Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности регуляции потенциал-зависимых Са2+-токов зимоспящих животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности регуляции потенциал-зависимых Са2+-токов зимоспящих животных"



о

На правах рукописи

Панкина Дина Альфредовна

Особенности регуляции потенциал-зависимых Са2+-токов зимоспящих животных

03.00.02. Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино- 1998

Работа выполнена в научной группе регуляции ионного транспорта Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук Ю.М.Кокоз

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук В.В.Смолянинов. кандидат биологических наук Носырева Е.Д.

Ведущая организация:

Московский Государственный

Университет, Биологический

факультет, кафедра физиологии человека и животных, г.Москва.

' 1998г. в

Защита диссертации состоится

минут на заседании диссертационного совета Д200.22.01. в Институте

теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142292 г.Пущино Московской области, проспект Науки, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан'

1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Актуальность темы исследования. Зимняя спячка - один из важнейших способов испособления животных к экстремальным условиям. Это состояние характеризуется зким снижением активности центральной нервной системы, пониженным уровнем требления кислорода, уменьшением частоты сокращения сердечной мышцы, давленным термогенезом, отсутствием двигательной активности, подавлением еточной пролиферации, гиперсокращением спинальной мышцы и т. д. У зимоспящих «ушки, сурки, ежи, бурундуки) температура тела может понижаться от 37°С до 1-5°С, а стота сокращений сердечной мышцы - от 400 уд./мин. до 5-10 уд./мин. (Wang 1978; man 1982). Незимоспящие животные при понижении температуры тела до 15°С, как авило, погибают из-за фибрилляции сердца (Lyman 1959; Düker 1986). Вход в состояние зернации и выход из него согласованны на всех уровнях (субклеточном, клеточном, шевом, органном) и сопровождается драматическими измей'ениями всей системы -уляции ионного транспорта. Из всех компонент ионного транспорта в кардиоцитах 5ернантов наиболее драматические изменения в цикле спячка-бодрствование происходят ютенциал-зависимым Са2+-током (Kondo N., Shibata S., 1984; Alekseev et al.,1994). В ггоящей работе исследуются возможные причины изменений потенциал-зависимого Са2+ са у зимоспящих.

Цель работы. Поиск эндогенных регуляторов Са2+-тока пептидной природы из мозга юспящих и исследование механизма адаптации Са2+ -каналов гибернантов к гаературе. Учитывая поставленные цели, нужно было решить следующие задачи:

1 .Идентифицировать из суммарных фракций мозга гибернирующих животных гтиды, регулирующие потенциал-зависимый Ca2'-ток. Провести сравнительный анализ [ствия синтетических аналогов отобранных соединений на амплитудные и кинетические актеристики Са2+-токов.

2.Исследовать адаптацию потенциал-зависимого Са2+-тока в кардиоцитах юспящих и незимоспящих животных к длительному понижению температуры.

Научная новизна полученных результатов. К настоящему времени из фракций га зимоспящих и якутской лошади идентифицированы и получены синтетические логи 29 новых пептидов. Автор принял непосредственное участие в идентификации 18 них. Впервые patch-clamp-методом исследованы изменения кинетических и литудных характеристик Са2+-токов в изолированных кардиоцитах пойкилотермных и ойотермных животных под действием идентифицированных пептидов.

Обнаружен феномен адаптации потенциал-зависимого Са2+ тока в кардиоцитах оспящих животных к длительному понижению температуры.

Теоретическая и практическая ценность работы. Получены новые регуляторные пептиды из тканей зимоспящих животных, для некоторых из них определены зависимость эффекта от концентрации и механизм их действия на кинетическом уровне. Открыт феномен адаптации потенциал-зависимого Са2+-транспорта в изолированных кардиоцитах гибернантов к холоду.

Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ и две приняты в печать. Материалы диссертации доложены на научных конференциях в России (2) и за рубежом (2).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит /^таблиц и Уу рисунков. Список литературы содержит ДЗ наименований. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Первый раздел обзора посвящен адаптации организма к экстремальным условиям, большое внимание уделено адаптации ионного транспорта, гипотезе существования и природе "триггеров" гибернации. В следующих разделах обсуждается классификация и характеристики Са2+-токов, структура дигидропиридин-чувствительного Са2+-канала и его цАМФ-зависимой регуляция, обсуждается также действие гипотермии на сердечные клетки. Заключительный раздел посвящен достоинствам и недостаткам метода перфорированного пэтча.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Идентификация пептидов. Для идентификации изолированных пептидов из суммарно; фракции мозга использовался метод последовательного разделения первичного материала Подробно все этапы разделения описаны в работах Зиганшина и соавторов (Зиганшин и др 1994, Ziganshin et al., 1995,1996). Получение экстракта из мозга животного, еп фракционирование, определение структуры пептидов, синтез синтетических аналого] отобранных соединений проводились сотрудниками лаборатории химии пептидо] Института биоорганической химии РАН. Отбирались фракции, изменяющие потенциала зависимый Са2+ ток. Кроме отбора фракций рассматривалось влияние на Са2+ toi синтетических аналогов изолированных пептидов.

Метод выделения кардиоцитов. Изолированные кардиоциты были получены из сердец якутских сусликов (Citellus undulatus) и крыс Wistar. Суслики были отловлены е конце летних периодов 1992- 1995 и 1997 г.г. в Якутии и помещены в условия, близкие к естественным. Эксперименты проводились с декабря по март месяц и с мая по сентябрь

4

емпература тела гибернирующих животных составляла 6^7.5°С, а у активных в летний и шний период 37°С. Для получения клеток был модифицирован метод (Bendukidze Z. et :., 1985), основанный на использовании проназы в качестве протеолитического фермента, несенные в эту методику изменения позволили в значительной степени унифицировать ыделение изолированных кардиомиоцитов из животных разного вида (Alekseev A.E.et al., 994).

Для контроля качества кардиомиоцитов были привлечены методы электронной и ветовой микроскопии, регистрации внутриклеточной концентрации ионов Са2+ с спользованием флуорисцентного зонда QUEN 2-АМ, а также измерения потенциалов окоя и потенциалов действия полученных клеток. По всем измеряемым параметрам в золированных кардиоцитах существенных различий от клеток in vivo не обнаружено.

Метод перфорированного пэтча аствор ! (камерный); NaCl -80мМ, ТЭА-С1 (тетраэтиламмоний хлористый) - 20мМ, CsCl ЮмМ, КН2Р04 - 1.2мМ, MgCl2 - 5мМ, СаСЬ -2мМ, глюкоза -20мМ, - ЮмМ, рН - 7.3. аствор 2: CsCl - 130мМ, MgCl2 - 5мМ, HEPES - ЮмМ, рН - 7.3. рН доводился NaOH.

Раствор для заполнения пипеток приготовлялся на основе раствора 2 (замена ионов на Cs+ использовалась для блокирования К+-токов). Концентрация амфотерицина в ипеточном растворе составляла в среднем 160-170 мкг/мл для мембран кардиомиоцитов рысы и 200-500 мкг/мл для клеток суслика.

Для доказательства Са2+ природы полученной компоненты тока было показано, что а2+ и Na+ компоненты тока разделены по потенциалу и предполагаемый Са2+-ток увствителен к дигидропиридинам, а предположительно Na+-tok блокируется гтродотоксином ( Alekseev А.Е. et al, 1994).

Все эксперименты проводили при комнатной температуре 20-22°С. Измеряемые токи егистрировали при помощи усилителя, сделанного СКВ «Биоприбор». Для проведения кспериментов использовался пакет программ «BioQuest», разработанный Алексеевым А.Е. Кокозом Ю.М., обеспечивающий сбор данных в режиме управляемого эксперимента.

Математические методы. Для определения параметров модели Са2+-канала спользовался метод наименьших квадратов. Для аппроксимации экспериментальных эковых кривых применялся метод Флетчера-Ривса (модифицированный метод эадиентного спуска), подбор параметров производился многократно с разными ачальными значениями (которые определялись из заданного диапазона генератором пучайных чисел). Программная реализация аппроксимации экспериментальных токовых ривых приведена в Приложении.

Все средние величины представлены как среднее ± стандартартная ошибка (СС

среднего. На рисунках все вертикальные бары соответствуют СО.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Выделение 1,-типа Са2+ компоненты входящего тока.

Известно, что в кардаоцитах различных животных суммарный Са2+ ток состоит ]

нескольких компонент (ММо1е$1 I., Роиап Т., 1987). В диапозоне физиологичес!

значимьк потенциалов особую роль играют две из них: ЬиТ типа. Ниже показано, что п{

используемых в работе поддерживаемых потенциалах ( выше -60 мВ) практически в»

потенциало-зависимый Са2+ ток в кардиоцитах гибернантов относится к Ь- компоненте. 1

рис.1 приведены стандартные записи ионных токов в кардиоцитах гибернирующе]

суслика (п=7) в контроле (кривая 1), под действием 2 мкМ изопротеренола (кривая 2) и пс

действием 5мкМ нифедипина в присутстви

изопротеренола (кривая 3). Видно, что во все

диапазоне мембранных потенциалов от -40м

до +20мВ изопротеренол (2мкМ) увеличивает

несколько раз, а нифедипин (5мкМ) блокиру!

входящий ток до нуля в диапазоне мембраннь:

потенциалов, характерном для Т-типа канало

которые, в отличие от Ь-типа Са2+ -канало

обладают низкой чувствительностью

изопротеренолу и нифедипину (Ту1§а1 ]., е1 а

1988; Ва1ке СЛУ., е! а1, 1992). Учитывая, чл

аналогичные результаты были получены и ь

кардиоцитах пробудившихся животных (п=5

можно утверждать, что в кардицита

гибернантов как в активном состоянии, так

гибернирующем в условиях наши

экспериментов практически весь входящий тс

можно отнести к Ь-типу.

Рис.1. Са2* - токи в кардиоците спящег животного при различных мембранны потенциалах (Ем): 1 - контроль, 2 - после минут действия изопротеренола (2мкМ), 3 после 5 минут действия нифедипина (5мкМ) присутствии изопротеренола (2мкМ, Поддерживаемый на клетке потенциал -бОмВ

В то же время в кардиоцитах крысы в суммарном токе есть вклад Т-компоненты. Однако, амплитуда этого тока в наших экспериментах незначительна. Поэтому далее при анализе данных, полученных на клетках гибернантов, мы будем иметь ввиду Ь-компоненту Са2+ тока, а данные, полученные на кардиоцитах крысы, относятся к суммарному Са2+ току.

Изученные пептиды.

В нашей работе было изучено действие 29 пептидов. Установлено, что 13 из них обладали активностью и их можно разделить на две группы: активаторы и блокаторы Са2+ тока. Исключение составляет пептид 112-6, меняющий знак эффекта в зависимости от времени действия. Каждое из этих соединений характеризуется изменением амплитуды и кинетических параметров тока. Обычно эффект пептидов развивался на 3-5 минуте после добавления его в омывающий клетку раствор, для Ю£-13 это время составляет 7-9 минут, а действие 112-6 начиналось через минуту.

В таблице 1 показаны активные соединения, для каждого пептида указан шифр (он будет использоваться в дальнейшем для удобства обозначения пептидов), структура, из какого животного и откуда он был выделен, характер эффекта пептида на Ь-тип Са2+-тока крысы ( "-" - пептид блокирует Са2+-ток, "+" - пептид активирует Са2+-ток, "+*"-действие пептида неоднозначно), действующая концентрация пептида (указан порядок значения минимальной концентрации пептида, на которую был обнаружен эффект), величина эффекта в % ± ошибка среднего (по данным не менее 4 экспериментов).

Таблица 1.

N Шифр пегтгада Животное Орга н Аминокислотная последовательность пептида Действие на Саи-ток Действующая конценграцияГ ЩМ1 Максимальный эффект на Са2*-ток, %

ВЭ суслик мозг БУ + -5 53±16

ВЬ-3 суслик мозг + -5 17±7

1*2-6 суслик мозг мают -6 30±9

суслик мозг ЬУУУР\VTQRF + -5 /7±5

№СТ суслик мозг Т5КУК - -5 8±3

кг-5 суслик мозг ТЭКУ - -6 32±8

К2-3 суслик мозг ЕТОН - -6 27±6

1*2-8 лошадь мозг АУН1,РШЖГРА\,НА51Л5 К - -5 59±10

1*2-20 суслик мозг структура не публикуется - -6 22±7

0 м-п лошадь мозг Р1,ОРРТТКТУРР1Ш31. - -6 35±6

1 1*2-13-12 производное 112-13 рГтктуррНрЕ)Ь_а - -5 №6

2 117-13-10 производное 112-13 - ткттершпь-а - -5 26±5

3 М-13-8 производное 112-13 - Т\ТРНРШ,-а - -5 27±7

Разделение экстракта мозга хладоадаптированнон якутской лошади до получения пептида 112-13.

Последовательное разделение фракций можно проследить на примере получения пептида РЬСРРТТКТУРРНРОЬ (112-13). Этот пептид был выделен из мозга хладоадаптированной якутской лошади.

Рис.2. Схема разделения суммарной фракции из мозга хладоадаптированной якутской лошади до получения активного соединения. Объяснения в тексте.

Якутская лошадь (генотипически хладоадаптированное домашнее животное) -уникальная порода лошадей, выведенная методом народной селекции, она круглый год выпасается на пастбищах и в холодный период впадает в состояние, сходное с состоянием оцепенения: перестает двигаться, есть, у нее снижается потребление кислорода и т.д. (Ахременко и др., 1991). На рис.2 показана схема разделения суммарной фракции НХ из мозга хладоадаптированной якутской лошади до получения активного пептида РЬОРРТТКТУТРНРОЬ (112-13). Суммарная фракция 1-10кД приводила к обратимому падению Са2+ -тока на 25±10% (НХ, 100мкг/мл). Она была разделена на 8 фракций НХ-1 -НХ-8, из которых выраженной активностью обладали НХ-4 (блокирование на 34±12%), НХ-5 (блокирование на 24±8%), НХ-8 (активация на 21±8%). Наибольший эффект имело действие фракции НХ-4. Эта фракция была разделена на пять фракций: НХ-41 - НХ-45, из которых НХ-45 блокировал Са2+-токи крыс на 40±12%, НХ-43 блокировал Са2+-токи крыс

8

а 20±5%, НХ-44 - на 15±7%. Обладающая наибольшей блокирующей активностью НХ-45 ыла разделена на три фракции: НХ-451 - НХ-453.

Активность фракции НХ-451 на Са2+-ток обнаружить не удалось. Из фракции НХ-452 ^локирование Са^-тока 20±8%) бьшо получено два пептида: УСЗКУУАОУАКАЬАНКУН ^2-12), который не обладал активностью на Са2+-транспорт, и РЬСРРТТКТУРРНРОР *2-13), который блокировал Са2+-токи на 35±6%. Из НХ-453 (блокирование Са2+-тока 40±9%) бьшо получено три пептида.

Аминокислотная последовательность этих пептидов показана на рис.3, она совпадает последовательностью ос-цепи гемоглобина 33-47, 33-50, 33-59. Поскольку фракции НХ-52 и НХ-453 содержат пептид 117-13, но оказывают на Са2+-транспорт различный по еличине эффект, то можно предположить, что больший эффект оказывают пептиды с минокислотнай последовательностью 33-47 и 33-59. Для определения структуры, грающей решающую роль в активности пептида в диссертации прослежена зависимость ффекта 112-13 при последовательном отщеплении аминокислот с N -конца. Из пептидов -роизводных 112-13 (1*2-13-14(ОРРТТКТУРРШта.), 112-13-12 (РТТКТУРРНРБЬ), 1*2-130 (ТКЛТРРНРОЬ), Я2-13-8 (ТУРРНРОЬ), 13-7 (УРРНИЭЬ), 112-13-6 (РРНРШ.), Я2-13-5 РИТО,)) наибольшей активностью обладали 1*2-13-8 (27±7%) и К2-13-10 (26±5%) :м.рис.4).

33 4 7 50 59

.рьсррттктуррнроьзнсзАдукАна

Рис.3. Аминокислотная последовательность пептидов, полученных из фракции НХ-453.

Рис.4. Сравнительная гистограмма действия ЛХ-13 и его производных.

Зависимость эффекта пептидов от концентрации. Стехиометрия взаимодействия |ептидов с центрами связывания.

Зависимость эффекта пептидов на Са2+-ток от концентрации описывается моделью ^оперативного взаимодействия лиганд-мишень (уравнение Хилла (1)). В работе [риведены доза-зависимость для трех пептидов: ВЭ, 112-13,112-20.

9

4*0" «о

"'♦КГ

где кт - максимальный эффект в %, п - константа Хилла, указывающая на кооперативность взаимодействия лиганда с мишенью, к<| - константа диссоциации в мМ. Одна из полученных кривых приведена на рис.5

Рис. 5 Концентрационная зависимостх действия ¡12-13 на токи кардиоцито< крыс, построенная по результатам, четырех экспериментов. Непрерывна! кривая построена по результатам подгонкг экспериментальных данных уравнениел Хилла (1).

Таблица2. Параметры,

определенные по результатам подгонки экспериментачьных данных действия пептидов на Са2*-токь кардиоцитов крысы уравнением Хилла.

Параметры, определенные в результате аппроксимации экспериментальных данных уравнением Хилла, приведены в таблице 2. В уравнении (1) параметр П характеризует кооперативность взаимодействия пептидов с мишенью. Для В5 и 112-13 соотношение числа молекул пептида к числу связывающих центров на мембране кардиоцитов составляет 3:2, а для ВХ-20 эта величина 5:2.

Определение изменений кинетических характеристик Са2+-тока под действием пептидов.

В рамках классического формализма Ходакина-Хаксли (см. раздел "Описание модели.") исследовались изменения кинетических характеристик Са2+-тока под действием пептидов ВБ, и И-б. В качестве базовой модели использовалась модель описанная нами ранее (А1екзееу а! а1. 1996, Алексеев А.Е.и др., 1997), в которой было показано, что лучшее совпадение теоретических и экспериментальных данных наблюдается, если в описании Са2+-тока использовать одну переменную активациии и две переменных инактивации: быструю и медленную. Дипептид ВБ незначительно изменяет кинетику аетивации и медленной инактивации и в большей степени кинетику быстрой инактивации (рис 6).

Пептид к^ мкМ к.,% п

ВБ 80 +87 1.5

1^-13 11 -35 1.7

20 23 -22 2.5

-20 0 20 40 Мембранный потенциал, мВ

Рис.6 (слева) Стационарные нормализованные проводимости,

рассчитанные подгонкой Са2*-токов кардиоцита суслика в контроле (окрашенные кружки) и под действием 20мкМ ¡12-5 (неокрашенные квадраты) уравнением (3).

Рис.7 (внизу) Стационарные нормализованные проводимости,

рассчитанные подгонкой Са2*-токов кардиоцита крысы в контроле (окрашенные кружки) и под действием А -50мкМ ВБ (неокрашенные квадраты), Б -25мкМ 112-6уравнением (3).

1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 к

Мембранный потенциал, мВ

Мембранный потенциал, мВ

Действие пептида 112-5 в значительной степени сказывается на кинетике активации, в то время как медленная и быстрая инактивация не претерпевают изменений (рис7А). Действие пептида несколько изменяет кинетику активации и в значительной степени сказывается на медленной инактивации, в то время как быстрая инактивация не претерпевает изменений (рис. 7Б). Известно, что Са2+ токи регулируются процессами фосфорилирования -дефосфорилирования. Как правило, эти изменения сказываются на параметрах активации и инактивации токов. Поэтому не исключено, что действие пептидов В5 и 1^-6, может быть связано с фосфорилированием (ВБ) и дефосфорилированием (К2-6) Са2+-каналов. Влияние пептида Я2-5 на кинетические характеристики Са2+-тока специфично: он действует лишь на параметры активации каналов, что на наш взгляд, представляет определенный интерес для фармакологии.

Холодовая адаптация Са2+ тока в кардиоцитах крысы и суслика.

Известно, что в регуляции цикла спячка-бодрствование существенную роль играют

как эндогенные, так и внешние физические факторы. Мы полагаем, что оба типа факторов оказывают существенное влияние на изменение потенциал-зависимого Са2+ транспорта в кардиоцитах и нейронах зимоспящих животных. Регуляция эндогенными пептидами

рассматривалась в первой части работы. Во второй части мы исследуем роль температуры- одного из важных внешних факторов. Предпосылками для проведенной работы был установленный ранее феномен длительного сохранения (несколько дней) препаратов зимоспящих животных в условиях пониженной температуры (Ве10и50Уе1 а1., 1990).

Рис.8. Вольтамперные характеристики Са2*-тока кардиоцитое А - крысы (по данным 10 экспериментов для каждой кривой) , Б -активного (по данным 7 экспериментов для каждой кривой) и В - спящего суслика (по данным 8 экспериментов для каждой кривой) до (окрашенные кружки) и после 24-часовой холодовой адаптации (незаполненные

прямоугольники). Поддерживаемый на клетке потенциал -60 мВ.

40 -20 0 20 40 60

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

Изолированные кардиоциты в специальных чашках Петри (дно этих чашек было проницаемо для кислорода, чтобы исключить гипоксию) помещались в холодильник при температуре +5°С на 20-24 часа. Затем они постепенно в течение 2-3 часов разогревались при комнатной температуре до +18 - +20°С. Специальные тесты показали, что клетки сохраняют морфологию, способность к сокращению, способность генерировать потенциал действия и регистрируемые от них Са2+-токи регулируются стандартными агонистами (изопротеренол) и антагонистами (нифедипин). На рис. 8 показаны усредненные вольтамперные характеристики Са2+-тока в изолированных кардиоцитах крысы и суслика в двух состояниях - активном и гибернирующем до и после 24-часовой холодовой адаптации. Видно, что Са2+-ток в кардиоцитах суслика как в состоянии гибернации, так и в активном состоянии, после адаптации к холоду падает. В клетках крысы этого эффекта нет. Поскольку, одной из главных причин гибели кардиоцитов и нейронов теплокровных животных является Са2+ перегрузка, то полученный результат, по-крайней мере частично, объясняет феномен длительного сохранения ткани зимоспящих при пониженных температурах.

Для выяснения механизмов адаптации ионного транспорта зимоспящих к холоду проведем амплитудный и кинетический анализ Са2+-тока зимоспящих и незимоспящих животных. Для анализа амплитудных характеристик воспользуемся уравнением Маркварда-Нилиуса (2) (Магкл>агс11, Б., №Нш, В. 1988). В таблице 3 представлены результаты приближения вольтамперных кривых (рис.8) теоретической кривой:

I = а2)-[\ + ехр{(а3 - Е)1 а(}]\ (2)

где / - ток, Е - потенциал мембраны, а; - проводимость, определенная по наклону правой ветви вольтамперной кривой, - кажущийся реверсивный потенциал для ионов Са2+, аз - потенциал полумаксимальной активации, а* - параметр наклона активационной (левой) ветви вольтамперной кривой.

Таблица 3.

Параметры функции (2) до холодовой адаптации после холодовой адаптации

крыса Суслик актив ный Суслик гибернирующий крыса Суслик активный суслик гибернирующий

а,(нС) 9.0 ± 1.0 5.6 ± 3.8 6.4 ± 1.4 7.3 ± 0.8 2.4 ± 0.8 4.0 ± 1.5

а,(мВ) 94.9 ±4.3 87.1 ± 3.9 70.2 ± 4.2 90.3 ± 2.3 89.3 ±10.4 81.4 ±9.9

а3(мВ) 1.7 ± 5.7 -15.4 ±4.7 5.5 ± 6.5 1.6 ±1.8 -5.5 ± 3.1 9.2 ± 6.5

а4(мВ) 9.7 ± 1.7 7.2 ± 0.2 11.2 ± 1.2 9.6 ±0.3 9.3 ±1.0 11.8 ±2.1

Из таблицы 3 видно, что если у крыс и гибернирующих сусликов холодовая адаптация не приводит к достоверному изменению параметров функции (2), то у активных

сусликов имеет место увеличение потенциала полумаксимальной активации (üj) и параметра наклона активационной ветви вольтамперной кривой (аД Недостоверность различия по параметрам as и а4 для гибернирующих сусликов позволяет заключить, что потенциал достижения максимумов токов в клетках до и после холодовой адаптации, по всей видимости, не изменяется и составляет ¡=20 мВ. У активных животных происходит увеличение потенциала достижения максимумов токов с «5мВ (до холодовой адаптации) до «20мВ (после холодовой адаптации). Из равенства параметров a¡ следует, что в условиях наших экспериментов при одинаковой внешней температуре внутриклеточная концентрация несвязанных ионов Са2+ для крыс, активных и гибернирующих сусликов до и после холодовой адаптации не изменяется.

Для определения кинетических параметров была использована построенная нами ранее математическая модель потенциал-зависимых Са2+ каналов (Алексеев и др. 1997). Проанализированы Са2+-токи в кардиоцитах крыс до (3 эксперимента) и после (3 эксперимента) холодовой адаптации клеток, активных сусликов ( соответственно 3 и 4 эксперимента) и гибернирующих сусликов ( соответственно 4 и 6 экспериментов).

Описание модели. В основу выбранной модели Са2+-канала положен формализм Ходжкина-Хаксли, в форме, для которой было показано, что она удовлетворительно описывает Са2+-токи кардиоцитов гибернантов (суслик) и негибернантов (крыса). Согласно этой модели ток представляется в виде:

I = ga-(E- ECJ- fa - (</„ - О ■ е-"" У ■ П к - а» - L) ■ ]"'. 0)

i = 1,2

Индексы 1 и 2 относятся к соответственно первой и второй токовым инактивационным компонентам. Здесь do, fio и f2o - стационарные значения активационной, первой - медленной и второй - быстрой инактивационных токовых компонент при поддерживаемом потенциале соответственно. Поскольку порог активации Са2+ каналов находится при более положительных, чем поддерживаемый, потенциалах, значения этих параметров выбираются предельными (do=0, fio=f2o=l)- 4«(Е), fi«(E), f2«(E) -стационарные нормализованные проводимости соответственно активации и обеих инактиваций, а та(Е), тп(Е), тп(Е) - характерные времена этих компонент проводимости.

Указанные шесть параметров (4»(Е), fi«(E), f2»(E), Td(E), тп(Е), т0(Е)) подбирались таким образом, чтобы решение уравнения (3) наилучшим образом описывало экспериментальные кривые развития Са2+-тока во времени. Параметр gca определялся для каждого эксперимента наилучшим приближением методом наименьших квадратов соответствующей вольт-амперной кривой соотношением (2). Таким образом были

14

вычислены ¿„(Е), ^„(Е), тЛ то для Са +-каналов кардиоцитов активных и

гибернируюших животных до и после холодовой адаптации а также крыс. Кривые, характеризующие стационарные значения активации и обеих инактиваций, хорошо описывались уравнением Больцмана:

= + (4)

Для построения кинетических параметров Са2+-каналов уравнение (3) удобнее переписать в дифференциальной форме:

; = 1,2

где связь констант а и (3 с известными параметрами определяется как

fm

(6)

А=-

i = 1,2

Рис.9 Схема активации Ca"* - канала

В терминах открытия и закрытия активационных и инактивационных ворот параметры aj,

an, an, и ßd, ßn, ßfz имеют смысл констант скоростей, соответственно открытия и закрытия активационных, инактивационных медленного типа и инактивационных быстрого типа ворот. Если учесть принятые для т, Пь пг значения, то канал условно полагается имеющим 2 активационных , 2 инактивационных медленного типа и 1 инактивационные быстрого типа ворота и схемы его активации и инактивации можно представить следующим образом (для активации -рисунок 9): где dcc, dco, d™, d°° -это состояния канала, в которых соответственно двое активационных ворот закрыты, одни ворота закрыты, другие - открыты, двое ворот открыты. Аналогично выглядит кинетическая схема для медленной инактивации с той лишь разницей, что состоянию dcc будет соответствовать ficc, состояниям dco, doc -

fCO j? ОС jOO л OO

i , fi , а состоянию d - состояние f| Для быстрой инактивации:

fi ,

an

(7)

г

Кинетика активации.

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный шпени и :1л, мВ

-20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

■2 0 0 20 40 Мембранный потенциал, мВ

1.0 0.6 0.6

)

0.4 0.2 0.0

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

-20 0 20 40 Мембранный потенциал, мВ

Рис.10. - Усредненные стационарные характеристики активации (слева) и усредненные характерные времена активации (справа) Са2*-тока: А - крысы, Б - активного суслика,В - гибернирующего суслика до - окрашенные кружки и после 24-часовой холодовоь адаптации - незаполненные прямоугольники. Непрерывные кривые построены по результатам подгонки данных уравнением (3). Параметры, полученные в результате аппроксимации, приведены в таблице 4.

На рис.10 приведены усредненные стационарные характеристики активации и усредненные характерные времена активации Са2+-тока для крысы, активного суслика и гибернирующего суслика соответственно.

В таблице 4 представлены Еа*® - потенциал, при котором стационарное значение аиивации достигает своего половинного значения параметр, характеризующий крутизну кривой, (см.

уравнение 4) Из представленных в таблице и ш рисунках данных следует, что стационарные характеристики аиивации крыс и гибернирующих жнвотных до и после холодовой адаптации достоверно не различаются, однако стационарные характеристики акшвации активных сусликов претерпевают после холодовой адаптации значительные изменения. Холодовая адаптация сдвигает кривую аетивации Са2+-тока активных сусликов в сторону деполяризащш приблгоиггельно на 10мВ, 1фупши криюй акшвации при этом достоверно не изменяется.

Таблица 4.

крыса активные суслики гибернирующие суслики

до холодовой адаптации после холодовой адаптации до холодовой адаптации после холодовой адаптации до холодовой адаптации после холодовой адаптации

Е„"'5,МВ -7.29 ± 0.64 -4.49 ± 2.48 -22.64 ± 5.33 -9.79 + 5,02 -0.92 ± 1.29 0.92 ± 1.39

к,!, мВ 12.67 ±0.95 13.30 + 0.82 15.18 ± 0.82 13.80 ± 1.15 12.36 ±0.81 13.81 ± 0.58

Как видно из таблицы 4, кривая активации гибернирующих сусликов сдвинута относительно кривой акптации активных сусликов в сторону деполяризации. Известно также, что параметры нормализованной проводимости активации Са2+-тока кардиошпов гибершфутощих сусликов сдвинуты относительно параметров спонтанно пробудившихся сусликов в сторону деполяризации (Аккэееу а! а1. 1996). Таким йбразом, холодовая адаптация клеток активных сусликов приводит к сдвигу кривой акшвации в сторону, характерную для гибернирующего состояния.

Кривые зависимостей скоростей прямого и обратного перехода для скоростей о^(Е) и Р<|(Е) эт потенциала, рассчитанные из соотношений (6) дня крыс, активных сусликов и гибернирующих :усликов имеют наклоны разного знака. Достоверное различие в константах скоростей активации Са2+-тока до и после холодовой адаптации как для крыс, так для активных и гибернирующих :услНков не обнаружено.

Таблица 5.

«Л мс"1 РЛмс"1 гл

крысы 0.126 + 0.018 0.043 ±0.019 2.64 ± 0.38

крысы после холодовой адаптации 0.099 ± 0. 024 0.0650 ± 0.0062 1.94 ± 0.08

активные суслики 0.155 ± 0.027 0.035 ±0.011 1.48 ± 0.08

активные суслики после холодовой адаптации 0.159 ± 0,032 0.068 ± 0.030 1.65 ±0.12

гибернирующие суслики 0.108 ± 0.010 0.104 ±0,018 2.02 ±0.10

гибернирующие суслики после холодовой адаптации 0.095 ± 0.007 0.100 ±0,007 1.83 ±0.11

В таблице 5 представлены а/, (З^0 - константы при Е=0мВ и эффективная валентность штивационного воротного заряда - для крыс, активных сусликов и гибернирующих ;усликов до и после холодовой адаптации, рассчитанные при помощи подгонки усредненных данных (рис.10) уравнением (8).

' Р'Е

где г<| - эффективная валентность активадионного воротного заряда, Б - постоянная Фарадея, Я - универсальная газовая постоянная, Т - термодинамическая температура.

Согласно кинетической схеме (рис.9) предполагается наличие двух активационных ворот, следовательно эффективная величина воротного заряда в два раза больше. Суммарный эффективный заряд переносимый воротными субъединицами при активации Са2+-канала крыс до и после холодовой адаптации составляет соответственно «5 и «4, то есть после действия холода уменьшается на «1. Суммарный эффективный заряд, переносимый воротными субъединицами при активации Са2+-канала ъ& активных и гибернирующих сусликов до и после холодовой адаптации, не изменяется и составляет соответственно «3 и =4. Таким образом, нужно отметить, что холодовая адаптация не влияет на величину эффективного активационного заряда зимоспящих животных. Как было показано ранее (А1ск5ссу А.Е. е1 а1, 1996) и как следует из таблицы 5, при изменении физиологического состояния животного от активного к гибернирующему, происходит увеличение эффективного активационного заряда примерно на 1. Но поскольку холодовая адаптация не влияет на величину эффективного активационного заряда Са2+-канала изолированного кардиоцита активных сусликов, то, следовательно, действие холода не объясняет изменений, происходящих с величиной при переходе из активного состояния в гибернирующее и наоборот. По-видимому, изменение величины эффективного воротного заряда активации у зимоспящих определяется не холодом, а другими, возможно эндогенными факторами.

Медленная инактивация.

Медленная инактивация определяет Са2+-токи на поздних стадиях их развития и характеризуется высокими характерными временами и низкими скоростями переходов ап(Е) и Рп(Е). Она является смешанным процессом, обусловленным воротным механизмом и ток-зависимой инактивацией. На рис.11 приведены усредненные стационарные характеристики медленной инактивации и усредненные характерные времена медленной инактивации для крыс, активных и гибернирующих сусликов до и после холодовой адаптации. В таблице 6 приведены значения параметров Ец 0,5 и кд для гибернирующих животных до и после холодовой адаптации, вычисленные, как показано выше, по усредненным стационарным характеристикам медленной инактивации. Из таблицы 6 и

представленных на рис.11 данных следует, что стационарные характеристики медленной инактивации крыс и гибернирующих животных до и после холодовой адаптации достоверно различаются лишь вблизи мембранного потенциала, равного -20мВ.

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

1.0

0.0 _ое

04 02 0.0

200 160 100 50

о

-20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

В

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

'ис.11. - Усредненные стационарные характеристики медленной инактивации (слева) и 'средненные характерные времена активации (справа) Са2*-тока: А - крысы, Б -гктивного суслика, В - гибернирующего суслика до - окрашенные кружки и после 24-асовой холодовой адаптации - незаполненные прямоугольники. Непрерывные кривые ьвстроены по результатам подгонки данных уравнением (3). Параметры, полученные в >езультате аппроксимации, приведены в таблице 6.

Холодовая адаптация незначительно сдвигает кривую медленной инактивации крыс и

ибернирующих сусликов в сторону деполяризации на =бмВ. Крутизна кривой медленной

[нактивации крыс и гибернирующих сусликов после холодовой адаптации не изменяется,

19

однако у активных сусликов кп претерпевает значительные изменения: имеет место значительный рост крутизны кривой медленной инактивации. Таким образом, холодовая адаптация клеток активных сусликов приводит к изменению параметра крутизны кривой кп, характерному при переходе из активного состояния в гибернирующее, однако этого не происходит с параметром Еп °'5.

Таблица 6.

крыса активные суслики гибернирующие суслики

до после до холодовой после до холодовой после

холодовой холодовой адаптации холодовой адаптации холодовой

адаптации адаптации адаптации адаптации

мВ -24.46 ± 2.01 -18.65 ± 2.14 -27.38 ± 6.02 -20.31 ± 4.09 -8.87 ± 2.82 -3.48 ±1.79

кп, мВ -17.74 ± 1.53 -16.70 ± 3.26 -23.88 ±3.15 -12.58 ± 2.28 -14.97 ± 1.04 -15.09 ± 1.68

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

0 010

-40 -20 0 20 40 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 Мембранный потенциал, мВ

0 02

В

S 0005

-40 -20 0 20 40 -40 -20 0 20 40

Мембранный потенциал, мВ Мембранный потенциал, мВ

Рис.12. Константы скоростей прямого и обратного переходов для кинетической схемы (аналогично рис.9): А - крысы, Б - активного суслика, В - гибернирующего суслика до -окрашенные кружки и после 24-часовой холодовой адаптации - незаполненные прямоугольники. Непрерывные кривые построены по результатам подгонки данных уравнениями (6).

Характер зависимости сеп(Е) и Рп(Е) от мембранного потенциала после холодовой даптации не изменяется у гибернирующих животных. Для крыс и активных сусликов дело >бстоит иначе. Зависимости ап(Е) до и после холодовой адаптации у крысы практически »впадают, а у активного суслика действие холода уменьшает скорость перехода ап(Е) фиблизительно в два раза при мембранных потенциалах выше ОмВ. Под действием :олода меняется знак наклона зависимости скорости обратного перехода рп от потенциала :ак для крыс, так и для активных сусликов; как для первых, так и для вторых имеет место ■екоторое уменьшение скорости обратного перехода Рп (см.рис.12). Ранее (А1екзееу а1 а1., 996) было обнаружено, что изопротеренол (агонист Р-адренэргических рецепторов, 'величивающий Са2+ ток за счет увеличения доли фосфориллированных каналов) -[зменяет знак наклона зависимости скорости обратного перехода Рп от потенциала.

Обратный действию изопротеренола эффект получен нами после холодовой даптации клеток крыс и активных сусликов. Это позволяет предположить, что холодовая даптация изолированных кардиоцитов крыс и активных сусликов приводит к снижению тела фосфориллированных каналов.

Параметр эффективной валентности инактивационного воротного заряда, 1ереносимого воротными субъединицами Са2+-канала при медленной инактивации несчитанная по соотношению (8), для гибернирующих сусликов и крыс до и после :олодовой адаптации достоверно не различается и составляет -1.47±0.13 и -1.62+0.08 «ответственно для гибернирующих сусликов -1.66±0.14 и -1.46+0.07 соответственно для :рыс. У активных сусликов соответствующие значения -0.98±0.05 до и -1.82±0.07 после юлодовой адаптации, то есть действие холода приближает значение параметра ктивных сусликов к значению для гибернирующих сусликов.

Быстрая инактивация.

На рис.13 изображены усредненные стационарные характеристики быстрой

гнактивации и усредненные характерные времена быстрой инактивации для крыс,

ктивных и гибернирующих сусликов до и после холодовой адаптации. В таблице 7

[риведены значения параметров Ее0,5 и кп для крыс, активных и гибернирующих сусликов

Ю и после холодовой адаптации, вычисленные по усредненным стационарным

:арактеристикам быстрой инактивации. Из таблицы 7 и представленных на рис.13 данных

ледует, что стационарные характеристики быстрой инактивации под действием холода

начительно модифицируются у зимоспящих животных и практически не изменяются у

рыс. Параметр кп не изменяется у крыс и сдвигается после действия холода в сторону

[еполяризации примерно на ЮмВ у активных сусликов. У гибернирующих животных

21

холод достоверно сдвигает Еп 0,5 и кс в сторону деполяризации приблизительно на 10м1 Усредненные характерные времена быстрой инактивации Са2+-тока крысы до и после 24 часовой холодовой адаптации не различаются, в отличие от зимоспящих, у которы действие холода приводит к падению этого параметра приблизительно в два раза в облает -20мВ у активных сусликов и росту в области мембранных потенциалов ОмВ гибернирующих.

1.0 о.а 0.6 0.4 0.2 0.0

1.0 0.0 а 06

0.4

0.2 0.0

■40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

В

-40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

2,-

-20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ

Рис.13. - Усредненные стационарные характеристики быстрой инактивации (слева) и усредненные характерные времена активации (справа) Са-тока: А - крысы, Б -активного суслика, В - гибернирующего суслика до - окрашенные кружки и после 24-часовой холодовой адаптации - незаполненные прямоугольники. Непрерывные кривые построены по результатам подгонки данных уравнением (3). Параметры, полученные в результате аппроксимации, приведены в таблице 7.

Таблица 7.

крыса активные суслики гибернирующие суслики

до после до холодовой после до после

холодовой холодовой адаптации холодовой холодовой холодовой

адаптации адаптации адаптации адаптации адаптации

Еп0-5, мВ 20.54 ± 11.03 -2.61 ± 14.82 8.72 ± 9.37 10.56 ± 7.09 10.913.66 20.89 ± 1.28

кгс, мВ -21.08 ± 1.66 -23.54 ± 0.56 -26.11 ±2.65 -17.67 ± 4.59 -25.25± 0.66 -16.29 ± 1.22

Характер зависимости ап от мембранного потенциала после холодовой адаптации не изменяется у крыс, активных и гнбернирующих сусликов, Рд(Е) и после действия холода претерпевает изменения лишь у гнбернирующих сусликов. У последних возрастает крутизна зависимости Рп(Е) от мембранного потенциала.

Кокоз Ю.М и др. в 1997г., основываясь на нечувствительности быстрой инактивации к нифедипину, чувствительности к изопротеренолу, а также принимая во внимание аномальную зависимость от потенциала ап и Ро, сделали следующий вывод: процесс быстрой инактивации нельзя представить как простой одностадийный конформационный переход, связанный с переносом воротного заряда, кинетика быстрой инактивации в основном определяется цАМФ зависимым фосфорилированием. После холодовой адаптации клеток у зимоспящих животных, в отличие от незимоспящих, быстрая инактивация претерпевает значительные сходные изменения нормализованной проводимости и характерных времен. Таким образом, одно из возможных объяснений полученных результатов регуляции Са2+-транспорта у гнбернантов при понижении температуры - адаптация Са2+-транспорта к низким температурам за счет модификации цАМФ-зависимого фосфорилирования.

ВЫВОДЫ.

I. Исследование роли эндогенных факторов в цикле спячка-бодрствование в регуляции потенциал-зависимого кальциевого тока.

1. Показано, что регистрируемый кальциевый ток у зимоспящих животных относится к току, протекающему через Ь-тип кальциевых каналов.

2. С использованием метода перфорированного пэтча путем последовательного разделения суммарных фракций из мозга гибернирующего суслика и хладоадаптированной якутской лошади совместно с сотрудниками лаборатории пептидов Института биоорганической химии РАН идентифицировано более 29 новых пептидов - претендентов на участие в регуляции цикла спячка-бодрствование. Из них пептиды БУ, УОК, ЬУУУР\УТд11Р - активаторы потенциал-зависимого Са2+-тока, Т5КУЯ, ЕУБН, ТЭКУ,

23

АУН1ЛЧЧОРТРАУНА8ЬОК, ЕЬОПЧТК.ТУКРШ'ОЦ Я'1-20 (структура патентуется) -блокаторы. Пептид М01ШТ оказывал на потенциал-зависимый Са2+-ток двойственный эффект: и как активатор, и как блокатор.

3. Прослежено изменение активности пептида РЬОРРТТКТУРРНРОЬ и его производных , полученных последовательным отщеплением аминокислот с К- конца.

4. Получены и проанализированы концентрационные зависимости действия пептидов О У, НЛЗРРТТКТУРРНРОЦ 512-20 (структура патентуется) на потенциал-зависимый кальциевый ток в кардиоцитах зимоспящих и незимоспящих животных. Показано, что для БУ и РЬОРРТТКТУРРНРБЬ соотношение числа молекул пептида к числу связьшающих центров на мембране кардиоцитов составляет 3:2, а для 152-20 (структура патентуется) эта величина соответственно 5:2.

5. Анализ влияния пептидов на кинетические характеристики потенциал-зависимого Са2+-тока показал, что влияние пептида 112-5 на кинетические характеристики Са2+-тока специфично: он действует лишь на параметры активации каналов, в то время как пептиды ВЭ 112-6 преимущественно влияют на кинетику активации и быстрой инактивации.

И. Исследование роли температуры в регуляции потенциал-зависимого кальциевого тока у зимоспящих.

1. Показано, что адаптация к холоду на уровне изолированных клеток у зимоспящих животных в отличие от незимоспящих проявляется в том, что кальциевые токи после холодовой адаптации длительное время (3-6 часов) остаются меньшими, чем до адаптации клеток к холоду.

2. Показано, что под действием холодовой адаптации у кардиоцитов крыс не происходит значительных изменений кинетических параметров Са2+-токов. Обнаружено изменение суммарного эффективного заряда, переносимого воротными субъединицами при активации Са2+-канала, с «¡5 до »4 после холодовой адаптации, изменение знака наклона зависимости скорости обратного перехода медленной инактивации от потенциала.

3. После холодовой адаптации в кардиоцитах активного суслика кинетические характеристики Са2+-транспорта сдвигаются в сторону значений, характерных для гибернирующих сусликов (сдвиг кривой активации, сдвиг крутизны кривой медленной инактивации, изменение знака наклона зависимости скорости обратного перехода медленной инактивации от потенциала, изменение эффективного воротного заряда медленной инактивации).

4. Показано, что холодовая адаптация не влияет на величину эффективного активационного заряда зимоспящих.

5. Подавление тока после холодовой адаптации у зимоспящих животных вызвано начительной модификацией кинетики быстрой инактивации.

6. Общим действием холодовой адаптации на кинетические параметры Са2*-токов гардиоцнтов крыс и активных сусликов является изменение знака наклона зависимости жорости обратного перехода медленной инактивации от потенциала на характерный для ибернирутощих животных.

Научные публикации по теме диссертации:

1. Alekseev А.Е., Korystova A.F., Malyutova D.A*., KokozY.M. Potential-dependent Ca2+ ;urrents in isolated heart cells of hibemators. Biochemistry and molecular biology international. 1994, v33,No2, 365-376.

2. Ziganshin R.H., Mikhaleva I.I., Ivanov V.T., Kokoz Y.M., Alekseev A.E., KorystOva A.F., Mavlutova D.A., Emelyanova T.G., Akhremenko A.K. Biologically active peptides isolated from brains of hibernating graund squirrel and cold adapted yakutian horse. Peptides: Chemistry, Structure and Biology, ESCOM, Leiden, 1995, 244-245.

3. Ziganshin R.H., Mikhaleva I.I, Ivanov V.T., Kokoz Y.M., Korystova A.F., Mavlyutova D.A., Emelyanova T.G. Biologically active peptides isolated from the brain of hibernating ground squirrels and cold adapted Yakutian horses. Adaptations to the cold: Tenth International Hibernation Symposium, 1996, Armidale.

4. Ziganshin R.H., Mikhaleva I.I., Ivanov V.T., Kokoz Y.M., Korystova A.F., Mavlutova D.A., Emelyanova T.G. Biologically active peptides isolated from brains of hibernating graund squirrel and cold adapted yakutian horse. In: Living in the cold, 1996, 373-378.

5. Ланкина Д.А. Действие холодовой адаптации на L-тшт Са2+-тока изолированных сердечных клеток незимоспящего и зимоспящего животного. Сборник научных трудов. Городская конференция молодых ученых, Пущино, 1996, 37-40.

6. Kokoz Y.M., Zenchenko, K.I., Alekseev А.А., Korystova A.F., Lankina D.A., Ziganshin R.H.,. Mikhaleva I.I,. Ivanov V.T, The effect of some peptides from the the hibernating brain on Ca current in cardiac cells and on the activity of septal neurons. FEBS Letters 1997,411, 71-76.

7. Алексеев A.E., Маркевич Н.И., Корыстова А.Ф., Ланкина. Д.А., Кокоз Ю.М. Кинетические характеристики кальциевых каналов L-типа в кардиоцитах зимоспящих животных. I. Вывод кинетической модели. Биологические мембраны, 1997, 14, 1, 29-40.

8. Кокоз Ю.М., Маркевич Н.И., Корыстова А.Ф., Ланкина. Д.А., Алексеев А.Е. Кинетические характеристики кальциевых каналов L-типа в кардиоцитах зимоспящих животных. II. Анализ кинетической модели. Биологические мембраны, 1997, 14, 2, 174-183.

Мавлютова - девичья фамилия диссертанта.

Научное издание

Автореферат Ланкиной Д.А.

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции OK-OOS—93, том 2; 953000 - книги и брошюры

15.10.98 г. 3. 8142Р. Т. 100 экз. Усл. печ. л. 1,5. Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации ИФПБ РАН 142292, г.Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ИФПБ РАН.