Эффекты и механизмы действия сероводорода на сократительную функцию миокарда лягушки

Хаертдинов, Наиль Назимович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эффекты и механизмы действия сероводорода на сократительную функцию миокарда лягушки
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эффекты и механизмы действия сероводорода на сократительную функцию миокарда лягушки"

На правах рукописи

Хаертдшгов Наиль Назимович

ЭФФЕКТЫ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ СЕРОВОДОРОДА НА СОКРАТИТЕЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ МИОКАРДА ЛЯГУШКИ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00501394У

1 2 иА ° ¿0:2

Казань-2011

005013949

Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учрежде высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федераль университет» Федерального агентства по образованию и науке РФ на кафедре физиоло человека и животных

Научный руководитель (консультант) доктор биологических наук, профессор Ситдикова Гузель Фаритовна.

Официальные оппоненты:

Аникина Татьяна Андреевна доктор биологических наук, доцент. Казанский (Приволжски федеральный университет кафедра анатомии, физиологии и охраны здоровья челове профессор.

Тарасова Ольга Сергеевна доктор биологических наук, профессор. Московы государственный университет им. М. В. Ломоносова кафедра физиологии человека животных биологического факультета, профессор.

Ведущая организация Учреждение Российской академии медицинских наук НИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН (г. Москва).

Защита состоится «27» марта 2012 г. в «_» часов

на заседании диссертационного совета Д 212.078.02 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Федерального агентства по образованию и наук РФ по адресу: 420008, г. Казань, ул. Левобулачная, д. 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУВПО «Казанский (Приволжски} федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 35. Автореферат разослан « »_20_г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Зефиров Тимур Львович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Исследование механизмов внутрисердечной регуляции сократимости миокарда является одним из актуальных направлений в физиологии сердца. Достаточно подробно изучена роль холин- и адренергических факторов в регуляции деятельности сердца (О.С. Тарасова, 2005). Ведутся исследования об участии пуринорецспторов в регуляции работы сердца и сосудов в онтогенезе (Т.А. Аникина, Ф.Г. Ситдиков, 2011). Сероводород (H2S) - газ, обладающий хорошо известными токсическими эффектами, связанными с нарушением окислительного фосфорилирования в клетке (R.J. Reiffenstein et al., 1992). Однако, все больше данных свидетельствует о том, что H2S эндогенно синтезируется и оказывает физиологические эффекты в сердечнососудистой, нервной и эндокринной системах, а также в желудочно-кишечном тракте (Г.Ф. Ситдикова, A.JI. Зефиров, 2006, 2010, Е.В.Герасимова, Г.Ф. Ситдикова, 2008, G.F.Sitdikova, 2010, D.J. Elsey et al., 2010, H. Kimura et al., 2010). H2S был предположен в качестве эндогенного «газомедиатора» наряду с двумя другими физиологически активными газами - оксидом азота (NO) и монооксидом углерода (Г.Ф. Ситдикова, A.JI. Зефиров, 2006, 2010, MM. Gadalla, S.H. Snyder, 2010). В сердечно-сосудистой системе H2S синтезируется из L-цистеина цистатионин у-лиазой и 3-меркаптосульфтрансферазой (В. Geng et al., 2004, G. Yong et al, 2008, D.J. Elsey et al., 2010) и оказывает целый ряд эффектов, включая вазодилятацию, регуляцию пролиферации и апоптоза, ангиогенез (М.М. Gadalla, S.H. Snyder, 2010, Г.Ф. Ситдикова, А.Л. Зефиров, 2010). Имеются данные о кардиопротекторной роли H2S, выражающейся в уменьшении повреждений миокарда в условиях ишемии/реперфузии в экспериментах in vitro и in vivo (В. Geng et al., 2004, J.S. Bian, et al., 2006, D.J. Elsey et al., 2010). В единичных исследованиях показано, что H2S оказывает отрицательный инотропный эффект в сердце различных видов теплокровных животных и уменьшает длительность потенциала действия рабочих кардиомиоцитов (Д.В. Абрамочкин, 2009, В. Geng et al. 2004, Y.G. Sun, Y.X. Cao, W.W. Wang et al., 2008). Механизмы действия H2S малоизученны и включают, по разным данным, систему аденилатциклазы, АТФ-зависимые К-каналы и потенциал-зависимые Са-каналы L-типа в зависимости от вида животного (M. Xu et al., 2007, Y.G. Sun, Y.X. Cao, W.W. Wang et al., 2008, G. Yong, et al., 2008, Д.В. Абрамочкин, 2009). Показано влияние H2S на сосудистый тонус у всех классов позвоночных животных (рыб, амфибий, рептилий) и включает как вазоконстрикцию, так и вазодилятацию, что указывает на филогенетическую древность H2S как газомедиатора и универсальность его действия (R.A. Dombkowski et al. 2004, K..R. Olson, et al. 2005). Данные о действии H2S на сократимость миокарда холоднокровных животных отсутствуют. Таким образом, сведения о регуляции функций сердца с помощью нового газообразного посредника - H2S во многом фрагментарны, а молекулярные

мишени его влияния не определены. Поэтому исследование эффектов и мишеней действия экзогенного и эндогенного сероводорода на сократимость миокарда лягушки является актуальным.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось выявление эффектов и механизмов действия сероводорода на сократимость миокарда лягушки

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить действие донора сероводорода - гидросульфида натрия на сократимость миокарда лягушки.

2. Выявить эффекты субстрата синтеза сероводорода Ь-цистеина и блокаторов фермента синтеза газа цистатионин у-лиазы на сократимость миокарда лягушки.

3. Проанализировать роль потенциал-зависимых кальциевых каналов Ь-типа и внутриклеточных кальциевых депо в эффектах гидросульфида натрия на сократимость миокарда.

4. Выявить влияние гидросульфида натрия на сократимость миокарда на фоне активации и ингибирования различных типов калиевых каналов.

5. Проанализировать роль закисления внутриклеточной среды в отрицательном инотропном эффекте гидросульфида натрия.

6. Выявить роль системы аденилатциклазы в эффектах сероводорода.

7. Исследовать взаимодействие системы оксида азота и сероводорода в регуляции сократимость миокарда

8. Проанализировать влияние сероводорода в условиях активации Р-адренорецепторов и блокирования фосфодиэстераз.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экзогенный и эндогенный сероводород оказывает обратимый и дозозависимый отрицательный инотропный эффект и уменьшает максимальные скорости укорочения и расслабления в желудочковом миокарде лягушки.

2. Отрицательный инотропный эффект сероводорода в миокарде лягушки опосредуется снижением входящего кальциевого тока в результате активации АТФ-чувствительных К-каналов и цГМФ-стимулируемой фосфодиэстеразы II типа.

Научная новизна

В работе впервые показано, что гидросульфид натрия - донор Н^Б обратимо и дозозависимо снижал силу сократимости и уменьшал максимальные скорости укорочения и расслабления полоски миокарда лягушки. При этом субстрат синтеза сероводорода Ь-цистеин также оказывал отрицательный инотропный эффект, а блокатор цистатионин у-лиазы увеличивал амплитуду сокращения, что указывает на возможность

эндогенного синтеза П23 в сердце холоднокровных животных. Впервые исследованы внутриклеточные механизмы действия сероводорода в миокарде лягушки. Показано, что одной из мишеней действия Н25 являются АТФ-чувствительные калиевые каналы, активация которых вызывает гиперполяризацию мембраны, снижение входящего Са-тока и уменьшение силы сокращения. Впервые показано взаимодействие системы N0 и Н2Б в регуляции сократимости миокарда. Кроме того, впервые выявлена роль аденилатциклазной системы в эффектах НгБ. Предположено, что активация фосфодиэстераз, гидролизующих цАМФ, в частности фосфодиэстеразы II, при действии Н28, особенно в условиях активации Р-адренорецепторов, приводит к уменьшению уровня цАМФ в клетке и снижению входящего Са-тока, что сопровождается понижением силы сокращения.

Научно-практическая ценность

Полученные в работе данные расширяют представления о возможности регуляции сократительной функции миокарда эндогенными физиологически активными соединениями. Это, в частности, касается вопросов влияния газообразных посредников, имеющих уникальные свойства, отличающие их от классических медиаторов, на сократимость миокарда холоднокровных животных. Научную ценность представляют данные об участии АТФ-зависимых калиевых каналов и фосфодиэстераз в эффектах Н28, что в дальнейшем позволит провести эволюционный анализ механизмов регуляции инотропной функции сердца эндогенными газообразными посредниками как у холоднокровных, так и у теплокровных животных. Полученные данные имеют не только теоретическое, но и практическое значение при разработке средств фармакологической коррекции сердечной деятельности. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре физиологии человека и животных Казанского (Приволжского) федерального университета. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (09-04-00748); «Ведущая научная школа» (НШ-5250.2010.4), гранта К. Цейс.

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных данных подтверждалась использованием достаточного объема экспериментальных исследований, постановкой и решением поставленных задач, статистической обработкой полученных результатов.

Апробация работы

«Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущине, 2009, 2011), Всероссийском с международным участием, научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2009, 2010), международной конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2009, 2010), XX Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Калуга 2010), Международном симпозиуме «Biological motility» (Пущино, 2009), XVII и XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (МГУ, 2010, 2011), XV и XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, КГМУ, 2010, 2011), ежегодных научных конференциях в Казанском федеральном университете.

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 публикации в рецензируемых журналах (из списка ВАК).

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 120 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 310 источников, из них 34 - отечественных и 276 -иностранных авторов. Диссертация содержит 30 рисунков и 2 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 320 разнополых лягушках Rana ridibunda в осенне-зимний период. Эксперименты проводились с использованием миокарда лягушки. Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro изучали на изолированных полосках желудочков сердца с использованием метода тензометрии на установках Power Lab (AD Instruments, Австралия) или Biopac Systems, Inc. (США), оснащенных изометрическими датчиками силы MLT 050/D или TSD 125С с диапазоном измерений 0-50 грамм. Препарат стимулировали электрическими импульсами с частотой 0.1 Гц через два серебряных электрода. Запись кривой сокращения регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения "Chart 5.3". Сигналы обрабатывали с помощью программы Chart или Elf (автор А.В.Захаров), силу сокращения определяли в граммах. Оценивали амплитуду сокращения, а также максимальные скорости укорочения и расслабления. Статистический анализ проводили с помощью стандартных методов, достоверность различий определяли с помощью параметрического t-критерия Стыодента (Г.Ф. Лакин, 1973).

Наркотизированное животное фиксировали, вскрывали грудную клетку и быстро извлекали сердце, которое помещали в специальную ванночку со стимуляцией. Из ткани миокарда желудочков вырезались полоски длиной 4-6

мм и шириной 0.8-1.0 мм. Препарат фиксировали вертикально одним концом к датчику, другим - к фиксирующему блоку и помещали в резервуар объемом 20 мл, в который подавался раствор Рингера для холоднокровных животных, содержащим в мМ: 118.0 NaCl, 2.5 KCI, 1.8 CaCl, 10 Trizma (рН -7.3-7.4 Т=20°С). После погружения препарата в резервуар следовал «период приработки» в течение 40-60 мин, в ходе которого мышечным волокнам постепенно придавалось оптимальное натяжение. По окончанию приработки регистрировались исходные параметры сокращения в течение 5 мин, после чего в резервуар добавлялись фармакологические агенты. По окончании регистрации фармакологических веществ, препарат изолированной полоски миокарда отмывали рабочим раствором в течение 10 минут.

В качестве донора H2S использовали гидросульфид натрия (NaHS), так как в водном растворе он диссоциирует до Na2+ и HS", затем HS" связывается с Н+ с образованием H2S. В нейтральном растворе одна треть NaHS находится в виде газа - H2S и оставшиеся две трети - в виде HS" (R.O. Beauchamp et. al., 1984). В экспериментах использовали: блокаторы и активаторы ионных каналов - нифедипин, глибенкламид, миноксидил, тетраэтиламмоний (TEA), NS 8593, 4-аминопиридин (4-АП), кофеин, субстрат синтеза II2S - L-цистеин, блокаторы цистатионин у-лиазы - р-цианоаланин и пропаргилглицин, неспецифичный блокатор фосфодиэстераз - 3-isobutyl-l-methy)xanthine (IBMX), аналоги циклических нуклеотидов - 8ВгсАМР, 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt (pCPT-cAMP), ингибитор аденилатциклазы — cisN-(2-phenylcyclopentyl) azacyclotridecl-en-amine hydrochloride (MDL-12,330A), блокатор NO-синтазы -№-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME), донор NO - S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), блокатор фосфодиэстеразы II - erytro-9-(2-hydroxy-3nonyl)-adenine) hydrochloride (EHNA), агонист p-адренорецепторов -изопротеренол. Вещества, нерастворимые в воде, растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). Концентрация ДМСО в подаваемых растворах не превышала 0.1%, в данной концентрации ДМСО в контрольных экспериментах не оказывал влияния на силу сокращения миокарда. Все использованные вещества фирмы Sigma (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Эффекты донора H2S - NaHS на сократимость изолированной полоски миокарда желудочка. Аппликация NaHS, донора H2S, в концентрациях 10-500 мкМ приводила к дозозависнмому снижению силы сокращения изолированной полоски миокарда желудочка. Была выявлена эффективная концентрация (ECS0) NaHS, которая составила 38±14 мкМ (Рис. 1 А, Б). Отрицательный инотропный эффект NaHS наблюдался с первых минут аппликации и выходил на плато к 20 мин эксперимента (Ркс.1 А). Таким образом, NaHS оказывает отрицательный инотропный эффект в миокарде лягушки. Подобное действие NaHS также наблюдалось и у теплокровных животных (G. Yong, 2008; K.R. Olson, 2008). В дальнейших

экспериментах использовали ЫаНБ в концентрации 100 мкМ, который к 20 мин эксперимента снижал силу сокращения полоски миокарда до 66±6% (п=14, р<0.05).

А Б

мин [№Н8|, мМ

Рис. 1. Отрицательный инотропкый эффект N»118 в миокарде желудочка лягушки.

А - Изменение амплитуды сокращений полоски миокарда при действии №Н5 (100 мкМ) во времени. На вкладке показаны механограммы сокращения полоски миокарда в контроле и к 20 минуте аппликации ИаНЗ,

Б - дозозависимость эффекта ЫаНБ на амплитуду сокращения миокарда лягушки.

Влияние субстрата синтеза Н28 - Ь-цистеина и блокаторов фермента синтеза Н28 на амплитуду сокращения изолированной полоски миокарда. Для выявления возможности эндогенного синтеза Н28 использовали Ь-цистеин и блокаторы цистатионин у-лиазы - одного из известных ферментов синтеза Н28 в миокарде. При добавлении Ь-цистеина в концентрации 200 мкМ наблюдалось снижение амплитуды сокращения полоски миокарда до 83±6% (п=6, р<0.05), а в концентрации 1 мМ Ь-цистеин угнетал силу сократимости до 58±4% (п=7, р<0.05) относительно контрольных значений к 20 мин аппликации (Рис. 2 А, Б). Для блокирования цистатионин у-лиазы использовали р-цианоаланин и пропаргилглицин в концентрациях 500 мкМ. Аппликация ¡5-цианоаланина приводила к повышению силы сократимости миокарда до 117±6% (п=8, р<0.05) относительно контрольного уровня, а пропаргилглицина - до 112±3 % (п=8, р<0.05) к 15 мин аппликации (рис. 2 Б). Таким образом, эндогенно синтезируемый Н28 вызывал такие же эффекты, что и экзогенно апплицируемый, а блокаторы цистатионин у-лиазы приводили к противоположному эффекту. В условиях блокирования цистатионин у-лиазы

р-цианоаланином аппликация Ь-цистеина в концентрациях как 200 мкМ, так и 1 мМ не вызывала отрицательного инотропного эффекта.

« з

с ¡0

с Ï

« 0-1--г-1-.— —.—-L-,-

L «сосен-4 J npwisrn-

1300 мкМ S0C м <V nniv» оЗОккН

Рис. 2. Влияние субстрата и блокаторов синтеза сероводорода на сократимость миокарда

А - Динамика изменения силы сокращения при действии субстрата синтеза HjS L-цистеина в концентрации I мМ. На вкладке показаны оригинальные записи сокращений в контроле и при действии L-цистеина к 20 мин аппликации.

Б - Изменение силы сокращения миокарда при действии L-цистеина (1 мМ) и блокаторов цистатионин у-лиазы - Р-цианоланина (500 мкМ) и пропаргилглицина (500 мкМ). *р<0.05

Роль Са-каналов в эффектах NaHS на сократимость изолированной полоски миокарда желудочка. Известно, что ионы Са играют ключевую роль в регуляции сократимости миокарда. В ответ на деполяризацию мембраны кардиомиоцитов происходит открытие потенциал-зависимых Са-каналов L-типа, вход Са , который вызывает высвобождение Са2+ из внутриклеточных Са-депо через рианодиновые рецепторы и запускает процесс мышечного сокращения (M. D. Bers, 2002). Отрицательный инотропный эффект NaHS может быть связан с угнетением потенциал-зависимых Са-каналов L-типа, тем более, подобное влияние NaHS наблюдалось в кардиомиоцитах крысы (Y.G. Sun et al., 2008). Для блокирования потенциал-зависимых Са-каналов L-типа использовали нифедипин в концентрации 10 мкМ. Нифедипин приводил к снижению силы сокращения до 75±5% (п=5 р<0.05) (Рис. 3 А,Б). На фоне действия нифедипина NaHS уменьшал амплитуду сокращения до 72±2% (п=5, р<0.05) (Рис ЗБ), что не отличалось от значений, полученных в контроле при аппликации NaHS. Следовательно, в сердце лягушки отрицательный инотропный эффект NaHS не связан с угнетением входящего Са-тока.

Для исследования роли внутриклеточных Са-депо в эффектах NaHS использовали кофеин, активирующий рианодиновые рецепторы саркоплазматического ретикулума. Аппликация кофеина в концентрации 3 мМ приводила к увеличению амплитуды сокращения миокарда до 127±11% (п=6, р<0.05). Эффект NaHS на фоне действия кофеина полностью

мин

сохранялся и к 20 мин аппликации составил 48±5% (п=6, р<0.05) (Рис. ЗБ). Таким образом, отрицательный инотропный эффект Й^Б в миокарде лягушки не связан с его влиянием на выброс ионов Са из внутриклеточных Са-депо.

Рис.3. Роль потенциал-зависимых Са-каиалов и внутриклеточных Са депо в отрицательном инотропном эффекте NaHS

А- Динамика изменения силы сокращения при ингибировании Са-каналов L-типа нифедипииом (10 мкМ).

Б - Изменение силы сокращения при аппликации NaHS, нифедипина, кофеина и NaHS на фоне действия нифедипина и кофеина. При анализе эффектов NaHS за 100% принимались значения, полученные в контроле и на фоне действия нифедипина и кофеина. *р<0.05

Роль К-каналов в отрицательном инотропном эффекте NaHS в изолированной полоске миокарда лягушки. Известно, что целый ряд К-токов участвует в реполяризации мембраны кардиомиоцитов в различные фазы потенциала действия. К ним можно отнести два типа быстро активирующихся и инактивирующихся К-токов (Ito,f и Ito,s) и несколько компонентов К-токов задержанного выпрямления, включающих IKr (rapid), IKs (slow), IKur (ultrarapid) и др. (J.M. Nerboime, 2005, J. Tamargo et al., 2004). Кроме того, в регуляции длительности потенциала действия и сократимости миокарда могут принимать участие и недавно выявленные в сердце теплокровных животных Са-активируемые К-каналы малой проводимости (Y. Xu et al, 2003).

Для ингибирования К-каналов использовали неселективный блокатор К-каналов TEA. Аппликация TEA в концентрациях от 3 до 10 мМ. увеличивала силу сократимости полоски миокарда до 159±24% (п=5, р<0.05), 202±23% (п=7, р<0.05) и 194±12% (п=4, р<0.05) (Рис. 4) относительно контрольных значений, соответственно. На фоне действия TEA во всех используемых концентрациях отрицательный инотропный эффект NaHS полностью сохранялся (рис. 4). Для блокирования потенциал-зависимых К-каналов использовали 4-аминопиридин (4-АП) в концентрациях 2.5 и 5 мМ. 4-АП в обеих концентрациях приводил к увеличению амплитуды сокращения

полоски миокарда до 133±12% (п=11, р<0.05) и 191±30% (п=7, р<0.05), соответственно (Рис. 4). Эффект НаШ на фоне действия 4-АП полиостью сохранялся (Рис. 4).

Рис. 4. Влияние NaHS на амплитуду сокращений миокарда в условиях ингибнрования калиевых каналов разных типов

На диаграмме показан эффект NaHS в контроле, тетраэтиламмония (TEA) в разных концентрациях (3, 5, 10 мМ), 4-аминопиридина (4-АП) (5 мМ) и NaHS на фоне действия блокаторов. При анализе эффектов NaHS за 100% принимались значения, полученные в контроле и на фоне действия ТЭА или 4-АП.

*р<0.05

Известно, что Са-активируемые К-каналы могут быть мишенью действия H2S (G.F. Sitdikova, 2010), активация которых в сердце теплокровных животных приводит к укорочению потенциала действия и снижению амплитуды сокращения миокарда. Блокатор Са-активируемые К-каналы малой проводимости - NS 8593 в концентрации 1 мкМ не приводил к достоверным изменениям амплитуды сокращения полоски миокарда. Эффект NaHS в данных условиях полностью сохранялся. Полученные данные свидетельствуют, что отрицательный инотропный эффект NaHS в миокарде лягушки не связан с изменением работы потенциал-зависимых и кальций-активируемых К-каналов.

Роль АТФ-чувствительных К-каналов в эффектах сероводорода.

Одним из известных механизмов действия H2S в гладких мышцах сосудов и кардиомиоцитах крысы является активация АТФ-зависимых К-каналов (К(АТФ)-каналы) (В. Cheng, 2004, W. Zhao, 2001, Д.В. Абрамочкин, 2009).

Для активации К(АТФ)-каналов использовали миноксидил (100 мкМ) и диазоксид (200 мкМ). При добавлении миноксидила происходило уменьшение силы сокращения полоски миокарда до 51±7% (п=5, р<0.05), диазоксида - до 68±8% (п=12, р<0.05).

« в

а ¡с о и

4 в и

100 -80 ео

40 20

■Х° ¿Г

глибенкламид 50 ЖМ

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 мин

Рис. 5. Роль К(АТФ)-каналов в эффектах сероводорода на силу сокращения миокарда лягушки

А - На диаграмме показаны амплитуды сокращений миокарда при действии N¡1(18 в контроле, миноксидила (100 мкМ), диазоксида (200 мкМ) и №Н8 на фоне действия данных соединений. При анализе эффектов №Н8 за 100% принимались значения, полученные на фоне действия миноксидила или диазоксида. * - р<0.05

Б - Пример эксперимента, в котором блокатор К(АТФ)-канапов глибенкламид 50 мкМ восстанавливает силу сокращения миокарда после действия ИаНБ.

На фоне миноксидила отрицательный инотропный эффект ИаНБ сохранялся, амплитуда сокращений уменьшалась до 61 ±6% (п=5, р<0.05) (Рис. 5 А), однако, на фоне действия диазоксида ЫаНБ не приводил к изменениям амплитуды сокращения, которая к 20 мин составила 91±10 (п=10, р>0.05) (Рис. 5 А). По-видимому, эффект миноксидила в миокарде лягушки не является специфичным для К(АТФ)-каналов, а снижение силы сокращения при действии миноксидила может быть связано с ингибированием Са-каналов Ь-типа, показанное в желудочковых кардиомиоцитах морской свинки (Б. НауавЫ , 1993). Блокатор К(АТФ)-каналов глибенкламид в концентрации 50 мкМ не изменял достоверно силу сокращения полосок миокарда 108±5% (п=12, р<0.05). В условиях блокирования К(АТФ)-каналов глибенкламидом, N8143 снижал силу сокращения миокарда до 78±1% (п=13, р<0.05), что достоверно меньше

эффекта NaHS в контроле. Было предположено, что снижение силы сокращения при действии NaHS может быть связано с активацией К(АТФ)-каналов. Эту гипотезу подтвердили эксперименты, в которых глибенкламид апплицировали после развития эффекта NaHS. В результате добавления глибенкламида происходило восстановление амплитуды сокращения полоски миокарда в среднем на 16±4% (п=5, р<0.05) (Рис.5 Б). Полученные данные указывают, что К(АТФ)-каналы участвуют в реализации отрицательного инотропного эффекта NaHS в миокарде лягушки.

Эффекты сероводорода на фоне закислення внутриклеточной среды кардиомиоцитов. Известно, что внутриклеточный рН играет важную роль в регуляции сократимости миокарда. «Закисление» внутриклеточной среды кардиомиоцитов сопровождается накоплением ионов Са в результате изменения направления работы Na/Са-обменника и снижения функциональной активности Са-насосов плазматической мембраны и саркоплазматического ретикулума, уменьшением чувствительности миофибрилл к ионам Са. В результате происходит снижение сократительной функции миокарда. Имеются данные о том, что H2S вызывает закисление внутриклеточной среды в гладкомышечных клетках аорты крысы путем активации С17НС03' обменника, что частично опосредует HjS-вызванную вазорелаксацию (S.W. Lee et al., 2007). Кроме того, накопление избыточного количества протонов (Na+, Н+) в кардиомиоцитах происходит и при некоторых патофизиологических состояниях в условиях анаэробного гликолиза. Учитывая, что H2S в высоких концентрациях может нарушать процессы окислительного фосфорилирования, сопровождающееся закислением внутриклеточной среды, исследовали эффекты газа на фоне действия пропионата натрия, который проникая через клеточную мембрану, закисляет содержимое клетки. В данной серии экспериментов регистрацию силы сокращений в контроле осуществляли в растворе пропионата натрия в концентрациях 20 и 40 мМ. Эффект NaHS на фоне действия пропионата полностью сохранялся и составил 66±6 (п=4, р<0.05), 63±13% (п=8, р<0.05) по отношению к начальному уровню, что не отличается от действия NaHS в контроле.

Роль адеиилатциклазной системы в эффектах сероводорода на сократимость миокарда. В нервной системе и кардиомиоцитах теплокровных животных эффекты H2S могут быть опосредованы через изменение уровня цАМФ (Q.C. Yong, 2008, H.Kimura 2000). Увеличение уровня цАМФ является механизмом регуляции сократимости миокарда в ответ на активацию (З-адренорецепторов. Для блокирования синтеза цАМФ использовали MDL-12,330A в концентрации 3 мкМ, аппликация которого приводила к понижению силы сокращения миокарда до 81±3% (n=l 1; р<0,05) (Рис. 6). Эффект NaHS на фоне действия MDL-12,330A был выражен в

меньшей степени, чем в контроле и составил 87±2% (п=13, р<0.05) (Рис 6) по отношению к начальному уровню.

Для увеличения концентрации цАМФ использовали мембранопроникающие аналоги - 8ВгсАМР и рСРТсАМР в концентрации 100 мкМ. Аппликация 8ВгсАМР или рСРТсАМР не приводила к достоверным изменениям амплитуды сокращения. К 20 мин действия 8ВгсАМР сила сокращения полоски миокарда составила 101±5% (п=5, р>0.05), а рСРТсАМР - 110±11% (п=5, р>0.05) (Рис.6) по отношению к контрольным значениям. Добавление ЫаНЯ на фоне действия 8ВгсАМР снижало сократимость полоски до 70±6% (п=5, р<0.05) и до 57±11% (п=5, р<0.05) в случае рСРТсАМР (Рис. 6). Таким образом, эффект на фоне действия аналогов цАМФ сохранялся в той же степени, что и в контроле.

Другим способом увеличения уровня цАМФ в клетке является ингибирование фосфодиэстераз. Неспецифический блокатор фосфодиэстераз 1ВМХ (200 мкМ) приводил к увеличению силы сокращения до 120±4% (п=7, р<0.05) к 8 минуте аппликации, что, по-видимому, связано с накоплением цАМФ в кардиомиоцитах (Рис. 6). На фоне повышения уровня эндогенных циклических нуклеотидов НаШ снижал силу сокращения полоски миокарда до 82±4% (п=5) и этот эффект был достоверно меньше, чем эффект донора Н28 в контроле (р<0.05) (Рис. 6).

120-

110-

£ 100-

X 90-

(1)

3 <в 80-

а ¡с 70-

Л 60-

я Т 50 -

>> 1- 40-

X с; 30-

с 20-

< 10-

о!

Л'"

/у

Рис. 6. Влияние гидросульфида натрия в условиях понижения и повышения уровня циклических нуклеотидов.

Представлены амплитуды сокращения миокарда при действии Ь'аШ (100 мкМ) в контроле, МЭЫ2,330А (3 мкМ), 1ВМХ (200 мкМ), рСРТсАМР (100 мкМ) и ЫаН5 на фоне действия указанных агентов. При анализе эффектов КаШ за 100% принимались

значения, полученные в контроле и на фоне действия МОЬ-12,ЗЗОА, 1ВМХ, рСРТсАМР, соответственно.

*- р<0.05

Таким образом, эффект НгЗ частично снимался в условиях ингибирования аденилатциклазы или блокирования фосфодиэстераз, что подтверждает участие цАМФ-зависимых путей в регуляции сократимости при действии газа. Отсутствие эффекта рСРТсАМР или 8ВгсАМР на силу сокращения миокарда свидетельствует о том, что они не могут имитировать ситуацию, при которой повышается эндогенный уровень цАМФ (как в случае с 1ВМХ). Кроме того, одним из ключевым факторов влияния цАМФ на сократимость является компартментализация этого циклического нуклеотида вблизи мишеней действия, а повышение общего уровня циклического нуклеотида недостаточно для специфической регуляции белковой мишени (М. 2ассо1о е1 а!., 2009). Полученные данные указывают на то, что отрицательный ннотропный эффект в миокарде лягушке может быть

связан с активацией фосфодиэстераз, гидролизующих цАМФ вблизи потенциал-зависимых Са-каналов и снижающих, соответственно, количество активных цАМФ-зависимых протеинкиназ.

Роль оксида азота в эффектах сероводорода на сократимость миокарда. Известно, что N0 является важным регулятором силы сокращения в миокарде у лягушки (1.М. СЬевгшБ, Л. р1ХсЬте1$1ег, Р.Н. Мёгу, 1999). Исходя из данных о взаимодействии N0 и Н25 в регуляции сосудистого тонуса (Л.Но5о!а е! а!., 1997, З.КиЬо ее а!., 2007), нами был проведён анализ эффектов ИаНБ в условиях ингибирования синтеза N0 и повышения его эндогенной концентрации. Блокатор различных форм N0-синтаз Ь-ИАМЕ (100 мкМ) приводил к повышению амплитуды сокращений, которая к 15 мин аппликации составила 115±4% (п=7, р<0.05) (Рис. 7 А). В условиях блокирования синтеза N0 КаШ снижал силу сокращений миокарда до 65±8% (п=7) (Рис.7 А), что не отличалось от эффекта Н28 в контроле и указывает на отсутствие влияние ЫаНБ на синтез N0. Донор N0 - БИАР в концентрации 10 мкМ уменьшал сократимость миокарда до 86±5% (п=10, р<0.05) (Рис. 7 А). На фоне действия ЭЫАР отрицательный инотропный эффект ЫаНБ был значительно меньше выражен, чем в контроле и составил 89±2% (п=11, р<0.05) (Рис. 7 А). Полученные данные указывают на участие сигнальных путей, запускаемых N0 в эффектах ИаН8. Известно, что отрицательный инотропный эффект N0 в миокарде лягушки опосредуется увеличением уровня цГМФ, мишенью которого является цГМФ-зависимая фосфоднэстераза (фосфодиэстераза II), активация которой ведет к понижению уровня цАМФ, угнетению Са-тока и снижению силы сокращения (М. ОШпсЬ е1 а1., 2001). Было предположено, что предварительная аппликация донора N0 приводит к активации фосфодиэстеразы II и снижению уровня цАМФ. В этих условиях эффект

ИаНБ уменьшался, что указывает на возможное участие фосфодиэстеразы этого типа в эффекте Н28 Для подтверждения этой гипотезы использовали специфический блокатор цГМФ-стимулируемой цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы (II типа) ЕНЫА в концентрации 30 мкМ. На фоне действия ЕНЫА отрицательный инотропный эффект №Ш не проявлялся, и к 20 мин аппликации сила сокращения миокарда составила 95±11% (п=6, р>0.05) (Рис. 7 А).

125

о-

>s~ 10»

а 75

ге

а 50

о 25

к 0

гт

гЬ

ifi

О? J^ > rS , ,

200

180

г« 160

>£ X 140

120

3 ге 100

о. 8(1

о а 60

(9 40

S О 20

Рис. 7. Роль оксида азота, р-адренорсцепторов и фосфодиэстеразы II в эффектах сероводорода

А - Показаны амплитуды сокращений миокарда при действии NaHS в контроле, LNAME (100 мкМ), SNAP (10 мкМ) и NaHS на фоне действия LNAME (100 мкМ), SNAP (10 мкМ) и EHNA (30 мкМ).

Б - На диаграмме показаны амплитуды сокращений миокарда при действии NaHS в контроле, изопротеронола (ISO) (1 мкМ), NaHS на фоне ISO (I мкМ) и ISO (1 мкМ)+1ВМХ (200 мкМ).

При анализе эффектов NaHS за 100% принимались значения, полученные на фоне действия вышеперечисленных веществ.

* - р<0.05

Эффекты сероводорода в условиях, активации р-адрсиорецепторов и блокирования фосфодиэстераз. Для активации Р-адренорецепторов в кардиомиоцитах использовали изопротеренол в концентрации 1 мкМ. Аппликация изопротеренола вызывала увеличение силы сократимости миокарда до 170±16% (п=11, р<0.05) (рис. 7 Б). Эффект ЫаШ на силу сокращения миокарда в условиях предварительной активации р-адренорецепторов изопротеренолом составил 28±4% (п=5, р<0.05) (рис. 7 Б), что достоверно больше, чем действие ИаНБ в контроле. По-видимому, это указывает на участие внутриклеточных систем, запускаемых при активации Р-адренорецепторов в эффектах 1123. Для подтверждения нашей гипотезы об участии фосфодиэстераз в эффектах ЫаНБ использовали одновременную

аппликацию изопротеренола и IBMX. В условиях одновременной активации ß-адренорецепторов и блокирования фосфодиэстераз IBMX отрицательный инотропный эффект NaHS практически не проявлялся, амплитуда сокращений составила 90±3% (п=5, р>0.05) (рис. 7 Б). Для подтверждения нашей гипотезы об участии фосфодиэстеразы II в эффектах H2S использовали EHNA в концентрации 30 мкМ. В условиях одновременной активации ß-адренорецепторов и блокирования фосфодиэстеразы II отрицательный инотропный эффект NaHS также не проявлялся и амплитуда сокращений составила 94±7% (п=6, р>0.05)

На основании полученных данных можно предположить, что отрицательный инотропный эффект NaHS опосредуется активацией фосфодиэстеразы II, что приводит к уменьшению уровня цАМФ и снижению входящего Са-тока.

Заключение

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что донор сероводорода - NaHS оказывает отрицательный инотропный эффект в миокарде лягушки, уменьшая максимальные скорости укорочения и расслабления полоски. Субстрат синтеза ILS - L-цистеин вызывал снижение амплитуды сокращений миокарда аналогичное действию NaHS, тогда как блокаторы цистатношш у-лиазы вызывали противоположный эффект. При этом в условиях ингибирования цистатионин у-лиазы эффект L-цистеина не проявлялся, что указывает на возможность синтеза H2S в миокарде холоднокровных животных ферментом цистатионин у-лиаза. Анализ ионных механизмов действия H2S выявил отсутствие его влияния на потенциал-зависимые Са-каналы L-типа, Са-каналы внутриклеточных Са-депо, потенциал- и кальций-активируемые K-каналы малой проводимости. Использование активаторов и блокатора К(АТФ)-каналов позволило сделать заключение, что К(АТФ)-каналы участвуют в реализации отрицательного инотропного эффекта NaHS в миокарде лягушки. По-видимому, активация калиевой проводимости под действием H2S приводит к укорочению потенциала действия, снижению входящего Са-тока, что, в свою очередь, ведет к уменьшению силы сокращения миокарда.

Известно, что регуляция Са-тока и сократимости может осуществляться опосредовано через фосфорилирование протеинкиназами А потенциал-зависимых Са-каналов при повышении уровня цАМФ в ответ на активацию ß-адренорецепторов (T.J. Kamp et al., 2000). В наших экспериментах как снижение (блокирование аденилатциклазы), так и повышение эндогенного уровня цАМФ (блокирование фосфодиэстераз) уменьшало отрицательный инотропный эффект H2S. По-видимому, эффект NaHS реализуется путем уменьшения внутриклеточной концентрации цАМФ в результате снижения активности аденилатциклазы, либо активации фосфодиэстераз. Исследование взаимодействия двух систем газообразных

посредников - H2S и NO показало, что на фоне предварительной аппликации донора NO SNAP эффект NaHS был выражен в меньшей степени, чем в контроле, что может быть связано с участием сигнальных систем, активируемых N0 в эффектах H2S. Действительно, на фоне ингибирования цГМФ-активируемой фосфодиэстеразы (фосфодиэстеразы И) EHNA эффект NaHS полностью предотвращался.

В желудочковых кардиомиоцитах лягушки Са-ток регулируется локальным повышением уровня цАМФ вблизи цитоплазматической мембраны, а фосфодиэстеразы обеспечивают компартментализацию цАМФ, предотвращая его диффузию вдоль длины кардиомиоцита. Действительно, в наших экспериментах в условиях локального повышения уровня цАМФ при активации (З-адренорсцепторов эффект H2S был выражен сильнее, чем в контроле. При этом одновременная активация p-адренорецепторов и блокирование фосфодиэстераз IBMX или EHNA предотвращало развитие отрицательного инотропного эффекта H2S.

Таким образом, в основе отрицательного инотропного действия H2S в миокарде лягушки лежит снижение уровня цАМФ и усиление гидролиза циклического нуклеотида в результате активации цГМФ-стимулируемых фосфодиэстераз И типа. В результате происходит уменьшение активности цАМФ-зависимых протеинкиназ и фосфорилирования потенциал-зависимых Са-каналов, уменьшение входа Са в клетку и снижение силы сокращения миокарда.

Выводы

1. Донор сероводорода NaHS вызывает дозозависимое и обратимое снижение амплитуды сокращения миокарда лягушки, уменьшая максимальные скорости укорочения и расслабления полоски.

2. L-цистеин - субстрат синтеза сероводорода оказывает отрицательный инотропный эффект в миокарде лягушки, тогда как блокаторы цистатиони-у-лиазы - фермента синтеза H2S - пропаргилгицин и Р-цианоаланин увеличивали амплитуду сокращения полоски миокарда.

3. В условиях блокирования потенциал-зависимых Са-каналов L-типа нифедипином и активации внутриклеточных Са-депо кофеином эффект NaHS полностью сохранялся.

4. В условиях блокирования потенциал- и кальций-зависимых калиевых каналов тетраэтиламмонием, 4-аминопиридином и NS 8593 влияние NaHS на сократимость полоски миокарда не отличалось от контроля.

5. Эффект NaHS частично снимался при блокировании и активации АТФ-зависимых К-каналов глибешсламидом и диазоксидом, соответственно.

6. Отрицательное инотропное действие NaHS полностью сохранялось в условиях закисления внутриклеточной среды пропионатом натрия.

7. Влияние NaHS на сократимость миокарда уменьшалось при ингибировании аденилатциклазы с помощью MDL-12330А и в условиях блокирования различных типов фосфодиэстераз IBMX.

8. Отрицательный инотропный эффект NaHS не изменялся в условиях блокирования синтеза оксида азота (L-NAME), уменьшался на фоне предварительной аппликации оксида азота (SNAP) и полностью предотвращался в условиях блокирования фосфодиэстеразы II EHNA.

9. Эффект NaHS на силу сокращения миокарда был выражен в большей степени в условиях предварительной активации ß-адренорецепторов изопротеренолом и не проявлялся при одновременной активации ß-адренорецепторов и блокировании фосфодиэстераз IBMX или EHNA.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Ситдикова Г. Ф., Герасимова Е. В., Хаертдинов Н. Н.. Зефиров А. Л. Роль циклических нуклеотидов в эффектах сероводорода на освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки. //Нейрохимия, 2009, т.26, № 4, С. 1-7. МАИК «Наука/Интерпериодика» ISSN(p): 1027-8133

2. Sitdikova G. F., Gerasimova E. V., Khaertdinov N. N.. Zefirov A. L. Role of Cyclic Nucleotides in Effects of Hydrogen Sulfide on the Mediator Release in Frog Neuromuscular Junction. //Neurochemical Journal, 2009, Vol. 3, No. 4, pp. 282-287

3. Ситдикова Г. Ф., Хаертдинов Н. Н., Зефиров А. Л. Исследование роли кальциевых и калиевых каналов в эффектах сероводорода на сократимость миокарда лягушки.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2011. -Т.151, № 2, С. 124-128

4. Abramochkin D. V., Haertdinov N. N.. Porokhnya М. V., Zefirov A. L., Sitdikova G. F., Carbon monoxide affects electrical and contractile activity of rat myocardium. // Journal of Biomedical Science 2011, 18:40 doi: 10.1186/1423-0127-18-40.

5. Абрамочкин Д. В., Хаертдинов Н. Н.. Порохня М. В., Зефиров А. Л., Ситдикова Г. Ф., Влияние монооксида углерода на параметры электрической и сократительной активности предсердного миокарда крысы. // доклады академии наук, 2011, том 439, № 2, с. 274-278

6. Хаертдинов Н. Н.. Ахметшина Д. Р., Зефиров А. Л., Ситдикова Г. Ф. Сероводород в регуляции сократимости миокарда лягушки// Биологические мембраны (принята в печать) 2012

7. Хаертдинов Н. Н., Сергеева Е. В. Влияние сероводорода на частоту и силу сокращения сердца лягушки // Тезис в сборнике. Биология наука XXI века. 13-я международная конференция молодых ученых. Пущино 2009. С. 127.

8. Хаертдинов Н. Н.. Сергеева Е. В. Исследование нового газообразного посредника-сероводорода на сократимость миокарда желудочков лягушки. // Тезис в сборнике. Биология наука XXI века. 13-я международная конференция молодых ученых. Пущино 2009. С. 127-128.

9. Khaertdinov N. N.. Sergeeva E. V., Shafigullin M. U. Hydrogen sulfide influence on rana ridibunda myocard contractility // Тезис в сборнике. Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expasion of Borders» P.103-104.

10. Ситдикова Г. Ф., Хаертдннов Н. II- Зефиров A. J1. Влияние донора сероводорода - гидросульфида натрия на сократимость изолированной полоски миокарда желудочка лягушки. // VII Всероссийская конференция с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем", посвященной 160-летию со дня рождения И.П. Павлова - Санкт-Петербург, 29 сентября - 2 октября 2009 года. - С. 46.

П.Хаертдинов Н. Н.. Яковлева О. В. Влияние сероводорода на сократимость миокарда в условиях ингибирования NO - синтазы. // Тезис в сборнике. XV Всероссийская научно- практическая конференция 2010. С. 297-298.

12. Khaertdinov N. N.. Yakovlev А. V., Sitdikova G. F. Effects of hydrogen sulfide on frog myocardium after inhibition of ATP-depended potassium channels. // Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies.-Pushcino:Synchrobook-2010- P. 122-125

13. Хаертдинов H. H.. Ситдикова Г. Ф. Роль калиевых каналов в отрицательном инотропном эффекте сероводорода на сердце лягушки. // Тезисы докладов XXI Съезда физиологического общества им. И.П.Павлова, Калуга 19-25 сентября 2010, М.-Калуга:000 "БЕСТ-принт", стр 650.

14. Ситдикова Г. Ф., Хаертдинов Н. Н. Роль аденилатциклазной системы в эффектах сероводорода на сократимость миокарда лягушки. // Материалы X юбилейной Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиологические механизмы адаптации растущего организма», Казань, 25-27 июня 2010 г, Казань: ТГГПУ, С. 174-175.

15. Хаертдинов Н. П., Ахметшина Д. Р. Эффекты сероводорода на сократимость миокарда лягушки в условиях блокирования АТФ-зависимых калиевых каналов. // Тезис в сборнике. XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Ломоносов-2010 С.290-291.

16. Хаертдинов Н. Н„ Ахметшина Д. Р., Ситдикова Г. Ф. Влияние сероводорода на сократимость миокарда лягушки Rana Ridibunda и роль калиевых каналов в его эффектах. // Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей. - Пущино.- 2011. -Т.1.-С. 162-166

П.Хаертдинов Н. Н., Шафигуллин М. У., Ахметшина Д. Р. Исследование роли внутриклеточной концентрации кальция в эффектах сероводорода на сократимость миокарда лягушки. // XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых. Сборник тезисов докладов «Ломоносов -2011»-Москва, 2011 г. - С. 247-248.

18. Хаертдинов Н. Н., Ахметшина Д. Р., Валиуллина Ф. Ф., Ситдикова Г. Ф. Выявление ионных механизмов действия сероводорода в миокарде

лягушки. //Сборник статей по материалам II международной научной конференции "Свободные радикалы, антиоксвданты и старение", Астрахань.'АГУ, С. 155-158

19.Ахметшина Д. Р., Хасртдинов H. Н. Эндогенный уровень цАМФ опосредует эффекты гидросульфвда натрия на силу сокращения миокарда лягушки. // XLIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» - Новосибирск, 16-20 апреля 2011 г.-С. 4.

20. Ахметшина Д. Р., Хаертдотгов H. Н.. Ситдикова Г. Ф. Роль оксида азота в эффектах сероводорода на сократимость миокарда лягушки. // XIV международное совещание и VII школа по эволюционной физиологии, посвященные памяти академика Л.А. Орбели. Сборник тезисов докладов и лекций - Санкт-Петербург, 24-29 октября 2011 г. - С. 20-21.

Выражаю искреннюю благодарность чл.-корр. РАМН, д.м.и., профессору Зефирову Андрею Львовичу за консультативную помощь и ценные рекомендации при выполнении и обсуждении работы.

Подписано в печать 12.01.12 Бумага офсетная. Печать ризографическая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,4 Уч.-изд.л. 1,1. Тираж 120 экз. Заказ 16/1

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. 233-73-59,292-65-60

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хаертдинов, Наиль Назимович, Казань

61 12-3/776

федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего профессионального образования казанский (приволжский) федеральный университет федерального агентства по образованию и науке

эффекты и механизмы действия сероводорода на сократительную функцию миокарда лягушки

российской федерации

На правах рукописи

Хаертдинов Наиль Назимович

03.03.01 - физиология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ситдикова г.ф.

казань-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Сероводород как сигнальная молекула 12

1.1.1. Особенности газомедиаторов, взаимодействие N0, СО и Н28 14

1.1.2. Физико-химические свойства Н28 16

1.1.3. Образование и катаболизм Н28 17

1.1.4. Токсичность и эндогенные концентрации Н28 22

1.1.5. Физиологические эффекты и механизмы действия Н28 26

1.1.6. Влияние Н28 на сократимость миокарда 31

1.2. Механизмы регуляции сократимости сердечной мышцы. Особенности строения и регуляции у холоднокровных животных 33

1.2.1. Особенности строения миокарда холоднокровных животных 33

1.2.2. Механизмы регуляции сокращения миокарда 34

1.2.3. Особенности внутриклеточных механизмов регуляции сократимости миокарда лягушки 41

2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46

2.1. Объект исследования 46

2.2. Организация и метод исследования 46

2.3. Растворы и фармакологические вещества 50

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53

3.1. Выявление эффектов экзогенного и эндогенного сероводорода на сократимость изолированной полоски миокарда желудочка 53

3.1.1. Влияние донора Н28 - гидросульфида натрия на сократимость изолированной полоски миокарда желудочка 53

3.1.2. Эффекты блокаторов ферментов синтеза Н28 и субстрата синтеза Ь-цистеина на амплитуду сокращения изолированной полоски миокарда 55

3.2. Выявление роли Са- и К-каналов в эффектах сероводорода на сократимость изолированной полоски миокарда желудочка 58

3.2.1. Роль Са-каналов в эффектах 58

3.2.2. Исследование роли потенциал- и К(Са)-каналов в отрицательном инотропном эффекте в изолированной полоске миокарда лягушки 60

3.2.3. АТФ-зависимые К-каналы в эффектах ЫаН8 на сократимость миокарда 62

3.3. Исследование эффектов Н28 на фоне закисления внутриклеточной среды кардиомиоцитов 65

3.4. Исследование роли аденилатциклазной системы и эффектах Н28 на инотропные свойства изолированной полоски миокарда лягушки 66

3.5. Исследование роли N0 в эффектах Н28 на сократимость изолированной полоски миокарда лягушки 69

3.6. Роль (3-адренорецепторов и фосфодиэстеразы II типа в эффектах Н28 71

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 74

4.1. Отрицательный инотропный эффект экзогенного и эндогенного Н28 74

4.2. Роль ионных каналов в реализации эффектов ЫаН8 в миокарде лягушки 75

4.3. Исследование эффектов Н28 на фоне закисления внутриклеточной среды кардиомиоцитов 79

4.4. цАМФ как фактор, опосредующий эффект Н28 на сократимость миокарда 80

4.5. Роль оксида азота в эффектах Н28 82

ВЫВОДЫ 85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 87

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

H2S - сероводород

NO- оксид азота (II)

СО - монооксид углерода

ЦБС - цистатионин (З-синтаза

ЦГЛ - цистатионин у-лиаза

3-МСТ - 3-меркаптопируват сульфтрансфераза

ЦАТ - цистеинаминотрансфераза

NOS - NO-синтаза

nNOS - нейрональная NO-синтаза

iNOS - внутриклеточная NO-синтаза

eNOS - эндотелиальная NO-синтаза

NaHS - гидросульфид натрия

MDL-12330A - ингибитор аденилатциклазы

IBMX - 3-isobutyl-l-methyl-xanthine

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

К(Са)-каналы - кальций активируемые калиевые-каналы

SK-каналы - кальций активируемые калиевые-каналы малой проводимости

К(АТФ) - АТФ-зависимые калиевые

ГАМК - у- амино масляная кислота

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

ПД - потенциал действия

МП - мембранный потенциал

НМД А - N- метил -D -аспартат

НАДФ-никотинамидадениндинуклеотид фосфат

[Ca2+]i_ внутриклеточная концентрация ионов кальция

ЧСС - частота сердечных сокращений

СПР - саркоплазматический ретикулум

ISO-изопротеронол

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Исследование механизмов внутрисердечной регуляции сократимости миокарда является одним из актуальных направлений в физиологии сердца. Достаточно подробно изучена роль холин- и адренергических факторов в регуляции деятельности сердца (Авакян, 1988; Аникина, Хуления 1990; Абрамочкин, Сухова, 2009). Ведутся исследования об участии пуринорецепторов в регуляции работы сердца и сосудов в онтогенезе (Аникина, Анисимова, Ситдиков, 2011). Сероводород (H2S) - газ, обладающий хорошо известными токсическими эффектами, связанными с нарушением окислительного фосфорилирования в клетке (Reiffenstein et al., 1992). Однако, все больше данных свидетельствует о том, что H2S эндогенно синтезируется и оказывает физиологические эффекты в сердечно-сосудистой, нервной и эндокринной системах, а также в желудочно-кишечном тракте (Ситдикова, Зефиров, 2006; Ситдикова, Зефиров, 2010; Герасимова, Ситдикова, 2008; Sitdikova, Weiger, Hermann, 2010; Elsey et al., 2010; Kimura et al., 2010).

H2S был предположен в качестве эндогенного «газомедиатора» наряду с двумя другими физиологически активными газами - оксидом азота (NO) и монооксидом углерода (Ситдикова, Зефиров, 2006; Ситдикова, Зефиров, 2010; Gadalla and Snyder, 2010). В сердечно-сосудистой системе H2S синтезируется из L-цистеина цистатионин у-лиазой и 3-меркаптосульфтрансферазой (Geng et al., 2004, Yong et al., 2008; Elsey et al., 2010) и оказывает целый ряд эффектов, включая вазодилятацию, регуляцию пролиферации и апоптоза, ангиогенез (Gadalla and Snyder, 2010; Ситдикова, Зефиров, 2010).

Имеются данные о кардиопротекторной роли H2S, выражающейся в уменьшении повреждений миокарда в условиях ишемии/реперфузии в

экспериментах in vitro и in vivo (Geng et al., 2004; Bian, et al., 2006; Elsey et al., 2010). В единичных исследованиях показано, что H2S оказывает отрицательный инотропный эффект в сердце различных видов теплокровных животных и уменьшает длительность потенциала действия рабочих кардиомиоцитов (Geng et al. 2004; Sun et al., 2008).

Механизмы действия H2S малоизученны и включают, по разным данным, систему аденилатциклазы, АТФ-зависимые К-каналы и потенциал-зависимые Са-каналы L-типа в зависимости от вида животного (Xu et al., 2007; Sun et al., 2008; Yong, et al., 2008;). Показано влияние H2S на сосудистый тонус у всех классов позвоночных животных (рыб, амфибий, рептилий) и включает как вазоконстрикцию, так и вазодилятацию, что указывает на филогенетическую древность H2S как газомедиатора и универсальность его действия (Dombkowski et al. 2004; Olson, et al. 2006). Данные о действии H2S на сократимость миокарда холоднокровных животных отсутствуют. Таким образом, сведения о регуляции функций сердца с помощью нового газообразного посредника - H2S во многом фрагментарны, а молекулярные мишени его влияния не определены. Поэтому исследование эффектов и мишеней действия экзогенного и эндогенного сероводорода на сократимость миокарда лягушки является актуальным.

Цель и задачи исследования

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить действие донора сероводорода - гидросульфида натрия на сократимость миокарда лягушки.

2. Выявить эффекты субстрата синтеза сероводорода L-цистеина и блокаторов фермента синтеза газа цистатионин у-лиазы на сократимость миокарда лягушки.

6. Выявить роль системы аденилатциклазы в эффектах сероводорода.

7. Исследовать взаимодействие системы оксида азота и сероводорода в регуляции сократимости миокарда

8. Проанализировать влияние сероводорода в условиях активации (3-адренорецепторов и блокирования фосфодиэстераз.

Научная новизна

В работе впервые показано, что гидросульфид натрия - донор Н28 обратимо и дозозависимо снижал силу сократимости и уменьшал максимальные скорости укорочения и расслабления полоски миокарда лягушки. При этом субстрат синтеза сероводорода Ь-цистеин также оказывал отрицательный инотропный эффект, а блокатор цистатионин у-лиазы увеличивал амплитуду сокращения, что указывает на возможность эндогенного синтеза Н28 в сердце холоднокровных животных. Впервые исследованы внутриклеточные механизмы действия сероводорода в миокарде лягушки. Показано, что одной из мишеней действия Н28 являются АТФ-чувствительные калиевые каналы, активация которых вызывает гиперполяризацию мембраны, снижение входящего Са-тока и уменьшение силы сокращения. Впервые показано взаимодействие системы N0 и Н28 в регуляции сократимости миокарда. Кроме того, впервые выявлена роль

аденилатциклазной системы в эффектах Н28. Предположено, что активация фосфодиэстераз, гидролизующих цАМФ, в частности фосфодиэстеразы II, при действии Н28, особенно в условиях активации |3-адренорецепторов, приводит к уменьшению уровня цАМФ в клетке и снижению входящего Са-тока, что сопровождается понижением силы сокращения.

Положения, выносимые на защиту

Научно-практическая ценность

Научную ценность представляют данные об участии АТФ-зависимых калиевых каналов и фосфодиэстераз в эффектах Н28, что в дальнейшем позволит провести эволюционный анализ механизмов регуляции инотропной функции сердца эндогенными газообразными посредниками как у холоднокровных, так и у теплокровных животных. Полученные данные

имеют не только теоретическое, но и практическое значение при разработке средств фармакологической коррекции сердечной деятельности. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре физиологии человека и животных Казанского (Приволжского) федерального университета. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (09-04-00748); «Ведущая научная школа» (НШ-5250.2010.4), гранта К. Цейс.

Личный вклад диссертанта

Достоверность полученных данных

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях и съездах: международном XIII Биологическом симпозиуме студентов и аспирантов «БутВюБЕ 2009», Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011), Всероссийском с международным участием, научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2009,

2010), международной конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2009, 2010), XX Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Калуга 2010), Международном симпозиуме «Biological motility» (Пущино, 2009), XVII и XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (МГУ, 2010, 2011), XV и XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, КГМУ, 2010, 2011), ежегодных научных конференциях в Казанском федеральном университете.

Реализация результатов исследования

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 121 страница состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 310 источников, из них 17 - отечественных и 293 -иностранных авторов. Диссертация содержит 20 рисунков и 2 таблицы.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сероводород как сигнальная молекула

В настоящее время не вызывает сомнения существование помимо синаптической формы передачи информации (от нейрона к нейрону или от нейрона к эффекторной клетке) другого способа ее передачи с участием газов, к которым относят оксид азота (NO), оксид углерода (СО) и сероводород (H2S) (Wang, 2004.). Среди известных к настоящему времени газотрансмиттеров H2S остается наименее изученным (Moore, Bhatia, Moochhala, 2003; Carsten, 2009). Предположения о физиологической роли H2S впервые возникли в 1989 г. после того как появились данные о высоком эндогенном уровне сульфида в срезах мозга крысы (1.6 мкг/г) и стволе мозга человека (0.7 мкг/г) (Goodvin, 1989). H2S в высоких концентрациях был обнаружен у представителей разных классов животных. В плазме крови крыс содержание H2S составило 46 мкМ, а в тканях мозга 50-160 мкМ, в стволе мозга человека 70 мкМ, (Abe and Kimura, 1996; Zhao et al., 2001).

H2S оказывает разнообразные физиологические эффекты во многих органах и тканях: модулирует синаптическую активность в периферической и центральной нервной системе, является гладкомышечным релаксантом (Abe and Kimura, 1996; Wang, 2002; Ситдикова, Зефиров, 2006; Ситдикова и др., 2009; Li and Moore, 2008; Russo et al., 2000; Qu, Lee, Bian, 2008; Ishigami et al., 2009; Герасимова и др., 2008; Skovgaard et al., 2011). Кроме того, H2S защищает нейроны и сердечную мышцу от оксидативного стресса (Kimura et al., 2006; Elrod et al., 2007; Kimura, 2010; Kimura, Goto, Kimura, 2010), регулирует секрецию инсулина (Yang et al., 2005; Kaneko et al., 2006; Ali et al., 2007). Показано, что H2S вызывает кальциевые волны в астроцитах, опосредуя взаимодействие между нейронами и глией (Nagai et al., 2004).

Клеточные эффекты H2S опосредуется через внутриклеточные посредники, либо напрямую через изменение субъединиц ионных каналов,

внутриклеточных ферментов, белков экзоцитоза и эндоцитоза (Gadalla and Snyder 2010; Kimura, 2010; Sitdikova, Weiger, Hermann, 2010; Ситдикова, Зефиров 2010; Ситдикова и др., 2011).

В ряде работ показано, что H2S оказывал гипометаболический эффект -вызывая снижение температуры тела у мелких млекопитающих (мышей) (Blackstone, Morrison, Roth, 2005; Haouzi et al., 2008 ). Установлено благотворное влияние доноров H2S при гемморагическом шоке, эндотоксемии, бактериальном сепсисе и асептическом воспалении (Lowicka and Beltowski 2007). Известны также противовоспалительные эффекты H2S обусловленые ингибированием адгезии лейкоцитов к сосудистому эндотелию, а также блокированием миграции лейкоцитов к сайтам воспаления. Следует отметить, что ингибирование синтеза H2S приводит к потере целостности слизистой и увеличению степени воспаления (Wallace et al., 2010). В культуре нейронов H2S повышал уровень цитозольного кальция, и этот эффект предотвращался блокаторами Са-каналов L-типа (Garcia-Bereguiain et al., 2008) При выявлении роли гуанилатциклазной системы в эффектах H2S было показано, что блокирование гуанилатциклазы потенциировало вазорелаксирующее действие газа в аорте крысы (Zhao and Wang, 2002). Один из механизмов действия H2S это модификация протеинов, так называемая сульфгидратация. Данный механизм сходен с влиянием NO, который связывается тиоловыми группами цистеинов - это S-нитрозилирование. Сульфгидратация изменяет -SH на -SSH, что приводит обычно к увеличению химической активности белка, тогда как S-нитрозилирование обычно ингибирует активность ферментов и рецепторов. Сульфгидратация - распространенная пост-трансляционная модификация многих белков (глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы, ß-тубулина, актина) которая затрагивает 10-25% эндогенных протеинов, тогда как уровень физиологического S-нитрозилирования белков составляет только 1-2%. (Gadalla and Snyder, 2010;Sen and Snyder, 2010).

1.1.1. Особенности газомедиаторов, взаимодействие NO, СО и H2S

Данные последних лет подтверждают тесное взаимодействие газообразных посредников - NO, СО и H2S как на уровне регуляции ферментов синтеза, так и мишеней их действия. Все три газа N0, СО и H2S являются жирорастворимыми, эндогенно высвобождаемыми газообразными медиаторами (Nicholson and Calvert, 2010). Они облегчают индукцию или по�

Информация о работе

Хаертдинов, Наиль Назимович
кандидата биологических наук
Казань, 2012
ВАК 03.03.01

Диссертация

Эффекты и механизмы действия сероводорода на сократительную функцию миокарда лягушки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы