Исследование экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов в течение годового цикла и спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии

Карадулева, Елена Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов в течение годового цикла и спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов в течение годового цикла и спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии"

На правах рукописи

КАРАДУЛЕВА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ТАЙТИНА В МИОКАРДЕ ЗИМОСПЯЩИХ СУСЛИКОВ В ТЕЧЕНИЕ ГОДОВОГО ЦИКЛА И СПОНТАННО-ГИПЕРТЕШИВНЫХ КРЫС ПРИ РАЗВИТИИ ГИПЕРТРОФИИ

03.01.02 - биофизика

4855748

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 0£Б 2011

Пущино-2011

4855748

Диссертационная работа выполнена в лаборатории структуры и функции мышечных белков Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Подлубная Зоя Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Озолинь Ольга Николаевна

доктор физико-математических наук Алиев Рубин Ренатович

Ведущая организация:

Казанский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «_2_»_марта_2011 г. в_1330_

на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан «_28_»_января_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.ф.-м.н.

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Одной из важных задач в области миологии является изучение цитоскелетного белка тайтина (коннектина), гигантские молекулы которого перекрывают расстояние от М-линии до Z-диска саркомера, формируя третью фнламентную систему в миофибриллах [Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981]. Сердечный тайтип экспрессируется в двух изоформах: короткой N2B (-3000 кДа) и длинной N2BA (-3200-3400 кДа), для которой известно несколько вариантов альтернативного сплайсинга [Freiburg et а!., 2000; Bang et al., 2001]. Исследования тайтина показали, что этот белок является одним из важнейших компонентов саркомера поперечнополосатых мышц позвоночных, выполняя множество различных функций - от участия в сборке саркомера и стабилизации его структуры на ранних этапах мнофибриллогенеза до регуляции процессов внутриклеточной сигнализации в зрелой мышце [Tskhovrebova & Trinick, 2010].

Функциональная важность тайтина в норме определяет интерес к изучению свойств этого белка при адаптационных процессах, развитие которых сопровождается изменениями в изоформном составе тайтина [LeWinter & Granzier, 2010]. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, выявили вклад тайтина в адаптацию сердца и скелетной мускулатуры человека и животных к повышенным физическим нагрузкам [Khramov et al., 2008] и к условиям реальной и моделируемой микрогравитации [Вихлянцев и Подлубная, 2008; Липец и др., 2009].

таким резким перепадам сократительной активности в течение гибернационного сезона сопровождается изменениями активности многих гибернационно-зависимых генов [Andrews et al., 1998; Fahlman et al., 2000; Storey, 2003], в том числе и гена тайтина, гиперэкспрессия которого обнаружена в миокарде сусликов Spermophilus tridecemlineatus при гибернации [Brauch et al., 2005]. В сердечной мышце гиберпиругощего медведя Urs us arctos horribilis было обнаружено увеличение содержания короткой N2B изоформы тайтина в период спячки [Nelson et al., 2008]. Однако в цитируемых работах не были проанализированы изменения в экспрессии тайтина на протяжении всего годового цикла. В литературе также отсутствуют данные по сопоставлению экспрессии тайтина на уровне мРНК с содержанием его белка. Между тем эти сведения могут внести вклад в понимание механизмов сезонной регуляции экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина и выяснение значения изменений изоформного состава тайтина в миокарде гибернантов в разные периоды зимней спячки. Поэтому одной из наших задач стало исследование экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в течение годового цикла.

Тайтин играет важную роль не только в адаптационных процессах, но также и в патофизиологии мышц [Tskhovrebova & Trinick, 2010; LeWinter & Granzier, 2010]. В частности, обнаружены количественные изменения N2B и N2BA изоформ тайтина в сердечной мышце человека [Makarenko et al., 2004; Вихлянцев и Подлубная, 2008; Ahmad et al., 2010] и собаки [Wu et al., 2002] при развитии дилатационной кардиомиопатии (ДКМП), ишемическом поражении сердца человека [Neagoe et al., 2002], а также в гипертрофированном сердце крысы [Warren et al., 2003]. В сердце морской свинки при развитии гипертрофии было зарегистрировано увеличение транскриптов мРНК тайтина на компенсаторной стадии сердечной недостаточности, тогда как по мере прогрессирования заболевания уровень мРНК тайтина снижался [Collins et al., 1996]. Однако исследования изменений экспрессии тайтина на транскрипционном и трансляционном уровнях при гипертрофии сердца не проводились. В этой работе для изучения экспрессии тайтина на разных сроках развития гипертрофии миокарда использовали линию спонтанно-гипертензивных крыс (,SHR), у которых в ответ на хроническое повышение давления и нарушение кальциевого гомеостаза формируется гипертрофия сердечной мышцы.

Знание изменений в экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина при развитии гипертрофии сердца и при адаптации миокарда к экстремальным условиям гибериации может иметь перспективы для применения в медицинской практике.

Цель ппботы.

Исследование экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в течение годового цикла и крыс линии SHR при развитии гипертрофии.

Задачи:

1. Исследовать изоформный состав тайтина в миокарде зимоспящих сусликов в течение годового цикла.

2. Проанализировать сезонные изменения в экспрессии тайтина на уровне мРНК-транскриптов в сердце зимоспящих сусликов.

3. Исследовать изоформный состав тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс на разных сроках развития сердечной гипертрофии.

4. Провести сравнительное исследование экспрессии гена тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс на разных сроках развития гипертрофии сердца.

Научнпя новизна работы.

В работе впервые проведено исследование изменений экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина как на уровне белка, так и на уровне мРНК в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в разные периоды годового цикла: летняя активность, осенняя активность (подготовка к спячке), гибернация, пробуждение, зимняя активность (межбаутная активность), вход в спячку. Обнаружено двукратное увеличение содержания N2BA изоформы тайтина по отношению к его N2B изоформе в предсердиях и желудочках сердца осенних активных сусликов в сравнении с содержанием этих форм тайтина у летних активных животных, что свидетельствует об активной перестройке тайтинового фенотипа в период подготовки животного к спячке. Повышенное соотношение N2BA/N2B в миокарде сусликов сохранялось на протяжении всего гибернационного сезона на фоне незначительного снижения общего содержания тайтина. Впервые при электрофоретическом исследовании образцов

миокарда осенних активных и пробуждающихся сусликов были выявлены два варианта длинной N2BA изоформы тайтина. На уровне мРНК экспрессия тайтина оказалась сниженной па всех фазах гибернационного сезона, а также в прегибернационный период осенней активности по сравнению с контрольным уровнем экспрессии у летних активных животных.

Впервые проведено исследование изменений экспрессии тайтина на уровне белка и мРНК в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс в возрасте 15 недель на ранних сроках развития гипертрофии и в возрасте 26 недель с выраженной гипертрофией сердца. В миокарде 15-недельных крыс линии SHR обнаружено двукратное снижение содержания N2B и N2BA изоформ тайтина, которое сопровождалось гиперэкспрессией гена ttn, что указывает на компенсаторную (адаптационную) стадию заболевания. На более поздних сроках развития гипертрофии сердца у 26-недельных SHR наблюдалось снижение содержания как белка, так и мРНК-транскриптов тайтина, что свидетельствует о декомпенсаторной (патологической) стадии болезни.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Настоящее исследование вносит вклад в понимание молекулярных механизмов развития патологии в гипертрофированном сердце крыс линии SHR и адаптации сердечной мышцы сусликов к экстремальным условиям гибернации, выявляя роль эластичного цитоскелетного белка тайтина в этих процессах. Полученные данные о дифференциальной экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина могут быть использованы для разработки методов ранней диагностики гипертрофических изменений при сердечно-сосудистых заболеваниях, а также тест-систем, оценивающих эффективность их лечения.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международном

междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и

интегративной медицине» (Судак, Украина, 2007 г.), XX Съезде Физиологического

общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007 г.), Международных симпозиумах "Biological

Motility" (Пущино, 2008 и 2010 гг.), 4-ом Международном междисциплинарном

конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2008 г.), VII

«Конференции молодых ученых, специалистов и студентов», посвященной Дню

космонавтики и приуроченной к 45-летию ГНЦ РФ ИМБП РАН (Москва, 2008 г.), V

Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008 г.), XXXVII Европейской мышечной конференции (London, UK, 2008 г.), 7-ом Европейском биофизическом конгрессе (Genoa, Italy, 2009 г.), 34-ом Европейском биохимическом конгрессе (Prague, Czech Republic, 2009 г.), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Калуга, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 12 тезисов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит /// страниц машинописного текста, ^таблиц и /¿'рисункба Список литературы включает^5с^)сточник^.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные.

В работе были использованы образцы миокарда зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus и крыс линий Wistar Kyoto (контрольные нормотензивные крысы) и SHR (спонтанно-гипертензивные крысы). Сусликов, отловленных летом в Якутии, содержали в условиях вивария ИБК РАН в индивидуальных клетках при естественном фотопериоде и обеспечении пищей, водой и гнездовым материалом ad libitum. Эксперименты проводили на следующих группах животных: активные летние (май-сентябрь); активные осенние (октябрь-середина ноября); гибернирующие (конец ноября-март, температура в области сердца 2-5°С, продолжительность баута спячки 714 суток); пробуждающиеся (температура в области сердца 10-32°С, время пробуждения 1,5-2,5 часа); активные зимние (межбаутная активность от нескольких часов после пробуждения до двух суток); входящие в спячку (температура в области сердца 30-10°С). Состояние сусликов оценивали визуально, а также по изменению ректальной температуры животного и частоты сердечных сокращений [Игнатьев и др.,

2001]. Спонтаппо-гипертензивные крысы с повышенным артериальным давлением были разделены па две возрастные группы - возрастом 15 недель с начальной стадией развития гипертрофии и возрастом 26 недель с выраженной гипертрофией сердца. Крыс линии IVistar Kyoto в возрасте 17 недель с нормальным артериальным давлением использовали в качестве контроля. Крысы содержались в Питомнике лабораторных животных ФИБХ РАН (Пущино). После декапитации животных образцы предсердий и желудочков сердца замораживали в жидком азоте, а затем хранили при температуре -70°С до использования. Все процедуры, связанные с экспериментами на животных, были одобрены комиссиями по биомедицинской этике ИБХ РАН и ИТЭБ РАН.

Гель-электрофорез белков.

Для электрофоретического тестирования высокомолекулярных изоформ тайтина использовали крупнопористый 1,9-2,3% полиакриламидный гель с добавлением агарозы [Вихлянцев и Подлубная, 2006]. Образцы сердечных мышц инкубировали в течение 40-60 минут при температуре 25-30°С в солюбилизирующем растворе, содержащем 10 мМ трис-НС1, 1% ДСН, 10% глицерина, 6 мМ ЭДТА, 2% р-меркаптоэтанола (или 75 мМ ДТТ), 8-10 мкг/мл ингибитора протеаз леупептина, 8-10 мкг/мл Е64, рН 6,8-7,0. Электрофорез проводили в вертикальных пластинах геля размером 8х 10 см при силе токе 3-5 мА в течение первых 30-60 минут, после чего поднимали силу тока до 10-12 мА. Электродный буфер содержал: 0,192 M глицин, 0,025 M трис, 0,1% ДСН рН 8,6. По окончании электрофореза гели фиксировали в течение 20-30 минут в растворе, содержащем 10% этанола и 10% уксусной кислоты. Затем гели окрашивали в течение 30-40 минут в растворе, содержащем по 0,1% Кумасси G-250 и R-250, 45% этанола и 10% уксусной кислоты. Отмывку окрашенных гелей проводили в 7% уксусной кислоте.

Денситометрия белковых полос в геле.

Денситометрический анализ белковых полос в геле проводили с помощью компьютерной программы Total Lab 1.11. В качестве стандартов для оценки молекулярных масс изоформ тайтина были использованы полосы тяжелых цепей миозина - ТЦМ (205 кДа), небулина (770-890 кДа), протеолитических фрагментов тайтина - Т2 (2100-2400 кДа) [Вихлянцев и Подлубная, 2008]. Количество тайтина оценивалось по отношению к количеству тяжелых цепей миозина. В таблицах

приведены средние арифметические величины соотношений денситометрических измерений соответствующих белковых полос на гелях и их стандартные ошибки.

Вестерн-блоттинг.

Вестерн-блоттинг тайтина проводили по методу, описанному в работе [Вихлянцев и Подлубная, 2008]. Перенос белка из полиакриламидных гелей па нитроцеллюлозные мембраны (диаметр пор 0,45 мкм) после электрофореза проводили в трис-глицин/метанольном буфере с добавлением ДСН при силе тока 0,8 мА на см3 в течение 48-72 часов при постоянном охлаждении. Неспецифическую сорбцию на мембранах блокировали 5% раствором обезжиренного молока в фосфатном солевом буфере (ФСБ) в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве первичных антител использовали: АВ5 (к участку молекулы тайтина, расположенному около М-линии саркомера), BD6 (к участку молекулы тайтина, расположенному на границе A-диска и I-области саркомера), 9D10 и Т11 (к участкам I-зоны тайтина), Z1/Z2 (к N-концу молекулы тайтина, расположенному в Z-диске саркомера). В качестве вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, использовали антитела против IgG мышей («Sigma», США) или кролика («Имтек», Москва). Инкубацию как с первичными, так и вторичными антителами проводили в течение 1 часа в ФСБ с 0,05% Твин-20. Белковые полосы выявляли с помощью 3,3'-диаминобензидипа.

Выделение геномной ДНК из образцов миокарда.

Выделение геномной ДНК осуществляли классическим фенол-хлороформным способом [Maniatis et al., 1982; http\\:wvvw.molbiol.ru]. Миокардиальную ткань (100 мг) растирали в ступке под жидким азотом до порошкообразного состояния, после чего добавляли лизирующий буфер, содержащий 25 мМ ЭДТА, 0,1 мг/мл протеиназы К («Fermentas», Литва), 0,5% SDS, 10 мМ Tris-HCl, 0,1 М NaCI, pH 8,0. После лизиса (3 часа при 56°С) добавляли насыщенный водой фенол (pH 8,0) в соотношении 1:1 (v/v), перемешивали и инкубировали на льду 20 минут, не допуская разделения фаз. Затем центрифугировали 15 минут при 4000 g, водную фазу переносили в новый энпендорф, и процедуру обработки фенолом повторяли ещё раз. Для лучшей очистки от белков, липидов и липопротеидов к пробе добавляли смесь фенол:хлороформ в соотношении 1:1 (v/v), инкубировали 15 минут при постоянном перемешивании и центрифугировали 15 минут при 4000 g. ДНК-содержащую водную фазу аккуратно отбирали и для

очистки от низкомолекулярных примесей диализовали против 0,14 М раствора NaCI в соотношении 4:1 (v/v) до удаления остатков фенола. После этого инкубировали в 2v 96% этилового спирта в течение 4 часов при -20°С и осаждали 10 минут при 1200015000 g. Полученный препарат ДНК растворяли в бидистиллированной воде, определяли концентрацию на спектрофотометре NanoDrop-1000 (США) и использовали для дальнейшей работы.

Выделение тотальной РНК ч проведение реакции обратной транскрипции.

РНК из ткани миокарда была выделена с использованием набора Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit («Bio-Rad», США), согласно протоколу изготовителя. Выровненные по концентрации РНК (100 нг/мкл) использовали для реакции обратной транскрипции с помощью набора MINT-Universal cDNA synthesis kit («Евроген», Россия). Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop-1000 (США). Качество полученных препаратов оценивали электрофоретически в 0,8% агарозном геле с 2,2 М формальдегидом.

Количественная ПЦР.

Праймеры для ПЦР синтезировали на основе последовательности гена тайтина крысы (EMBL ENSRNOG00000022637) (Табл. 1) [Opitz et al., 2004]. В соответствии с опубликованными данными, все изоформы сердечного тайтина крысы содержат экзоны 49 и 50. Для короткой N2B изоформы тайтина характерен сплайсинг экзонов 50 и 219. Для всех вариантов длинной N2BA изоформы тайтина характерно наличие экзонов 107 и 108, которые отсутствуют в N2B изоформе. Поскольку последовательность гена тайтина суслика неизвестна, то для анализа экспрессии изоформ тайтина в миокарде сусликов использовались те же пары праймеров, что и для крысы.

Реакцию qRT-PCR проводили на амплификаторе ДТ-322 («ДНК-Технология», Россия), используя набор Tersus PCR kit («Евроген», Россия), с применением SYBR Green I («Invitrogen», США) в качестве флуоресцентного зонда. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 2-4 мкл кДНК, по 4 пмоль каждого праймера, 0,1 мМ каждого dNTP, стандартный буфер («Евроген», Россия), 1 мкл SYBR Green I (разведение 1:3000) и 1 U Taq-полимеразы («Евроген», Россия). После предварительной денатурации в течение 2 мин при 94°С, программа амплификации для всех пар праймеров включала 30-40 следующих циклов: 94°С-20 сек, 58°С-20 сек, 72°С-20 сек. Флуоресцентный сигнал

регистрировали в конце каждого цикла в течение 15 секунд (Рис. 1, 2). В качестве позитивного контроля использовали пробы, содержащие геномную ДНК из миокарда исследуемого животного (наблюдали только ожидаемый продукт), а в качестве негативного - пробы с РНК, проведенные через реакцию обратной транскрипции без добавления фермента (синтез ампликонов отсутствовал).

Таблица 1. Праймеры, использованные для количественной ПЦР.

Название Прямой праймер (5-31) Обратный праймер (5'-3') Размер продукта (п.н.)

N2B+N2BA тайтин (экзоны 49-50) CCAAGCTCACTGTG GGAGAAA GCTACTTCCA AG GGCT СААТТС 67

N2B изоформа (экзоны 50-219) CCAACGAGTATGGC AGTGTCA TGGGTTCAGGCAGTAA TTTGC 93

N2BA изоформы (экзоны107-108) CGGCAGAGCTCAGA ATCGA GTCAAAGGACACTTCA САСТСАААА 110

ß-актин ATGGTGGGTATGGG TCAGAA CTTTTCACGGTTGGCC TTAG 225

А Б

Акгшинчгь I iipin ip

1» (bp) м 1

HW(t »«»,

1" ■ / .0. V ЯЮ

ь / / / ЛИ' ,,.. ,

Iй ¡0 - / А\/ / // / ЛиО v. 2ш> V. <

! 10(1

j < < » мвнияййлаавам He-мер ц.* ill

Рис. 1. Анализ экспрессии ttn в миокарде сусликов методом qRT-PCR с кр SYBR Green I.

А. Зависимость флуоресценции от номера цикла амплификации. Б. Электрофореграмма ПЦР продуктов: 1 -N2BA изоформа активного суслика; 2 -N2B изоформа активного суслика; 3 - (N2BA+N2B) тайтин активного суслика; 4 -N2BA изоформа гибернирующего суслика; 5 - N2B изоформа гибернирующего суслика; б - (N2BA+N2B) тайтин гибернирующего суслика; М - маркер молекулярных весов.

1 5 i 1 » II U II I! » 21 i> IS S! JS 51 >1 К V » liiefla

Рис. 2. Количественная ПЦР для гена //л в миокарде крыс методом qRT-PCR.

А. Динамика накопления флуоресцентного сигнала (SYBR Green I).

Б. Результат проверки специфичности амплификации: 1 - N2BA SHR-15 недель, 2

- N2BA WKY, 3 - N2B SHR-15 недель, 4 - N2B WKY, 5 - (N2BA+N2B) SHR-15

недель, 6 - (N2BA+N2B) WKY; М1 и М2 - маркеры молекулярных весов.

Количественный анализ уровня экспрессии проводили при помощи программы q_PCR («ДНК-Технология», Россия). Относительное количество синтезированных ампликонов гена tin рассчитывали по методу 2"ЛЛС| согласно работе [Livak & Schmittgen, 2001], где С, - пороговый цикл реакции или точка пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии. Все расчеты проводились с учетом поправки на эффективность амплификации с праймеров. В качестве референсного гена использовали ген ß-актина.

ПЦР проводили в 4-х повторностях для каждой матрицы с двумя разведениями кДНК в каждой повторности. Все значения экспрессии для различных изоформ тайтина (ДС|) рассчитывали отдельно для каждого животного в группе и сравнивали между собой как отдельные выборки. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Во всех статистических данных уровень достоверности был принят за р < 0,05.

Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Качество продуктов амплификации оценивали разделением в 5% полиакриламидном геле (Рис. 1Б, 2Б) [Maniatis et al., 1982]. Для визуализации фронта ДНК использовали смесь красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. Электрофорез проводили в буфере TBE (89 мМ Tris-HCI, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, pH 8,0) при напряжении 200-250 В и силе тока 70-110 мА. После разделения

фрагментов гель окрашивали бромистым этидием и визуализировали на трансиллгаминаторе.

Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ.

Для клонирования полученные после электрофоретического разделения фрагменты ДНК экстрагировали из геля по методике, описанной в работе [Maniatis et al., 1982]. После визуализации на трансиллюминаторе нужный фрагмент вырезали из геля и измельчали скальпелем. Затем переносили в эппендорф, гомогенизировали тефлоповым пестиком, добавляли равный весу фрагмента объем элюирующего буфера (0,5 мМ CH3COONH4, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и инкубировали 12-16 часов при непрерывном перемешивании. Затем пробу центрифугировали в течение 10 минут при 10000 g (при комнатной температуре), супернатант переносили в новый эппендорф, а к осадку акриламида добавляли 0,5v элюирующего буфера, перемешивали и повторяли центрифугирование. Супернатант пропускали через стекловату, чтобы удалить остатки акриламида. После этого фрагменты ДНК осаждали 2,5v этилового спирта, инкубировали 15-20 часов (при -20°С) и центрифугировали 20 минут при 10000 g (при 4°С). Осадок растворяли в 200 мкл буфера ТЕ (10 мМ Tris-HCl, рН 7,4 и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), добавляли 35 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и снова осаждали ДНК центрифугированием. Осадок промывали 70% этиловым спиртом, высушивали и растворяли в небольшом объеме (20-100 мкл) бидистиллированной воды. Концентрацию фрагментов определяли на спектрофотометре NanoDrop-1000 (США).

Клонирование фрагментов ПЦР в pAL-TA вектор.

Для клонирования был использован pAL-TA вектор («Евроген», Россия) - аналог pGEM-T Easy для быстрого клонирования продуктов ПЦР. Лигирование проводили с использованием Т4 ДНК лигазы и подходящего для нее лигазного буфера фирмы «Fermentas» (Литва) в соответствии с протоколом производителя. Для трансформации были использованы клетки Е. coli Тор 10 («Invitrogen», США). Скрининг трансформантов проводили с помощью амплификации с праймерами, один из которых был специфичен к промотору фага Т7, находящемуся в векторе, а второй - к последовательности клонируемого фрагмента. Нуклеотидная последовательность вставленных в вектор фрагментов была секвенирована в ЗАО «Евроген» (Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов ЗрегторМЫь иш1и1(11и,ч в течение годового цикла.

1.1. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в миокарде зимоспящих сусликов.

На рис. 3 и в табл. 2 представлены результаты исследования сезонных изменений качественного и количественного состава тайтина в сердечной мышце зимоспящих сусликов. Выявлено двукратное увеличение соотношения изоформ К2ВА/Ы2В в миокарде гибернирующих сусликов в сравнении с содержанием этих форм тайтина в сердце активных летних животных. В чём физиологический смысл обнаруженной нами перестройки тайтинового фенотипа в сердце сусликов при гибернации?

I 2 3 4 5 6 7 S

Рис. 3. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в левом желудочке сердца сусликов.

Электрофореграмма: 1 - активный летний суслик; 2 - активный осенний суслик; 3 - спящий (гибернирующий) суслик; 4 - пробуждающийся суслик; 5 - активный зимний суслик (межбаутная активность); 6 - входящий в спячку суслик. Указаны профили интенсивности оптической плотности полос тайтина на геле. Вестерн-блоттинг (с антителами АВ5 к тайтину): 7 - активный летний суслик; 8 -спящий (гибернирующий) суслик. Белковые полосы: ТЦМ - тяжелые цепи миозина; Т2 - протеолитические фрагменты тайтина; N2B и N2BA изоформы тайтина; Интакт.тайтин - высокомолекулярные формы тайтина, которые по данным электрофоретических исследований и Вестерн-блоттинга могут являться интактными изоформами этого белка [Вихлянцев и Подлубная, 2008].

Известно, что длинная и короткая изоформы тайтина за счет отличий в своей структуре работают в саркомере как пружины разной жесткости, развивая неодинаковые уровни пассивного напряжения. Преобладание длинной N2BA изоформы тайтина определяет большую степень эластичности и, следовательно, растяжимости миокардиалыюй ткани, что увеличивает силу сердечных сокращений по закону Франка-Старлинга. Мы полагаем, что увеличение доли длинной N2BA изоформы тайтина в сердечной мышце гибернирующих сусликов имеет адаптационную природу и направлено на облегчение выброса более вязкой крови из камер сердца в период гибернации [Maclean, 1981; McArthur et al., 1992].

Табл. 2. Сезонные изменения содержания тайтина в левом желудочке сердца сусликов

Циклы сезонной активности сусликов №ВА/ТЦМ шв/тцм Т2/ТЦМ N2BA/N2B

Летняя активность (май-сентябрь), п = 12 0,014±0,005 0,068±0,013 0,024±0,009 0,195±0,084

Осенняя активность (октябрь-середина ноября), п= 10 0,024±0,012* 0,074±0,017 0,039±0,014* 0,295±0,085*

Спячка (гибернация) (конец ноября-март), п = 12 0,019±0,008 0,049±0,016* 0,018±0,009 0,385±0,114*

Пробуждение (выход из спячки), п = 11 0,025±0,009* 0,056±0,024 0,025±0,010 0,449±0,097*

Зимняя активность (2 часа после пробуждения), п = 8 0,033±0,001* 0,078±0,006 0,027±0,001* 0,432±0,040*

Вход в спячку, п = 10 0,033±0,014* 0,071±0,020 0,031±0,009* 0,442±0,092*

Примечание: приведены средние арифметические величины соотношений денситометрических измерений соответствующих белковых полос на гелях и их стандартные ошибки. С вероятностью Р>0,95 различия между выборками в сравнении с группой активных летних сусликов статистически достоверны согласно и-критершо Манна-Уитни.

В миокарде гибернирующих сусликов выявлено снижение содержания его изоформ (в 1,2-1,4 раза), а также Т2-фрагментов (в 1,5-2 раза) в сравнении с их содержанием в сердце активных животных (Табл. 2, Рис. 3). Известно, что протеазная активность в протеосомах ингибируется при низких температурах торпора [УеНскоУБка

et al., 2005]. Однако по нашим данным распад тайтина продолжается и при гибернации. Мы предполагаем, что уменьшение количества тайтина происходит в результате протеолиза Са2+-зависимыми протеазами - кальпаинами [Goll et al., 2008]. При этом белковый пул не пополняется по причине ингибирования трансляции, что можно рассматривать как адаптацию, направленную на минимизацию энергетических затрат в период гибернации.

Подавление синтеза белка при гибернации может достигаться различными путями, например, дефицитом самой матрицы РНК и инактивацией факторов инициации (eIF-2) и элонгации (eEF-2) путем обратимого фосфорилирования [Frerichs et al., 1998; Chen et al., 2001]. Об интенсивности трансляции в период гибернации можно судить по соотношению полисом и моносом. Показано, что фракция полисом уменьшается на стадии торпора и снова увеличивается при пробуждении [Knight et al., 2000], что соответствует активации биосинтеза белка в период выхода животного из спячки [Жегунов и Микулинский, 1987]. Эти данные находятся в согласии с нашими результатами, показывающими увеличение содержания N2B и N2BA изоформ тайтина в миокарде сусликов при пробуждении по сравнению со стадией торпора (Табл. 2, Рис. 3). При этом увеличенное содержание N2BA изоформы сохраняется, что может адаптировать сердечную мышцу к повышенной механической нагрузке в период выхода животного из спячки, когда частота сердечных сокращений достигает более 400 уд/мин. В этот период усиливается и протеолитический распад тайтина, на что указывает увеличение содержания Т2-фрагментов по сравнению с фазой гибернации (Табл. 2, Рис. 3). В течение межбаутной активности в миокарде сусликов наблюдается полное восстановление количества тайтина. Таким образом, возможное значение межбаутных пробуждений на молекулярном уровне может заключаться в обновлении пула белков, в частности тайтина.

В какой же период годового цикла происходит дополнительная наработка N2BA изоформы тайтина, преобладание которой мы наблюдаем на протяжении всего гибернационного сезона?

Учитывая, что процесс трансляции мРНК в белок является крайне энергоемким процессом и ингибируется в период гибернации, мы предположили, что повышенный синтез ШВА изоформы тайтина может происходить в период осенней активности при подготовке суслика к спячке, что и было подтверждено в наших исследованиях (Табл. 2, Рис. 3). Более того, на электрофореграммах левого желудочка сердца осенних активных сусликов мы отмечали появление дополнительного варианта ШВА изоформы, что также свидетельствует об активной перестройке тайтинового фенотипа в миокарде сусликов в период подготовки к спячке (Рис. 4).

Таким образом, сезонные изменения качественного и количественного состава тайтина в миокарде зимоспящих сусликов 5'реппорШЫ ипс1и1аШ5 направлены на увеличение доли длинной ШВА изоформы тайтина в период подготовки животного к спячке, поддержание её повышенного уровня в течение всего гибернационного сезона и быстрое восстановление содержания тайтина при пробуждении. Эти изменения вносят вклад в увеличение пластичности сердечной мышцы сусликов в течение всего сезона гибернации и способствуют выходу из спячки без патологических последствий.

1.2. Сезонные изменения в экспрессии гена тайтина на уровне мРНК в сердце зимоспящих сусликов.

Исходя из данных об увеличении содержания длинной ШВА изоформы тайтина при подготовке сусликов к спячке, мы предположили, что для обеспечения повышенного синтеза ШВА изоформы потребуется увеличить количество ее мРНК посредством активации транскрипции. Однако результаты количественной ПЦР показали снижение содержания мРНК как для ШВА, так и для ШВ изоформ тайтина в ~7 раз в миокарде активных осенних сусликов по сравнению с контрольным уровнем мРНК тайтина у активных летних животных (Рис. 5). Эти данные могут указывать на ускорение процесса трансляции мРНК в белок, а также на подавление транскрипции в прегибернационный период. Поскольку не было обнаружено изменений в соотношении

— «в

Рис. 4. Регистрация двух вариантов длинной ШВА изоформы тайтина в миокарде активных осенних сусликов.

мРНК-транскриптов для обеих изоформ тайтина при подготовке к спячке и в течение всего гиберпационного сезона, напрашивается вывод о различной эффективности трансляции N213 и ШВА изоформ. Для проверки этого предположения необходимы дальнейшие исследования.

Рис. 5. Изменение уровня экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина в левом желудочке сердца зимоспящих сусликов в разные периоды годового цикла (количество животных в каждой группе п=4). Различия между выборками в сравнении с группой активных летних сусликов достоверны при уровне значимости *Р<0,05 согласно U-критерию Манна-Уитни.

Проанализировав все стадии гибернационного сезона, мы также выявили снижение в среднем в 5 раз содержания мРНК сердечных изоформ тайтина у сусликов Spermophilus undulatus (Рис. 5), что не согласуется с данными о гиперэкспрессии гена тайтина в миокарде гибернирующих сусликов Spermophilus iridecemlineatus, полученными методом транскриптомного анализа [Brauch et al., 2005]. Обнаруженное нами подавление экспрессии гена тайтина в миокарде сусликов как при подготовке животного к погружению в торпидное состояние, так и на протяжении всего гибернационного сезона может вносить вклад в экономичный расход АТФ.

Отсутствие достоверных отличий в содержании мРНК сердечных изоформ тайтина между различными стадиями гибернационного сезона свидетельствует о поддержании стабильного уровня мРНК тайтина в этот период. В частности, в литературе показано, что в течение гибернации в разных тканях сусликов общая активность транскрипционного аппарата снижается, но уровни мРНК-транскриптов для

большинства генов и соответствующих им белков не изменяются [Carey et al., 2003;

Storey, 2003]. Стабильный уровень мРНК тайтина в течение зимней спячки может достигаться защитой РНК-транскриптов от расщепления с помощью РНК-связывающих белков, а также преобладанием популяции мРНК с длинными poly(A)-хвостами, которые ее стабилизируют [Knight et al., 2000]. Мы полагаем, что сохранение относительно постоянного уровня мРНК тайтина в миокарде сусликов в сезон гибернации имеет адаптационное значение и необходимо для быстрого возобновления синтеза белка при пробуждении [Жегунов и Микулинский, 1987; Epperson & Martin, 2002]. Это предположение подтверждается нашими данными о быстром восстановлении нормального содержания тайтина в миокарде сусликов при пробуждении и в первые часы межбаутной активности (Табл. 2, Рис. 3), что вносит вклад в поддержание структурно-функциональных свойств саркомера. Следует отметить, что на электрофореграммах левого желудочка сердца пробуждающихся сусликов часто наблюдаются двойные полосы N2BA изоформы тайтина, что также указывает на активный синтез этого белка в период выхода животного из спячки.

Таким образом, изменения экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus направлены на ингибирование процесса транскрипции в течение гибернационного сезона, что может иметь значение для минимизации энергетических затрат. При этом поддержание относительно стабильного уровня мРНК в период гибернации обеспечивает быстрый синтез белка при пробуждении.

2. Анализ экспрессии тайтина в миокарде крыс линии SHR при развитии гипертрофии.

2.1. Изоформный состав тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс па разных сроках развития гипертрофии сердца.

При электрофоретическом анализе тайтина в сердце крыс линий SHR и IVKY мы выявили снижение его содержания в среднем в 2 и в 1,5 раза относительно ТЦМ в миокарде 15-ти и 26-ти недельных гипертензивных крыс соответственно. Достоверных отличий в содержании протеолитического фрагмента Т2, а также в соотношении изоформ тайтина обнаружено не было (Табл. 3, Рис. 6).

Табл. 3. Содержание тайтина в левом желудочке сердца крыс

Группы животных N2BA/T4M N2B/TUM Т2/ТЦМ N2BA/N2B

WKY, 11=10 0,029±0,003 0,115±0,009 0,060±0,011 0,254±0,031

SHR (15 недель), п=8 0,017±0,005* 0,062±0,008* 0,048±0,014 0,272±0,053

SHR (26 недель), п=6 0,023±0,004* 0,080±0,009* 0,058±0,014 0,286±0,044

Примечание: приведены средние арифметические величины соотношений денситометрических измерений соответствующих белковых полос на гелях и их стандартные ошибки. Статистическая значимость различий между выборками £7№ в сравнении с контрольной группой ¡УК У согласно и-критерию Манна-Уитни составила *р<0,05.

И п I л к I. Т.______,

NîliA—^

N2 В

—-

Иитак-r. *1 "i N2IIA. •H N2U-л T2"

^ Итакт.Т^

N2H I

N2BA « -N2B

а — Т2

.....Г".........."Т" "Т~ 4

Рис. б. Изоформный состав тайтина в сердце нормотензивных и гипертепзивпых крыс.

Электрофореграмма: 1) левый желудочек №КУ; 2) левый желудочек 15-недельных ОТ/?; 3) левый желудочек 26-недельных БНИ. Указаны профили интенсивности оптической плотности полос тайтина на геле.

Вестерн-блоттинг (с антителами В06 к тайтину): 4) левый желудочек ¡УКУ. Белковые полосы: ТЦМ - тяжелые цепи миозина; Т2 - протеолитические фрагменты тайтина; N21! и ШВА изоформы тайтина; Интакт.Т - высокомолекулярные формы тайтина, которые по данным электрофоретических исследований и Вестерн-блоттинга могут являться интактными изоформами этого белка [Вихлянцев и Подлубная, 2008].

Учитывая литературные данные, показывающие увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ в кардиомиоцитах SUR, можно предположить, что снижение количества тайтина происходит за счет его усиленного протеолиза кальций-зависимыми протеазами, например, кальпаином, повышенная экспрессия которого также показана у крыс этой линии [Белостоцкая и др., 2008]. Следует отметить, что разрушение тайтина может являться не только следствием гипертрофии, по и причиной её дальнейшего развития, поскольку показано, что фрагменты деградации тайтина активируют экспрессию механоростового фактора MGF [Furalyov et al., 2010].

Таким образом, наши исследования показывают, что развитие патологического процесса в гипертрофированной сердечной мышце сопровождается значительным уменьшением содержания N2B и N2BA изоформ тайтина. Это, несомненно, вносит вклад в нарушение структуры саркомера и его сократительных свойств, о чем свидетельствуют инотропия и морфология миокарда SHR [Санталова и др., 2008].

2.2. Сравнительное исследование экспрессии тайтина на уровне мРНК-транскриптов в миокарде спонтанно-гипертеизивных крыс на разных сроках развития сердечной гипертрофии.

На фоне снижения содержания обеих изоформ белка совершенно неожиданным оказалось, что уровень мРНК тайтина повышается в образцах миокарда 15-ти недельных SHR более чем в 10 раз по сравнению с ее количеством в миокарде WKY (Табл. 4). При этом уровни мРНК короткой N2B изоформы и длинной N2BA изоформы тайтина были повышены более чем в 5 и 4 раза, соответственно (Рис. 7). Степень индивидуальных различий между животными очень велика, поэтому в таблицах и графиках показаны результаты измерений для каждого животного в отдельности, по которым можно видеть общую тенденцию, направленную на активацию транскрипции гена тайтина.

Полученная обратная зависимость между экспрессией гена тайтина и содержанием его белка в миокарде 15-ти недельных SHR может быть следствием «опережающей активации генов» («.anticipatory up-regulation of genes»), когда уровень транскриптов гена возрастает без увеличения количества соответствующего ему белка [Storey, 2003]. Мы рассматриваем возрастание содержания мРНК тайтина в качестве признака компенсаторной стадии заболевания, когда транскрипция гена активируется

для восстановления нормального содержания тайтина, сниженного в результате повышенной деградации самого белка и/или подавленной трансляции мРНК.

Табл. 4. Изменение уровня экспрессии гена ип (экзоны 49-50) в миокарде 15-ти недельных гипертензивных крыс относительно его экспрессии у нормотензивных крыс

Образец N циклов-С| мишени ДС, АДС, 2"МС1

N2BA+N2B (экзоны 49-50) ß-актин

1) WKY 14,5 5,3 9,2

SHR-15 недель 23,4 9,9 13,5 -4,3 19,7

2) WKY 15 12,3 2,7

SHR-15 недель 20,8 13,3 7,5 -4,8 27,9

3) WKY 18 13,7 4,3

SHR-15 недель 24 16,4 7,6 -3,3 10,6

Учитывая литературные данные, свидетельствующие о наличии различных стадий в патогенезе сердечных заболеваний, которые характеризуются изменением активности транскрипции и трансляции белков, в том числе и тайтина [Collins et al., 1996; Makarenko et al., 2004; Ahmad et al., 2010], мы предположили, что по мере развития гипертрофии сердечной мышцы у SHR характер экспрессии тайтина также может меняться. Действительно, по сравнению с экспрессией тайтина у нормотензивных крыс, в левом желудочке сердца 26-недельных гипертензивных крыс было выявлено общее снижение уровня мРНК тайтина от 4 до 56 раз (Табл. 5). Содержание мРНК для N2BA изоформы при этом уменьшалось в 4 - 45 раз, а для N2B изоформы - в 4 - 11 раз (Рис. 7).

Табл. 5. Изменение уровня экспрессии гена ttn (экзоны 49-50) в миокарде 26-ти

недельных гипертензивных крыс относительно его экспрессии у нормотензивных крыс

Образец N циклов-С| мишени ДС, ДДС, 2"А4С1

N2BA+N2B (экзоны 49-50) ß-актин

1) WKY 16,2 15 1,2

SHR-26 недель 14,3 16,1 -1,8 -3 8

2) WKY 15,8 12,7 3,1

SHR-26 недель 12,8 15,5 -2,7 -5,8 55,7

3) WKY 11,5 10,4 1,1

SHR-26 недель 10,6 11,5 -0,9 -2 4

Наши результаты согласуются с данными других авторов, показавших увеличение транскриптов мРНК тайтина у морской свинки на стадии компенсаторной гипертрофии левого желудочка, тогда как при переходе к декомпенсаторной стадии заболевания уровень мРНК тайтина снижался [Collins et al., 1996].

отн, ед. гтамвоформа тайтина «юв-изоформа тайтина |

30 J4.J

20 10 4 5 10.« SHR - 26 недегь

0 -10 ■ -20 • ■ н н

$HR 15 недель ■ -3.7-1,3 | ■ -11,J

-30 •

■40 •

-50 -15,3

Рис. 7. Изменение экспрессии №ВА и №В изоформ тайтина в миокарде гипертензивных крыс (5ЯЛ) в возрасте 15 и 26 недель относительно нормотензивных крыс для каждого животного в группе.

Таким образом, наши исследования показывают, что у 15-ти недельных спонтанно-гипертензивных крыс на ранних сроках развития гипертрофии миокарда происходит двукратное снижение содержания тайтина, сопровождаемое гиперэкспрессией гена ип, что может указывать на компенсаторную (адаптационную) стадию развития заболевания. На более поздних сроках развития гипертрофии сердца у 26-недельных 5НК наблюдается снижение содержания тайтина как на уровне белка, так и на уровне мРНК, что может свидетельствовать о декомпенсаторной (патологической) стадии развития заболевания. Полученные результаты могут быть полезны для разработки метода диагностики сердечной гипертрофии.

ВЫВОДЫ:

1. В предсердиях и желудочках сердца сусликов в период подготовки к спячке выявлено двукратное увеличение доли ШВА изоформы тайтина, которая поддерживается на повышенном уровне в течение всего гибернационного сезона. При этом на электрофореграммах левого желудочка сердца сусликов при подготовке к спячке и при пробуждении обнаруживаются двойные полосы ШВА изоформы тайтина. Эти данные указывают на активную перестройку тайтинового фенотипа, что обуславливает увеличение эластичности сердечной мышцы.

2. В сердце гибернирующих сусликов зарегистрировано снижение содержания N28 и ШВА изоформ тайтина (в 1,2-1,4 раза), которое быстро восстанавливается при пробуждении животного, что направлено на поддержание структурно-функциональных свойства саркомера.

3. Показано снижение уровня мРНК тайтина (в ~5 раз) в сердечной мышце сусликов на всех фазах гибернационного цикла, а также в период подготовки животных к спячке (в ~7 раз), что, вероятнее всего, свидетельствует о подавлении транскрипции гена тайтина.

4. В миокарде спонтанно-гипертензивных крыс обнаружено снижение содержания ШВ и ШВА изоформ тайтина (в 1,5-2 раза) как на ранней стадии развития гипертрофии сердечной мышцы у 15-недельных спонтанно-гипертензивных крыс, так и на более поздней стадии развития патологии у 26-недельных крыс линии 5ЯЛ.

5. Обнаружена гиперэкспрессия гена тайтина в миокарде 15-недельных спонтанно-гипертензивных крыс на начальном этапе развития гипертрофии сердца, что указывает на компенсаторную стадию заболевания.

6. Выявлено снижение уровня мРНК тайтина в сердечной мышце 26-недельных крыс линии БНЯ на более позднем сроке развития гипертрофии сердца, что свидетельствует о декомпенсаторной стадии заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи:

1. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А., Карадулева Е.В.. Храмов Р.Н., Мурашев А.Н., Козловская И.Б. Изменения изоформного состава тайтина в сердечной мышце спонтанно-гипертензивных крыс и его восстановление после курса низкоинтенсивного красно-оранжевого облучения // Доклады АН 2007, Т. 417, №3, С. 403-406.

2. Вихлянцев И.М., Карадулева Е.В., Подлубная З.А. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в мышцах зимнеспящих сусликов // Биофизика 2008, Т.53, вып. 6., С. 1066-1072.

3. Карадулева Е.В.. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Экспрессия тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии // Биофизика 2010, Т. 55, вып. 4, С. 612-618.

4. Карадулева Е.В.. Вихлянцев И.М., Тутукина М.Н., Подлубная З.А. Сезонные изменения экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова 2010, Т. 6, №4

Тезисы:

1. Вихлянцев И.М., Карадулева Е.В., Подлубная З.А. Электрофоретическое изучение тайтина в норме, при адаптации и патологии // Тезисы XX Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова, Москва, 4-8 июня 2007 г., С. 179.

2. Podlubnaya Z.A., Vikhlyantsev I.M., Karaduleva Е. V. Molecular physiology of extreme states: changes in isoform composition of myosin and titin of animal muscles under conditions of hibernation and their value for diagnostics and prognostics of cardiovascular diseases and myodystrophies of man // Proc. of International Multidisciplinary Symposium "From experimental biology to preventive and integrative medicine" - "EXB+PIM'07", Sudak, Crimea, Ukraine, 17-28 of September 2007, P. 93-94.

3. Карадулева E.B.. Вихлянцев И.М. Изоформный состав тайтина в сердечной мышце гибернирующих сусликов и спонтанно-гипертензивных крыс. // VII «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная Дню космонавтики и приуроченная к 45-летию ГНЦ РФ ИМБП РАН, Москва, 9 апреля 2008, С. 25-26.

4. Vikhlyantsev I.M., Karaduleva E. V.. Podlubnaya Z.A. Electrophoretic study on titin of skeletal and cardiac muscles in norm, during adaptation, and in pathology. // In: "Biological Motility: achievements and perspectives" (eds. Podlubnaya Z.A. and Malyshev S.L.), Pushchino, Foton-Vek, Volume 1, 2008, P. 125-129.

5. Karaduleva E. V., Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A. "Extreme environmental conditions and changes in muscle proteins" // International Congress "Neuroscience for Medicine and Psychology, Sudak, Crimea, Ukraine, 10-20 June 2008, Proc. (eds. E.V. Loseva, N.A. Loginova) M.: MAKS PRESS, P. 140-142.

6. Шумилина Ю.В., Карадулева E.B.. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Адаптационные изменения изоформного состава белков семейства тайтина в мышцах зимоспящих сусликов в условиях гипоксии // 5-ая Российская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва, 9-11 октября 2008, Патогенез, № 3, С. 97.

7. Vikhlyantsev I.M., Karaduleva Е. V., Malyshev S.L., Podlubnaya Z.A "Changes in titin isoform composition of skeletal and cardiac muscles upon adaptation and pathology". // XXXVII European Muscle Conference, London, UK, 13-16 September 2008, J.Muscle Res.Cell.Motil., v. 29, P. 306.

8. Karaduleva Elena. Vikhlyantsev Ivan, Shumilina Julia, Podlubnaya Zoya. Comparison of protein and mRNA expression levels of titin isoforms in cardiac muscles of hibernating ground squirrels // 34th FEBS Congress, Prague, Czech Republic, 4-9 July 2009, FEBS Journal, v. 276, suppl.l. P. 108.

9. Karaduleva E. V., Vikhlyantsev I.M., Shumilina J.V., Malyshev S.L., Podlubnaya Z.A. Protein and mRNA expression levels of titin in myocardium of hibernating ground squirrels and SHR // 7th European Biophysics Congress, Genoa, Italy, 11-15 July 2009, European Biophysics Journal with Biophysics Letters, v. 38 suppl.l, p. S151, P. 446.

10.Карадулева E.B., Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Изучение экспрессии тайтина в миокарде гибернирующих сусликов и спонтанно-гипертензивных крыс // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 14-ая Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, 19-23 апреля 2010, С.141.

W.Karadaleva E.V., Vikhlyantsev I.M., and Podlubnaya Z.A. Altered cardiac titin expression in the pathogenesis of hypertension and during hibernation // In: "Biological Motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino: Synchrobook, 2010, P. 118-122.

12.Карадулева E.B., Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Изменение уровня экспрессии сердечных изоформ тайтина при гибернации, микрогравитации и патологии // XXI Съезд Физиологического общества им. И. П. Павлова, Калуга, 19-25 сентября 2010, С. 262.

Список используемых сокращений:

мРНК матричная (информационная) РНК

кДНК комплементарная ДНК

уд/мин ударов в минуту (частота сердечных сокращений)

ДКМП дилатационная кардиомиопатия

ttn ген тайтина

кДа кцдодальтон

п количество индивидуальных образцов, взятых для исследования

V объем

ТЦМ тяжелые цепи миозит

Интакт.Т высокомолекулярные формы тайтина, которые, возможно, являются

интактными изоформами этого белка

Т2 протеолитические фрагменты тайтина

ДСН додецилсульфат натрия

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

ДТТ дитиотреитол

ФСБ фосфатный солевой буфер

IgG иммуноглобулины класса G

SDS додецилсульфат натрия

ПААГ полиакриламидный гель

TBE трис-боратный буфер для электрофореза

Taq-pol термостабильная ДНК-полимераза из Thermus aquaticus

dNTP смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (субстратов для ПЦР)

п.н. (bp) пара нуклеотидов (base pair)

Ct пороговый цикл реакции или точка пересечения графика накопления

ДНК и пороговой линии

ПЦР (PCR) полимеразная цепная реакция

qRT-PCR количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

WKY линия контрольных нормотензивных крыс Wistar Kyoto

SHR линия спонтапно-гипертензивных крыс

Подписано в печать:

26.01.2011

Заказ № 4892 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карадулева, Елена Валерьевна

Список основных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1-ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1.' СТРУКТУРА МОЛЕКУЛЫ ТАЙТИНА И ЕГО ФУНКЦИИ

1.1. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в Ъ-диске саркомера

1.2. Структура и функциональные свойства растяжимой области молекулы тайтина, расположенной в 1-зоне саркомера

1.3. Изоформы тайтина и их изоварианты в 1-зоне саркомера

1.4. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в А-диске саркомера

1.5. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в М-линии саркомера

1.6. Роль тайтина в сократительных свойствах миокарда

Глава 2. ЗИМНЯЯ СПЯЧКА МЛЕКОПИТАЮЩИХ

2.1. Общие представления о зимней спячке млекопитающих

2.2. Гибернация и биомедицина

2.3. Транскрипционная и трансляционная регуляция экспрессии генов у зимоспящих животных

2.4. Изменения экспрессии некоторых саркомерных белков в сердце зимоспящих животных

Глава 3. ЭКСПРЕССИЯ ТАЙТИНА ПРИ ПАТОЛОГИИ МИОКАРДА

3.1. Мутации тайтина и их значение

3.2. Изменение изоформного состава тайтина при сердечных заболеваниях

3.3. Ремоделирование миокарда при развитии гипертрофии

3.4. Гипертрофия миокарда у спонтанно-гипертензивных крыс (8Н11) как модель патологии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов в течение годового цикла и спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии"

Одной из важных задач в области миологии является изучение цитоскелетного белка тайтина (коннектина), гигантские молекулы которого перекрывают расстояние от М-линии до Z-диска саркомера, формируя третью филаментную систему в миофибриллах [Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981]. Сердечный тайтин экспрессируется в двух изоформах: короткой N2B (-3000 кДа) и длинной N2BA (-3200-3400 кДа), для которой известно несколько вариантов альтернативного сплайсинга [Freiburg et al., 2000; Bang et al., 2001]. Исследования тайтина показали, что этот белок является одним из важнейших компонентов саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных, выполняя множество различных функций - от участия в сборке саркомера и стабилизации его структуры на ранних этапах миофибриллогенеза до регуляции процессов внутриклеточной сигнализации в зрелой мышце [Tskhovrebova & Trinick, 2010].

Функциональная важность тайтина в норме определяет интерес к изучению свойств этого белка при адаптационных процессах, развитие которых сопровождается изменениями в изоформном составе тайтина [LeWinter & Granzier, 2010]. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, выявили, вклад тайтина в адаптацию сердца и скелетной мускулатуры человека и животных к повышенным физическим нагрузкам [Khramov et al., 2008]. и к условиям реальной и моделируемой микрогравитации [Вихлянцев и Подлубная, 2008; Липец и др., 2009].

Удобной природной моделью для изучения изменений в мышцах при адаптации к условиям гипотермии, гипоксии, ишемии и оксидативного стресса является зимняя спячка, или гибернация млекопитающих. Наиболее значительные изменения в период гибернации наблюдаются в работе сердечной мышцы. Во время спячки сердце гибернантов продолжает функционировать даже при температурах, близких к 0°С. У суслика Spermophiliis undulatus во время торпора частота сердцебиения может составлять 4-5 ударов в минуту при температуре тела 3-5°С, при этом кровяное давление падает, а объем сердечного выброса снижается в 65 раз. При пробуждении суслика частота сердечных сокращений может достигать более 400 уд/мин, что в 2-3 раза выше, чем у активного животного [Игнатьев и др., 2001]. Адаптация миокарда к таким резким перепадам сократительной, активности в течение гибернационного сезона сопровождается изменениями активности многих гибернационно-зависимых генов [Andrews et al., 1998; Fahlman et al., 2000; Storey, 2003], в том числе и гена тайтина, гиперэкспрессия которого обнаружена в миокарде сусликов; Spermophilns tridecemlineatus при гибернации [Brauch et al., 2005]. В сердечной мышце гибернирующего медведя Ursus arctos horribilis было обнаружено увеличение содержания короткой N2B изоформы тайтина в период спячки [Nelson et al., 2008]. Однако в цитируемых работах не были проанализированы изменения в экспрессии тайтина на протяжении всего годового цикла. В литературе также отсутствуют данные по сопоставлению экспрессии тайтина на уровне мРНК с содержанием его белка. Между тем эти сведения могут внести вклад в понимание механизмов сезонной- регуляции экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина и выяснение значения изменений изоформного состава тайтина в миокарде гибернантов в разные периоды зимней спячки.

Тайтин; играет важную роль не только в адаптационных процессах, но также и в патофизиологии мышц [Tskhovrebova & Trinick, 2010; LeWinter & Granzier, 2010]. В частности; обнаружены количественные изменения N2B и N2BA изоформ тайтина- в г сердечной мышце человека. [Makarenko et ah, 2004; Вихлянцев. и Подлубная, 2008; Ahmad; et al>, 2010]!и co6aKH?[Wu et al-, 2002]^при развитии; дилатационной кардиомиопатии: (ДКМП), ишемическом поражении сердца человека [Neagoe et ah, 2002], а также в гипертрофированном сердце крысы [Warren et al., 2003]. В сердце морской свинки при;развитии гипертрофии было зарегистрировано увеличение транскриптов мРНК тайтина на компенсаторной стадии сердечной недостаточности, тогда как по мере прогрессирования заболевания уровень мРНК тайтина снижался [Collins et al., 1996]. Однако исследования изменений экспрессии тайтина' на транскрипционном и трансляционном уровнях при гипертрофии сердца не проводились.

Знание изменений в экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина при развитии гипертрофии сердца и при адаптации миокарда к экстремальным условиям гибернации может иметь перспективы для применения в медицинской практике.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Карадулева, Елена Валерьевна

ВЫВОДЫ:

1. В предсердиях и желудочках сердца сусликов в период подготовки к спячке выявлено двукратное увеличение доли N2BA изоформы тайтина, которая поддерживается на повышенном уровне в течение всего гибернационного сезона. При этом на электрофореграммах левого желудочка сердца сусликов при подготовке к спячке и при пробуждении обнаруживаются двойные полосы N2BA изоформы тайтина. Эти данные указывают на активную перестройку тайтинового фенотипа, что обуславливает увеличение эластичности сердечной мышцы.

2. В сердце гибернирующих сусликов зарегистрировано снижение содержания N2B и N2BA изоформ тайтина (в 1,2-1,4 раза), которое быстро восстанавливается при пробуждении животного, что направлено на поддержание структурно-функциональных свойства саркомера.

4. В миокарде спонтанно-гипертензивных крыс обнаружено снижение содержания N2B и N2BA изоформ тайтина (в 1,5-2 раза) как на ранней стадии развития гипертрофии сердечной мышцы у 15-недельных спонтанно-гипертензивных крыс, так и на более поздней стадии развития патологии у 26-недельных крыс линии SHR.

6. Выявлено снижение уровня мРНК тайтина в сердечной мышце 26-недельных крыс линии SHR на более позднем сроке развития гипертрофии сердца, что свидетельствует о декомпенсаторной стадии заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение качественного и количественного состава тайтина при адаптации и патологии позволяет получить более широкое представление о диапазоне возможных изменений экспрессии этого белка и установить их важность при адаптационно-патологических процессах. Такой двусторонний подход имеет большое теоретическое и практическое значение.

Результаты, представленные в первой части настоящего исследования, демонстрируют, что тайтин дифференциально экспрессируется в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus iindiilatiis в разные периоды годового цикла: летняя активность, осенняя активность (подготовка к спячке), гибернация, пробуждение, зимняя активность (межбаутная активность), вход в спячку. Вариабельность изоформного состава тайтина в сердце выражается в различном соотношении длинной и короткой изоформ. Обнаружено двукратное увеличение содержания его N2BA изоформы по отношению к N2B изоформе в предсердиях и желудочках сердца сусликов на протяжении всего гибёрнационного сезона. При этом содержание мРНК обеих изоформ тайтина снижалось в период гибернации. Следует отметить, что вышеперечисленные изменения наблюдались уже в прегибернационный период осенней активности, что свидетельствует об активной перестройке тайтинового фенотипа, в период подготовки животного к спячке. При этом в период гибернации общее содержание тайтина снижается, но быстро восстанавливается при каждом межбаутном пробуждении.

Во второй части исследования представлены результаты изменений экспрессии тайтина на уровне белка и мРНК в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс в возрасте 15 недель на ранних сроках развития гипертрофии и в возрасте 26 недель с выраженной гипертрофией сердца. В миокарде 15-недельных крыс линии SHR обнаружено двукратное снижение содержания N2B и N2BA изоформ тайтина, которое сопровождалось гиперэкспрессией гена ttn, что может указывать на компенсаторную стадию заболевания. На более поздних сроках развития гипертрофии сердца у 26-недельных SHR наблюдалось снижение содержания как белка, так . и мРНК-транскриптов тайтина, что может свидетельствовать о декомпенсаторной стадии болезни.

Анализируя роль обнаруженных нами изменений в экспрессии тайтина при гибернации и патологии, мы пришли к следующему заключению. Увеличение содержания длинной ШВА изоформы тайтина в миокарде сусликов на протяжении всего гибернационного сезона вносит вклад в повышение эластичности миокарда, и, тем самым, способствует лучшему наполнению желудочков и увеличению конечного диастолического объёма. Это обуславливает реализацию компенсаторного механизма Франка-Старлинга, направленного на оптимизацию сокращения сердечной мышцы как во время торпора (для облегчения выброса густой крови), так и при пробуждении (для предотвращения механических повреждений). Подавление транскрипции гена тайтина в течение гибернационного сезона может быть направлено на минимизацию энергетических затрат во время гибернации, что соответствует основной стратегии спячки: экономии энергоресурсов.

В сердце крыс линии на начальной: стадии развития гипертрофии также происходят адаптационные процессы, заключающиеся в активации транскрипции гена тайтина с целью компенсации сниженного содержания его белка в миокарде этих животных. Однако восстановления содержания тайтина в гипертрофированном сердце БНЯ не происходит, тогда как у зимоспящих сусликов сниженное содержание тайтина быстро« возвращается к норме в течение межбаутной активности, что вносит вклад в поддержание структурно-функциональных свойств саркомера на протяжении всего гибернационного сезона. В" миокарде спонтанно-гипертензивных крыс на более позднем этапе развития гипертрофии обнаруживаются только декомпенсаторные изменения -снижение экспрессии тайтина как на транскрипционном, так и трансляционном уровнях.

Полученные данные об адаптационном изменении экспрессии ШВ и ШВА изоформ тайтина при гибернации могут стать основой для их применения в биомедицине, а дифференциальная экспрессия тайтина при патологии поможет в разработке методов диагностики гипертрофии миокарда и в поиске подходов, оценивающих эффективность ее лечения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карадулева, Елена Валерьевна, Пущино

1. Adaptation to the Cold (Eds. Geiser F., Hulbert A.J., Nicols S.C.) (1996) // Armidale, NSW, Australia: Univ. of New England Press, pp. 404.

2. Agarkova I., Ehler E., Lange S., Schoenauer R., Perriard J.C. (2003) M-band: a safeguard for sarcomere stability? // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 24(2-3). P. 191-203.

3. Agarkova I., Schoenauer R., Ehler E., Carlsson L., Carlsson E., Thornell L.E., Perriard J.C. (2004) The molecular composition of the sarcomeric M-band correlates with muscle fiber type // Eur J. Cell Biol. V. 83(5). P. 193-204.

4. Ahmad F., Seidman J.G., Seidman C.E. (2005) The genetic basis for cardiac remodeling. //Annu. Rev. Genomics. Hum. Genet. V. 6. P. 185-216.

5. Andrews M.T., Squire T.L., Bowen C.M., and*Rollins M.B. (1998) Low-temperature carbon utilization is regulated by novel gene activity in the heart of a hibernating animal. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95. P. 8392-8397.

6. Arber S., Haider G., Caroni P. (1994) Muscle LIM protein, a novel essential regulator of myogenesis, promotes myogenic differentiation // Cell. V. 79(2). P. 221-231.

7. Astier C., Raynaud F., Lebart M.C., Roustan C., Benyamin Y. (1998) Binding of a native titin fragment to actin is regulated by PIP2 // FEBS Lett. V. 429 (1). P. 95-98.

8. Ayoob J.C., Turnacioglu K.K., Mittal В., Sanger J.M., Sanger J.W. (2000) Targeting of cardiac muscle titin fragments to the Z-bands and dense bodies of living muscle and non-muscle cells // Cell. Motil. Cytoskeleton. V. 45. P.67-82.

9. Belke D.D., Wang L.C., and Lopaschuk G.D. (1998) Acetyl-CoA carboxylase control of fatty acid oxidation in hearts from hibernating Richardson's ground squirrels. // Biochimica et Biophysica Acta. V. 1391(1). P. 25-36.

10. Bennett P., Craig R., Starr R., ffer G. (1986) The ultrastructural location of C-protein,f

11. X-protein and H-protein in rabbit muscle // J. Muscle. Res. & Cell Motil. V. 7 (6). P. ) 550-567.

12. Bianco P., Nagy A., Kengyel A., Szatmari D., Martonfalvi Z., Huber T., Kellermayeri

13. M.S. (2008) Interaction forces between F-actin and titin PEVK domain measured with optical tweezers I I Biophys J. V. 93(6). P. 2102-2109.

14. Bocharova L.S., Gordon R.Y., and Arkhipov V.I. (1992) Uridine uptake and RNAi

15. Boyer B.B., Barnes B.M. (1999) Molecular and metabolic aspects of mammalian hibernation. // Bioscience. V. 49. P. 713-724.

16. Brauch K.M., Dhruv N.D., Hanse E.A, and Andrews M.T. (2005) Digital transcriptome analysis indicates adaptive mechanisms in the heart of a hibernating mammal. // Physiological Genomics.V. 23(2). P. 227-234.

17. Carey H.V. and Martin S.L. (1996) Preservation of intestinal gene expression during hibernation. //Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. V. 271. P. 804-813.

18. Carey H.V., Andrews M.T., Martin S.L. (2003) Mammalian hibernation: cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature. // Physiol. Rev. V. 83. P. 1153-1181.

19. Cazorla O., Freiburg A., Helmes M., Centner T., McNabb M., Wu Y., Trombitas K., Labeit S., Granzier H. (2000) Differential expression of cardiac titin isoforms and modulation of cellular stiffness // Circ. Res.V. 86. P. 59-67.

20. Cazorla O., Wu Y., Irving T.C., Granzier H. (2001) Titin-based modulation of calcium sensitivity of active tension in mouse skinned cardiac myocytes // Circ. Res. V. 88. P. 1028-1035.N

21. Collins J.F., Pawloski-Dahm C., Davis M.G., Ball N., Dorn G.W. and, Walsh R.A. (1996) The role of the cytoskeleton in left ventricular pressure overload hypertrophy and failure. // J Mol. Cell. Cardiol. V. 28(7). P. 1435-1443.

22. DeGracia D.J., Kumar R., Owen C.R., Krause G.S., and White B.C. (2002) Molecular pathways of protein synthesis inhibition during brain reperfusion: implications for neuronal survival or death. // J Cereb. Blood. Flow. Metab. V. 22. P. 127-141.

23. Dubois R. Physiologie comparée de la marmotte (1896) // Paris: Masson, pp. 268.

24. Duker G.D., Olsson S.O., Hecht N.H., Senturia J.B., Johansson B.W. (1983) Ventricular fibrillation in hibernators and nonhibernators. // Cryobiology. V. 20(4). P. 407-420.

25. Epperson L.E., Martin S.L. (2002) Quantitative assessment of ground squirrel mRNA levels in multiple stages of hibernation. //Physiol. Genomics. V. 10(2). P. 93-102.

26. Eto Y., Yonekura K., Sonoda M., et al. (2000) Calcineurin is activated in rat hearts with physiological left ventricular hypertrophy induced by voluntary exercise training. // Circulation. V. 101. P. 2134-2137.

27. Fahlman A., Storey J.M., and Storey K.B. (2000) Gene up-regulation in heart during mammalian hibernation. // Ciyobiology. V. 40 (4). P. 332-342.

28. Fahrmann M., Erfmann M., Beinbrech G. (2002) Binding of CaMKII to the giant muscle protein projectin: stimulation of CaMKII activity by projectin // Biochim. Biophys. Acta. V. 1569 (1-3). P. 127-134.

29. Frank G. L., Storey K. B. (1996) The effect of total unsaturate content on hibernation. In: Adaptation to the Cold: Tenth International Hibernation Symposium (Geiser F.,

30. Hulbert A. J., Nicol S. C., eds.) // University of New England Press, Armidale, P. 211216.

31. Freiburg A., Gautel M. (1996) A molecular map of the interactions between titin and myosin-binding protein C. Implications for sarcomeric assembly in familial hypertrophic cardiomyopathy//Eur. J. Biochem. V. 235(1-2). P. 317-323.

32. Frey N., Olson E.N. (2002) Calsarcin-3, a novel skeletal muscle-specific member of the calsarcin family, interacts with multiple Z-disc proteins // J. Biol. Chem. V. 277(16). P. 13998-14004.

33. Fujita H., Labeit D., Gerull B., Labeit S., Granzier H.L. (2004) Titin isoform-dependent effect of calcium on passive myocardial tension. // Am. J Physiol. Heart. Circ. Physiol. V. 287. P. 2528-2534.

34. Fukuda N., Granzier H.L. (2004) Role of the giant elastic protein titin in the Frank-Starling mechanism of the heart. // Curr. Vase. Pharmacol. V. 2. P. 135-139.

35. Fukuda N., Granzier H.L., Ishiwata S., Kurihara S. (2008) Physiological functions of the giant elastic protein titin in mammalian striated muscle. // J Physiol. Sci. V. 58(3). P. 151-159.

36. Fukuda N., Sasaki D., Ishiwata S., Kurihara S. (2001) Length dependence of tension generation in rat skinned cardiac muscle: role of titin in the Frank-Starling mechanism of the heart. // Circulation. V. 104. P. 1639-1645.

37. Fukuda N., Wu Y., Farman G., Irving T.C., Granzier H. (2005a) Titin-based modulation of active tension and interfilament lattice spacing in skinned rat cardiac muscle // Pflugers. Arch. V. 449(5). P. 449-457.

38. Fukuda N., Wu Y., Nair P., Granzier H.L. (2005b) Phosphorylation of titin modulates passive stiffness of cardiac muscle in a titin isoform-dependent manner // J. Gen. Physiol. V. 125(3). P. 257-271.

39. Fukushima H., Chung C.S., Granzier H. (2010) Titin-isoform dependence of titin-actin interaction and its regulation by S100A1/Ca2+ in skinned myocardium. // J Biomed. Biotechnol. V.2010, Article ID 727239, 9 pages, doi:10.1155/2010/727239.

40. Gautel M., Goulding D., Bullard B., Weber K., Fürst D.O. (1996) The central Z-disk region of titin is assembled from a novel repeat in variable copy numbers // J. Cell Sei. V. 109. P. 2747-2754.

41. Gautel M., Leonard K., Labeit S. (1993) Phosphorylation of KSP motifs in the C-terminal region of titin in differentiating myoblasts // EMBO J. V. 12. P. 3827-3834.

42. Goll D.E., Neti G., Mares S.W., Thompson V.F. (2008) Myofibrillar protein turnover: the proteasome and the calpains // J. Anim. Sci. V. 86 (E. Suppl.): E19-E35.

43. Granzier H. & Labeit S. (2004) The giant protein titin. A major player in myocardial mechanics, signaling and disease // Circ. Res. V. 94. P. 284-295.

44. Granzier H., Helmes M., Cazorla O., McNabb M., Labeit D., Wu Y., Yamasaki R., Redkar A., Kellermayer M., Labeit S., Trombitas K. (2000) Mechanical properties of titin isoforms. // Adv. Exp. Med. Biol. V. 481. P. 283-300.

45. Granzier H., Kellermayer M., Helmes M., Trombitas K. (1997) Titin elasticity and mechanism of passive force development in rat cardiac myocytes probed by thin-filament extraction // Biophys. J. V. 73. P. 2043-2053.

46. Granzier H., Labeit S. (2002) Cardiac titin: an adjustable multi-functional spring. // J Physiol. V. 541(Pt 2). P. 335-342.

47. Granzier II., Wu Y., Siegfried L., LeWinter M. (2005) Titin: physiological function and role in cardiomyopathy and failure // Heart Fail. Rev. V. 10(3). P. 211-223.

48. Granzier H.L., Irving T.C. (1995) Passive tension in cardiac muscle: contribution of collagen, titin, microtubules, and intermediate filaments // Biophys J. V. 68. P. 10271044.

49. Granzier H.L., Labeit S. (2006) The giant muscle protein titin is an adjustable molecular spring // Exerc. Sport Sci. Rev. V. 34(2). P. 50-53.

50. Gregorio C.C., Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? // Curr. Opin. Cell Biol. V. 11. P. 18-25.

51. Gregorio C.C., Trombitas K., Centner T., Kolmerer B., Stier G., et al. (1998) The NH2 terminus of titin spans the Z-disc: its interaction with a novel 19-kD ligand (T-cap) is required for sarcomeric integrity // J. Cell Biol. V. 143. P. 1013-1027.

52. Gulevsky A.K., Zagnoiko V.I., and Mishneva L.G. (1992) The intensity of protein synthesis in organs of heterothermal animals on hibernation. // Cryo. Lett. V. 13. P. 99-108.

53. Guo W., Bharmal S.J., Esbona K., Greaser M.L. (2010) Titin diversity-alternative splicing gone wild 11 J. Biomed. Biotechnol. V. 2010. P. 753675

54. Hein S., Kostin S., Heling A., Maeno Y., Schaper J. (2000) The role of the cytoskeleton in heart failure // Cardiovasc. Res. V. 45. P. 273-278.

55. Hein S., Scholz D., Fujitani N., Rennollet H., Brand T., Friedl A., Schaper J. (1994) Altered expression of titin and contractile proteins in failing human myocardium // J. Mol. Cell Cardiol. V. 10. P. 1291-1306.

56. Helmes M., Lim C.C., Liao R., Bharti A., Cui L., Sawyer D.B. (2003) Titin determines the Frank-Starling relation in early diastole // J. Gen. Physiol. V. 121(2). P. 97-110.

57. Helmes M., Trombitas K., Granzier H. (1996) Titin develops restoring force in rat cardiac myocytes // Circ. Res. V. 79. P. 619-626.

58. Hittel D. and Storey K.B. (2001) Differential expression of adipose and heart type fatty acid binding proteins in hibernating ground squirrels. // Biochim. Biophys. Acta. V. 1522. P. 238-243.

59. Hittel D. and Storey K.B. (2002) Differential expression of mitochondria-encoded genes in a hibernating mammal. // J Exp. Biol. V. 205. P. 1625-1631.

60. Hittel D. and Storey K.B. (2002) The translation status of differentially expressed mRNAs in the hibernating thirteen-lined ground squirrel (Spermophilus tridecemlineatus). // Arch. Biochem. Biophys. V. 401. P. 244-254.

61. Ho K.K., Levy D., Kannel W.B., Pinsky J.L. (1993) The epidemiology of heart failure: the Framingham study. // J Am. Coll. Cardiol. V. 22. P. 6-13.

62. Horowits R. (1992) Passive force generation and titin isoforms in mammalian skeletal muscle // Biophys J. V. 61(2). P. 392-398.

63. Horowits R., Kempner E.S., Bisher M.E., Podolsky RJ. (1986) A physiological role for titin and nebulin in skeletal muscle // Nature. V. 323. P. 160-164.

64. Hoshijima M. (2006) Mechanical stress-strain sensors embedded in cardiac cytoskeleton: Z disk, titin, and associated structures // Am J Physiol Heart Circ Physiol. V. 290(4). P. 1313-1325.

65. Houmeida A., Holt J., Tskhovrebova L., Trinick J. (1995) Studies of the interaction between titin and myosin // J. Cell Biol. V. 131. P. 1471-1481.

66. Itoh Y., Kimura S., Suzuki T., Ohashi K., Maruyama K. (1986) Native connectin from porcine cardiac muscle. // J Biochem. V. 100(2). P. 439-447.

67. Itoh-Satoh M., Hayashi T., Nishi H.5 Koga Y., Arimura T., et al. (2002) Titin mutations as the molecular basis for dilated cardiomyopathy // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 291. P. 385-393.

68. Johansson B.W. (1996) The hibernator heart Nature's model of resistance to ventricular fibrillation. // Cardiovascular Research. V. 3(1). P. 826-832.

69. Kawaguchi N., Fujitani N., Schaper J., Onishi S. (1995) Pathological changes of myocardial cytoskeleton in cardiomyopathic hamster // Mol.Cell Biochem. V. 144. P. 75-79.

70. Kimura S., Maruyama K., Huang Y.P. (1984) Interactions of Muscle P-Connectin with Myosin, Actin, and Actomyosin at Low Ionic Strengths // Biochem. J. V. 96. P. 499506.

71. Knight J.E., Narus E.N., Martin S.L., Jacobson A., Barnes B.M., Boyer B.B. (2000) mRNA stability and polysome loss in hibernating Arctic ground squirrels (Spermophilus parryii) // Mol. Cell. Biol. V. 20(17). P. 6374-6379.

72. Kolaeva S.G., Kramarova L.I., Ilyasova E.N., Ilyasov F.E. (1980) The kinetics and metabolism of the cell of hibernating animals during hibernation // Int. Rev. Cytol., V. 66. P. 147-170.

73. Kong Y., Flick M.J., Kudla A J., Konieczny S.F. (1997) Muscle LIM protein promotes myogenesis by enhancing the activity of MyoD // Mol. Cell Biol. V. 17(8). P. 47504760.

74. Kontrogianni-Konstantopoulos A., Jones E.M., Van Rossum D.B., Bloch R.J. (2003) Obscurin is a ligand for small ankyrin 1 in skeletal muscle // Mol. Biol. Cell. V. 14(3). P. 1138-1148.

75. Kontrogianni-Konstantopoulos A., Ackermann M.A., Bowman A.L., Yap S.V., Bloch R.J. (2009) Muscle giants: molecular scaffolds in sarcomerogenesis // Physiol. Rev. V. 89(4). P. 1217-1267.

76. Korner P.I. (1995) Cardiovascular hypertrophy and hypertension: causes and consequences //Blood. Press. V.2. P. 6-16.

77. Krüger M., Kötter S., Grützner A., Lang P., Andresen C., Redfield M.M., Butt E., dos Remedios C.G., Linke W.A. (2009) Protein kinase G modulates human myocardial passive stiffness by phosphorylation of the titin springs // Circ Res. V. 104(1). P. 8794.

78. Krüger M.,,Linke W.A. (2006) Protein kinase-A phosphorylates titin in human heart muscle and reduces myofibrillar passive tension // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 27(5-7). P. 435-444.

79. Krüger M., Sachse C., Zimmermann W.H., Eschenhagen T., Klede S., Linke W.A. (2008) Thyroid hormone, regulates developmental titin isoform transitions via the phosphatidylinositol-3-kinase/AKT pathway//Circ Res. V. 102(4). PI 439-447.

80. Kurihara S. and Konishi M; (1987) Effects of ß-adrenoceptor stimulation on intracellular Ca2+ transients and tension in rat ventricular muscle // Pflugers. Arch. V. 409. P. 427-437.

81. Labeit D., Watanabe K., Witt C., Fujita H., Wu Y., Lahmers S., Funck T., Labeit S., Granzier H. (2003) Calcium-dependent molecular spring elements in the giant protein titin // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 100. P. 13716-13721.

82. Labeit S., Barlow D.P., Gautel M., Gibson T., Holt J., Hsieh C.L., Francke U., Leonard K., Wardale J., Whiting A. (1990) A regular patternof two types of 100-residue motif in the sequence of titin // Nature. V. 345. P. 273-276.

83. Labeit S., Gautel M., Lakey A., Trinick J. (1992) Towards a molecular understanding of titin // EMBO J. V. 11 (5). P. 1711 -1716.

84. Labeit S., Kolmerer B. (1995) Titins, giant proteins in charge of muscle ultrastructure and elasticity // Science. V. 270. P. 293-296.

85. Laheit S., Kolmerer B., Linke W.A. (1997) The giant protein titin. Emerging roles in physiology and pathophysiology // Circ. Res. V. 80(2). P. 290-294.

86. Lange S., Auerbach D., McLoughlin P., Perriard E., Schäfer B.W., Perriard J.C., Ehler E. (2002) Subcellular targeting of metabolic enzymes to titin in heart muscle may be mediated by DRAL/FHL-2 // J. Cell Sei. V. 115(Pt 24). P. 4925-4936.

87. Lange S., Ehler E., Gautel M. (2006) From A to Z and back? Multicompartment proteins in the sarcomeres // Trends Cell Biol. V. 16(1). P. 11-18.

88. Lee E.J., Peng J., Radke M., Gotthardt M., Granzier H.L. (2010) Calcium sensitivity and the Frank-Starling mechanism of the heart are increased in titin N2B region-deficient mice // J. Mol. Cell Cardiol. V. 49(3). P. 449-458.

89. Levy D., Garrison R.J., Savage D.D., Kannel W.B., Castelli W.P. (1990) Prognostic implications of echocardiographically determined left ventricular mass in the Framingham heart study // N Engl. J Med. V. 322. P. 1561-1566.

90. LeWinter M.M., Granzier H. (2010) Cardiac titin: a multifunctional giant // Circulation. V. 121(19). P. 2137-2145.

91. Li L., Desantiago J., Chu G., Kranias E.G., Bers D.M. (2000) Phosphorylation of phospholamban and troponin I in ß-adrenergic-induced acceleration of cardiac relaxation // Am. J Physiol. Heart. Circ. Physiol. V. 278. P. 769-779.

92. Li Z., Bing O.H.L., Long X., Robinson K.G., and Lakatta E.G. (1997) Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. V. 272. P. 2313-2319.

93. Linke W.A. (2008) Sense and stretchability: The role of titin and titin-associated proteins in myocardial stress-sensing and mechanical dysfunction // Cardiovascular. Research. V. 77. P. 637-648.

94. Linke W.A., Ivemeyer M., Olivieri N., Kolmerer B., Rüegg J.C., Laheit S. (1996) Towards a molecular understanding of the elasticity of titin // J. Mol. Biol. V. 261. P. 62-71.

95. Linke W.A., Kulke M., Li H., Fujita-Becker S., Neagoe C., Manstein D.J., Gautel M., Fernandez J.M. (2002) PEVK domain of titin: an entropic spring with actin-binding properties // J. Struct. Biol. V. 137 (1-2). P. 194-205.

96. Livak K.J., Schmittgen T.D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods V. 25 (4). P. 402-408.

97. Liversage A.D., Holmes D., Knight P J., Tskhovrebova L., Trinick J. (2001) Titin and the sarcomere symmetry paradox. // J Mol. Biol. V. 305(3). P. 401-409.

98. Luther P.K., Squire J.M. (2002) Muscle Z-band ultrastructure: titin Z-repeats and Z-band periodicities do not match // J. Mol. Biol. V. 319(5). P. 1157-1164.

99. Lyman C. P. (1982) Who is Who among the Hibernators. In: Hibernation and torpor in Mammals and Birds. (Lyman C. P., Willis J. S., Malan A., Wang L. C. H., eds.) // Academic Press, New York, P. 12-31.

100. Ma Y.L., Zhu X., Rivera P.M., Toien 0., Barnes B.M., LaManna J.C., Smith M.A., Drew K.L. (2005) Absence of cellular stress in brain after hypoxia induced by arousal from hibernation in Arctic ground squirrels // Am. J Physiol. V. 289. P. 1297—1306.

101. Malatesta-M., Zancanaro C., Martin T.E., Chan E.K.L., Amalric F., Luhrmann R., Vogel P., and Fakan S. (1994)» Cytochemical and immunocytochemical characterization of nuclear bodies during hibernation // Eur. J Cell. Biol. V. 65. P: 8293.

102. Maniatis T., Fritsch E.F., and Sambrook J. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual // Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

103. Maruyama K., Hu D.H., Suzuki T. and Kimura S. (1987) Binding of Actin Filaments to Connecting J. Biochem. V. 101. P. 1339-1346.

104. Maruyama K., Kimura S., Ohashi K., Kuwano Y. (1981) Connectin, an elastic protein of muscle. Identification of "titin" with connectin // J. Biochem. V. 89. P. 701-709.

105. Mattu A., Brady W.J., Perron A.D. (2002) Electrocardiographic manifestations of hypothermia. //Am. JEmerg. Med. V. 20(4). P. 314-326.

106. Mayans O., van der Ven P.F., Wilm M., Mues A., Young P., Furst D.O., Wilmanns M., Gautel M. (1998) Structural basis for activation of the titin kinase domain during myofibrillogenesis //Nature. V. 395 (6705). P. 863-869.

107. McArthur M.D., Jourdan M.L., Wang L.C. (1992) Prolonged stable hypothermia: effect on blood gases and pH in rats and ground squirrels. // Am. J Physiol. V. 262(2 Pt 2). P. 190-197.

108. Millman B.M. (1998) The filament lattice of striated muscle. // Physiol. Rev. V. 78(2). P. 359-391.

109. Molkentin J.D. (2004) Calcineurin-NFAT signaling regulates the cardiac hypertrophic response in coordination with the MAPKs. // Cardiovascular Research. V. 63. P. 467— 475.

110. Molkentin J.D., Lu J.R., Antos C.L., Markham B., Richardson J., Robbins J., Grant S.R., Olson E.N. (1998) A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy. // Cell. V. 93. P. 215-228.

111. Morano I., Hadicke K., Grom S., Koch A., Schwinger R.H. et al. (1994) Titin, myosin light chains and C-protein in the developing and failing human heart // J. Moll. Cell Cardiol. V. 26. P. 361-368.

112. Morin P.Jr, Storey K.B. (2006) Evidence for a reduced transcriptional state during hibernation in ground squirrels // Cryobiology. V. 53(3). P. 310-318.

113. Mouritzen C.V., Andersen M.N. (1965) Myocardial temperature gradients and ventricular fibrillation during hypothermia // J Thorac. Cardiovasc. Surg. V. 49. P. 937-944.

114. Mues A., van der Ven, P.F.M., Young P., Furst D.O., Gautel M. (1998) Two immunoglobulin-like domains of the Z-disc portion of titin interact in a conformation-dependent way with telethonin // FEBS Lett. V. 428. P. 111-114.

115. Musa H., Meek S., Gautel M., Peddie D., Smith A.J., Peckham M. (2006) Targeted homozygous deletion of M-band titin in cardiomyocytes prevents sarcomere formation // J. Cell Sci. V. 119(Pt 20). P. 4322-4331.

116. Nagata K., Somura F., Obata K., Odashima M., Izawa H., Ichihara S., Nagasaka T., Iwase M., Yamada Y., Nakashima N., Yokota M. (2002) ATI receptor blockade reduces cardiac calcineurin activity in hypertensive rats // Hypertension. V. 40. P. 168-174.

117. Nakata T., Sato S., Hachisu M., Tsutsumi T., Osada H. Nave et al., (1989) Differences in the characterization of the Ca2+ current in ventricular myocytes between spontaneously hypertensive rats and normotensive rats // V. 22(1). P. 230-231.

118. Neagoe C., Kulke M., del Monte F., Gwathmey J.K., de Tombe P.P., Hajjar R.J., Linke W.A. (2002) Titin isoform switch in ischemic' human heart disease // Circulation. V. 106(11). P. 1333-1341.

119. Neagoe C., Opitz C., Makarenko I., Linke W. (2003) Gigantic variety, expression patterns of titin isoforms in striated muscles and consequences for myofibrillar passive stiffness // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 24 (2-3). P. 175-189.

120. Nelson O.L., Robbins C.T., Wu Y., Granzier H. (2008) Titin isoform switching is a major cardiac adaptive response in hibernating grizzly bears // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. V. 295(1). P. H366-371.

121. Nicholas G., Thomas M., Langley B., Somers W., Patel K., Kemp C.F., Sharma M., Kambadur R. (2002) Titin-cap associates with, and regulates secretion of Myostatin // J. Cell Physiol. V. 193(1). P. 120-131.

122. O'Hara B.F., Watson F.L., Srere H.K., Kumar H., Wiler S.W., Welch S.K., Bitting L, Heller H.C., and Kilduff T.S. (1999) Gene expression in the brain across the hibernation cycle // J Neurosci. V. 19. P. 3781-3790.

123. Opitz C.A., Kulke M., Leake M.C., Neagoe C., Hinssen H., Hajjar R.J., Linke W.A. (2003) Damped elastic recoil of the titin spring in myofibrils of human myocardium // Proc Natl Acad Sei U S A. V. 100(22). P. 12688-12693.

124. Opitz C.A., Leake M.C., Makarenko I., Benes V., Linke W.A. (2004) Developmentally regulated switching of titin size alters myofibrillar stiffness in the perinatal heart // Circ. Res. V. 94. P. 967-975.

125. Osborne P.G., Gao B., Hashimoto M. (2004) Determination in vivo of newly synthesized gene expression in hamsters during phases of the hibernation cycle. // Jpn. J Physiol. V. 54(3). P. 295-305.

126. Ottenheijm C.A., Granzier H. (2010) Role of Titin in Skeletal Muscle Function and Disease. // Adv. Exp. Med. Biol. V. 682. P. 105-122.

127. Peckham M., Young P., Gautel M. (1997) Constitutive and variable regions of Z-disk titin/connectin in myofibril formation: a dominant-negative screen // Cell Struct. Funct. V. 22 (1). P. 95-101.

128. Pehowich D.J., Wang L.C.H. (1984) Seasonal changes in mitochondrial succinat dehydrogenase activity in a hibernator Spermophilus richardsonii // J. Comp.-Physiol. V. 154B.P. 495-501.

129. Peng- J., Raddatz K., Molkentin J.D., Wu Y., Labeit S., Granzier H., Gotthardt M. (2007) Cardiac hypertrophy and, reduced' contractility in' hearts deficient in the titin kinase region// Circulation. V. 115(6). P. 743-751.

130. Pissarek M., Bigard X., Mateo P., Guezennec C.Y., Hoerter J.A. (1997) Adaptation of cardiac myosin and creatine kinase to chronic hypoxia: role of anorexia and hypertension //Am. J. Physiol., V. 272 (4), pt 2. P. 1690-1695.

131. Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Vikhlyantsev I.M., Malyshev S.L., Udaltsov S.N., Ziegler C., Beinbrech G. (2003) Comparative electron microscopic study on projectin and titin binding to F-actin // Insect. Biochem. Mo.l Biol. V. 33(8). P. 789793.

132. Radke M.H., Peng J., Wu Y., McNabb M., Nelson O.L., Granzier H., Gotthardt M. (2007) Targeted deletion of titin N2B region leads to diastolic dysfunction and cardiac atrophy // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 104(9). P. 3444-3449.

133. Rhee D., Sanger J.M., Sanger J.W. (1994) The premyofibril: evidence for its role in myofibrillogenesis // Cell. Motil. Cytoskeleton. V. 28(1). P. 1-24.

134. RoIfe D.F. and Brown G.C. (1997) Gellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. // Physiol. Rev. V. 77. P. 731-758.

135. Ryazanov A.G., Spirin A.S. (1993) In: Translational regulation of gene expression 2 (Ilan J, ed) // New York: Plenum. P. 433-455.

136. Satoh M., Takahashi M., Sakamoto T., Hiroe M., Marumo F., Kimura A. (1999) Structural analysis of the titin gene in hypertrophic cardiomyopathy: identification of a novel disease gene // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 262. P. 411-417.

137. Siu B.L., Niimura FL, Osborne J.A., Fatkin D., MacRae C., Solomon S., Benson D.W., Seidman J.G. Seidman C.E. (1999) Familial dilated cardiomyopathy locus maps to chromosome 2q31 // Circulation. V. 99. P. 1022-1026.

138. South F.E., House W.A. (1967) Energy metabolism in hibernation In: Mammalian hibernation'(Fisher K.C., Dawe A.R:, Lyman C.P;, Schonbaum E., South F.E., Eds.) // NewYork. Elsevier. V. 111. P. 305-324.

139. Spierts I.L., Akster H.A., Granzier H.L. (1997) Expression of titin isoforms in red and white muscle fibres of carp (Cyprinus carpio L.) exposed to different sarcomere strains during swimming // J Comp Physiol. V. 167(8). P. 543-551.

140. Srere H.K., Wang L.C.H:, and Martin S.L. (1992) Central role for differential gene expression in mammalian hibernation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 89. P. 71197123.

141. Storey K.B. (2003) Mammalian hibernation: transcriptional and translational controls. // In: Hypoxia: Through the Lifecycle (Roach, R.C., Wagner, P.D., and Hackett, P.H., eds.) Advances in Experimental Medicine and Biology. V. 543. P. 21-38:

142. Storey K.B: and Storey J.M. (2007) Tribute to P. L. Lutz: putting life on 'pause' -molecular regulation of hypometabolism // The Journal of Experimental Biology V. 210. P.1700-1714.

143. Storey K.B., Storey J.M. (2004) Metabolic rate depression in animals: transcriptional and translation^ controls // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. V. 79(1). P. 207-233.

144. Strang K.T., Sweitzer N.K., Greaser M.L., Moss R.L. (1994) Beta-adrenergic receptor stimulation increases unloaded shortening velocity of skinned single ventricular myocytes from rats // Circ. Res. V. 74(3). P. 542-549.

145. Stuyvers B.D., Miura M., ter Keurs H.E. (1997) Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle: involvement of Ca2+ // Adv. Exp. Med. Biol. V. 430. P. 13-28.

146. Sussman M.A., Lim H.W., Gude N., Taigen T., Olson E.N., Robbins J., Colbert M.C., Gualberto A., Wieczorek D.F., Molkentin J.D. (1998) Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition// Science. V. 281. P. 1690 -1693.

147. Tatsumi R., Hattori A. (1995) Detection of giant myofibrillar proteins connectin and nebulin by electrophoresis in 2 % polyactylamide slab gels strengthened with agarose // Anal. Biochem. V. 224. P. 28-31.

148. Trinick J., Knight P., Whiting A. (1984) Purification and properties of native titin // J. Mol. Biol. V. 180. P. 331-356.

149. Trinick J.A. (1981) End-filaments: a new structural element of vertebrate skeletal muscle thick filaments // J Mol. Biol. V. 151(2). P. 309-314.

150. Trombitas K., Greaser M.L., Pollack G.H. (1997). Interaction between titin, and thin filaments in intact cardiac muscle // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 18. P. 345-351.

151. Trombitas K., Jin J.P., Granzier H. (1995) The mechanically active domain of titin in cardiac muscle // Circ Res. V. 77(4). P. 856-861.

152. Trombitas K., Pollack G.H. (1993) Elastic properties of the titin filament in the Z-line region of vertebrate striated muscle // J Muscle Res Cell Motil. V. 14(4). P. 416-42.

153. Trombitas K., Wu Y., Labeit D., Labeit S., Granzier H. (2001) Cardiac titin isoforms are coexpressed in the half-sarcomere and extend independently // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. V. 281. P. H1793-H1799.

154. Tskhovrebova L., Trinick J. (1997) Direct visualization of extensibility in isolated titin molecules // J. Mol. Biol. V. 265. P. 100-106.

155. Tskhovrebova L., Trinick J. (2005) Muscle disease: a giant feels the strain //Nat Med. V. 11(5). P. 478-479.

156. Velickovska V., Lloyd B.P., Qureshi S., van Breukelen F. (2005) Proteolysis is depressed during torpor in hibernators at the level of the 20S core protease // J. Comp. Physiol. B. V. 175. P. 329-335.

157. Wang K., McClure J., Tu A. (1979) Titin: major myofibrillar components of striated muscle // Proc.Natl. Acad. Sci.USA. V. 76 (8). P. 3698-3702.

158. Wang K., Wright J. (1988) Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z-line // J Cell. Biol. V. 107 (6 Pt 1). P. 2199-212.

159. Wang L.C.H. (1987) Mammalian hibernation. In: The effects of low temperatures on biological systems (Eds. Grout B.W.W., Morris G.J.) // Edward Arnold Publ. London, P. 349-386.

160. Warren C.M., Jordan M.C., Roos K.P., Krzesinski P.R., Greaser M.L. (2003) Titin isoform expression in normal and hypertensive myocardium // Cardiovasc. Res. V. 59(1). P. 86-94.

161. Warren C.M., Krzesinski P.R., Campbell K.S., Moss R.L., Greaser M.L. (2004) Titin isoform changes in rat myocardium during development // Mech. Dev. V. 121(11). P.1301-1312.

162. Whitten B.K. and; Klain G.J. (1968) Protein metabolism in hepatic tissue of hibernating and arousing ground squirrels // Am. J Physiol. V. 214. P. 1360-1362.

163. Williams D.R., Epperson L.E., Li W., Hughes M.A., Taylor R., Rogers J., Martin S.L., Cossins A.R., Gracey A.Y. (2005) Seasonally hibernating phenotype assessed through transcript screening // Physiol. Genomics. V. 24(1). P. 13-22.

164. Wu Y., Bell S.P., Trombitas K„ Witt C.C., Labeit S., LeWinter M.M., Granzier H. (2002) Changes in titin isoform expression in pacing-induced cardiac failure give to increased passive muscle stiffness // Circulation. V. 106 (11). P. 1384-1389.

165. Wu Y., Peng J., Campbell K.B., Labeit S., Granzier H. (2007) Hypothyroidism leads to increased collagen-based stiffness and re-expression of large cardiac titin isoforms with high compliance // J Mol. Cell. Cardiol. V. 42(1). P. 186-195.

166. Xu X., Meiler S.E., Zhong T.P., Mohideen M., Crossley D.A., et al. (2002) Cardiomyopathy in zebrafish due to mutation in an alternatively spliced exon of titin // Nat. Genet. V. 30. P. 205-209.

167. Yamasaki R., Wu Y., McNabb M., Greaser M., Labeit S., Granzier H. (2002) Protein kinase A Phosphorylates titn's cardiac-specific N2B domain and reduces passive tension in rat cardiac myocytes // Circ. Res. V. 90. P. 1181-1188.

168. YaniJ., Barnes B.M., Kohl F., Marr T.G. (2008) Modulation of gene expression in hibernating arctic ground squirrels // Physiol. Genomics. V. 32(2). P. 170-181.

169. Young P., Ehler E., Gautel M. (2001) Obscurin, a giant sarcomeric Rho guanine nucleotide exchange factor protein involved in sarcomere assembly // J Cell. Biol. V. 154(1). P. 123-136.

170. Young P., Ferguson C., Banuelos S., Gautel M. (1998) Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin interactions lead to an asymmetrical sorting of alpha-actinins// EMBO J. V. 17. P. 1614-1624.

171. Zhegunov G.F., Mikulinsky Y.E., Kudokotseva E.V. (1988) Hyper- activation of protein synthesis in tissues of hibernating animals on arousal // Cryo-Lett. V. 9. P.r236.245.

172. Адо А.Д., Ишимова JI.M. в книге: «Патологическая физиология» (1973) // М.: Медицина, 536 с.

173. Белостоцкая Г.Б., Захаров Е.А., Клюева Н.З., Петрова Е.И., Наследов Г.А. (2008) Нарушения в работе рианодиновых рецепторов кардиомиоцитов спонтанногипертензивных крыс, выявленные с помощью 4-хлор-м-крезола // Биофизика. Т. 53. вып. 6. С. 1033-1037.

174. Бледжянц Д.А. (2009) Изменение состава легких цепей миозина миокарда при адаптационно-патологических процессах: перспективы для диагностики //. Диссертационная работа, Пущино, 114 с.

175. Бронников Г.Е. (1987) Возможные пути регуляции энергетического метаболизма у зимоспящих. Кинетический подход // В сб. «Механизмы зимней спячки», Пущино, С. 25-32.

176. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. (2003) Фосфорилирование саркомерных цитоскелетных белков — адаптационный фактор ингибирования сократительной активности мышц при зимней спячке // Биофизика, Т. 48, № 3, С. 499-504.

177. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. (2007) Структура и функции тайтина -гигантского белка скелетных и сердечных мышц: доказательства и предположения // Биофизика. Т. 52, вып. 6, С. 1030-1040.

178. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. (2008) Изоформный состав тайтина в мышцах при патологических процессах. // Биофизика. Т. 53. № 6. С. 1058-1065.

179. Жегунов Г.Ф., Микулинский Ю.Е. (1987)> Активация синтеза белка в тканях сусликов при пробуждении после зимней спячки // Украинский биохимический журнал. Т.59, №3. С. 69-73.

180. Зуйкова О.В., Осипова Д.А., Вихлянцев И.М., Малышев С.Л., Удальцов С.Н:, Подлубная З.А. (2005) Легкие цепи миозина скелетных и сердечных мышц суслика Ске11ш ипёикШэ в разные периоды зимней спячки // Биофизика. Т. 50. № 5. С. 797-802.

181. Игнатьев Д.А., Сухова Г.С., Сухов В.П. (2001) Анализ изменений частоты сердцебиений и температуры суслика СкеИиэ ипсКЛаШэ в различных физиологических состояниях // Журн. общ. биологии. Т. 62. № 1. С. 66-77.

182. Калабухов Н. И. (1985) Спячка млекопитающих // Москва, «Наука». 285 с.

183. Карманова И.Г. (1977) Эволюция сна (этапы формирования цикла бодрствование-сон в ряду позвоночных) // Л.: Наука. 174 с.

184. Карманова И.Г., Оганесян Г.А. (1994) Физиология и патология цикла бодрствование-сон. Эволюционные аспекты // СПб: Наука. 200 с.

185. Лушникова Е.Л., Непомнящих Г.И., Туманов В.П., Непомнящих Л.М., Гончар A.M. (1983) Ультраструктурный стереологический анализ кардиомиоцитов у крыс со спонтанной генетической гипертонией // Бюллют. эксперимент, биолог. № 1. С. 97-100.

186. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. (2003) Морфологическая и стереологическая характеристика ремоделирования миокарда стареющих спонтанно-гипертензивных крыс SHR // Бюллют. эксперимент, биолог, и мед. Т. 135 (2). С. 208-214.

187. Макаренко И.В., Шпагина М.Д., Вишневская З.И., Подлубная З.А. (2002) Изменение структурно-функциональных свойств цитоскелетного эластичного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии // Биофизика. Т. 47. № 4. С. 706-710.

188. Мархасин B.C., Изаков В.Я. Шумаков В.И. (1994) Физиологические основы нарушения сократительной функции миокарда// СПб.: Наука, 256 с.

189. Механизмы природных гипометаболических состояний (1991) (Сб. науч. трудов, под ред. С.Г.Колаевой) // Акад. Наук СССР Пущин, науч. центр. Ин-т биофизики клетки, 164 с.

190. Моисеев B.C. (2000) Сердечная недостаточность и достижения генетики. Достижения в изучении генома человека делают все более и более значимой оценку различных генетических аспектов при конкретных видах патологии. Consilium Mudicum. Т. 1,№4: 121-131.

191. Морман Д., Хеллер Л. (2000) Физиология сердечно-сосудистой системы // СПб Издательство: «Питер». 256 с.

192. Подлубная З.А. (1987) Минорные белки толстых нитей // В кн.: Структура и функция белков сократительных систем. // Л., Наука, 1987, С. 32-70.

193. Постникова Г. Б., Целикова С. В., Игнатьев Д. А., Колаева С. Г. (1997) Сезонные изменения содержания миоглобина в мышцах зимоспящего якутского суслика // Биохимия Т. 62. С. 167 170.

194. Слоним А.Д. (1971) Экологическая физиология животных // М. Высшая школа. 448 с.

195. Слоним А.Д. (1986) В кн.: «Эволюция терморегуляции» // Л.: Наука. 76 с.

196. Смирнов К.В. (1990) В кн.: «Пищеварение и гипокинезия» // Изд. «Медицина». 224 с.

197. Соколов В. Е., Сухов В.П., Сухова Г.С., Игнатьев Д. А. (1995) Суточные и сезонные изменения температуры и сердечного ритма длиннохвостого суслика Citellus undulates // Докл. Акад. Наук. Т. 344. С. 282-286.

198. Фрейдина Н.А. (1987) Исследование С- и F- минорных белков толстых нитей скелетных мышц кролика // Диссертационная работа. Пущино. 164 с.

199. Хочачка П., Сомеро Дж. (1988) Биохимическая адаптация // М.: Мир. 568 с.

200. Особенно благодарю всех моих друзей и коллег в Казани за моральную поддержку, сердечную преданность и то ощущение нужности, которое вы мне давали. Огромное спасибо моей семье и всем родным за тепло, понимание и принятие моих решений. Спасибо!

Информация о работе

Карадулева, Елена Валерьевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов в течение годового цикла и спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы