Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция Ca2+ токов L-типа L-аргинином через активацию α2-адренорецепторов в изолированных желудочковых кардиомиоцитах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция Ca2+ токов L-типа L-аргинином через активацию α2-адренорецепторов в изолированных желудочковых кардиомиоцитах"

Ненов Мирослав Николаевич

Регуляция Са2+ токов Ь-типа Ь-аргинином через активацию аг-адренорецепторов в изолированных желудочковых кардиомиоцитах

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

ПУЩИНО-2009

Работа выполнена в Секторе регуляции ионных каналов Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г.Пущино, Россия.

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук

Кокоз Юрий Моисеевич

Научный консультант: кандидат физико-математических наук

Дынник Владимир Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Колесников Станислав Сергеевич

доктор биологических наук Корыстов Юрий Николаевич

Ведущая организация: Кафедра биохимии Биологического

факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «23» декабря 2009 г. в / з - на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан «23» /^^/ЙА2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

-//ЗИЧЗ? Ланина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

L-аргинин - условно незаменимая аминокислота, которой наука и медицина в последние десятилетия уделяет большое внимание. Исследования по действию L-аргинина на сердечнососудистую систему показывают, что данная аминокислота может использоваться в качестве профилактики и при лечении сердечнососудистых заболеваний - стенокардии, гипертензии, коронарной болезни, гипертрофии миокарда, сердечной недостаточности и т.д. (Appleton J., 2002; Gornik H.L. and Creager M.A., 2004). Большинство эффектов L-аргинина связаны с модуляцией активности NO-синтаз и NO-cGMP каскада. Отклонения от нормы в синтезе N0 и нарушения в запускаемом им NO-cGMP каскаде могут приводить к развитию вышеперечисленных заболеваний. Часто, эти процессы сопровождаются нарушением в работе Са2+-транспортирующих систем, регулируемых NO-cGMP сигнальным каскадом. Так известно, что NO-cGMP каскад принимает участие в модуляции активности Са2+ каналов L-типа, которые играют важную роль в формировании потенциала действия, электромеханическом сопряжении, регуляции частоты и силы сердечных сокращений. Нарушения в работе NO-cGMP каскада и Са2+ каналов L-типа отмечается у спонтанно-гипертензивных крыс (Shorofsky S.R. et. al., 1999). Также значительные нарушения в функционировании Са2+ каналов L-типа отмечаются у животных с нокаутами по генам NO-синтаз (Wang H. et. al., 2008). Поэтому при исследовании функционирования NO-cGMP каскада в сердечнососудистой системе, для целости картины, нужно пытаться учитывать как модуляцию синтеза NO, так и регуляцию им Са2+ транспорта.

Однако, исследования о влиянии NO-cGMP каскада на активность Са2+ каналов L-типа носят противоречивый характер: доноры оксида азота и активаторы протеинкиназы G либо не оказывают эффект на Са2+ токи, либо ингибируют их, либо активируют. Столь противоречивые результаты связывают как с прямым нитрозилированием Са2+-канала L-типа, так и с регуляцией его фосфорилирования cGMP-зависимыми фосфодиэстеразами II и III типа и протеинкиназой G (Gallo М.Р. et al., 1998; Imai Y. et al., 2001; Mery P.F. et al, 1991; Hartzell H.C. and Fischmeister R., 1986; Fishmeister R. and Hartzell H.C., 1987; Suraii K. and Sperelakis N., 1995; Tohse N. and Sperelakis N., 1991). Противоречивые результаты наблюдались и при исследовании животных с нокаутами по генам NO-синтаз. Расхождения в результатах также объяснялись особенностями регуляции Са2+ каналов в синусе, предсердиях, желудочках или в разных видах животных. Одной из причин различных результатов также может быть отсутствие L-аргинина (субстрата NO-синтаз) в экспериментальных средах. Так показано, что добавление этой аминокислоты в экспериментальный раствор улучшает брадикинин-вызванную продукцию NO и подавление изопротеренол-активированных Са2+ токов L-типа интерликином-1 (Rozanski G.J. and Witt R.C., 1994; Flam B.R. at. al., 2001).

Следует учесть, что на сегодняшний день также не до конца понятна регуляция активности NO-синтаз и NO-cGMP каскада экзогенным L-аргинином. Положительные эффекты L-аргинина, оказываемые им при лечении

ряда заболеваний и, связанные с регуляцией активности NO-синтаз, вызывают большой интерес в научном сообществе. В организме уже содержится достаточное количество L-аригинина для поддержания нормальной активности NO-синтаз. Так содержание L-аргинина в плазме крови достигает 400мкМ, а эндотелиальные клетки могут накапливать его до 2 мМ, при этом Km всех форм NO-синтаз для L-аргинина варьирует в пределах 2-10 мкМ. Тем не менее, экзогенно-добавленный L-аргинин способен модулировать активность N0-синтазы, этот феномен называется «аргининовый парадокс». Ситуация осложняется тем, что на сегодняшний день существует несколько гипотез о природе «аргининового парадокса»: недоступность внутриклеточного пула L-аргинина и близкое расположение NO-синтазы и переносчика L-аргинина (McDonald К.К. et. al. 1997; Li С. et. al., 2005); конкуренция NOS и аргиназы за субстрат (Li H. et. al., 2001; Zhang С. et. al., 2001; Chicoine L.G. et. al., 2004); повышенное содержание конкурентного ингибитора - ассиметричного диметиларгинина (Boger R.H. 2004); действие L-аргинина через а2-адренорецепторы, модулирующие активность NOS (Joshi M.S. et al., 2007). Последняя гипотеза основана на том, что L-аргинин содержит гуанидиновую группу, поэтому существует вероятность взаимодействия L-аргинина или его декарбоксилированного производного - агматина с рецепторами, имеющими сродство к гуанидинам. Гипотеза рецепторного действия L-аргинина является последней по времени и интересна тем, что, в отличие от предыдущих, не связана с субстратным действием L-аргинина. Настоящая работа является логическим продолжением работ, проводящихся в нашей группе. В данной работе уделяется особое внимание как регуляции Са2+ тока L-типа, так и NO-cGMP каскада L-аргинином в контексте «аргининового парадокса».

Цели и задачи исследования.

Основная цель работы - изучение возможности действия L-аргинина через а2-адренорецепторы на активность NO-cGMP каскада и на амплитуду Ca2+ токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах в норме и патологии. Задачи:

1. Подобрать условия в которых эффект L-аргинина на амплитуду Са2+ тока L-типа будет максимальным. Оценить, связан ли эффект, оказываемый L-аргинином на Са2+ ток, с NO-cGMP сигнальным каскадом.

2. Исследовать рецепторную гипотезу «аргининового парадокса» т.е. влияние L-аргинина на активность NO-cGMP каскада и амплитуду Са2+ тока L-типа через его воздействие на а2-адренорецепторы.

3. Исследовать действие агматина, на амплитуду Са2+ тока L-типа.

4. Исследовать рецепторную гипотезу «аргининового парадокса» и активность NO-cGMP каскада в изолированных кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс.

Научная новизна работы и полученные результаты.

Впервые нами показано, что «аргининовый парадокс» наблюдается в изолированных кардиомиоцитах крыс линии SD (Spraque Dowlay). Добавка 5мМ L-аргинина на фоне постоянно присутствующем в окружающей среде 1мМ L-аргинина, приводит к увеличению скорости синтеза N0 при стимуляции сокращений и подавлению амплитуды Са2+ тока L-типа. Действие 5 мМ L-аргинина, связано с а2-адренорецепторами и PI3K-Akt каскадом. Так, агонист а2-адренорецепторов гуанабенц ацетат, также как и L-аргинин, вызывал увеличение продукции N0 и подавлял амплитуду Са2+ токов L-типа. Подавление L-аргинином амплитуды Са2+ токов резко уменьшалось в присутствии антагонистов а2-адренорецепторов иохимбина и раувольсцина. В присутствии вортманнина - ингибитора фосфоинозитол-3 киназы и гуанабец ацетат и L-аргинин подавляли амплитуду Са2+ тока в значительно меньшей степени. Ингибитор Akt 1/2 киназы также снимал эффект L-аргинина в отношении Са2+ тока. Действие гуанабенц ацетата и L-аргинина на амплитуду Са2+ токов L-типа было значительно ниже в присутствии ингибиторов N0-синтазы - 7NI и ингибитора cGMP-зависимой протеинкиназы — КТ5823.

Агматин, как L-аргинин, подавлял амплитуду Са2+ тока. Однако, в отличие от L-аргинина, действие агматина на Са2+ ток не изменялось в присутствии иохимбина и 7NI.

В кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс «аргининовый парадокс» отсутствует, реактивность а2-адренорецепторов снижена, NO-cGMP каскад имеет низкую активность: L-аргинин, 8BrcGMP, SNP оказывают незначительное влияние на амплитуду Са2+ тока L-типа. Кривая доза-зависимого действия гуанабенц ацетата на Са2+ ток смещена вправо относительно кривой для крыс Spraque Dawlay. Ни L-аргинин, ни гуанабенц ацетат не оказывают влияние на скорость продукции оксида азота. Не исключено, что обнаруженное нами снижение реактивности а2-адренорецепторов и низкая активность NO-cGMP каскада в кардиомиоцитах SHR имеет отношение к развитию гипертрофии миокарда у крыс этой линии.

Научно-практическая ценность.

Полученные результаты вносят вклад в изучение «аргининового парадокса» и расширяют знания о механизмах регуляции активности NO-cGMP каскада и Ca + тока L-типа в кардиомиоцитах нормотензивных и спонтанно-гипертензивных животных. Кроме того, полученные данные позволяют в значительной степени облегчить исследования механизмов регуляции N0-cGMP сигнального каскада и Са2+ токов L-типа. Дальнейшие исследования на основе полученных данных могут быть полезны при создании методик и новых препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (г. Санкт-Петербург, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009 гг.); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007, 2009);. на международной конференции «BIOLOGICAL MOTILITY: achievements and perspectives» (Пущино, 2008).

Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в /3 печатных работах, в том числе J>_ статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на (0? страницах с использованием рисунков, 2- таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 1 5"Зссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изолированные кардиомиоциты были получены из сердец линейных крыс породы Spraque Dowlay (SD) и спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) по методу, описанному ранее (Alekseev A. et al., 1994). Клетки сохранялись при комнатной температуре и использовались для экспериментов в тот же день. Регистрация токов проводилась через 2-3 часа после выделения при комнатной температуре 23°С методом «whole cell patch-clamp» в конфигурации «perforated patch». Измеряемые токи регистрировали при помощи усилителя СКВ "Биоприбор". Са2+ токи L-типа вызывались прямоугольным стимулирующим импульсом. Поддерживаемый потенциал составлял -40 мВ, стимулирующий импульс 40 мВ, продолжительностью 300 мс. Для проведения экспериментов использовали оригинальный пакет программ "BioQuest", обеспечивающий сбор данных во время эксперимента и их последующий анализ. Регистрируемые данные визуализировали и сохраняли при помощи платы цифро-аналогового/аналого-цифрового (ЦАП/АЦП) преобразователя L-153 (L-card).

Регистрацию флуоресценции проводили с помощью системы анализа изображений "Cell observer" на базе микроскопа "Axiovert" 200М (Carl Zeiss),

оснащенного системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Ludí МАС5000. Для возбуждения флуоресценции DAF-FM применяли светофильтр BP 475/40. Для регистрации флуоресценции использовался фильтр BP 530/50.

Полученные данные на гистограммах показаны как среднее значение указанного числа (п) проведенных экспериментов и соответствующей дисперсии среднего. Выводы о действии каждого из соединений и комбинации соединений сделаны на основании сравнения полученных средних значений амплитуд устоявшихся токов с использованием критерия Стьюдента при уровне значимости Р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.1 Исследование действия L-аргинина на базальную амплитуду Ca2* тока L-mutta в изолированных кардиомиоцитах крыс Spraque Dawlay в присутствии в средах L-аргинина и без него.

NO-cGMP каскад играет важную роль в функционировании сердечнососудистой системы. Большинство эффектов, опосредуемых этим каскадом, связаны с регуляцией активности Са2+ транспортирующих систем, в частности, Са2+ каналов L-типа. Однако, исследования действия NO-cGMP каскада на активность Са2+ каналов обычно проводятся в экспериментальных средах без L-аргинина, хотя известно, что L-аргинин является единственным субстратом NO-синтаз. В целом, исследования о влиянии NO-cGMP каскада на активность Са2+ канала L-типа носят противоречивый характер: доноры оксида азота и активаторы протеинкиназы G либо не оказывают эффект на Са2+ токи, либо ингибируют их, либо активируют (Wahler G.M. and Dollinger S.J., 1995; Gallo M.P. et al., 1998; Imai Y. et al., 2001; Tsuchida К. and Watajima H., 2002; Mery P.F. et al, 1991; Hartzell H.C. and Fischmeister R., 1986; Fishmeister R. and Hartzell H.C., 1987; Sumii K. and Sperelakis N., 1995; Tohse N. and Sperelakis N., 1991; Schroder F. et al., 2003). Разногласия в данных могут быть связаны с тем, что NO-cGMP каскад в стандартных экспериментальных условиях имеет низкую активность и для его нормального функционирования необходимо добавление L-аргинина в рабочие растворы. Так показано, что добавление этой аминокислоты в экспериментальный раствор улучшает брадикинин-вызванную продукцию NO и подавление изопротеренол-актививированных Са2+ каналов L-типа интерликином-1 (Rozanski G.J. and Witt R.C., 1994; Flam B.R. at. al., 2001).

Для подтверждения этой гипотезы, нами были проведены эксперименты по действию L-аргинина на амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах левого желудочка крыс линии Spraque Dawlay (SD) в условиях с различной концентрацией L-аргинина в экспериментальной среде. При проведении экспериментов в средах без L-аргинина добавление 1-5 мМ L-аргинина не приводило к сколь либо заметному изменению амплитуды Са2+ тока L-типа. Однако в 30% экспериментов мы наблюдали 12% подавление Са2+ тока L-типа (п=3, рис. 1а, д). В среде с 0,4 мМ L-аргинина добавление 5 мМ данной аминокислоты приводило к подавлению кальциевого тока на 24%,

однако в 30% процентах случаев эффект отсутствовал (п=5, рис. 16, д). В среде с 1 мМ Ь-аргинина добавление 5 мМ Ь-аргинина всегда приводило к 30 % подавлению амплитуды Са2+ тока Ь-типа (п=8, рис. 1в, д).

1_-аргинин Б мМ

1,-аргинин 1 мМ

0 5 10 15 20

0,0 -0,2

<

£ -0.4

1 ^ I .0,8

-1,0

и-аргииин 5 мМ

Ь-аргииии 1 мМ

10 20 30 60 50

| -0,4 §

| -0,6 -0.8

(.-аргинин б мМ

10 15 20 25 30 35 время, мим

0,0 -0,2

%

£

1 -о.« * -0,8

Ь-аргинин 5 мМ

МВ среда без 1-аргинина ШШ среда с 0,4мМ Ь-аргинина ШШ среда с 1 мМ ь-аргинина среда с 5 мМ Ьарг инина

1»

[-.аргинин 5 мМ

Рис 1. Действие добавленных 5 мМ Ь-аргинина на амплитуду Са2+ токов Ь-типа в присутствие 0 (а), 0,4мМ (б), 1мМ (в) и 5мМ (г) Ь-аргнинина в экспериментальной среде . На графиках представлены изменения пиковых значений амплитуды Са2+ тока во времени, д -гистограмма действия 5 мМ Ь-аргинина в зависимости от содержание в среде Ь-аргинина.

Использование сред с 5 мМ Ь-аргинина во время выделения приводило к гибели клеток. Вероятно, это связано с тем, что клетки в период выделения очень уязвимы и в этих условиях 5 мМ Ь-аргинина могут оказывать цитотоксический эффект. Если же данная концентрация добавлялась только в растворы для переживания и экспериментальные, каких-либо негативных

последствий не отмечалось, добавление 5 мМ Ь-аргинина приводило к 15% подавлению кальциевого тока в 50% экспериментов (п=5, рис. 1 г, д).

Таким образом, нами было показано, что максимальный эффект 5 мМ Ъ-аргинина на амплитуду Са2+ тока Ь-типа наблюдался в средах с 1 мМ Ь-аргинина, поэтому все последующие эксперименты проводились с содержанием именно этой концентрации аминокислоты в экспериментальном растворе. Далее нами было исследовано, действительно ли действие 5 мМ Ь-аргинина в отношении амплитуды Са2+ тока Ь-типа связано с регуляцией активности ЫО-синтазы и МО-сСМР каскада.

1.2 Исследование действия Ь-аргинина на базальную амплитуду Са + тока Ь-типа в изолированных кардиомиоцитах 5/) на фоне ингибиторов NО-сСМР каскада

Для того, чтобы проверить действительно ли эффект L-аргинина на кальциевый ток связан с регуляцией активности NO-cGMP каскада нами были проведены исследования на фоне 7NI - ингибитора NO-синтаз, ODQ -ингибитора цитозольной гуанилатциклазы и КТ 5823 - ингибитора протеинкиназы G.

Добавка 5 мМ L-аргинина вызывала подавление Са2+ тока L-типа на 30±4.8% в кардиоцитах SD (п=8, рис. 1в). На фоне 2 мкМ 7NI эффект L-аргинина уменьшался до 3,8±4,9% (п=5, рис. 2а, г), на фоне ODQ до 10,6±2,7% (п=5, рис. 26, г), а на фоне 1 мкМ КТ 5823 до 6,5±1,9% (п=6, рис. 2в, г).

L-аргинии 5 мМ

•••••••••^^^Й^осй»»»»»»

10 15 20 25 30

10 15 20 25 30 35

КТ3823 0,5 мкМ

10 20 30 40

шрччя. иш

В

Рис. 2. а, б, в — действие Ь-аргинина на амплитуду Са2+ тока Ь-тгапа на фоне ингибиторов >Ю-сОМР каскада. На графиках представлены изменения пиковых значений амплитуды Са2+ тока во времени, г - гистограммы действия Ь-аргинина в присутствии указанных соединений. * - Р < 0,05.

Таким образом, нами показано, что в присутствии 1 мМ L-аргинина в экспериментальных средах добавление 5 мМ L-аргинина ингибирует амплитуду Са2+ тока L-типа за счет активации NO-cGMP каскада. Подавление тока связано с активностью протеинкиназы G и, по-видимому, опосредовано cGMP-завиеимым фосфорилированием Са2+ каналов L-типа.

Однако, возникает вопрос, почему же при таких высоких концентрациях L-аргинина в экспериментальной среде (1мМ) дополнительное введение 5мМ этой аминокислоты приводит к подавлению Са2+ тока L-типа.

Мы предположили, что этот результат имеет отношение к достаточно давно известному в научной литературе явлению - «аргининовому парадоксу». «Аргининовый парадокс» - феномен, при котором высокие дозы экзогенного L-аргинина стимулируют NOS-зависимую продукцию N0, несмотря на высокое сродство NOS к L-аргинину (2-10мкМ) и большую концентрацию последнего в клетках от 0,8 до 2мМ. В наших экспериментальных условиях (с избыточностью L-аргинина в среде) «аргининовый парадокс» хорошо выражен и легко оценивается по влиянию L-аргинина на амплитуду потенциал-зависимого Са2+ тока L-типа. Таким образом, появляется возможность исследовать природу «аргининового парадокса» на изолированных кардиомиоцитах.

На данный момент существуют следующие гипотезы, объясняющие «аргининовый парадокс»: активность NO-синтазы и продукция NO определяется скоростью транспорта L-аргинина в клетку переносчиком аминокислот-катионов (САТ), так как внутриклеточный пул L-аргинина является недоступным для фермента; высокий уровень асимметричного диметиларгинина (АДМА), который является эндогенным конкурентным ингибитором NO-синтаз; конкуренция за L-аргинин между NOS и аргиназой, которая может лимитировать продукцию N0; взаимодействие L-аргинина с а2-адренорецептором, модулирующим активность NOS.

В наших исследованиях на всех стадиях выделения кардиомиоцитов и при проведении экспериментов в среде присутствует 1 мМ L-аргинина. Можно предположить, что такая большая концентрация L-аргинина должна обеспечивать стабильную работу переносчиков аминокислот-катионов и максимально насыщать NOS, несмотря на конкуренцию за субстрат со стороны аргиназы. Поэтому, не отрицая первые три гипотезы причин «аргининового парадокса», мы предположили, что в наших условиях влияние дополнительных 5мМ L-аргинина на Са2+ ток L-типа в кардиомиоцитах происходит через активацию аг-адренорецепторов.

1.3 Исследование действия L-аргинина на базальную амплитуду Са2+ тока L-muna в изолированных кардиомиоцитах SD на фоне антагонистов аг-адренорецепторов и ингибиторов PI3K-Akt сигнального каскада.

Ранее на культуре клеток эндотелия было показано, что «аргининовый парадокс» может быть связан с активацией аг-адренорецепторов (Joshi M. et. al., 2007). Поэтому мы решили проверить возможность активации NO-cGMP каскада L-аргинином через а2-адренорецепторы. Для этого нами

использовались селективные антагонисты этих рецепторов - иохимбин и раувольсцин. На фоне ЮмкМ иохимбина, 5 мМ Ь-аргинина уменьшал амплитуду Са2+ тока Ь-типа на 11 ± 2% (п=6, рис. За, в), а на фоне 10 мкМ раувольсцина на 10 ± 2% (п=5, рис. 36, в).

-0.4 -0.6 -0,8

Аргинин 5 мМ

иохимбин ЮмкМ

(

-0.4

■Об -0,8

I.-аргинин 6 мМ раувольсцин 10 мкМ

0 15 20 25 30 время, мин

Рис. 3. а, б - действие Ь-аргинина на амплитуду Са2+ тока Ь-типа на фоне селективных антагонистов аг-адренорецепторов - иохимбина и раувольсцина. На графиках представлены изменения пиковых значений амплитуды Са2+ тока во времени, в - гистограмма действия Ь-аргинина в присутствии указанных соединений. * - Р < 0,05.

В тоже время, иохимбин не оказывал достоверного эффекта на ингибирующее действие 8К'Р и 8Вг-сйМР в отношении амплитуды Са2+ тока Ь-типа (рис. 4).

Полученные данные позволяют предположить, что эффект Ь-аргинина на Са2+ ток Ь-типа в кардиомиоцитах опосредован активацией аг-адренорецепторов, т.к. иохимбин не оказывает достоверного действия непосредственно на сам ЫО-сСМР каскад, предотвращая действие только Ь-аргинина, но не других активаторов ЫО-сОМР каскада (ЯМ5 и 8ВгсОМР).

M

2 I

CL

Рис 4. Гистограммы действия L-аргинина, SNP и 8BrcGMP на амплитуду Са2+ тока L-типа в присутствии иохимбина. * - Р < 0,05.

В работе Joshi и соавторов приведены данные, в пользу того, что в эндотелиальных клетках "аргининовый парадокс" вызван действием L-аргинина на а2-адренорецепторы, сопряженные с G-белок-зависимой активацией фосфолипазы С (PLC) и входом ионов Са2+ через мембрану (Joshi M.et al., 2007). Активация PLC приводит к синтезу диацилглицерола (DAG) и инозитолтрифосфата (IP3) из фосфотидилинозитолдифосфата (PIP2). IP3 активирует 1РЗ-чуствительные каналы, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ и, далее, к входу Са2+ через депо-зависимые каналы (SOC) клеточной мембраны, благодаря чему происходит Са2+-зависимая активация eNOS. В кардиомиоцитах доказано наличие IP3-чуствительных каналов (Moschella М.С. and Marks A.R., 1993; Perez P.J. et. al, 1997; Bare D.J. at. al., 2005), однако не существует данных об их вкладе в Са2+-зависимую активацию NO-синтазы. Также следует учесть, что в наших экспериментах уже присутствует Са2+-зависимая активация NOS, поскольку ведется постоянная электрическая стимуляция кардиомиоцитов. Можно предположить, что в данных условиях в кардиомиоцитах проявляется другой путь активации eNOS L-аргинином. Существует большой спектр как рецепторов, сопряженных с G-белками, так и тирозинкиназных рецепторов, активация которых может приводить к изменению активности eNOS за счет её фосфорилирования через PI3K-Akt сигнальный каскад (Igarashi J. et al., 2001; Vecchione C.et al., 2002; Gelinas D.et al., 2002; Stirone C.et al., 2005; Zhang Z.et al., 2005; Suzuki H.et al., 2006; Cahuana G. et al., 2008), а2-адренорецепторы также могут модулировать активность NO-синтазы через PI3K-Akt каскад (Plato С. and Garvin J., 2001).

Для подтверждения вклада PI3K-Akt сигнального пути в а2-адренорецептор-опосредованную активацию L-аргинином NO-cGMP каскада

нами были использованы: ингибитор фосфотидилинозитол-3 киназы (Р13К) -вортманнин и ингибитор протеинкиназы В (Akt) - ингибитор Akt 1/2 киназы. На фоне ЮОнМ вортманнина L-аргинин уменьшал амплитуду Са2+ тока L-типа на 9,6 ± 2,2% (п=5, рис. 5а, в), а на фоне 0,5 мкМ ингибитора Akt 1/2 на 6,7 ± 2,3% (п=5, рис. 56, в).

Аргинин 5 мМ вортманнин 100 нМ

0.0

1 -0,2

S

л <0.4

1

L ■o.e

-0.8

L-арпшин S мМ akt 1/2 киназы ингибитор 0,5 мкМ

. .. , TT * Тт.

10

15

20

25

КВкП

Рис. 5 а, б - действие L-аргинина на амплитуду Са2+ тока L-типа на фоне ингибиторов PI3K-Akt каскада - вортманнина и ингибитор Akt 1/2 киназы. На графиках представлены изменения пиковых значений амплитуды Са2+ тока во времени, в - гистограммы действия L-аргинина в присутствии указанных соединений. * - Р < 0,05.

Из полученных результатов можно предположить, что активация а2-адренорецепторов играет существенную роль в реализации "аргининового парадокса" в кардиомиоцитах. L-аргинин, взаимодействуя с а2-адренорецепторами, активирует NO-синтазу через PI3K-Akt каскад, с последующим cGMP-зависимым подавлением амплитуды Са2+ тока L-типа.

Однако, показано, что в эндотелиальных клетках агматин (декарбоксилированный аргинин) в низких концентрациях (ЮцМ) также, как и L-аргинин, способен взаимодействовать с а2-адренорецепторами. Агматин синтезируется из L-аргинина ферментом аргининдекарбоксилазой. Существует гипотеза, что именно агматин, синтезирующийся в результате добавления высоких доз экзогенного L-аргинина, может выходить из клетки, и действуя через а2-адренорецепторы, активировать NO-синтазу (Joshi et al., 2007). Однако, ранее было показано, что агматин является ингибитором NO-синтаз (Galea Е. et.

-11 -

а1., 1996; Оета<Зу Э.Я. е1. а1., 2001). Тем не менее, мы решили проверить и такую возможность, так как ингибирующие концентрации агматина достаточно велики и составляют для п!Ч08~660 мкМ, а €N08-7,5 мкМ.

1.4 Исследование действия агматина на базальную амплитуду Са типа в изолированных кардиомиоцитах SD.

тока L-

Показано, что агматин доза-зависимо ингибирует Са2+ токи в желудочковых кардиомиоцитах и неонатальной культуре нейронов гиппокампа (Qing L. et. al., 2002; Zheng J. et. al, 2004).

В наших экспериментах на изолированных кардиомиоцитах дозозависимое действие агматина начиналось с концентраций 200 мкМ и блокирующий эффект на амплитуду Са2+ токов составлял 20-25% при концентрациях 2 мМ и достигал 50% при 10 мМ (рис. 6, 7а) Таким образом значительный эффект агматина на Са2+ токи L-типа отмечался при достаточно высоких концентрациях, способных ингибировать активность NO-синтаз (Galea Е. et. al., 1996).

60

50

40

о 30

20

10

0,2

2 5

агматин, мМ

10

Рис 6. Гистограмма доза-зависимого эффекта агматина на амплитуду Са2+ тока L-типа.

Для того, что бы проверить, воздействует ли агматин на а2-адренорецепторы и то, что его эффект действительно не связан с активацией NO-синтазы, мы использовали, соответственно, иохимбин и 7NI.

В отличие от 5 мМ L-аргинина, иохимбин (10 мкМ) не оказывал влияние на действие 2 мМ агматина в отношении амплитуды Са2+ тока (рис. 76). Кроме того, эффект агматина не снимался в присутствии 2 цМ 7NI (рис. 7в).

Полученные данные можно интерпретировать как существенное отличие в регуляции Са2+ токов и синтеза NO в эндотелиальных клетках и кардиомиоцитах.

Судя по всему, в кардиомиоцитах агматин, добавленный в экспериментальный раствор, оказывает свой эффект на Са2+ токи через процессы не сопряженные с активацией а2-адренорецепторов и ЫО-синтазы.

агматин 2 мМ

иохимбин 10 мкМ

-0,2 -0.4

|

= -0,8

I

I

*Е1

Рис. 7. а, б, в - действие агматина на амплитуду Са тока Ь-типа на фоне иохимбина и 7Ы1. На графиках представлены изменения пиковых значений амплитуды Са2+ тока во времени, г - Гистограмма действия 2мМ агматина на амплитуду Са2+ тока Ь-типа в присутствии указанных соединений.

Для дальнейшего подтверждения гипотезы о том что эффект Ь-аргинин связан с а2-адренорецопторами нами использовался селективный агонист этих рецепторов - гуанабенц ацетат.

1.5 Исследование действия гуанабенц ацетата на базальную амплитуду С а2* тока ¿-типа в изолированных кардиомиоцитах БЭ на фоне ингибиторов Р13К-АШ и !\'0-сСМР сигнальных каскадов.

Селективный агонист а2-адренорецепторов гуанабенц ацетат в концентрации 10 мкМ (ЕС50) подавлял амплитуду Са2+ тока Ь-типа в кардиомиоцитах крыс ЙО на 29.4 ±3,6% (п=5, рис. 8а, д).

Как и в случае Ь-аргинина эффект гуанабенц ацетата значительно снижался в присутствии ЗООнМ вортманнина до 7,7 ± 3,0% (п=5, рис. 86, д), 10 мкМ 7 N1 до 15,6±1,2% (п=6, рис. 8в, д) и 1мкМ КТ5823 до 18±1,3% (п=5, рис. 8г, д).

Из приведенных результатов видно, что а2-адренорецепторы действительно принимают участие в регуляции активности ЫО-синтазы и амплитуды Са2+ тока Ь-типа в изолированных кардиомиоцитах 8П).

£ -0.4 2

| -0.6

гуанабенц 10 мкМ

•0,2

2

| -0.6 -о.в

гуанабенц 10 мкМ вортманнин 300 кМ

гуанабенц 10 м«М

■0,2

<

5 -0,4 |

| -0,6 ■0.Й

гуанабенц 10 мкМ

Рис. 8. а, б, в г — действие гуанабенц ацетата на амплитуду Са2+ тока Ь-типа на фоне ингибиторов Р13К-аЙ и ЬЮ-сОМР каскада. На графиках представлены изменения пиковых значений амплитуды Са2+ тока во времени, г - гистограммы действия гуанабенц ацетата в присутствии указанных соединений. * - Р < 0,05.

Таким образом, нами показано, что в норме «аргининовый парадокс» может являться следствием взаимодействия Ь-аргинина с а2-адренорецепторами. Однако, следует учесть, что «аргининовый парадокс» также чаще всего упоминается в контексте различного рода сердечнососудистых заболеваний (Вос1е-Вб§ег 8.М. е1:. а1., 2007). В этом случае феномен «аргининового парадокса» может быть связан с недостатком Ь-

аргинина в связи с высоким уровнем активности аргиназы или увеличением количества АДМА и, как следствие, низкой активности >10-синтаз.

Поэтому мы решили проверить имеет ли место регуляция активности N0-синтазы и амплитуды Са2+ тока Ь-типа Ь-аргинином через аг-адренорецепторы при состояниях, связанных с нарушением в функционировании сердечнососудистой системы.

Далее нами были проведены исследования по изучению действия Ь-аргинина и гуанабенц ацетата на амплитуду Са2+ токов Ь-типа и скорость продукции оксида азота в изолированных кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс по сравнению с Spraque Оа\у1ау.

1.6 Исследование действия Ь-аргинина и гуанабенц ацетата на базальную амплитуду Са2+ тока Ь-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс БНЯ.

Сердца БНЯ гипертрофированы и имеют увеличенную сократимость, однако, не проявляют признаков сердечной недостаточности. Пиковая амплитуда Са2+ токов Ь-типа и среднее значение амплитуды Са2+ спарков в кардиомиоцитах ЗНИ. увеличены. (ЗЬогоГвку 5.Я. а1., 1999). Также у спонтанно-гипертензивных крыс показаны изменения в функционировании ЫО-сСМР каскада. В сердцах БИЯ снижена экспрессия эндотелиальной N0-синтазы (ВаугакМап и. е1. а1., 1998; Р1есЬ А. е1. аЬ, 2003), в кардиомиоцитах значительно снижена экспрессия протеинкиназы в первого типа (МаггеП1 Ь. е1. аЬ, 2001). Кроме того, в сердцах этих крыс отмечается увеличенная аргиназная активность (Ва§поз1 Т. е1. а1., 2009), в то же время, уровень АДМА не увеличивается по сравнению с контрольным (Ма1зиока Н. еЬ а1., 1997).

В наших экспериментах Ь-аргинин не оказывал сколь либо значительного влияния на амплитуду Са2+ токов Ь-типа в кардиомиоцитах БНЯ. Более того, схожим эффектом обладали 8ЫР и вВгсвМР. Ь-аргинин подавлял Са2+ ток в кардиомиоцитах ББ на 30,3±4,7% (п=8), а в кардиомиоцитах БИЛ на 4,3±0,6%, (п=5) (рис. 9а, б, ж), соответственно на 25,4±6,6% (п=5) и 7,5±2,8% (п=6) (рис. 9в, г, ж), а 8ВгсОМР (п=5) на 27,5±5,8 и 2,4±3,3% (п=5) (рис. 9д, е, ж).

Таким образом, нами показано, что в кардиомиоцитах крыс БНЯ N0-свМР каскад имеет крайне низкую активность и слабо регулирует базальные Са2+ токи Ь-типа. Можно было бы предположить, что 5 мМ Ь-аргинина не оказывает влияние на Са2+ токи в связи с высокой активностью аргиназы. Однако, БЫР и 8ВгсОМР также не оказывали влияния на Са2+ ток, что может свидетельствовать о низкой активности всего ЫО-сйМР каскада, что хорошо согласуется с данными о сниженной экспрессии еЫ08 и РКй.

Далее мы исследовали связано ли отсутствие действия Ь-аргинина на амплитуду Са2+ тока Ь-типа не только с нарушением в работе ЫО-сСМР каскада, но и со снижением реактивности а2-адренорецепторов в кардиомиоцитах БНЯ. Для подтверждения этой гипотезы, мы исследовали дозозависимое действие гуанабенц ацетата на амплитуду Са2+ тока Ь-типа в кардиомиоцитах и БНЯ.

10 15 » 15

0.0 С2

1

1 -о*

с -0,8'

о**

О 5 10 15 20 2$ 30 35

1 -о.е-

вВгсСМР 1мкМ

ю го

Ьаргинин 6 мМ

«ВкСМР 1ккМ

О 9 14 1$ 24 25

(-

3 го-

»ВгсОМР 1мкМ

Ж

Л

1

п»в

А

Рис. 9 Действие Ь-аргинина, БЫР и 8ВгсОМР на амплитуду Са2+ тока Ь-типа в изолированных кардиомиоцитах 80 (а, в, д, ж) и БНИ (б, г, е, ж). На графиках представлены изменения пиковых значений амплитуды Са2+ тока во времени, г -гистограммы действия Ь-аргинина, БЫР и 8ВгсОМР. * - Р < 0,05.

Гуанабенц ацетат подавлял амплитуду Са2+ тока Ь-типа как в кардиомиоцитах 80, так и БНЯ. Однако, наблюдаемый эффект при одних и тех же концентрациях агониста был значительно ниже в кардиомиоцитах вНЛ, чем

в кардиомиоцитах SD (п >3 для каждой концентрации, рис. 10а): ECso=10,4 мкМ, подавление тока =30% для SD и ECso=17,4 мкМ, подавление тока =17% для SHR. На рис.106 приведены кривые доза-зависимость в кардиоцитах SD и SHR (для каждой концентрации п >3). Кривая доза-эффект у SHR сильно смещена вправо относительно кривой для SD. Обе кривые доза-эффект имеют вид характерный для кривых, описывающих действие агониста на фоне присутствия в среде частичного агониста (Foreman J.C., Johansen Т., 2003) и смещены вверх относительно нуля. Можно предположить, что смещение кривых вверх связано с тем, что в экспериментальной камере постоянно присутствует ImM L-аргинина, который, по-видимому, также оказывает влияние на а2-адренорецепторы, играя роль частичного агониста.

60

| 50

.j jj 40

~3 30

I 20 !»

I

П

10 15

гуанабенц ацетаг, мкМ

гуанабснц ацетат, мкМ

Рис. 10. Действие агониста аг-адренорецепторов гуанабенц ацетата на амплитуду Са +тока Ь-типа в кардиомиоцитах 80 и БНЯ. а - гистограмма доза-зависимого эффекта, черные бары 5Б, серые БНЯ; б - кривые доза- эффект.

Смещение кривой доза-эффект вправо у крыс линии SHR по отношению к аналогичной кривой для SD, свидетельствует о том, что реактивность а-г адренорецепторов в кардиомиоцитах SHR понижена по сравнению с реактивностью а2-адренорецепторов у крыс SD.

Полученные результаты также показывают, что действие L-аргинина на активность NO-синтазы может быть опосредовано «2-адренорецепторами. Снижение реактивности этих рецепторов сопутствует нарушению активности NO-cGMP каскада в кардиомиоцитах SHR.

Критерием оценки приведенных выше результатов по функционированию NO-cGMP каскада является изменение амплитуды Са2+ тока L-типа в присутствие веществ, влияющих на активность каскада. Хотя мы считаем, что изменение амплитуды Са2+ тока является достоверным критерием, т.к. эффекты L-аргинина и гуанабенц ацетата снимаются 7NI, КТ5823, тем не менее далее нами были проведены исследования по действию этих веществ на скорость продукции NO в изолированных кардиомиоцитах SD и SHR.

1.7 Изменение скорости продукции оксида азота в кардиомиоцитах при дополнительном введении 5тМ аргинина или гуанабенц ацетата на фоне электрической стимуляции в кардиомиоцитах 51) и 8НЯ

Добавление 5 мМ Ь-аргинина в среду инкубации на фоне электрической стимуляции кардиомиоцитов 50 с частотой 0,1 Нг вызывает после непродолжительной лаг-фазы увеличение скорости продукции оксида азота (п=3) (рис.11а).

Полученный результат также иллюстрирует «аргининовый парадокс» в кардиомиоцитах 8Э, т.к. в экспериментальной камере уже присутствует 1 мМ Ь-аргинина, т.е. имеет место насыщение >Ю-синтаз субстратом.

В кардиомиоцитах 8НЯ добавление 5мМ Ь-аргинина в тех же условиях, не оказывало влияния на скорость роста N0 (п=3) (рис.116). Добавление 20ткМ гуанабенц ацетата на фоне электрической стимуляции в кардиомиоцитах 8Б также, как и 5мМ Ь-аргинина, вызывало увеличение скорости продукции N0, в то время как в кардиомиоцитах БНИ заметного

1,2 1,0 0,8

о It % 0,6

0,4

0,2

0,0

0 300 600 »00 1200 1500 1800 2100 2400 0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400

в №n« (sec) f~ time («ее)

Рис. 11. Влияние добавки 5 мМ L-аргинина и 20 мкМ гуанабенц ацетата на продукцию NO в кардиомиоцитах SD (а, в) и SHR (б, г) при электрической стимуляции клеток с частотой 0.1 Hz, оцененные по изменению флуоресценции DAF FM. Стрелками показаны моменты включения стимуляции, подачи в раствор L-аргинина, гуанабенц ацетата и 7NI.

Таким образом, нами показано, что в кардиомиоцитах SHR «аргининовый парадокс» отсутствует. Добавка 5шМ L-аргинина не изменяют амплитуду Са2+ тока L-типа в кардиомиоцитах этих крыс. Эти данные можно было бы объяснить тем, что в кардиомиоцитах SHR значительно снижена экспрессия протеинкиназы G I типа (Mazzetti L. et al., 2001). Однако, в кардиомиоцитах SHR в ответ на добавление 5 шМ L-аргинина также не наблюдается изменений и в скорости продукции N0, т.е. происходят нарушения в регуляции реакций, предшествующих активации PKG. Таким образом, отсутствие эффекта L-аргинина на скорость продукции N0 может быть связано: с десенситизацией аг-адренорецепторов, с изменением активности PI3K-Akt сигнального каскада, или с изменениями в экспрессии eNOS. Однако, продукция N0 в ответ на электрическую стимуляцию в кардиомиоцитах SHR сохраняется.

В кардиомиоцитах экспрессируются две формы конститутивных N0-синтаз - eNOS и nNOS (Massion P., et. al., 2003; Bredt D., 2003). Ранее было показано, что в кардиомиоцитах SHR экспрессия eNOS значительно снижена (Bayraktutan U. et. al., 1998). Однако, позднее выяснилось, что, несмотря на сниженную экспрессию eNOS в левом желудочке SHR, общая активность конститутивных NO-синтаз и продукция cGMP остается неизменной, т.к. наряду с уменьшением экспрессии eNOS происходит значительное увеличение экспрессии nNOS (Piech A. et. al., 2003). Можно предположить, что в кардиомиоцитах SHR сохранена Са2+-зависимая регуляция NO-синтаз, и, благодаря компенсаторным механизмам, общий пул конститутивных NOS не меняется. В тоже время, именно eNOS расположена на внутренней стороне сарколеммы кардиомиоцитов и многие типы рецепторов, в том числе а2-адренорецепторы, активируют именно эндотелиальную NO-синтазу через PI3K-Akt каскад. Поэтому десенситизация этих рецепторов, нарушение активности или регуляции PI3K-Akt каскада или снижение экспрессии eNOS могут играть заметную роль. В наших экспериментах в кардиомиоцитах SHR гуанабенц ацетат также как и L-аргинин не оказывал влияние на скорость продукции оксида азота. Исследование дозозависимого эффекта гуанабенц ацетата на амплитуду Са2+ тока показало, что реактивность а2-адренорецепторов в кардиомиоцитах SHR значительно снижена по сравнению с SD. Данные факты хорошо объясняют отсутствие действия 5мМ L-аргинина на скорость продукции NO и амплитуду Са2+ тока в кардиомиоцитах SHR за счет сниженной реактивности рецепторов. Тем не менее, не до конца ясно, с какой из вышеперечисленных причин связано снижение реактивности аг-адренорецепторов у SHR. Все предлагаемые гипотезы нуждаются в дальнейшем экспериментальном подтверждении.

Существуют данные о том, что у мышей, нокаутов по а2— адренорецепторам, развивается гипертрофия миокарда (Hein L. et al., 1999). Не исключено, что обнаруженное нами снижение реактивности аг-адренорецепторов и низкая активность NO-cGMP каскада в кардиомиоцитах SHR имеет отношение к развитию гипертрофии миокарда у крыс этой линии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной проблемой в исследовании регуляции Са2+ каналов L-типа N0-cGMP каскадом было большое разнообразие получаемых результатов. Противоречия объяснялись либо спецификой cGMP-завиеимой регуляции у различных типов клеток и разных видов животных, либо различиями в экспериментальных методах. Нами было предположено, что при отсутствии в рабочих средах единственного эндогенного источника N0 - L-аргинина. происходит изменение в функционировании NO-cGMP каскада, что и приводит к противоречивым результатам. Действительно, в наших экспериментах в условиях без L-аргинина также не наблюдалось какого-либо значимого эффекта при добавлении L-аргинина (1-5мМ). В присутствии 1мМ L-аргинина во всех рабочих средах добавка 5мМ L-аргинина приводила к подавлению базального Са2+ тока L-типа в кардиомиоцитах крыс SD. Эффект L-аргинина снимался 7NI, ODQ, КТ5823, что говорит о том, что действие этой аминокислоты на амплитуду Са2+ тока связано с модуляцией активности NO-cGMP каскада и, по-видимому, с cGMP-завиеимым фосфорилированием. Полученный результат моделирует «аргининовый парадокс», т.к. 5мМ L-аргинина оказывают эффект при том, что в растворе уже находится 1 мМ этой аминокислоты. Получается, что в наших экспериментальных условиях (с избыточностью L-аргинина в среде) «аргининовый парадокс» хорошо выражен и легко оценивается по влиянию L-аргинина на амплитуду потенциал-зависимого Са2+ тока L-типа. Таким образом, появляется возможность исследовать природу «аргининового парадокса» на изолированных кардиомиоцитах. Нами была исследована рецепторная гипотеза «аргининового парадокса». Селективные антагонисты а2-адренорецепторов иохимбин и рауволсцин снимали эффект L-аргинина на амплитуду Са2+ токов L-типа. Показано, что а2-адренорецепторы активируют NO-синтазу через PI3K-Akt сигнальный каскад. В наших экспериментах эффект L-аргинина на амплитуду Са2+ тока снимался вортманнином и ингибитором Aktl/2 киназы - блокаторами PI3K и Akt. По аналогии с L-аргинином селективный агонист а2-адренорецепторов - гуанабенц ацетат подавлял амплитуду Са2+ тока в изолированных кардиомиоцитах. Эффект гуанабенц ацетата снимался вортманнином, 7NI, КТ5823. Однако существовало предположение, что не L-аргинин, а агматин (синтезируемый из L-аргинина) взаимодействует с а2-адренорецепторами. Агматин также подавлял Са2+ ток, однако, его эффект не снимался ни иохимбином, ни 7NI. Предполагаемый каскад реакций, на основе полученных данных, от аг-адренорецептора к Са2+ каналу в кардиомиоцитах крыс SD приведен на рисунке 12.

Для дальнейшей проверки рецепторной гипотезы «аргининового парадокса» мы исследовали регуляцию скорости продукции оксида азота и Са2+ токов L-типа L-аргинином и гуанабенц ацетатом в кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс. L-аргинин не оказывал влияния на амплитуду Са2+ тока, доза-зависимый эффект гуанабенц ацетата на кальцивые токи смещался вправо по сравнению с кардиомиоцитами SD. L-аргинин и гуанабенц ацетат также не оказывали влияния на скорость продукции оксида азота в кардиомиоцитах SHR по сравнению с SD. Полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии

«аргининового парадокса» и снижении реактивности а2-адренорецепторов в кардиомиоцитах этих крыс.

иохимбин гуанабенц

Рис. 12. Участие аг-адренорецепторов в реализации "аргининового парадокса" и регуляции Са2+тока L-типа в кардиомиоцитах. аг - аг-адренорецептор, G; - G.-белок, PI3K - фосфатидилинозитол-З-гидрокси киназа, PDK - фосфатидилинозитолзависимая киназа, Akt - протеинкиназа В, eNOS - эндотелиальная NO-синтаза, N0 - оксид азота, sGC -цитозольная гуанилатциклаза, cGMP - циклический гуанозинмонофосфат, PKG -протеинкиназа G, L-канал - Са2+ канал L-типа.

На основе полученных результатов, можно сделать вывод, что L-аргинин принимает участие в регуляции Са2+ токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах. Для достижения эффекта необходимо чтобы на момент своего действия L-аргинин уже присутствовал в экспериментальных растворах, что создает «аргининовый парадокс». В этих условиях дополнительный L-аргинин, взаимодействуя с аг-адренорецепторами, активирует NO-синтазу через PI3K-Akt путь, с последующим подавлением амплитуды Са2+ тока посредством cGMP-завиеимого фосфорилирования.

выводы

1. L-аргинин в концентрации 5мМ эффективно подавляет пиковую амплитуду Са2+ токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах SD. Действие L-аргинина на Са2+ ток реализуется через NO-cGMP каскад.

2. а2-адренорецепторы принимают участие в реализации «аргининового парадокса» в изолированных кардиомиоцитах SD. L-аргинин, взаимодействуя с а2-адренорецепторами через PI3K-Akt сигнальный путь, активирует NO-cGMP каскад и подавляет амплитуду Са2+ тока L-типа.

3. Эффект агматина на амплитуду Са2+ тока L-типа не связан с его действием на а2-адренорецепторы и NO-синтазу

4. В кардиомиоцитах SHR «аргининовый парадокс» отсутствует. Скорость продукции оксида азота и амплитуда Са2+ тока L-типа не изменяются в ответ на добавление L-аргинина. Реактивность а2-адренорецепторов снижена.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Дынник В.В., Грушин, К.С., Корыстова А.Ф., Ненов М.Н.. Мурашев A.B., Кокоз Ю.М. Стабилизирующая роль аргинина и N0 в регуляции потенциалзависимого Са2+ тока L-типа в клетках миокарда. Доклады Академии Наук, 2005, том 404, №5, стр. 1-4.

2. Кокоз Ю.М., Грушин К.С., Ненов М.Н.. Дынник В.В., Семушина С.Г., Пахомова И.А., Мурашев А.Н. Регуляция NO-cGMP-каекадом Са2+-тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах нормотензивных и спонтанно-гипертензивных крыс. Доклады Академии Наук. 2007, том 415, № 2: 257-261.

3. Грушин К.С., Ненов М.Н.. Дынник В.В., Семушина С.Г., Пахомова И.А., Мурашев А.Н., Кокоз Ю.М.. Роль NO-cGMP каскада в регуляции Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах. Биологические мембраны. 2008, т.25, №5, с. 377-387.

Тезисы докладов

1. Грушин К.С., Ненов М.Н.. Корыстова А.Ф., Дынник В.В., Кокоз Ю.М. Синергизм действия cGMP-регуляторной и холинэргической систем в кардиомиоцитах крыс. Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и Медицина», Санкт-Петербург, 2005, стр. 30.

2. Дынник В.В., Грушин К.С., Корыстова А.Ф., Ненов М.Н.. Бережное A.B., Пименов О.Ю., Кокоз Ю.М. Роль NO-cGMP-PKG в регуляции Ca +тока L-типа в миокарде. Стабилизирующая роль аргинина. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2005, стр. 123-126.

3. Ненов М.Н.. Грушин К.С. Роль NO-cGMP системы в регуляции базальных и активированных изопротеренолом Са2+ токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах нормотензивных и спонтанно-гипертензивных крыс. Сборник тезисов 9-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2006, 233-234.

4. Ненов М.Н.. Грушин К.С. Протеинкиназа G - ключевой компонент в регуляции Са2+ тока L-типа NO-cGMP каскадом. Сборник тезисов 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2007,302-303.

5. Грушин К.С., Ненов М.Н., Дынник В.В., Семушина С.Г., Пахомова И.А., Мурашев А.Н, Кокоз Ю.М.. NO-cGMP каскад и адаптация сердечно-сосудистой системы к экстремальным условиям у нормотермных и зимоспящих животных. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2007, стр. 84-87.

6. Ненов М.Н.. Грушин К.С., Пименов О.Ю. Аргинин ингибирует амплитуду Са2+ тока L-типа в кардиомиоцитах рецепторно, активируя N0 - синтазу. Всероссийская конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и медицина» Санкт-Петербург, СПбГУ, 2008, стр. 254-255.

7. Nenov M.N.. Pimenov O.Yu., Grushin K.S., Dynnik V.V., Kokoz Yu.M. The Receptor Role Of Arginine In The Regulation Of L-Type Ca2+ Current By The NO-cGMP Cascade. Biological motility. Pushchino, 2008, v.l, p. 172-174.

8. Ненов M.H.. Грушин K.C., Пименов О.Ю. Роль альфа2-адренорецепторов в реализации "аргининового парадокса" в изолированных кардиомиоцитах крыс SD и SHR. Всероссийская конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и медицина». Санкт-Петербург, СПбГУ, 2009, стр. 265-266.

9. Nenov М.. Grushin К.,. Pimenov О, Dynnik V., Kokoz Y. L-arginine Decreases L-type Ca2+ Current Through Receptor Activation Of NO-cGMP Cascade. Enigma Of "Arginine Paradox". Biophysical Journal, 2009, Volume 96, Issue 3, Pages 172a-173a

10. Ненов M.H.. Бережное A.B., Федотова Е.И., Дынник В.В., Грушин К.С., Пименов О.Ю., Семушина С.Г., Пахомова И.А., Мурашев А.Н., Зинченко В.П., Кокоз Ю.М. Активация <Х2-адренорецепторов L-аргинином в кардиомиоцитах крыс SD и SHR. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2009, стр. 143-148.

Подписано в печать:

12.11.2009

Заказ № 3029 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ненов, Мирослав Николаевич

Список сокращений

Введение

1 .Обзор литературы

1.1.L-Аргинин

1.1.1. Действие L-аргинина на сердечно-сосудистую систему в экспериментальных и клинических исследованиях

1.1.2. «Аргининовый парадокс» 1 з

1.2. NO-синтазы и NO-cGMP сигнальный каскад

1.2.1. Классификация, характеристика и структура NO-синтаз

1.2.2. Регуляция активности NO-синтаз

1.2.3 Роль конститутивных NO-синтаз в сердце

1.2.4 Оксид азота - NO

1.2.5 Биологические эффекты NO

1.2.6 Гуанилатциклаза

1.2.7 cGMP-зависимая протеинкиназа

1.3. Типы потенциал-зависимых Са -каналов и их классификация

1.3.1. Структура потенциал-зависимых Са2+-каналов

1.3.2. Регуляция Са2+ канала L-типа серин/треониновыми протеинкиназами

2. Материалы и методы исследования

2.1. Выделение клеток

2.2. Метод перфорированного пэтча

2.2.1. Растворы

2.2.2. Приготовление и заполнение пипеток

2.2.3. Регистрация токов

2.3. Флуоресцентная микроскопия

2.3.1. Прокраска клеток

2.3.2. Измерение продукции N0 и [Са2+]г 54 3. Результаты и обсуждения

3.1. Исследование действия L-аргинина на базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс Spraque Dawlay

3.2. Исследование действия L-аргинина на базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SD на фоне ингибиторов NO-cGMP каскада

3.3. Исследование действия L-аргинина па базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SD на фоне антагонистов а2-адренорецепторов и ингибиторов PI3K-Akt сигнального каскада

3.4. Исследование действия агматина на базальную амплитуду

Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SD

3.5. Исследование действия гуанабенц ацетата на базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SD на фоне ингибиторов PI3K-akt и NO-cGMP сигнальных каскадов

3.6. Исследование действия L-аргинина и гуанабенц ацетата на базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SHR

3.7. Изменение скорости продукции оксида азота в кардиомиоцитах при дополнительном введении 5шМ аргинина или гуанабенц ацетата на фоне электрической стимуляции в кардиомиоцитах крыс SD и SHR 80 Заключение

Выводы

Цитируемая литература

Список сокращений. сАМР - циклический аденозинмонофосфат cGMP - циклический гуанозинмонофосфат

РКА - сАМР-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А)

РКВ - протеинкиназа В (протеинкиназа Akt)

PKG - cGMP-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа G)

РКС - протеинкиназа С

PDE - фосфодиэстераза

PI3K - фосфотидилинозитол-3 киназа

PDK - фосфотидилинозитол-зависимая киназа

NFAT - ядерный фактор активированных Т-клеток

NOS - NO-синтаза nNOS - нейрональная NO-синтаза eNOS - эндотелиальная NO-синтаза iNOS - индуцибельная NO-синтаза

СаМ - кальмодулин sGC - цитозольная гуанилатциклаза

SD - Spraque Dawlay крысы

SHR - спонтанно-гипертензивные крысы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция Ca2+ токов L-типа L-аргинином через активацию α2-адренорецепторов в изолированных желудочковых кардиомиоцитах"

L-аргинин - условно незаменимая аминокислота, которой наука и медицина в последние десятилетия уделяет большое внимание. Исследования по действию L-аргинина па сердечно-сосудистую систему показывают, что данная аминокислота может использоваться в качестве профилактики и при лечении сердечнососудистых заболеваний - стенокардии, гипертензии, коронарной болезни, гипертрофии миокарда, сердечной недостаточности и т.д. (Appleton J., 2002; Gornik H.L. and Creager M.A., 2004). В организме из L-аргинина группой ферментов NO-синтаз синтезируется оксид азота (N0). Оксид азота активирует гуанилатциклазу, что приводит к росту cGMP и активации протеинкиназы G (NO-cGMP сигнальный каскад). Большинство эффектов L-аргинина связаны с модуляцией активности NO-синтаз и NO-cGMP каскада. Отклонения от нормы в синтезе NO и нарушения biзапускаемом им NO-cGMP каскаде могут приводить к развитию гипертензии, эректильной дисфункции, сердечной недостаточности, гипертрофии миокарда и т.д. Часто, эти процессы могут сопровождаться нарушением в работе Са2+-транспортирующих систем, регулируемых NO-cGMP сигнальным каскадом. Так известно, что в сердечнососудистой системе NO-cGMP каскад принимает участие в модуляции активности Са2+ каналов L-типа, которые играют важную роль в формировании потенциала действия, электромеханическом сопряжении, регуляции частоты и силы сердечных сокращений. Нарушения в работе NO-cGMP каскада могут приводить к Са2+ перегрузке кардиомиоцитов, связанной с Са2+ каналами L-типа и активации сигнальных каскадов (кальциньюрин/NFAT сигнальный каскад), принимающих участие в развитие нефункциональной гипертрофии миокарда, что в'Конечном счете может приводить к сердечной недостаточности (Kempf Т. end'Wollert К. С., 2004). Нарушения в работе NO-cGMP каскада и Са2+ каналов L-типа отмечается у спонтанно-гипертензивных крыс (Shorofsky S.R. et. а!.,

1999). Также значительные нарушения Са2+ гомеостаза и изменения в функционировании Са каналов L-типа отмечаются у животных с нокаутами по генам NO-синтаз (Wang Н. et. al., 2008). Поэтому при исследовании функционирования NO-cGMP каскада в сердечнососудистой системе, для целости картины, нужно пытаться учитывать как модуляцию синтеза NO и N0у. cGMP каскада, так и регуляцию им Са транспорта.

Однако, исследования о влиянии NO-cGMP каскада на активность Са2+ канала L-типа носят противоречивый характер, доноры оксида азота и активаторы протеинкиназы G либо не оказывают эффект на Са2+ токи, либо ингибируют их, либо активируют. Столь противоречивые результаты связывают как с прямым нитрозилированием Са2+ канала L-типа, так и с рефляцией его фосфорилирования cGMP-завиеимыми фосфодиэстеразами II и

III типа и протеинкиназой G (Gallo М.Р. et al., 1998; Imai Y. et al., 2001; Mery

P.F. et al, 1991; Hartzell H.C. and Fischmeister R., 1986; Fishmeister R. and Hartzell

H.C., 1987; Sumii K. and Sperelakis N., 1995; Tohse N. and Sperelakis N., 1991).

Расхождения в результатах объяснялись особенностями регуляции Са2+ каналов в синусе, предсердиях, желудочках или в разных видах животных.

Противоречивые результаты наблюдались и при' исследовании животных с нокаутами по генам NO-синтаз (Vandecasteele G. et. al., 1999; Wang H. et. al.,

2008). Одной из причин различных результатов также может быть отсутствие Lаргинина (субстрата NO-синтаз) в экспериментальных средах. Так показано, что добавление этой аминокислоты в экспериментальный раствор улучшает брадикинин-вызванную продукцию NO и подавление изопротеренол

21. актививированных Са каналов L-типа интерликином-1 (Rozanski G.J. and Witt R.C., 1994; Flam B.R. at. ah, 2001).

Следует учесть, что на сегодняшний день также' не до конца понятна регуляция активности NO-синтаз и NO-cGMP каскада L-аргинином. Положительные эффекты L-аргинина, оказываемые им при лечении ряда заболеваний и связанные с регуляцией активности NO-синтаз, вызывают большой интерес в научном сообществе. В организме уже содержится достаточное количество L-аригинина для поддержания нормальной активности NO-синтаз. Так содержание L-аргинина в плазме крови достигает 400мкМ, а эндотелиальные клетки могут накапливать его до 2 мМ, при этом Km всех форм NO-синтаз для L-аргинина варьирует в пределах 2-10 мкМ. Тем не менее, экзогенно-добавленный in vivo, in situ и in vitro L-аргинин способен модулировать активность NO-синтазы, в научной литературе этот феномен известен как «аргининовый парадокс». Ситуация осложняется тем, что на сегодняшний день существует несколько гипотез о природе «аргининового парадокса»: недоступность внутриклеточного пула L-аргинина и близкое расположение NO-синтазы и переносчика L-аргинина (McDonald К.К. et. al. 1997; Li С. et. al., 2005); конкуренция NOS и аргиназы за субстрат (Li Н. et. al., 2001; Zhang С. et. al., 2001; Chicoine L.G. et. al., 2004); повышенное содержание конкурентного ингибитора - ассиметричного диметиларгинина (Boger R.H. 2004); действие L-аргинина через а2-адренорецепторы, модулирующие активность NOS (Joshi M.S. et al., 2007). Последняя гипотеза основана на том, что L-аргинин содержит гуанидиновую группу, поэтому существует вероятность взаимодействия L-аргинина или его декарбоксилированного производного - агматина с рецепторами, имеющими сродство к гуанидинам. Гипотеза рецепторного действия L-аргинина является последней по времени И' интересна тем, что, в отличие от предыдущих, не связана с субстратным действием L-аргинина. Настоящая работа является логическим продолжением работ,, проводящихся в нашей группе. В данной' работе уделяется особое I внимание как регуляции Са тока L-типа, так и NO-cGMP каскада L-аргинином в контексте «аргининового парадокса».

Цель данной работы - изучение возможности действия L-аргинина через а2-адренорецепторы на активность NO-cGMP каскада и на амплитуду Са2+токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах в норме и патологии. Задачи исследования:

1. Подобрать условия в которых эффект L-аргинина на амплитуду Са2+тока L-типа будет максимальным. Оценить, связан ли эффект, оказываемый L-аргинином на Са2+ток, с NO-cGMP сигнальным каскадом.

2. Исследовать рецепторную гипотезу «аргининового парадокса» т.е. влияние L-аргинина на активность NO-cGMP каскада и амплитуду Са2+ тока L-типа через его воздействие на а2-адренорецепторы.

3. Исследовать действие агматина, на амплитуду Са2+тока L-типа.

4. Исследовать рецепторную гипотезу «аргининового парадокса» и активность NO-cGMP каскада в изолированных кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс.

1. Обзор литературы 1.1. L-Аргинин.

L-Аргинин впервые был выделен из семян люпина в 1886 году, а в 1895 его идентифицировали как компонент животных белков. Аргинин (условно незаменимая аминокислота) в организме млекопитающих используется не только для синтеза белков, но и является предшественником креатина, мочевины и таких сигнальных молекул, как оксид азота (N0), глутамат и агматин. Аргинин (а-амино-8-гуанидино-валериановая кислота) одна из самых поляризованных, положительно заряженных аминокислот.

L-аргинин единственный субстрат в организме, из которого может синтезироваться N0. Синтез оксида азота из L-аригинина осуществляется группой ферментов NO-синтаз (NOS). Существуют три формы NO-синтаз -конститутивные, эндотелиальная - eNOS и нейрональная nNOS и индуцибельная (iNOS) (Alderton W.K. et al., 2001). Синтезируемый, оксид азота взаимодействует со своими мишенями, в частности с цитозольной гуанилатциклазой (sGC). Активированная оксидом азота sGC производит цГМФ из ГТФ. цГМФ в свою очередь активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу (протеинкиназа G, PKG). Оксид азота играет важную роль в поддержании нормального функционирования сердечнососудистой системы. Нарушение в синтезе N0 часто сопутствуют различного рода сердечнососудистых заболеваний, поэтому L-аргинин широко используется при лечении и профилактики данных патологий (Appleton J., 2002).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Ненов, Мирослав Николаевич

Выводы:

1. L-аргинин в концентрации 5мМ эффективно подавляет пиковую

2+ амплитуду Са токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах SD. Действие

2+

L-аргинина на Са ток реализуется через NO-cGMP каскад.

2. а^-адренорецепторы принимают участие в реализации «аргининового парадокса» в изолированных кардиомиоцитах SD. L-аргинин, взаимодействуя с о^-адренорецепторами через PI3K-Akt сигнальный путь,

2+ активирует NO-cGMP каскад и подавляет амплитуду С а тока L-типа.

2+

3. Эффект агматина на амплитуду Са тока L-типа не связан с его действием на а2-адренорецепторы и NO-синтазу

4. В кардиомиоцитах SHR «аргининовый парадокс» отсутствует. Скорость

2+ продукции оксида азота и амплитуда Са тока L-типа не изменяются в ответ на добавление L-аргинина. Реактивность а -адренорецепторов снижена.

Заключение

Основной проблемой в исследовании регуляции Са" каналов L-типа NO-cGMP каскадом было большое разнообразие получаемых результатов. Противоречия объяснялись либо спецификой cGMP-завиеимой регуляции у различных типов клеток и разных видов животных, либо различиями в экспериментальных методах. Нами было предположено, что при отсутствии в рабочих средах единственного эндогенного источника NO - L-аргинина. происходит изменение в функционировании NO-cGMP каскада, что и приводит к противоречивым результатам. Действительно, в наших экспериментах в условиях без L-аргинина также не наблюдалось какого-либо значимого эффекта при добавлении L-аргинина (1-5мМ). В присутствии 1мМ

L-аргинина во всех рабочих средах добавка 5мМ L-аргинина приводила к ji подавлению базального Са тока L-типа в кардиомиоцитах крыс SD. Эффект L-аргинина снимался 7NI, ODQ, КТ5823, что говорит о том, что действие этой аминокислоты на амплитуду Са тока связано с модуляцией активности NO-cGMP каскада и cGMP-зависимым фосфорилированием. Полученный результат моделирует «аргининовый парадокс», т.к. 5мМ L-аргинина оказывают эффект при том, что в растворе уже находится 1мМ этой аминокислоты. Получается, что в наших экспериментальных условиях (с избыточностью L-аргинина в среде) «аргининовый парадокс» хорошо выражен и легко оценивается по влиянию L-аргинина на амплитуду потенциал-зависимого Са2+ тока L-типа. Таким образом, появляется возможность исследовать природу «аргининового парадокса» на изолированных кардиомиоцитах. Нами была исследована рецепторная гипотеза «аргининового парадокса». Селективные антагонисты а2-адренорецепторов иохимбин и раувольсцин снимали эффект L-аргинина на

94амплитуду Са токов L-типа. Показано, что а2-адренорецепторы активируют NO-синтазу через PI3K-Akt сигнальный каскад. В наших экспериментах эффект L-аргинина на амплитуду Са тока снимался вортманнином и ингибитором Aktl/2 киназы, соответственно блокатарами PI3K и Akt. По аналогии с L-аргинином селективный агонист а2-адренорецепторов -гуанабенц ацетат подавлял амплитуду Са2+ тока в изолированных кардиомиоцитах. Эффект гуанабенц ацетата снимался вортманнином, 7NI, КТ5823. Однако существовало предположение, что не L-аргинин, а агматин (синтезируемый из L-аргинина) взаимодействует с сх2-ад ренорецепторами. Агматин также подавлял Са ток, однако, его эффект не снимался ни иохимбином, ни 7NI. Для дальнейшей проверки рецепторной гипотезы «аргининового парадокса» мы исследовали регуляцию скорости продукции

2-Ь оксида азота и

Са токов L-типа L-аргинином и гуанабенц ацетатом в кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс. L-аргинин не оказывал влияния на амплитуду Са тока, доза-зависимый эффект гуанабенц ацетата на кальцивае токи смешался вправо по сравнению с кардиомиоцитами SD. L-аргинин и гуанабенц ацетат также не оказывали влияния на скорость продукции оксида азота в кардиомиоцитах SHR по сравнению с SD. Полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии «аргининового парадокса» и снижении реактивности а2-адренорецепторов в кардиомиоцитах этих крыс.

На основе полученных результатов, можно сделать заключенее, что L-аргинин принимает участие в регуляции Са2+ токов L-типа» в изолированных кардиомиоцитах. Для достижения эффекта необходимо чтобы на момент своего действия L-аргинин уже присутствовал в экспериментальных растворах, что создает «аргининовый парадокс». В этих условиях дополнительный L-аргинин, взаимодействуя с а2-адренорецепторами, активирует NO-синтазу через PI3K-Akt путь, что приводит к GMP-зависимому подавлению амплитуды Са2+ тока L-типа. ,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ненов, Мирослав Николаевич, Пущино

1. Турпаев К.Т. Роль окиси азота в передаче сигнала между клетками // Молекулярная биология. 1998. V. 32. N. 4. Р. 581-591.

2. Adams M.R., Forsyth C.J., Jessup W., Robinson J., Celermajer D.S. Oral L-arginine inhibits platelet aggregation but does not enhance endothelium-dependent dilation in healthy young men. // J. Am. Coll. Cardiol. 1995. V. 26. P. 1054-1061.

3. Alden K.J., Goldspink P.H., Ruch S.W., Buttrick P.M., Garcia J. Enhancement of L-type Ca2+ current from neonatal mouse ventricular myocytes by constitutively active PKC-betall. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2002 V. 282 N. 4 P. 768-774.

4. Alderton W.K., Cooper. C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition //Biochem. J. 2001. V. 357. P. 593-615.

5. Alekseev A.E., Korystova A.F., Mavlyutova D.A., Kokoz Yu.M. Potential-dependent Ca2+ current in isolated heart cells of hibernators // Biochemistry and Molecular biology International. 1994. V. 33. N. 2. P. 365-376.

6. Aletta J.M., Cimato T.R., Ettinger M.J. Protein methylation: a signal event in post-translational modification. // Trends Biochem. Sci. 1998. V. 23 P. 89-91.

7. Alkon, D.L., Naito, S. Long-term synergistic regulation of ionic channels by C-kinase and Ca2+/CaM-type II kinase // Adv Exp Med Biol. 1987. V. 221. P. 275-290.

8. Altman J.D., Trendelenburg A.U., MacMillan L., Bernstein D., Limbird L., Starke K., Kobilka B.K., Hein L. Abnormal regulation of the sympathetic nervous system in оьд-adrenergic receptor knockout mice. // Mol. Pharmacol. 1999. V. 56. P: 154-161.

9. Appleton J. Arginine: Clinical Potential of a Semi-Essential Amino Acid // Alternative Medicine Review 2002. V. 7. N. 6. P. 512-522.

10. Arnar D.O., Xing D., Martins J.B. Alpha-2 adrenergic antagonism enhances risk of ventricular tachycardia during acute ischemia. // Scand Cardiovasc. J. 2007. V. 41(6) P. 378-385.14