика. Активность прямой формы NCX оценивалась с помощью гипонатриевого раствора (50% замена ионов Na+ на Li+). Роль обратной формы - путем использования специфического ингибитора KB-R7943 (Iwamoto et al., 1996, Sato et al., 2000).

Как следует из данных, представленных на Рис. 6, у сусликов с 1 типом ритмоинотропии эффект LiCl был выражен значительно слабее, чем в ПМ со 2 типом, и значимо проявлялся лишь в области частот стимуляции свыше 0.6Гц (Рис. 6А). Таким образом, полученные данные вновь свидетельствуют в пользу преимущественной зависимости силы сокращения ПМ со 2 типом ритмоинотропии от транссарколеммального обмена Са2+ Исследование влияния KB-R7943 (10 мкМ при 1С5о -1.2-2.4 мкМ), ингибитора NCXrcvcree, на ритмотмоинотропные характеристики ПМ сердца исследованных групп сусликов не выявило значимого эффекта обратной формы NCX в регуляцию силы сокращения сердца сусликов (Аверин А.С., канд. дисс.2011).

зима

лето-осень Тип 2

140%

Тип 1

0.003 0.1 0.3 0.5

1 3 0.003 0.1 0.3 0.5 Частота стимуляции, Гц

Рисунок 6. Вклад прямой формы На+/Са2+-обменного механизма в характер формирования разных типов ритмоинотропии в ПМ сердца суслика. Влияние 1лС1 на зависимость ЧС в ПМ с 1 (А) и 2 (В) типами ритмоинотропии. Данные представлены, как средние значения ± стандартная ошибка среднего (•-достоверное отличие от контроля Р < 0,05).

Роль внутриклеточных источников Са2+ в реализации ритмоинотропиных феноменов в сердце суслика.

Сап ко ил спм ати ч ески и реши кул ум является важнейшим внутриклеточным компартментом, отвечающим за регулирование обмена Са2+ и осуществление процесса мышечного сокращения. Спонтанный выброс Са2+ из везикул 511 вследствие нарушения его функции, способствует усилению «триггерной» активности кардиомиоцитов и может служить причиной нарушений ритма сердца. Повышенная способность саркоплазматического ретикулума (БИ.) запасать и удерживать Са2+ в период гибернации лежит в основе уникальной устойчивости функционирования сердца зимоспящих в экстремальных условиях. В этой связи выявление закономерностей и динамики адаптивных изменений кальциевого гомеостаза в сердце зимоспящих животных на уровне саркоплазматического ретикулума -предмет повышенного внимания исследователей (обзор 1л, 2011). Основными компонентами мембраны ЭЯ, необходимыми для освобождения Са2+ и его последующей реаккумуляции БЯ, являются Са2+-каналы (И-уЛ.) и Са2+-АТФаза 5Я (ЗЕЯСА, в сердечных мышцах представленная изоформой 5ЕЯСА2а). Си '-каналы (ЯуЯ) Для оценки роли ЯуЯ в регуляции силы сокращения в ПМ с разыми типами ритмоинотропии был использован высокоселективный алкалоид рианодин, который в микромолярных концентрациях

ингибирует активность рианодиновых рецепторов саркоплазматического ретикулума (Jones et al., 1979; Fleisher et al., 1985).

Активные I n=5

Активные II n=4

К 120%-

120%

О 0,3 0,6 0.8 1 1,5 2 3 4 0 0.3

Частота стимуляции, Гц

0.6 0,8 1 1.5 2 3 4

1 ын|

5 минут

Рисунок 7. Влияние рианодина (1 мкМ) на зависимость ЧС (А) в ПМ сердца активных сусликов летне-осеннего периодов с 1 и 2 типами ритмоинотропии. По оси ординат, амплитуда стационарного изометрического сокращения в % относительно 0.1 Гц. (А) - типичные записи регистрации изменения силы сокращения на частоте 0.3 Гц с ленты самописца в ответ на воздействие рианодином. Время введения рианодина в раствор указано стрелками. Данные представлены, как средние значения ± стандартная ошибка среднего (»-достоверное отличие от контроля Р < 0,05).

В группе активных животных с 1 типом ритмоинотропии рианодин (1 мкМ) вызывает кратковременный (в пределах 5 мин) рост силы сокращения, сопровождающийся ее быстрым (в течение 15 мин) падением практически до нуля (рис. 7Б). В препаратах активных животных со 2 типом ритмоинотропии рианодин действует слабее, особенно в области высоких частот стимуляции (рис. 7Б). В результате действия рианодина в данной группе животных зависимость ЧС из отрицательной становится положительной. Полученные данные свидетельствуют о том, что сокращение мышц с первым типом ритмоинотропи в большей степени зависит от внутриклеточных источников Са2+.

С и2*-Л ТФаза SR (SERCA2a). С целью выяснения роли Са2+-АТФазы SR в механизмах, обуславливающих разный тип ритмоинотропии в группах активных сусликов, были проведены эксперименты с использованием CPA, селективного ингибитора данной АТФ-азы (Seidler et al., 1989). Рис. 8демонстрирует влияние CPA (10 мкМ) на характер

ритмоинотропной связи (0.1 - 1.0 Гц) в ПМ мышцах сердца активных сусликов со слабой (AF около 20%, группа I, п=4) и выраженной (AF около 80%, группа II, п=4) частотной зависимостью. В группе 1 типа воздействие CPA в течение 1 часа вызывает значительный рост силы сокращения в области низких частот стимуляции (от 0.1 до 0.3 Гц), практически не меняет ее величину в области средних частот (0.4-0.6 Гц) и достоверно уменьшает в диапазоне частот свыше 0.6 Гц. В группе активных животных 2 типа CPA, при сходстве общих тенденций в развитии эффекта, оказывает слабое влияние на зависимость ЧС (Рис. 8Б).

Ожидалось, что в условиях обработки препаратов CPA потенцирующий эффект паузы (как показатель содержания Са2+ в CP) будет в значительной степени подавлен. Однако вопреки ожиданиям, эффект паузы не только не блокировался, но значительно усиливался, особенно в I группе сусликов (рис. 8Г). Даже в условиях длительной (порядка 5-12 часов) предварительной обработки ПМ высокими концентрациями CPA (30 мкМ, п=5), мы не наблюдали подавления эффекта паузы, но, напротив, получали его значительное усиление. В целом, индуцируемые CPA изменения, делали характер ритмоинотропных проявлений в группе активных животных 1 типа более выраженным, сходным с тем, который обычно наблюдается у активных животных 2 типа.

0.2 0.3 0.4 0.5 О-в O.S 1

Частота стимуляции. Гц ♦ контроль ♦ CPA

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 О.в 0.»

Рисунок 8. Влияние циклопиазоновой кислоты (CPA, 10 мкМ) на (А) силу сокращения (на частоте 0.1 Гц); (Б) - эффект паузы и (В,Г) зависимость силы сокращения от частоты стимуляции в папиллярных мышцах сердца активных сусликов первого (В) (п=4) и второго типа (Г) (п=4): *- Достоверность отличия величины нормированной амплитуды сокращения в контроле от ее

величины после действия CPA (для одной и той же частоты стимуляции). (Б) - приведен типичный пример CPA-индуцируемого увеличения эффекта паузы в ПМ с 1 типом ритмоинотропии.

В этой связи интересно то, что в условиях, способствующих снижению активности прямой формы Na+/Ca2+ - обменного механизма (при 50% замене в омывающем растворе ионов Na+ на Li+), характер зависимости ЧС приобретал выраженные черты зависимости I типа (Рис. 9). На таких препаратах эффект CPA проявлялся в наиболее ярком виде. Можно предположить, что снижение активности прямой формы NCX, удаляющей Са2+ из цитоплазмы в процессе расслабления, вызывает компенсаторное повышение активности Са-АГФ-азы CP и наоборот. Таким образом, данные ингибиторного анализа свидетельствовали о том, что изменение соотношения вклада SERCA и NCX в процесс удаления Са2++ из цитоплазмы в процесс расслабления, является принципиально важным для формирования определенного типа ритмоинотропии. В пользу данного предположения свидетельствуют и данные молекулярного анализа, выполненного нами на препаратах замороженных образцов ткани всех исследованных групп сусликов (Рис.10).

Контроль

1.0 Гц

¿¿11 i* L L

2 5 10 15 30 60 120 c

1.0ГЦ

LiCI (50%)

1.0 Гц f

2 5 10 15 30 60 120 c Пауза, с

I )| wwlu l L L

2 5 10 15 30 60 120 c

Контроль

L CI+CPA

—с— контр ОЛЬ —*—LI 50% - -д - CPA+LI

LIC1+CPA

Контроль

Частота стимуляции, Гц » отличие от контроля. ■ отличив от LI60%, Р< 0,05 ANOVA

Рисунок 9. Влияние ЫС1 на (А) эффект паузы и зависимость ЧС (Б- среднестатистический результат; п=5, Р < 0,05) и (В - типичный пример) в папиллярных мышцах сердца сусликов осеннего периода.

Определение соотношения ЖЛС4 и NCX в процессе смены сезонов активности животных методом иммуноанализа.

Оказалось, что уровень БЕЯСА в ПМ спящих и входящих в состояние спячки животных почти в 2 раза выше, чем содержание ЫСХ. У активных сусликов весенне-осеннего периода со 2 типом ритмоинотропии уровень ЫСХ, напротив, почти в 2 раза выше, чем уровень БЕКСА. У активных сусликов с 1 типом ритмоинотропии 8ЕЯСА /ЫСХ содержатся примерно в равном соотношении. Анализ полученных данных подтверждает, что у сусликов со вторым типом ритмоинотропии Ыа+/Са2+ -обмен играет, по-видимому, доминирующую роль в процессе удаления Са2+ из цитоплазмы во время фазы расслабления.

Рисунок 10. Изменение соотношения вклада вЕИСА и 1МСХ в процесс удаления Са2' из цитоплаазмы в миокарде сусликов различных сезонных периодов. (А спящие п=4; Б-входящие в спячку п=3; В- пробуждающиеся п=5; Г- активные тип 1 п=3; активые 2 типа п=3). Иммуноанализ содержания в замороженных образцах сердца сусликов: Са2+ АТФ-азы саркоплазмати-ческого ретикулума С8ЕЯСА2а, черные столбцы) (нормализованного к вАРОН) и инвертированной формы №+/Са2+ обменного механизма (ИСХ, заштрихованные столбцы) (нормализованного к САРОН)

В этом случае возникает вопрос, почему величина эффекта паузы таких мышц значительно выше, чем мышц с 1 типом ритмоинотропии? Почему, на препаратах, предварительно обработанных циклопиазоновой кислотой, не снижается, а даже увеличивается уровень кальция в СР? Какой механизм обеспечивает поступление Са2+ в СР в условиях, когда активность ЗЕЯСА снижена? Мы предположили, что подобным механизмом могут быть депо-активируемые кальциевые каналы (вОС-каналы).

Депо-зависимые Са+ каналы (store operated Са2+ channels, SOC), каналы, активируемые в результате понижения концентрации свободных ионов Са2+ во внутриклеточных депо (саркоплазматическом ретикулуме) (Nilius et al. 2007; Watanabe et al.2008; Watanabe, 2009; Huke et al., 2011; Smani et al., 2014). До недавнего времени считалось, что SOC тип каналов наиболее характерен для невозбудимых тканей, однако в настоящее время их присутствие обнаружено и в миокардиапьной ткани, но только на стадиях эмбрионального развития, где они играют важную роль в регуляции сократимости и пейсмекерной активности. Показано, что депо-активируемые Са2+ каналы в саркоплазматическом ретикулуме сердца эмбрионов цыпленка активируются в условиях снижения активности SERCA с помощью специфических ингибиторов (тапсигаргин, циклопиазоновая кислота) (Sabourin et al., 2011). Считалось, что в норме данный тип каналов отсутствует в сердце высших теплокровных животных и человека. Показано, что они вовлечены в процессы, инициирующие развитие аритмий, гипертрофии и сердечной недостаточности (Seth et al., 2009; Vassort and Alvarez, 2009; Wu et al., 2010; Eder & Molkentin, 2011; Vennekens 2011; Luo et al, 2012). Существование депо-активируемых каналов в сердце зимоспящих животных ранее показано не было. С целью оценки возможной роли SOC каналов в регуляции кальциевого гомеостаза сердца суслика мы исследовали влияние 2-аминоэтоксидифенилбората (2 - АРВ), ингибитора SOC - каналов на характер ритмоинотропных отношений в сердце суслика в норме и в условиях предварительной обработки ПМ циклопиазоновой кислотой (Рис. 11).

Наиболее сильное действие АРВ оказывал на препаратах с резко выраженной отрицательной зависимостью, свойственной ПМ со 2 типом ритмоинотропии. Показано, что 2-АРВ всегда снижает индуцируемые воздействием CPA (Рис. 11 Б) рост эффекта паузы и силы сокращение в области низких частот стимуляции (Рис. 11). Аналогичные результаты получены и с другим ингибитором SOC-каналов (SK.F-96365).

(а)

Контроль

0.1 1.0 Гц

АРВ 10 мкМ 0.1 1.0 Гц

uIlLL IU1LL

О.ООЗ 0.3 0.5 0.8 1.5 3 5 Гц Частота стимуляции, Гц

L L

2 5 1015 30с

(г)

ILiLLL

-Л

0.М1 J.oit o-oj at

Частота стимуляции. Гц

Рисунок 11 Ингибитор SOC -каналов, 2-аминоэтоксидифенилборат (АРВ, 10 мкМ и 25 мкМ, 30 мин) вызывает обратимое подавление силы сокращения во всей области исследованных частот стимуляции (б,в) и эффект паузы (а) в ПМ сердца суслика со 2 типом ритмоинотропии (а,б,в) и с 1 типом ритмоинотропии, обработанных в течение 6 часов раствором CPA (10 мкМ) (п=3).

В настоящее время нами проводятся исследования по изучению экспрессии белков SOC каналов в сердце суслика методом вестерн-блота. Впервые показано, что два гена из семейства TRP каналов (transient receptor potential channel) - TRPC3 и TRPC5 экспрессируются в сердечной ткани зимоспящего животного (Рис. 12). Гены каналов TRPC6 и TRPC7 в ткани сердца суслика - не обнаружены.

ТкРСЗ ТР1РС5 ТЯРСб ТаРС7

Рисунок 12. При исследовании экспрессии генов семейства ТЯРС методом вестерн-блота впервые показана экспрессия двух генов из этого семейства - ТЯРСЗ и ТЯРС5 в сердечной ткани зимоспящего животного. Гены каналов ТЯРС6 и ТЯРС7 в ткани сердца суслика - не обнаружены.

В совокупности, полученные нами данные свидетельствуют в пользу существования в сердце

суслика альтернативного пути поступления Са2+ в SR, реализующегося через депо-

активируемые Са каналы. Детализация особенностей ритмоинотропных явлений в сердце суслика и их связь с соотношением активности различных кальцийтранспортирующих систем позволила нам в дальнейшем использовать ритмоинотропные характеристики для исследования роли различных сигнальных систем, активируемых рецепторами тирозинового типа (инсулиновые) и рецепторами, действие которых реализуется через ГТФ-связывающие белки (р-адренергических и мускариновых).

Роль инсулина в регуляции силы сокращения и ритмоинотропных явлений в сердце зимоспящих животных.

В настоящей работе впервые проведено сравнительное исследование влияния инсулина (0,1-10 нМ) на сократимость папиллярных мышц сердца суслика [Накипова и др., 1997]. Обнаружено, что чувствительность к инсулину и характер инотропного действия гормона значительно меняется в течение годового цикла жизни суслика [Накипова и др., 2000, 2001; 2004; Чумаева 2004]. В ПМ сердца глубоко спящих сусликов инсулин не оказывал значимого влияния на силу сокращения. У активных животных различных сезонных периодов (лето, осень, зима), а также взятых в эксперимент на различных стадиях пробуждения, инсулин оказывал положительный либо отрицательный инотропный эффект в зависимости от времени действия и концентрации гормона, а также от стадии пробуждения [Накипова и др., 2000].

Обнаружено, что эффект инсулина по-разному проявляется в зависимости от частоты стимуляции (Накипова и соавт, 2006а). Слабый положительный инотропный эффект инсулина чаще всего удается зарегистрировать в области низких частот стимуляции (0.1-0.5 Гц) при низких дозах гормона. В высоких концентрациях (1 - 50 нМ) инсулин оказывал преимущественно отрицательное инотропное действие во всем диапазоне исследованных частот стимуляции, ассоциирующееся с одновременным ростом эффекта паузы. Показано, что величина инотропного действия инсулина в значительной степени зависит от исходного типа ритмоинотропии и наиболее сильно проявляется у животных со 2 типом зависимости ЧС (Рис. 13) (Накипова и соавт, 2006а).

лет о • осень

период гибернации

Спящие

10t) г »-------; т

0.1 0.2 0.1 11.4

0.5 0.6 (J.S 10

О ill О 2 0.1 U.4 0.5 (>.<• 0.8 КО

Частота стимуляции, Гц

Рисунок 13. Влияние инсулина на силу изометрических сокращений ПМ сердца суслика.

Зависимость эффектов инсулина от частоты стимуляции и исходного типа ритмоинотропии. Среднестатистические кривые влияния инсулина (10 нМ) на зависимость «частота-сила» в ПМ сердца активных животных летне-осеннего (А,В) и зимнего (Б,Г) периодов в ПМ с I (А,Б); II (рис.В) типами ритмоинотропии и у спящих (Г) (п> 5 в каждом случае). Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего.*- Достоверность отличия величины нормированной амплитуды сокращения в контроле от ее величины после действия инсулина (для одной и той же частоты стимуляции) (*-

Фосфатидилинозитол-З-киназа (PI3K - phosphatidylinositol-3-kinase) является ключевым элементом всех сигнальных путей действия инсулина. ФИ-З-К действует, как внутриклеточный мессенджер на этапе активирования фосфатидилинозитолзависимых киназ, среди которых выделяется своими особыми свойствами фосфоинозитолзависимая серин/треонин протеинкиназа В (или Akt) (Рис.14А). Считается, что большинство, если не все, функции инсулиновых рецепторов детерминированы активностью этого фермента [Johnston et al, 2003; Sussman 2011]. На основе молекулярного анализа нами впервые показано, что инсулин вызывает значительное увеличение активности АКТ-киназы в сердце суслика,о чем свидетельствует повышение уровня фосфорилирования АКТ - белка (Рис.14Б). Данный эффект полностью блокировался вортманнином, специфическим ингибитором Р13К-киназы. Этот факт подтверждает, что в сердце зимоспящих животных действие инсулина реализуется через Р13К/АКТ-зависимый сигнальный механизм.

Р0.05).

Con Ins Wn Wn+lns

Инсулин

вк

Cifa

Con

Ins Wn Wn+lns

Рисунок 14. Механизм рецепторного действия инсулина (А). Роль АКТ- киназы (Б)- фотографии мембран после иммуноблоттинга лизированной ткани из правого желудочка сердца суслика из группы осенних животных (октябрь). Блоты исследовали с фосфо-АКТ (Ser473) и АКТ. (В)- результат денситометрии пятен, в условных единицах (р<0.05, п=4).

С целью доказательства участия PI3K- в механизме инотропного эффекта инсулина в сердце суслика мы также использовали вортманнин (Рис.15). Действуя из контроля, инсулин (10 нМ, 30 мин действия) вызывал типичный для него ингибирующий эффект (около 40%) (Рис.15А), ассоциирующийся с одновременным ростом (в 1.5-2 раза) эффекта паузы (Рис. 15Б). Вортманнин (100 нМ) на фоне действия инсулина не только полностью устранял вызванное инсулином снижение силы сокращения, но вызывал ее дополнительный рост при частоте стимуляции свыше 0.3 Гц. Предварительная обработка препаратов вортманнином полностью подавляла последующее развитие эффекта инсулином (Накипова и соавторы, 20066)

Частота стимуляции. Гц Максимум эффекта пау»ы. %

Рисунок 15. - Роль PI3 киназы в механизме инотропного действия инсулина в сердце суслика.

Влияние вортманнина на инсулин-индуцируемые изменения (А) зависимости «Частота-сила» и (Б) эффект паузы при частоте стимуляции 0.8 Гц в сердце суслика. Данные представлены как средние значения ± ошибка среднего (п=6 в каждой группе).

Таким образом, полученные данные подтверждают участие PI3-K в механизме инотропного действия инсулина на миокард суслика.

Роль Са2+-А ТФ-азы СР. Значительное усиление инсулином эффекта паузы (качественного показателя содержании Са2+ в CP) позволило высказать предположение о возможной роли Са2+-АТФ-азы CP в реализации отрицательного инотропного действия инсулина. С целью проверки данной гипотезы было проведено исследование эффектов инсулина на препаратах, предварительно обработанных циклопиазоновой кислотой (CPA), специфическим блокатором Са2+-АТФ-азы СР. Вопреки ожиданиям, обработка CPA не только не подавляла эффект инсулина, но усиливала его, особенно на препаратах I типа, исходно обладающих слабовыраженным характером ритмоинотропии (Рис. 16).

Усиление эффекта инсулина в условиях его сочетанного действия с циклопиазоновой кислотой позволяет предположить возможность участия SOC-канапов в механизме инотропного действия инсулина. В пользу этого предположения свидетельствуют и данные литературы. В частности, в работе Fauconnier et al. (2007), показано, что инсулин увеличивает экспрессию генов TRP3 каналов (относящихся к семейству SOC) в кардиомиоцитах мыши. По нашим вышеприведенным данным молекулярного анализа (Рис.12), именно TRP3 белки экспрессируются в сердце суслика.

160'!

=fc

СРА*Инсулин

Контроль ft £:

0.003 0.1 0.3

Частота, Гц

tiri.-M

Длительность паузы, с

О контроль иоРА t'J инсунии

I I

-«.и- u

СРА*Инсупин

-LU U U

СРА+Инсулин+АРВ

_lLLLL L

2 5 10 16 30 60 c

Рисунок 16. Влияние цнклопиазоновой кислоты на эффект инсулина в сердце суслика. Инсулин (10 нМ) вызывает рост амплитуды сокращений в области низких частот стимуляции (А) и значительное усиление эффекта паузы (Б,В), действуя на фоне предварительной обработки ПМ CPA (30 мкМ, 1 час). Ингибитор SOC каналов, 2-АРВ (25 мкМ) устраняет индуцируемый инсулином рост эффекта паузы (В).

Таким образом, на примере инсулина, мы впервые показали участие инсулин-зависимой сигнальной системы в регуляции сократительной функции миокарда суслика и участие SOC-каналов в реализации эффектов инсулина.

Роль Р-адренергической и мускариновой рецепторных систем в регуляции сократительной активности сердца суслика.

Большинство наиболее важных нейрогормональных рецепторов, контролирующих сократительную функцию миокарда, принадлежат к семейству серпентиновых рецепторов (семикратно пересекающих мембрану), сопряженных с G белками (G protein-coupled receptors, GPCR). К семейству GPCRs принадлежат p-адренергические (PAR) и мускариновые рецепторы (MR), динамическое взаимодействие между которыми играет важную роль в

регуляции сократительной функции сердца. В настоящее время известно о существовании 3 подтипов ßAR: ßlAR, ß2AR и ß3AR. Большую часть ßAR в здоровом миокарде млекопитающих и человека составляют ßl-рецепторы (70-80%), на долю ß2 приходится около 15%-18% и остающуюся часть (2%-3%) составляют ß3ARs (обзоры Lymperopoulos et al., 2012; 2013). Основной путь передачи сигнала от активированных GPCR реализуется через Gs-белки и направлен на повышение внутриклеточного уровня цАМФ и активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы (АПК) [Brodde et al., 2006; Bers, 2008; Woo and Xiao, 2012], фосфорилирующей ключевые белки системы электромеханического сопряжения, включая кальциевые каналы L-типа; регулятор активности Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума, фосфоламбан; рианодиновые рецепторы и тропонин I [Ginsburg, Bers, 2004]. Следствием активации данных белков является увеличение силы сокращения (положительный инотропный эффект) и уменьшение его длительности (положительный лузитропный эффект) [Ginsburg, Bers, 2004; Brodde et al., 2006; Goldhaber, Hamilton, 2010].

Сезонные особенности влияния изопротеренола в сердце суслика

Повышение активности симпатических нервов через активацию ß-адренорецепторов вызывает увеличение частоты и силы сердечных сокращений за счет повышения уровня цАМФ и([Са2+]1 . Ацетилхолин, освобождаемый из нервных окончаний парасимпатических волокон, стимулирует мускариновые рецепторы и снижает клеточную реакцию на стимуляцию ß-адренергических рецепторов за счет уменьшение уровня цАМФ и [Ca2+]i. Такое постсинаптическое взаимодействие позволяет осуществлять парасимпатическую регуляцию активности симпато-адренаповой системы, чрезмерная активация которой является одним из основных факторов, уменьшающих электрическую стабильность сердца. Показано, что соотношение активности симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы претерпевает значительные сезонные изменения в сердце гибернирующих животных [Kondo and Shibata, 1984; Kondo, 1986; O'Shea and Evans, 1985; Pleschka et al., 1996; Harris and Milsom, 1995; Milsom et al., 1999; Milsom et al., 2001; Elvert and Heldmaier, 2005; Braulke and Heldmeier 2010]. Однако в целом вопрос о характере их координированного взаимодействия в процессах адаптационных изменений кальциевого гомеостаза и сократимости сердца зимоспящих животных продолжает оставаться неясным.

Первые представления о роли ß-адренергической рецепторной системы в регуляции процессов электромеханического сопряжения в сердце гибернирующих животных основаны

на работах Кондо, выполненных на папиллярных мышцах сердца бурундуков [Kondo and Shibata, 1984; Kondo, 1986]. По данным Кондо, в сердце активных летних животных данный препарат действует классически, как положительный инотропный агент: стимулирует силу сокращения и кальциевый ток, увеличивая выраженность плато потенциала действия. У спящих бурундуков при этих же условиях изопротеренол не влиял на силу сокращения, хотя оказывал значительный (и даже более выраженный, чем у активных животных) рост кальциевого тока. В сердце спящих сусликов изопротеренол также стимулировал кальциевый ток [Alekseev et al., 1996; Kokoz et al., 1999] и увеличивал плато потенциала действия [Gainullin&Saxon, 1988]. Почему изопротеренол в этом случае не стимулирует сокращение до сих пор остается загадкой.

В рамках настоящей работы проведено исследование эффектов синтетического агониста pAR изопротеренола (1мкМ) на силу сокращений (0.1. -3.0 Гц; 30 ± 0.1°С; 1.8 тМ Са2+) ПМ сердца всех исследованных групп сусликов (результаты опубликованы частично: Аверин и соавт2010; Аверин, канддисс. 2011).

Активные лето

Активные лша

, „„„„о*. 11

" Н-f-i -

4-.л_-

т ; Т г контр

' Н4-Н

изопротеренол

' 41

0.5 0.3 1 1.5 2 3 Гц Спящие

120%

. f

"1,

^ контроль

ИЗО 1\ 1

0.3 0.5 0.8 1 1.6 2 3 Гц Пробуждающиеся ЗОоС

: . ^ , контроль

к, Н * \

изопротеренол

0.S 1 1.5 2 ЭГц

Частот стимуляции. Гц

0.5 0.3 1 1.5 2 3 Гц

Рисунок 17. Влияние изопротеренола (1 мкМ) на силу изометрических сокращений папиллярных мышц правого желудочка сердца активных летних (А), активных между баутами спячки (Б), спящих (В) и пробуждающихся сусликов (Г) в зависимости от частоты стимуляции. Среднестатистические кривые зависимости частота-сила в контроле и через 15 мин от начала воздействия изопротеренола. Данные представлены, как средние значения ± стандартная ошибка среднего (р<0,05). *-Достоверность отличия величины нормированной амплитуды сокращения в контроле от ее величины после действия изопротеренола (для одной и той же частоты стимуляции).

По нашим данным, изопротеренол при низких частотах (<0.2 Гц) слабо влияет на силу сокращения ПМ всех исследованных групп животных. В сердце активных летних сусликов при частотах свыше 0.2 Гц изопротеренол вызывает рост сокращения, выраженность которого растет с увеличением частоты стимуляции (Рис. 17 А); в сердце животных периода гибернации, независимо от их функционального состояния, в диапазоне частот от 0.3 до 1.0 Гц снижает силу сокращения (Рис. 17 Б,В,Г). Таким образом, отрицательный инотропный эффект изопротеренола нам удалось обнаружить только благодаря исследованию частотной зависимости эффекта (эксперименты Кондо были выполнены на одной частоте стимуляции- 1 Гц, при которой и в наших экспериментах у животных периода гибернации эффект изопротеренола отсутствовал).

Для проверки сАМР-зависимой природы ингибирующего эффекта изопротеренола был использован прямой активатор аденилатциклазы- форсколин. Мы убедились, что форсколин (1 мкМ), оказывает эффекты той же направленности, что и изопротеренол, как на ПМ сердца летних сусликов, так на препаратах животных периода гибернации, что доказывает с АМР-зависимую природу ингибирующего эффекта.

0 1 0.3 0.5 8.8 1 1.5 2 Гц 01 0 3 0 $ ое 1 1.5 2 ГЦ

Частота стимуляции. Гц

Рисунок 18. В сердце сусликов негибернационного периода изопротеренол и форсколин (прямой активатор АЦ) оказывают однонаправленное действие: стимулирующее у животных летнего периода (А) и ингибирующее у сусликов периода гибернации (Б).

Как можно видеть (Рис. 18), эффект изопротеренола превышает эффект форсколина и имеет выраженный «фазный» характер: достигает максимальной величины в первые 3-5 мин от начала действия, затем, незначительно снижаясь, остается на уровне, превышающем контрольный или равный ему (Рис.18А). У животных периода гибернации кратковременный рост силы сокращения сменяется ее снижением ниже контрольного уровня (Рис. 19А). Форсколин, прямой активатор аденилатциклазы, действует однофазно, как в случае стимулирующего (Рис. 18Б), так и ингибирующего действия (19Б). Таким образом, в характере действия изопротеренола существуют особенности (большая выраженность и «фазный» характер эффекта), которые позволяют думать, что его действие может реализоваться через какой-то дополнительный механизм, не связанный только с повышением уровня сАМР в клетке.

0.1 0.2 о.з 0 1 0 2 0.з Частота стимуляции. Гц

Рисунок 19. Усиление выраженности эффектов изопротеренола (А) и форсколина (Б) на препаратах, предварительно обработанных CPA (10 мкМ, 5 часов).

Отрицательный инотропный эффект изопротеренола и форсколина в области низких частот стимуляции ПМ животных периода гибернации значительно усиливался в условиях предварительной обработки мышц циклопиазоновой кислотой (Рис.19).

-ч

.....§-4"

зопротвренол

изопротеренол

Частота стимуляции. Гц

Рисунок 20. Усиление выраженности отрицательного инотропиого эффекта изопротеренола на фоне предварительной обработки препаратов (А) инсулином (10 нМ) и (Б) агматином (250 мкМ).

Значительное усиление отрицательного инотропного эффект изопротеренола также наблюдалось на препаратах, исходно обработанных инсулином (Рис. 20А) или агматином (Рис. 20Б). Данный факт позволяет предположить вовлеченность N0—зависимой сигнальной системы в процесс положительного инотропного действия изопротеренола в сердце зимоспящих животных.

120%

, изопротеренол

\ контроль

'Чх

карбахолиЯЛ-л___

Осенний активный

карбах\5лии N

\ \

изопротеренол

Пробуждени»

0.1 0.2 0.3 0.5 1

0.1 0.2 0.3 0.6 1 15 2 3 4 5 Гц

Частота стимуляции. Гц

Рисунок 21. Типы эффектов карбахолина, выявленные в сердце суслика летнего периода (А) и периода гибернации в группе пробуждающихся животных (на уровне ЗОоС температуры сердца) (Б).

Карбахолин (1 мкМ), синтетический аналог ацетилхолина, во всех группах животных снижал положительный инотропный эффект изопротернола (Рис.21 А) и только при определенных условиях инвертировал его ингибирующее действие (Рис.21 Б). Наиболее вероятно положительный инотропный эффект карбахолина в области низких частот стимуляции наблюдался у пробуждающихся животных (Рис. 21Б). Вероятность значительно увеличивалась на препаратах, предварительно обработанных агматином, т.е. в условиях, способствующих повышению уровня N0. Но и в этом случае способность карбахолина

инвертировать ингибирующее действие изопротеренола проявлялась только у животных периода гибернации.

120 %'

2 юо

■Ф- контроль

-0-7NI

-*- H30+7NI

•ir Кх*Изо+7М

контроль -Q-7NI

).1 О.З

).5

1.9 2 3 Гц 0.015 0.1 0.3

Частота стимуляции, Гц

Рисунок 22. Роль NO-зависимого сигнального пути в механизме действия изопротеренола в сердце сусликов периода гибернации. 7-NI (I мкМ, 30 мин), ингибитор NO-синтаз, полностью подавляет эффекты изопротеренола и карбахолина в области низких частот стимуляции, как в норме (А), так и в условиях их сочетанного действия с агматином (Б).

Ввиду того, что ингибирующий эффект изопротеренола и противоположный ему эффект карбахолина усиливались на препаратах, предварительно обработанных агматином, мы предположили возможную роль NO-зависимого сигнального пути в механизме их действия в области низких частот стимуляции. Результаты исследований с использованием 7 NI (ингибитора NO синтаз) частично подтверждают данное предположение.

Известно, что pAR стимуляция влияет на несколько каскадов сердечной сигнализации, в том числе пути PI3K сигнализации. Усиление отрицательного эффекта изопротеренола на фоне предварительной обработки препаратов инсулином (активирующим Р13/АКТ-киназный каскад) и агматином (увеличивающим в клетках синтез оксида азота), позволяет предположить возможность участия Р13К/АКТЧ^Ю-сигнального пути в механизме отрицательного инотропного эффекта изопротеренола на препаратах животных периода гибернации.

Кроме того, судя по тому, что ингибирующий эффект изопротеренола усиливается на фоне CPA, его проявление может реализоваться через подавление активности SOC каналов. В данном случае эффект может развиваться и по цАМФ-зависимому механизму, аналогично тому, как это происходит в макрофагах, для которых показано, что особенно быстро и эффективно агенты, повышающие уровень сАМР подавляют уже развившийся депо-зависимый вход Са2+ (Крутецкая и соавт. 2003). С этим согласуются и наши данные,

поскольку максимально выраженный ингибирующий эффект изопротеренола проявлялся именно в условиях, способствующих активации SOC-каналов (на фоне предварительной обработки CPA, инсулином и агматином) (Рис. 19,20).

Таким образом, обнаруженный нами отрицательный инотропный эффект изопротеренола в сердце сусликов периода гибернацип открывает интересные перспективы для открытия новых функций GPCRs, на регуляцию которых нацелены более трети сердечно-сосудистых препаратов, используемых в клинической практике, что указывает на их особую значимость (Ginsburg, Bers, 2004; Brodde et al., 2006; Goldhaber, Hamilton, 2010: Hissain et al., 2013; Siryk-Bathgate et al., 2013).

Заключение

Нам представляется, что наиболее важным результатом настоящей работы является создание феноменологической картины особенностей сезонных изменений ритмоинотропных явлений в сердце суслика, созданной на основе впервые проведенного сравнительного анализа изменений зависимости силы сокращения от частоты стимуляции в течение годового цикла жизни животных. На основе этого анализа нам удалось предсказать возможность существования в сердце суслика депо-активируемых Са2+ каналов. Ранее считалось, что SOC каналы наиболее характерны для невозбудимых тканей. Хотя их присутствие и обнаружено в миокардиальных тканях на эмбриональных стадиях, наличие SOC-каналов в сердце взрослых млекопитающих считается признаком серьезных патологий. В ходе выполнения настоящей работы нами получены данные, подтверждающие существование SOC-каналов в сердце сусликов. Показано, что в наиболее выраженном виде их активность проявляется у пробуждающихся животных периода спячки или в весенний период. В свете этого, состояние животных переходных периодов, обладающих повышенной зависимостью сокращения от внеклеточных источников Са2+ и минимальной активностью Са2+АТФ-азы CP, можно рассматривать, как стратегическое, направленное на предоставление клетке шанса «выжить» в критических ситуациях. В этом плане миокард зимоспящих животных, находящихся в пограничных ситуациях, напоминает эмбриональный миокард и миокард незимоспящих при заболеваниях.

Установленные нами особенности сезонных изменений ритмоинотропных явлений в сердце суслика и их связь с активностью различных кальцийтранспортирующих систем миокардиальных клеток позволили нам использовать ритмоинотропные тесты для

исследования сигнальных систем, активируемых различными типами рецепторов. В данной работе основное внимание было уделено инсулин-зависимой и Р-адренергической рецепторным системам, играющим важнейшие роли в регуляции сократительной активности, причем часто во взаимосвязи.

К началу наших исследований роль рецепторов инсулина в регуляции функции сердца зимоспящих была совершенно не изучена. Вызывало особый интерес то, что у данных животных наблюдается изменение чувствительности к инсулину при смене сезонов активности. В результате проведенных исследований нами впервые показано, что инсулин обладает выраженным инотропным влиянием на сердце суслика. Большой цикл работ выявил разнообразные проявления эффектов инсулина: полное отсутствие эффекта у спящих животных, положительный инотропный эффект на определенной стадии пробуждения и сильный ингибирующий у животных переходных периодов. Удивительно, но вариабельность эффектов инсулина свойственна и незимоспящим млекопитающим, причина которой до сих пор точно не установлена. Нами показано, что величина и направленность эффектов инсулина на сердце суслика в определяющей степени зависят от соотношения вклада внеклеточных и внутриклеточных источников Са2+ в активацию сокращения, что вероятнее всего, и определяет вариабельность инотропных эффектов инсулина у разных видов животных (Накипова и др, 2012). В настоящий момент только с позиций наличия депо-управляемых (SOC) каналов в миокардиальных клетках и поступления через них Са2+ мы смогли найти подход к объяснению механизма отрицательного инотропного действия инсулина в сердце суслика и при определенных условиях в сердце незимоспящих млекопитающих.

Отличительной особенностью периода подготовки к спячке является выраженная инсулинорезистентность, которая способствует формированию фенотипа, устойчивого в условиях гипотермического и оксидативного стрессов, особенно выраженных в процессах пробуждения животных из состояния спячки. В настоящее время внимание исследователей привлекают зимоспящие, как модель для поиска механизмов повышения устойчивости сердца в условиях постишемической реперфузии. Нами получены данные, которые указывают на важную защитную роль инсулина в данных процессах. Эти данные могут приблизить нас к пониманию механизмов активации стресс-факторов и роли инсулина в повышении адаптационных возможностей высших млекопитающих и человека.

В результате проведенных исследований нами впервые показано, что изопротеренол, классически известный как положительный инотропный агент, на животных периода гибернации оказывает ингибирующее действие. Показано, что данный эффект опосредуется через повышение уровня внутриклеточного сАМР и усиливается в условиях, способствующих активации БОС-каналов, в том числе агентами, повышающими активность N0 синтаз, среди которых - агматин и инсулин. Данный факт позволяет предположить участие Р13К/-Ы0-сигнального каскада в механизме отрицательного инотропного эффекта изопротеренола. РОК, ключевой фермент инсулин-зависимой рецепторной системы, рассматривается как один из важнейших регуляторных белков, находящихся на пересечении разных сигнальных путей, в том числе активируемых (5-адренорецепторами. Однако перекрестное взаимодействие между РАЯ и Р13К сигнальными путями еще практически не исследовано, особенно в отношении сердца. В этом плане изучение механизмов перекрестного взаимодействия инсулин-зависимой и РАЯ рецепторных систем в сердце зимоспящих животных, заложенное в настоящей работе, может стать источником ценной информации.

выводы

1. Определен характер зависимости силы сокращения от частоты стимуляции (ритмоинотропные отношения) в папиллярных мышцах сердца суслика при смене сезонов активности животных и в динамике зимней спячки. Выявлено 2 типа зависимости: со слабовыраженной и резко выраженной отрицательной направленностью. Резко выраженная зависимость свойственна животным переходных периодов (вход или выход из состояния спячки).

2. Показано, что изменения типов ритмоинотропии происходят в соответствии с основной стратегией адаптационных преобразований в сердце гибернантов, которая базируется на изменении соотношения вклада внеклеточных и внутриклеточных источников кальция в активацию сокращения в процессе смены функционального состояния животных. Сильно выраженный тип ритмоинотропии преимущественно зависит от внеклеточных источников кальция, а слабовыраженный - от внутриклеточных.

3. Получены экспериментальные факты, указывающие на существование в сердце зимоспящих животных депо-активирусмых Са2+ каналов. Показано, что роль данных каналов существенно возрастает в сердце животных переходных периодов.

4. Впервые показано, что инсулин обладает выраженным инотропным влиянием на сердце суслика. Установлено, что величина и направленность эффектов инсулина зависят от физиологического состояния животных, частоты стимуляции и исходного характера ритмоинотропии. Все эти условия влияют на соотношение вклада внеклеточных и внутриклеточных источников Са2+ в активацию сокращения миокардиальных клеток и определяют вариабельность инотропных эффектов инсулина у разных видов животных.

5. Установлено, что сигнальный механизм действия инсулина в сердце суслика включает активацию фосфоинозитолзависимой серин/треониновой протеинкиназы В (или АкЫсиназы), а также фосфатидилинозитол-3-киназы и частично реализуется через ингибирование кальциевых каналов Ь-типа и активацию прямой формы ЫСХ и БОС-каналов.

6. Впервые обнаружено, что активация Р - адренорецепторов вызывает разнонаправленное инотропное действие и зависит от физиологического состояния животных: увеличивает силу сокращения у активных сусликов летне-осеннего периода, а у животных периода гибернации оказывает выраженный отрицательный инотропный эффект.

7. Обнаружено наличие перекрестного взаимодействия сигнальных путей инсулин-зависимой и [}-адренергической рецепторных систем в сердце зимоспящих животных. Показано, что характер взаимодействия этих систем зависит от функциональной активности животных, состояния кальциевого гомеостаза миокардиальных клеток и активности МО-зависимой сигнальной системы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 01-04-48199, № 04-04-48199, исполнитель) и грант №13-04-01234А (руководитель), а также Федеральной центральной программы «Интеграция» (проект А № 0055).

Список опубликованных работ в рецензируемых журналах

1. Накипова О.В., Лазарев А.В., Кшуташвили Т.Ш., Повзун А.А., Крупенин В.А. Модификация атропином действия ацетилхолина на кальциевый ток предсердия лягушки. Биологические мембраны, 1991, том 8, №12, С. 1281-1291.

2. Накипова О.В., Гайнуллин Р.З., Сафронова В.Г., Косарский Л.С., Баканева В.Ф., Игнатьев Д.А., Амерханов З.Г., Колаева С.Г., Кукушкин Н.И., Соломонов Н.Г. Влияние инсулина на сократимость миокарда суслика Citellus undulatus в разные периоды активности. // Биофизика. 1997. Т. 42, вып. 6. С. 1297-1300.

3. Накипова О.В., Гайнуллин Р.З., Андреева Л.А., Сафронова В.Г., Косарский Л.С., Колаева С.Г., Соломонов Н.Г., Кукушкин Н.И.. Влияние инсулина на миокард активного, гибернирующего и пробуждаемого суслика Citellus undulatus. // Биофизика. 2000, т. 45, в. 2, с. 344-355.

4. Андреева Л.А., Накипова О.В., Чумаева Н.А., Косарский Л.С., Колаева С.Г., Кукушкин Н.И., Соломонов Н.Г. Сезонные особенности зависимости частота сила в миокарде суслика Citellus undulatus. ДАН. 2001, т. 377, № 1, с. 108-110.

5. Накипова О.В., Андреева Л.А., Чумаева Н.А., Ануфриев А.И., Косарский Л.С., Колаева С.Г., Кукушкин Н.И., Соломонов Н.Г. Частотно - зависимое действие инсулина на сократимость миокарда активного суслика Citellus undulatus в разные сезоны. ДАН. 2001. Т.386,. №6, с. 825-827.

6. Накипова О.В., Андреева Л.А., Чумаева Н.А., Гайнуллин Р.З., Ануфриев А.И., Косарский Л.С., Колаева С.Г., Кукушкин Н.И. Особенности ритмоинотропных отношений в миокарде суслика Citellus undulatus. // Биофизика. 2002. Т. 47 (4). С. 735 - 747.

7. О.В. Накипова, Л.А. Андреева, Н.А. Чумаева, А.И. Ануфриев, Л.С. Косарский, С.Г. Колаева, Н.Г. Соломонов. Влияние инсулина на ритмоинотропные отношения в миокарде суслика Citellus undulates в периодзимней активности. ДАН, 2004,т. 396,№ 1, с.117-120.

8. О.В. Накипова, JI.A. Андреева, Н.А. Чумаева, А.И. Захарова Н.М., Кукушкин Н.И., Семенова Т.П., Соломонов НГ. Зависимость «частота-сила» и эффект паузы в папиллярных мышцах якутского суслика в период подготовки к зимней спячке. ДАН, 2006, т. 407, № 4, С. 547-549.

9. Накипова О.В., Андреева Л.А.,Чумаева Н.А., Захарова Н.М., Косарский Л.С., Семенова Т.П., член-корр. РАН Соломонов Н.Г Зависимость инотропного действия инсулина от характера ритмоинотропных отношений в папиллярных мышцах сердца якутского суслика. ДАН, 2006, т. 408, № I, С. 122-124.

10. Накипова О.В., Андреева Л.А., Захарова Н.М., Семенова Т.П., член-корр. РАН Соломонов Н.Г Влияние вортманнина на инотропный эффект инсулина в папиллярных мышцах сердца якутского суслика ДАН, 2006, т. 407, №. 5, С. 695-697.

11. Nakipova O.V., Zakharova N.M., Andreeva L.A., ChumaevaN.N Averin AS. Kosarskii L.S., Anufriev A.I. Lewinski DV, Kockskamper J, Pieske B. The seasonal peculiarities of force-frequency relationships in active ground squirrel Spermophilus undulatus ventricle. J. Cryobiology, 2007, v. 55, № 3, pp. 173-181.

12. Захарова H.M., Накипова O.B., Аверин A.C., Тихонов К.Г., член-корр. РАН Соломонов Н.Г. Модификация ритмоинотропных характеристик при охлаждении папиллярных мышц сердца гибернирующих сусликов. ДАН, 2009. Т.424, с.21-24.

13. Аверин АС, Захарова НМ, Игнатьев ДА, Тарлачков СВ, Накипова ОВ. Влияние изопротеренола на сократимость папиллярных мышц сердца суслика. Биофизика 2010, т.55, вып. 5, с. 910-917.

14. О.В. Накипова, А.С. Аверин, Н.М. Захарова, М.Л. Учитель, Е.В. Гришина, Л.А. Богданова, Е.И. Маевский. Роль энергетических субстратов в регуляции ритмоинотропных отношений сердца крысы: влияние амбиокора. Биофизика. 2010, т.55, вып. 6.

15. О.В. Накипова, Н.А. Чумаева, Л.А. Андреева, А.И. Ануфриев, Н.И. Кукушкин. Механизмы вариабельности инотропного действия инсулина в папиллярных мышцах сердца якутского суслика. Биофизика 2012. том 57, вып. 6, сгр 1020-1028.

16. О. В. Накипова, А. С. Аверин, С. В. Тарлачков, Ю. М. Кокоз. Действие агматина на ритмоинотропные явления в папиллярной мышце сердца зимоспящих животных. ДАН 2013, т.451, №5, с. 581-586.

17. Андреева Л.А., Накипова О.В., Сергеев А.И., Аверин А.С., Лобанов А.В., Рыков В.А., Чемерис Н.К., Гришина Е.В., Дынник В.В. Дисрегуляция ЫО/сОМР/сАОРг/Са2+-сигнального пути в сосудах и миокарде спонтанно гипертензивных крыс. Фундаментальные исследования, 2013, №6, сгр. 1397-1401.

Статьи в сборниках

1. Nakipova O.V. Andreeva L.A., Chumaeva N.A., Kosarskii L.S., Kolaeva S.G., Kukushkin N,I, The effects of insulin on the contractility of active ground squirrels myocardium: a possible mechanism. Internat.symp. "Biological motility: new trends in research". Pushchino-2001, p.102-103.

2. L.A. Andrejeva, N.A. Chumaeva, O.V. Nakipova, S.G. Kolaeva, Y.A. Andrejev. The role of nitric oxide in insulin-dependent regulation of rat heart contractility Internat.symp. "Biological motility: new trends in research". Pushchino-2001, p.8-9.

3. O.V. Nakipova, L.A. Andreeva, N.A. Chumaeva, L.S Kosarski, S.G. Kolaeva. The force-frequency relationship in ground squirrel myocardium: effects of insulin. Internet, symp. "Biological motility: new trends in research". Pushchino. 2004, pp. 48-50

4. Andrejeva L.A., Nakipova O.V. The role of phosphoinositide 3-kinase in insulin-dependent regulation of the heart contractility of ground squirrel Citellus undulates in different seasons. Internat. symp. "Biological motility: new trends in research". Pushchino. 2004, pp. 109-111.

5. N.A. Chumaeva, O.V. Nakipova, L.A. Andreeva, S.G. Kolaeva. The role of extracellulary derived calcium in seasonal FFR changes in the heart of active hibernating animals. Internat. symp. "Biological motility: new trends in research". Pushchino. 2004, pp. 1210-1211.

6. Fedorov VV, Aliev RR, Glukhov AV, Resnik AV, Anufriev A, Nakipova OV, Kolaeva SG, Rosenshtraukh LV, Efimov IR. Cardiac conduction and resistance to ventricular fibrillation in Siberian hibernator Ground squirrel Citellus undulatus. 2004. In Life in the Cold: Evolution, Mechanisms, Adaptation, and Application. Twelfth International Hibernation Symposium, (ed.by B.M.Barnes and H.V.Carrey), pp. 543-555. Fairbanks, Alasca, USA: Institute of Arctic Biology, University of Alasca..

7. Накипова OB Андреева ЛА Чумаева НА Захарова НМ Аверин АС (2005). Миокард зимнеспящих животных, как природная модель для исследования инсулинорезистентной формы диабета. Всероссийская научная конференция «Физиология сердца», г. Казань , 24-25 ноября, с.35-36.

8. Averin AS, Zakharova NM, Ignatijev DA, Nakipova O.V. Effects of isoproterenol on the contractility of papillary muscles of ground squirrel myocardium. Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies. Pushchino: Synchrobook-2010. P.26-28.

9. Nakipova OV., Averin AS., Zakharova NM, Uchitel ML, Grishina EV., Bogdanova LA, Maevsky EM.The role of energy substrates in the regulation of force-frequency relationship of the rat myocardium: the influence of ambiocor Pushchino: Synchrobook-2010. P.187-189.

Подписано в печать:

24.01.2014

Заказ № 9319 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское т., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Информация о работе

Накипова, Ольга Васильевна
доктора биологических наук
Пущино, 2014
ВАК 03.01.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Механизмы регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы регуляции сократительной активности миокарда зимоспящих
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика