Роль NO в регуляции Ca2+ токов L-типа циклическими нуклеотидами в кардиомиоцитах нормотермных и гибернирующих животных

Грушин, Кирилл Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль NO в регуляции Ca2+ токов L-типа циклическими нуклеотидами в кардиомиоцитах нормотермных и гибернирующих животных
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль NO в регуляции Ca2+ токов L-типа циклическими нуклеотидами в кардиомиоцитах нормотермных и гибернирующих животных"

На правах рукописи

□ОЗ166087

Грушин Кирилл Сергеевич

РОЛЬ N0 В РЕГУЛЯЦИИ Са2+ ТОКОВ Ь-ТИПА ЦИКЛИЧЕСКИМИ НУКЛЕОТИДАМИ В КАРДИОМИОЦИТАХ НОРМОТЕРМНЫХ И ГИБЕРНИРУЮЩИХ ЖИВОТНЫХ.

Специальность «Биофизика» 03.00.02

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 АПР 2008

ПУЩИНО - 2008

003166887

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г.Пущино, Россия

Научный руководитель

кандидат физико-математических наук

Кокоз Юрий Моисеевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Орлов Николай Яковлевич

доктор биологических наук Чемерис Николай Константинович

Ведущая организация

кафедра физиологии человека и животных, МГУ, г Москва

Защита состоится 23.04.08 в 1330 на заседании совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу. 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, 3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142290, Московская область, г. Пущино, ул Институтская, 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан 2008г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандвдат физико-математических наук

"С1Ч1У ЛанинаНФ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуачышсть проблемы.

Са + каналы L-типа (Cavl 2 каналы) в кардиомиоцитах играют важную роль в процессах электромеханического сопряжения и мышечного сокращения, во многом определяя функционирование миокарда Регуляция Са2 -тока через L-каналы осуществляется различными регуляторными каскадами, часть которых действуют через циклические нуклеотиды - цАМФ, цГМФ По литературным данным, цАМФ является внутриклеточным мессенжером, участвующим в регуляции сердечной деятельности двумя основными регуляторными системами - адренергической и холинергической Другому циклическому нуклеотиду (цГМФ), большинство исследователей отводили роль, противоположную цАМФ, однако, из-за неоднозначности получаемых данных, на данный момент затруднительно адекватно определить роль в регуляции Са2+ тока L-типа как цГМФ и цГМФ-зависимого фосфорилирования, так и оксида азога (NO), одного из активаторов цГМФ-зависимого каскада Наблюдаемые расхождения в результатах исследователи объясняли особенностями регуляции L-каналов в клетках различных типов (синус, предсердие, желудочек) или разных видов животных С этим можно было бы согласиться, если бы результаты экспериментов на одних тех же объектах совпадали, однако на одном и том же препарате разные авторы получали неодинаковые, качественно различные данные

Корректное изучение действия роли цГМФ-зависимого фосфорилирования и всего NO-цГМФ каскада в регуляции Са2+ -транспорта в норме и патологии является актуальной задачей, поскольку данный каскад в сердечно-сосудистой системе участвует в большом количестве регуляторных процессов, в частности ангиогенезе (Kawasaki et al, 2003), поддержании работоспособности миокарда и его защите от гипертензии, гипертрофии и реперфузии (Gao et al, 2002, Massion et al, 2003, Fiedler and Wollert, 2004) В сердце перечисленные свойства каскада связаны непосредственно с регуляцией Са2+ гомеостаза и уровня [Са2+] В качестве одной из экспериментальных

моделей участия каскада в развитии ряда патологий могут служить спонтанно-гипертензивные крысы (SHR) Отличительная черта этих животных -повышенное давление, гипертрофия миокарда, диабет II типа (инсулиновая резистентность) и другие физиологические нарушения В кардиомиоцитах этих крыс наблюдается нарушение Са2+ гомеостаза, повышенный по сравнению с нормой уровень [Са2+], и развитие гипертрофии через активацию кальцинейрин/NFAT системы (Kempf and Wollert, 2004) Однако, причины, приводящие к подобным событиям у SHR до сих пор полностью не установлены С другой стороны, на первичной культуре клеток желудочка сердца крыс линии Sprague-Dawley показано, что активация NO-цГМФ каскада уменьшает активность кальцинейрин/NFAT системы за счет подавления входа Са2+ в клетку через L-тип канала (Fiedler et al, 2002) Таким образом, крысы линии SHR представляют большой интерес для изучения причин развития сердечно-сосудистых заболеваний

С другой стороны, есть группа животных, в которых также происходят серьезные изменения в регуляции Са2+ гомеостаза Эти животные - гибернанты Изменение регуляции Са2+ токов во время зимней спячки позволяет им поддерживать сердечную деятельность в условиях низких температур, повышенной вязкости крови и других неблагоприятных факторов Однако, стоит заметить, что, несмотря на подобные изменения, у гибернантов патологических изменений в миокарде не происходит. И исследование возможного участия NO-цГМФ каскада в регуляции Саг+ тока L-типа во время гибернации может пролить свет на возможные причины подобного приспособления без серьезных патологических изменений

Цели и задачи исследования.

Основная цель работы - исследование роли ЫО-цГМФ каскада в регуляции Са2+ тока Ь-типа в норме и патологии Задачи

1 Исследование влияния цГМФ-зависимого фосфорилирования на базальные и активированные цАМФ-зависимым фосфорилированием Са2+ тока Ь-типа в норме

2 Исследование роли КЮ-цГМФ каскада в регуляции базальных и активированных цАМФ-зависимым фосфорилированием Са2+ токов Ь-типа

3 Исследование роли МО-цГМФ каскада в регуляции Са2+ тока Ь- типа при гипертензии и гипертрофии миокарда у крыс линии 8Ш1

4 Исследование роли МО-цГМФ каскада при адаптации к экстремальным условиям у зимоспящих животных

Научная новизна работы и полученные результаты

В экспериментах на кардиомиоцитах нормотензивных крыс впервые показано, что при постоянном присутствии во всех рабочих средах аминокислоты Ь-аргинина (1 мМ) проявляются ответы на соединения, активирующие иГМФ-зависимое фосфорилирование Изучено действие на Са2+ тою! Ь-типа соединений, регулирующих активность различных звеньев N0-цГМФ каскада в норме Во всех проведенных экспериментах введение активаторов М0-ц1~МФ каскада (8Вг-сОМР 1мкМ, Ь-аргинии 5мМ, БИР 1мМ) приводила к подавлению базальных Са2+токов Ь-типа на 29±9,6% Использование блокаторов различных звеньев каскада показало, что ингибирующее действие связано с активацией протеинкиназой й Показано, что, в отличие от базальных токов, активация ЫО-цГМФ каскада не способна вызвать какие-либо значимые изменения активированных насыщающей концентрацией изопротеренола Са2+ токов Ь-типа Однако, при совместном действии ацетилхолина и агонистов МО-цГМФ каскада происходит возвращение токов до базального уровня

Впервые показано, что кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс (БНЯ) и гибернирующих сусликов Ж)-цГМФ каскад нарушен и имеет низкую активность. Полученные данные позволяют предположить, что низкая активность ЫО-цГМФ каскада в кардиомиоцитах крыс линии БНЯ является одной из основополагающих причин развития у них гипертензии и гипертрофии, в тоже время у гибернирующих сусликов подобное изменение может носить приспособительный характер к низкотемпературным условиям зимней спячки

Научно-практическая ценность

Полученные результаты расширяют наши знания о механизмах регуляции Са2+ тока в кардиомиоцитах нормотермно-нормотензивных, нормотермно-гипертензивных и зимоспящих животных Кроме того, полученные данные позволяют в значительной степени облегчить исследования механизмов регуляции Са2+ токов Ь-типа и помогут решить противоречия, скопившиеся на данный момент в исследованиях роли N0 и цГМФ-регуляторного пути в регуляции работы сердца как на уровне клетки, так и уровне целого органа Дальнейшие исследования на основе полученных данных могут привести к созданию методик и новых препаратов для лечения сердечнососудистых заболеваний.

Апробация диссертации

Материалы диссертации были представлены на IX международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), на всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (г Санкт-Петербург, 2005, 2006,2007 гг), на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005 г)

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 10 печатных работах в том числе 2 статьи в реферируемых журналах

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на_страницах с использованием

_рисунков, таблиц и включает введение, обзор литературы, материалы и

методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы Список литературы содержит __ссылок

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изолированные кардиомиоциты были получены из сердец линейных крыс породы Spraque Dowlay (SD), SHR и гибернирующих якутских сусликов (Citellus undulatus) по методу описанному ранее (Alekseev et al, 1994) Клетки сохранялись при комнатной температуре и использовались для экспериментов в тот же день Регистрация токов проводилась через 2-3 часа после выделения при комнатной температуре 20-22°С методом «whole cell patch-clamp» в конфигурации «perforated patch)/ Измеряемые токи регистрировали при помощи усилителя СКБ "Биоприбор" Для проведения экспериментов использовали оригинальный пакет программ "BioQuest", разработанный Алексеевым А Е и Кокозом Ю М , обеспечивающий как сбор данных во время эксперимента, так и последующий их анализ Регистрируемые данные визуализировали и сохраняли в компьютере IBM АТ/486 при помощи платы цифро-аналогового/аналого-цифрового (ЦАП/АЦП) преобразователя L-153 (L-card) Кончики электродов из мягкого молибденового стекла оплавляли на микрокузнице, сопротивление полученных электродов составляло 1-5 МОм

Омывающий раствор содержал (рН=7,25) ЫаС1-80мМ, ТЭА-С1-20мМ, CsCl-ЮмМ, КН2РО„ -1 2мМ, MgCl2-5MM, СаС12-2 мМ, глюкоза-20мМ, HEPES -ЮмМ, при необходимости добавлялся 1мМ L-аргинина Раствор для заполнения стеклянных электродов содержал (рН=7,25) CsCl -130мМ, MgCb -5мМ, HEPES-ЮмМ рН доводился NaOH

Артериальное давление (АД) у крыс измеряли с помощью катетеров Животным были имплантированы полиэтиленовые катетеры в брюшную аорту через бедренную артерию для измерения АД и в бедренную вену для введения веществ АД регистрировали с помощью электроманометра, кривую АД обрабатывали на компьютеризированной установке, рассчитывая среднее АД и частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Полученные данные (кроме оригинальных записей токовых трасс при конкретных значениях потенциала и зависимостей пикового тока во времени) показаны как среднее значение указанного числа (п) проведенных экспериментов и соответствующей дисперсии среднего. Выводы о действии каждого из соединений и комбинации соединений сделаны на основании сравнения полученных средних значений амплитуд устоявшихся токов с использованием критерия Стыодента при уровне значимости Р<0.05

Эксперименты проводились в двух вариантах без L-аргинина и в присутствии L-аргинина (1мМ) в средах выделения и камерном (омывающем) растворе. Все используемые соединения производства фирмы Sigma (Sigma-Aldnch, GmbH)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. NO-цГМФ каскад в кардиомнощггах нормотензивных крыс. Действие 8Br-cGMP на базальный Ca2* ток L-muna. Основная трудность в определении роли цГМФ-зависимого фосфорилирования в кардиомиоцитах состояла в том, что результаты одних авторов не воспроизводились в экспериментах других Как правило, расхождения объяснялись либо видоспецифичностью, либо разной регуляцией клеток предсердия и желудочка сердца

Первоначальная попытка исследования влияния цГМФ-зависимого фосфорилирования на базальный Са2+ ток L-типа была проведена в стандартных экспериментальных условиях, используемых практическими всеми исследователями при изучении регуляции Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах желудочков В этих условиях введение в среду

8Br-cGMP (ImkM) (активатора протеинкиназы G (PKG)) (n=4, рис la) не изменяло базальные токи, как и в большинстве работ с использованием 8Вг-cGMP или прямыми инъекциями цГМФ в клетку (Levi et al, 1989, Mery et al, 1991, Hartzell and Fischmeister, 1986, Fishmeister and Hartzell, 1987, Kumar et al, 1997) Подавление базальных токов наблюдалось лишь при дополнительном введении PKG в клетку (Sumii and Sperelakis, 1995, Tohse and Sperelakis, 1991, Schrodei et al, 2003) В норме же подавление практически отсутствовало, что объяснялось незначительным содержанием PKG в кардиомиоцитах

Мы предположили, что основной причиной различных результатов являются экспериментальные условия, в которых проводились эксперименты, включая наши Регуляция потенциал-зависимых Са2" каналов L-типа в кардиомиоцитах, как правило, исследуется в средах, не содержащих L-аргинин (далее по тексту аргинин) - единственного эндогенного источника оксида азота (NO), активирующего цитозольную гуанилатциклазу Отсутствие в рабочих растворах этой аминокислоты приводит к крайне низким «фоновым» концентрациях N0 и цГМФ, что, в конечном счете, может приводить к нарушениям в работе цГМФ-зависимого каскада Исходя из этих предположений во все среды (выделения и экспериментальные) было добавлено 1мМ аргинина

В данных условиях ситуация полностью изменилась добавление 1мкМ 8Br-cGMP во всех проведенных нами экспериментах приводило к подавлению базальных Са2+ токов (п=10, рис 16) На фоне 1 мкМ специфического блокатора протеинкиназы G - КТ5823, эффект 8Br-cGMP исчезал (п=6, рис 1в, 1г), что подтверждает участие именно этой киназы в подавлении базального Са2+ тока Этот результат показывает, что в отсутствие аргинина в рабочих средах PKG-зависимая регуляция базального Са2+ тока L-типа в кардиомиоцитах не проявляется, но в условиях более близких к нативным PKG участвует в регуляции базального тока В связи с этим дальнейшее изучение роли PKG в регуляции L-тока проводилось в присутствии 1 мМ аргинина во всех растворах (в том числе и при выделении клеток)

0,0 3-0,1 | -0,2 '£ -0,3 I -0,4 ,5 -0,5

И.

0,0

>2 о

-0,4

л а

| -0,6

-0,8

вВг-свМР 1мкМ

10 15 20 Время, мин

КТ5823 1мкМ

вВг-сИМР 1мкМ

5 10 15 20 Время, мин В

0,0

<г

X -0,2

о н -0,4

Л -0,6

5 -0,8

-1,0

25 30

О -10

£ -20 <и

-& -30 ■&

т -40 -50

8Вг-свМР 1мкМ

Э1_

//^ВВг-сСМР 1мкМ / ^.....-контроль

10 20 30 40 Время, мин

„г, КТ5823+

8ВГ-ССМР 8Вг^емР

■ I ■у у\ ЦК 6

ВПК ■НИ

I 10

Рис.1. I. Действие 8Вг-сСМР (1мкМ) на базальный Са+ ток Ь-типа в двух различных условиях. Представлены пиковые значения Са2+ тока во времени и отдельные токовые трассы, а - в отсутсвие 1мМ аргинина, б - в присутствии 1мМ аргинина; вставка - записи оригинальных регистрации Са2+-токов в контроле и после действия 8Вг-сОМР. II. в -Блокирование действия 8Вг-сОМР специфическим блокатором РКО - КТ5823 (1мкМ). г -Гистограмма, отражающая процент подавления базальных Са2+ токов при аппликации 8Вг-свМР в контроле и на фоне КТ5823 (1мкМ) (приведены средние значения и стандартные ошибки, цифры под вертикальными барами - количество экспериментов).

Тот факт, что при постоянном присутствии аргинина (1мМ) Са2+ ток Ь-типа может прямо регулироваться цГМФ-каскадом через активацию РК£т, по-новому ставит вопрос о роли "ЫО-цГМФ каскада в регуляции Са2+ тока в кардиомиоцитах.

Участие NO-цГМФ каскада в регуляции базальнпго Caп тока L-miina Роль аргинина.

В большинстве работ подавление Са2+ тока в кардиомиоцитах при аппликации доноров NO на базальных токах не отмечалось (Wahler and Dollinger, 1995, Imai et al, 2001, Tsuchida and Watajima, 2002, Gallo et al, 1998) Поэтому считалось, чю участие NO-цГМФ каскада в рефляции базальных токов минимально

В стандартных условиях наши результаты были аналогичны литературным данным добавка аргинина от ЮмкМ до 5мМ практически не оказывала какого-либо значимого действия на базальный ток (рис 2а, п=11) Экзогенный донор NO - SNP (1шМ) во всех экспериментах также не влиял на токи (рис 26, п=4) При добавлении во все растворы 1 мМ аргинина ответ клеток, как и в случае с 8Br-cGMP, кардинально изменился

В этих условиях дополнительное введение api инина (5мМ) и SNP (1мМ) во всех экспериментах приводили к подавлению Са2+ токов (рис 2в, 2г) (п=15) в среднем на 29±9,6% (рис 2д) Было предположено, что действие аргинина и SNP также опосредовано активацией PKG Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты с использованием блокаторов основных звеньев NO - цГМФ каскада

Ингибирующий эффект аргинина устранялся в присутствии 7NI (2мкМ) -неспецифического ингибитора конститутивных NOS (cNOS) (п=4) (рис За, Зд), таким образом действие аргинина обуславливается активацией фермента NO-синтазы и увеличением уровня NO в клетке Для проверки вероятности цГМФ-независимого эффекта NO (Ни et al, 1997) было исследовано действие SNP и аргинина на фоне блокатора цитозольной гуанилатциклазы - ODQ (50мкМ) На рис 36 и Зд видно, что ингибирующий эффект аргинина (п=4) и SNP (п=4) в этом случае практически не проявлялся, т е эффект доноров N0 связан именно с активацией гуанилатциклазы и повышением уровня цГМФ в клетке

0,0

< -0,2

* -0,4 о

I- -0,6

>5 2 -0,8 а>

§ -1,0 £-1.2 -1,4

Аргинин

500 мкМ .

ЗмМ

5 10 15 Время, мин

0,0 < -0,2 1 -0.4 о -0,6 ■5 -0,8 £ -1,о 1-1,2 С -1,4 -1,6

вМР1мМ

6 8 10 12 14 16 16 Время, мин

II.

0,0 < -0.1

2 -о.з

'5 -0,4 т -0,5 1-0,6 С -0,7 -0,8

в -10

о4

К а: -20

# -30

•е

т -40

-50

Аргиннн 5м!И

I ■ ■

// ,...--ЗрГИНИН 5м

/___^-контроль

0,0

< -0,2

о н -0,4

>5 -0,6

-а

1 -0,8

С -1,0

5 10 15 20 25 30 35 Время, мин В

Аргинин вЫР 8Вг-сСМР

ЩВ-

ЭЫР1мМ

Э1_

50 мс^^ж

/^ТБЫР 1мМ /^контроль

ос^"

10 15 20 25 30 35 Время, МИН

Рис. 2. Действие аргинина (5шМ) и БЫР (1тМ) на базальный Са2+ -ток Ь-типа в двух различных условиях. Представлены пиковые значения Са2+ тока во времени и отдельные токовые трассы. I. В отсутствии аргинина, а - Отсутствие эффекта различных концентраций аргинина (0,5 и ЗмМ). б - Отсутствие эффекта донора N0 - БЫР (1мМ). П. В присутствии 1мМ аргинина; вставка - записи оригинальных регистрации Са2+-токов. в - Подавление базальных Са + токов аргинином (5мМ) и г - (1мМ). д -Процент подавления базальных Са токов при аппликации аргинина (5мМ), 8МР (1мМ) и 8Вг-сСМР (1мкМ) (приведены средние значения изменений токов и стандартные ошибки, цифрами показано число проведенных экспериментов).

7NI2мкМ

i -0 2

О t- -04

3 со -0 6

s -0 8

-10

Аргинин 5мМ

20 30 Время, мин

00 < -0 2

I--06

1 -°8 Е-ю

С-12

-1 4

0DQ 50мкМ

SNP1мМ

15 20 25 Время нии

1-02 1-045-06

х-08

EHNA ЗОмкМ SNP1мМ

20 30 Бремя, мин

< X -02

-04

>5 -06

Ш 9 -0 8

s С -1 0

1,2

КТ5823 0,5мкМ

SNP 1мМ

10 15 20 Время, мин Г

-10

S -20 ■8-■а

о -30

-40

5 S £ о. 1 5 о-< 5 о. S- < + I < < + п

1 + 5 <Э

izoiP г- о ш:«:

7 2. ?л ОТ

С/3 j.

п. А < 7 О 2 mRI о UJ

Рис. 3. Действие аргинина (5шМ) и SNP (ImM) на фоне блокаторов основных звеньев N0-цГМФ каскада Представлены пиковые значения Са2+ тока во времени а - Отсутствие эффекта аргинина (5тМ) на фоне блокатора cNOS 7NI (2mkM) б - Отсутствие эффекта SNP (1мМ) на фоне блокатора цигозольной гуанилатциклазы ODQ (SOmkM) в - Подавление базальных Са2+ токов SNP (1мМ) на фоне блокатора PDE II EHNA (ЗОткМ) г -Подавление эффекта SNP (ImM) бдокатороад PKG КТ5823 (0,5 мкМ) д - Гистограммы соответствующие проведенным экспериментам (приведены средние значения изменений токов и стандартные ошибки, внизу показано число экспериментов)

Для проверки возможной активации фосфодиэстеразы II в присутствии NO-доноров, нами был использован селективный блокатор этой фосфодиэстеразы - EHNA (ЗОмкМ) (Achterberg et al, 1985, Vargeese et al,

1994) Оказалось, что в присутствии EHNA подавление тока сохранялось и при действии аргинина (п=3), и при действии SNP (рис Зв, Зд, п=4). Т.е фосфодиэстераза II, скорее всего, не оказывает существенного влияния на подавление токов L-типа как в присутствии эндогенного, так и в присутствии экзогенного источников N0. Дальнейшие эксперименты с использованием блокатора протеинкиназы G КТ5823 (0,25 мкМ, 0,5 мкМ) показали, что ингибирующий эффект на базальные Са2+ токи L-типа аргинина (п=5) (рис Зд) и SNP (п=4) (рис Зг, Зд), так же как и 8Br-cGMP, связан с активацией цГМФ-зависимого фосфорилирования

Таким образом, в присутствии 1мМ аргинина NO-цГМФ каскад ингибирует базальный Са2+ ток через активацию PKG, которая, скорее всего, фосфорилирует Са2+ канал L-типа, что и приводит к уменьшению входящего Са2+ тока

Действие активаторов NO-иГМФ каскада на Са2+ токи L-muna, активированные изопротеренолом - агонистом В, r-адренореиепторов. Роль PKG при взаимодействии В-адренергической и холинергической систем.

Дальнейшие наши исследования были направлены на изучение взаимодействия NO-цГМФ каскада с другими регуляторными каскадами кардиомиоцитов - (3-адренергическим и холинергическим Эти два каскада играют в целом противоположные роли в регуляции входящего Са2+ тока в кардиомиоцитах. Активация катехоламинами Р1д-адренорецепторов приводит к увеличению Са2+ тока L-типа посредством цАМФ-зависимого фосфорилирования субъединиц канала Холинергическая система представлена в основном М2-холинорецепторами, активация которых в конечном счете должна приводить к уменьшению уровня цАМФ и вслед за этим возврату Са2+ тока к базальным значениям (Harvey and Belevych, 2003). Однако хорошо известно, что в экспериментальных условиях, на изолированных кардиомиоцитах, Са2+ ток, активированный насыщающими концентрациями изопротеренола, лишь частично подавляется ацетилхолином (Hartzell, 1988, Nascimento et al, 2001, Harvey and Belevych, 2003) Такая же ситуация

наблюдалась и у нас - ацетилхолин (АСЬ, 0,1 мМ) как в стандартных условиях (данные не показаны), так и в присутствии 1мМ аргинина (рис.4а, 4в, п=6) никогда не возвращал активированные насыщающими концентрациями изопротеренола токи до базальных значений.

Первоначальной задачей стала проверка действия активаторов ЫО-цГМФ каскада на Са2+ токи, изопротеренолом (1яо 0,1мкМ). Эксперименты проводились в условиях с постоянным присутствием 1мМ аргинина.

: г-'

ISO

Iso+ACh

lso+(ACh+8Br-cGMP)

lso+(ACh+AprnHMH)

lso+(ACh+SNP)

Рис. 4. Вклад NO-цГМФ каскада в регуляцию Са2+ тока L-типа при взаимодействии ß-адренергического и холинергического каскадов. Представлены пиковые значения Са2+ тока во времени, а - Частичное подавление разогнанных изопротеренолом (Iso, ОЛмкМ) токов насыщающей концентрацией ацетилхолина (Ach, 0,1 мМ); б - Гистограмма, отражающая процент изменения активированных Iso (0,1мкМ) Са2+ токов при введении 8Br-cGMP (1мкМ), аргинина (5мМ) и SNP (1мМ); б - гистограмма, отражающая совместное действие 8Br-cGMP (1мкМ) и ацетилхолина (ОДмМ), аргинина (5мМ) и ацетилхолина(0,1мМ), SNP (1мМ) и ацетилхолина (0,1мМ) на Са2+ токи, активированные Iso (0,1мкМ).

В отличие от базальных токов, добавление 8Вг-сОМР (1мкМ) на фоне изопротеренола не вызывало какого-либо значимого подавления токов (п=5) (рис 46) Введение аргинина (5мМ) (п=8) и БЫР (1мМ) (п=5) (рис 46) также не оказывало какого-либо влияния на активированные изопротеренолом токи Таким образом, сами по себе активаторы Ж)-цГМФ каскада не способны влиять на Са2+ токи, активированные насыщающими концентрациями изопротеренола

Однако, при совместном введение АсЬ (0,1мМ) и активаторов ЫО-цГМФ каскада - 8Вг-сОМР (1мкМ) (п=4) (рис 4в), аргинина (5мМ) (п=3) и 5№(1мМ) (п=3) (рис 4в), происходило полное возвращение разогнанных токов к базальным значениям

Полученный результат представляется важным, поскольку показывает существенную роль МО-цГМФ каскада в регуляции Са2+ тока в ситуациях, связанных с активацией (3-адренергической системы, и, по всей видимости, цГМФ выполняет роль антагониста цАМФ в регуляции Са2~ тока Ь-типа кардиомиоцитов лишь при активации М-холинергической системы

Из вышеприведенных результатов следует, что в нормально функционирующем организме КО-цГМФ каскад выполняет роль тонкого регулятора входящего Са2+ тока, и соответственно, сердечной активности Но каково функционирование этого каскада в кардиомиоцитах при патологических изменениях и при адаптации к экстремальным условиям до настоящего времени не совсем ясно Мы рассмотрели участие МО-цГМФ каскада в регуляции Са2+ тока у спонтанно-гипертензивных крыс (БНЯ) и гибернирующих якутских сусликов

II. NO-цГMФ каскад в кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс (линия вНН).

Крысы линии БНЯ выведены из крыс линии \Vistar-Kyoto в Японии в 1963 году отбором особей с повышенным артериальным давлением Отличительные характеристики линии гипертензия, инсулиновая

резистентность, гиперинсулинемия, гиперхолистеринемия,

гипертриглицеридемия

В кардиомиоцитах этих крыс наблюдается нарушение Са2+ гомеостаза, повышенный по сравнению с нормой уровень [Са2+], и развитие гипертрофии через активацию кальцинейрин/NFAT системы (Nakata et al, 1995, Habuchi et al, 1995; Shorofsky et al, 1999, Kempf and Wollert, 2004) С другой стороны, на первичной культуре клеток желудочка сердца крыс линии Sprague-Dawley показано, что активация NO-цГМФ каскада уменьшает активность кальцинейрин/NFAT системы за счет подавления входа Са2+ в клетку через L-тип канала, и, вероятно, таким образом может предотвращать развитие гипертрофии (Fiedler et al, 2002, Kempf and Wollert, 2004) В связи с этим нами была поставлена задача исследовать активность NO-цГМФ каскада как в кардиомиоцитах, так и в сердечно-сосудистой системе крыс линии SHR в целом Все эксперименты проводились при постоянном присутствии 1мМ аргинина

В кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс, в отличие от нормотензивных (линия SD), практически не наблюдалось никаких изменений в амплитуде Са2+ тока при добавлении 5мМ аргинина (рис 5а), либо 1мМ SNP (рис 56), или 1мкМ 8Br-cGMP (рис 5в)

Так же как и в экспериментах на нормотензивных животных, в экспериментах на кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс, ацетилхолин не способен полностью подавить Са2+ ток L-типа, активированный изопротеренолом (данные не показаны), но, в отличие от нормотензивных крыс, совместное действие активаторов NO-цГМФ каскада, в частности, аргинина (5мМ) (рис 5г), и ацетилхолина (0,1мМ) не возращало активированные токи до базальных значений

Полученные результаты дают основание полагать, что NO-цГМФ регуляторный каскад в кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных животных нарушен и имеет низкую активность

00 < -02

-0 4 • о -06 -0,8 ■ ¡8 -10-| -1 2 С -1 4 • -1 6 •

Аргинин, 5мМ

10 15 время, мин

? -02

8 -0 4 ь

'5 -06 о "0.8 ¿-10 -1,2

1мМ

10 15 20 Время, мин

<-0, * -о

2 -О

3 О

ш 8 1

-1

8Вг-свМР 1мкМ

10 15 20 Время, мин

25 30

00 -0 5 -1,0 -15 : -20 -2 5

|£О0,1мкМ

Аргинин 5мМ + АСИ 0,1мМ

О 10 20 30 40 50 Время, мин

Рис 5 Влияние активаторов ЫО-цГМФ пути на базальные и активированные изопротеренолом (1зо) Са2+ токи кардиомиоцитов спонтанно-гипертензивных крыс Представлены пиковые значения Са24 тока во времени а - Отсутствие эффекта аргинина (5мМ), б - Отсутствие эффекта вИР (1мМ), в - отсутствие эффекта 8Вг-с<ЗМР (1мкМ), г -Отсутствие совместного действия аргинина (5мМ) к ацетилхолина (АСИ, 0,1 мМ)

Важно отметить, что у БНИ. 1ЧО-цГМФ каскад сохраняет способность

регулировать тонус сосудов и артериальное давление (АД) даже более

эффективно, чем у крыс \Vistar-Kyoto (\¥КУ) В лаборатории Мурашева А Н

(ФИБХ РАН) были проведены эксперименты на целом животном с измерением

артериального давления Внутривенное введение Ь-ИАМЕ (1 мг/кг) -

неспецифического ингибитора синтеза N0, вызывало повышение АД у БНЯ на

20 мм рт ст, тогда как у контрольных \Vistar-Kyoto (WKY) АД повышалось не

более, чем 10 мм рт ст Экзогенный источник N0 - (10 мкг/кг) понижал

давление у гипертензивных крыс значительно эффективней, чем у

нормотензивных (АД максимально снижалось на 41,4+2 4 мм ртст и 25 0+1 5

мм ртст, соответственно) Из представленных результатов видно, что в

сосудах кровеносного русла 1ЧО-цГМФ каскад функционирует

Таким образом, можно утверждать, что одной из важных причин развития гипертензии и гипертрофии миокарда у крыс линии SHR является подавление активности NO-cGMP каскада именно в клетках рабочего миокарда, а необходимым условием нормального функционирования сердечно-сосудистой системы является работоспособность NO-cGMP каскада во всех ее отделах, включая клетки сосудов и миокарда желудочков

III. NO-цГМФ каскад в кардномиоцитах гибернирующих сусликов.

Исследования проводились на истинных представителях зимоспящих животных - сусликах (citellus undulatus) Для изолированных кардиоцитов желудочка негибернирующего суслика не показано отличия входящего Са2+ тока от Са2+ тока животных других видов (Alekseev et al, 1994, Alekseev et al, 1996), NO-цГМФ каскад также выполняет стандартную роль в регуляции Са2+ тока, описанную выше для нормотензивных животных

Во время спячки в кардномиоцитах гибернантов для поддержания сердечной деятельности происходит сильное изменение Са2+ тока L-типа и [Са], переходных процессов, в частности происходит сильное уменьшение входящего Са2+ тока и усиливается выброс Са2+ из рианодиновых рецепторов, но общий уровень Са2+ во время покоя остается неизменным (Zhou et al, 1991, Wang and Zhou, 1999, Wang et al., 2000) Поэтому y нас были основания полагать, что в этих условиях NO-цГМФ каскад должен модифицироваться.

Эксперименты, проведенные на кардномиоцитах гибернирующего суслика в условиях с 1мМ аргинина показали, что, как и в случае с крысами SHR, введение модуляторов NO-цГМФ каскада - аргинина (рис 6а), SNP (рис. 66) и 8Br-cGMP (рис 6в) в тех же концентрациях, которые использовались на контрольных животных, не вызывали значимых изменений амплитуды базальных Са2+ токов L-типа

3-01 е-02

й-оз 2

[5-0 4 -0,5

Аргинин 5мМ

ооо0ооо°о°оо

О 5 10

Время, мин

оо < -о 1

>3-0 3

| "04 С -0 5 -06

эда 1мм

10 15 20

Время мин

« -04

? -06 С

8Вг-сСМР 1мкМ

О 5 10 15 20

Время, мин

Рис. 6 Эффект модуляторов МО-цГМФ пути на базальный Са2+ то.с Ь-типа в кардцотшпчтах гибернирующих сусликов Представлены пиковые значения Са2+тока во времени Отсутствие действия а - аргинина (5мМ), б - БОТ (1мМ), в - 8Вг-сОМР (1мкМ)

1зо 0,1мкМ

00 --02 ; -0 4 -06 • -08 ■ -1 0 •

1 2 -

1бо 0,1 мкМ

АСЬ01мМ

<-0 2

Р-04

С-0 8

Аргинин 5мМ + АСЬ 0,1мМ

Чь Г

40 60 80 Время, мин

О 10 20 30 40 50 60 70 Время, мин

Рис. 7. Эффект ацетилхолина и активаторов ЫО-цГМФ каскада на Са2+ токи, активированные изопротеренолом в кардиомиоцитах гибернирующих сусликов Представлены пиковые значения Са2+ тока во времени и отдельные токовые трассы а -Частичное подавление разогнанных изопротеренолом (Ьо, 0,1мкМ) токов насыщающей концентрацией ацетилхолина (АСЬ, 0,1мМ), б - Отсутствие совместного действия аргинина (5мМ) и ацетилхолина (АСЬ, 0,1мМ)

Поскольку Са + ток у спящих сусликов по амплитуде меньше, чем у активных животных, то полученные результаты могли иметь по крайней мере

два объяснения - отсутствие активности NO-цГМФ каскада во время зимней спячки или наоборот, каскад в этот период максимально активирован Для проверки этих вариантов были проведены эксперименты с активированными изопротеренолом токами На рис 7 видно, что ни ацетилхолин (рис 7а), ни ацетилхолин совместно с аргинином (5 мМ) (рис 76) (аналогичные данные были получены с 8Br-cGMP (1мкМ) и SNP (1мМ)) не снимали полностью активацию изопротеренолом Са2+ токов, что указывает на отсутствие или сильное подавление активности NO-цГМФ регуляторного каскада в кардиомиоцитах сусликов во время гибернации Это, по-видимому, является важным фактором для зимоспящих

1) устраняется необходимость энергетических затрат на поддержание этой системы

2) на нормотермных животных показано, что NO-цГМФ каскад в кардиомиоцитах может играть роль отрицательного регулятора активности Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума и рианодиновых рецепторов (Xu et al, 1999, Zahradnikova et al, 1999, Ziolo et al, 2001, Sears et al, 2002). Как уже было сказано выше, увеличение активности саркоплазматического ретикулума в регуляции Са2+ гомеостаза является одним из механизмов, обеспечивающих поддержание работоспособности миокарда при низких температурах, таким образом, активный NO-цГМФ каскад во время гибернации может отрицательно сказаться на функционировании миокарда

3) в процессе пробуждении животного существенную роль играет усиление симпатической регуляции и увеличение входа Са2+ через каналы L-типа, а активность NO-цГМФ каскада, направленная против этих процессов, в этом случае создавала бы препятствие при выходе животного из спячки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог проведенным исследованиям, можно заключить, что в кардиомиоцитах NO-цГМФ каскад в целом, и цГМФ-зависимое фосфорилирование в частности, может играть важную роль в регуляции Са2+ тока через L-тип каналов.

Основной проблемой в исследовании цГМФ-зависимого фосфорилирования было практически полное отсутствие повторяемости получаемых результатов и в большинстве случаев не наблюдалось какого-либо эффекта на базальных токах Объяснений данному порядку вещей по литературным данным достаточно много специфика цГМФ-зависимой регуляции у разных видов животных и различных типов клеток, различия в экспериментальных методах и другие причины Нами было предположено, что при отсутствии в рабочих средах единственного эндогенного источника N0 (одним из основных действий которого является увеличение цГМФ в клетке посредством стимуляции цитозольной гуанилатциклазы) - аргинина И в этих условиях происходит изменение в функционировании >Ю-цГМФ каскада, что и приводит к невоспроизводимым и, зачастую, противоречивым результатам Действительно, если в стандартных условиях в наших экспериментах также не наблюдалось какой-либо значимого эффекта при добавлении активаторов N0-пГМФ каскада (8Вг-сОМР 1мкМ, аргинин 5мМ, БЫР 1мМ) на базальных токах, то в присутствии 1мМ аргинина во всех рабочих средах активация цГМФ-зависимого фосфорилирования при введении специфического активатора РКС 8Вг-сОМР (1мкМ) приводило к подавлению базального Са2+ тока Ь-типа в кардиомиоцитах крыс БЭ Использование специфического блокатора РКО (КТ5823, 0,25-0,5 мкМ) подтвердило, что данный эффект вызван активацией этой протеинкиггазы Последующие эксперименты с использованием доноров N0 - аргинина (5мМ) и БОТ (1мМ) показали, что добавление их добавление аналогично уменьшает амплитуду базального тока на 29±9,6% Эксперименты с использованием ингибиторов основных звеньев ИО-цГМФ каскада показали, что наблюдаемый эффект, скорее всего, связан с активацией оксидом азота растворимой гуанилатциклазы и последующей активацией РКХЗ фосфорилирования, а не с нитрозилированием Са2+ канала или активацией фосфодиэстеразы II Этот результат показывает, что в отсутствие аргинина в рабочих средах РКХ}-зависимая регуляция базального Са2+ тока Ь-типа в кардиомиоцитах не проявляется, но в условиях более близких к нативным РКС участвует в регуляции базального тока

С Са2+ токами, активированными цАМФ-зависимым фосфорилированием (через активацию изопротеренолом (0,1мкМ) (В12-адренорецепторов), ситуация оказалась сложнее введение активаторов N0-цГМФ каскада, в отличие от базальных токов, не вызывала какого-либо значимого изменения амплитуды разогнанных токов Однако, если на фоне или совместно с активаторами Ж)-цГМФ каскада (Вг-сСМР (1мкМ) (п=4), аргинина (5мМ) и БЫРОмМ)) вводилась насыщающая концентрация агониста М2-холинорецепторов ацетилхолина (0,1мМ), то происходило полное возвращение разогнанных токов к базальным значениям, чего не наблюдалось при введении одного лишь ацетилхолина Таким образом, цГМФ, скорее всего, выполняет роль антагониста цАМФ в регуляции Са2+ тока Ь-типа кардиомиоцитов лишь при активации холинергического каскада

Данный результат расходится с большинством литературных данных, где показано, что активаторы ЫО-цГМФ каскада подавляют Са2+ Ь-токи, активированные цАМФ-зависимым фосфорилированием Мы предполагаем, что возможной причиной этому может быть либо различие в методиках, либо может быть связано с тем, что при максимальной стимуляции адренергического каскада Са2+ канал Ь-типа по каким-то причинам становится недоступным для фосфорилирования РКХ}. Либо присутствие 1мМ аргинина в среде, как и в случае с базальными токами, резко изменило ситуацию в регуляции активированных цАМФ-зависимым фосфорилированием токах

Из вышеприведенных результатов следует, что в нормально функционирующем организме МО-цГМФ каскад выполняет роль тонкого регулятора входящего Са2+ тока, и соответственно, сердечной активности

Для исследования роли ЫО-цГМФ каскада в регуляции Са2+ токов Ь-типа при различных отклонениях от нормы, были проведены эксперименты в двух других группах животных, характеризующихся изменением Са2+ гомеостаза — спонтанно-гипертензивных крыс (ЗИЛ) и гибернирующих якутские сусликов, показали, что в у них ЫО-цГМФ каскад в кардиомиоцитах нарушен и имеет низкую активность Однако, исходя из литературных данных, мы полагаем, что данное нарушение имеет различные причины и последствия Так, у БНЯ,

данное нарушение носит патологический характер, и, скорее всего, является причиной развития гипертрофии миокарда и других заболеваний, свойственных этой группе С другой стороны у гибернирующих сусликов эти изменения, вероятнее всего, имеют приспособительный характер к условиям зимней спячки

ВЫВОДЫ

1 Показано, что в кардиомиоцитах крыс Spraque-Dow]ey в присутствии аргинина во всех рабочих средах активация цГМФ-зависимого фосфорилирования приводит к подавлению базального Са2+ тока Ь-гипа и не проявляется на токах, активированных насыщающими концентрациями изопротеренола- активатора цАМФ-зависимого фосфорилирования

2 Исследована роль ключевых звеньев ЫО-цГМФ каскада в регуляции токов Ь-типа Показано, что добавка эндогенного или экзогенного источников N0 уменьшает ампли гуду базального тока на 29±9,6% Наблюдаемый эффект связан с активацией оксидом азота растворимой гуанилатциклазы и последующей активацией цГМФ-зависимого фосфорилирования и не связан с нитрозилированием

Са2+ канала или

активацией фосфодиэстеразы II

3 Показано, что С а31 токи Ь-типа, активированные насыщающими концентрациями изопротеренола, подавляются до базального уровня при совместном действии ацетилхолина и агонистов 1Ч0-цГМФ каскада

4 Показано, что ЫО-цГМФ каскад в кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс (8НЯ) и гибернирующих сусликов (СйеНдо ишМа№) нарушен И имеет низкую активность

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1) Дынник В В, Гр-ушин, К С. Корысгова А Ф, Ненов М Н, Мурашев А В , Кокоз Ю М. Стабилизирующая роль аргинина и N0 в регуляции потенциалзависимого Са2+ тока Ь-типа в клетках миокарда Доклады Академии Наук, 2005, том 404, №5, стр 1-4.

2) Кокоз ЮМ, Грушин КС, Ненов МН, Дынник ВВ., Семушина СГ, Пахомова И А., Мурашев АН Регуляция ТМО-свМР-каскадом Са2+-тока Ь-типа в изолированных кардиомиоцитах нормотензивных и спонтанно-гипертензивных крыс Доклады Академии Наук 2007, том 415, №2 257-261.

Тезисы докладов

1) Дынник В В , Грушин К С. Корыстова А Ф, Ненов М Н, Бережнов А В , Пименов О Ю, Кокоз Ю М Роль 1ЧО-сСМР-РКС в регуляции Са2+тока Ь-типа в миокарде Стабилизирующая роль аргинина Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2005, стр 123-126

2) Дынник В В , Джафаров Р.Х, Гришина Е В , Касымов В А, Грушин К С , Кокоз Ю М, Зинченко В П Печеночные энцефалопатии Синдром Рэя Токсические эффекты жирных кислот — «четыре в одном» Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2005,238-243

3) Грушин К С. Ненов М Н, Корыстова А Ф , Дынник ВВ., Кокоз Ю М Синергизм действия сСМР-регуляторной и холинэргической систем в кардиомиоцитах крыс Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и Медицина», Санкт-Петербург, 2005, стр 30.

4) Грушин К С. Дынник В В , Корыстова А Ф, Кокоз Ю М Стабилизирующая роль аргинина в регуляции потенциалзависимого Са2+ Ь-типа в кардиомиоцитах нормотермных животных Сборник тезисов 9-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2005,112.

5) Дынник В В , Джафаров Р X, Гришина Е В , Касымов В А , Грушин К С . Кокоз ЮМ, Зинченко ВП Синдром Рэя Токсические эффекты жирных кислот Научные труды I Съезда физиологов СНГ, 2005, том 1, N0 196

6) Ненов М Н, Грушин К С Роль ИО-сСМР системы в регуляции базальных и активированных изопротеренолом Са2+ токов Ь-типа в изолированных кардиомиоцитах нормотензивных и спонтанно-гипертензивных крыс Сборник

тезисов 9-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2006,233-234

7) Ненов МН, Грушин КС Протеинкиназа й - ключевой компонент в регуляции Са2+ тока Ь-типа МО-сОМР каскадом Сборник тезисов 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2007,302-303

8) Грушин К С, Ненов М Н , Дынник В В , Семушина С Г., Пахомова И А, Мурашев А Н, Кокоз Ю М >Ю-сОМР каскад и адаптация сердечно-сосудистой системы к экстремальным условиям у нормотермных и зимоспящих животных Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, 2007, 84-87

Подписано в печать 20 03 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 181 Тираж 90экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грушин, Кирилл Сергеевич

Список сокращений.

Введение.

1 .Обзор литературы.

1.1. Типы Са2+-каналов и их классификация.

1.2. Структура потенциалзависимых Са2+-каналов.

1.3. Оксид азота (NO).

1.4. NO-синтазы.

1.4.1. Классификация, характеристика и структура NO-синтаз.

1.4.2. Регуляция активности NO-синтаз.

1.5. Аргинин и его транспорт в клетку.

1.6. Фосфодиэстеразы.

1.7. Гуанилатциклаза.

1.8. cGMP-завиеимая протеинкиназа.

2. Материалы и методы исследования.

2.1. Выделение клеток.

2.2. Метод перфорированного пэтча.

2.2.1. Растворы.

2.2.2. Приготовление и заполнение пипеток.

2.2.3. Регистрация токов.

3. Результаты и обсуждения.

3.1. NO-cGMP каскад в кардиомиоцитах нормотензивных крыс.

3.1.1. Действие 8Br-cGMP на базальиый Са2+ ток L-типа.

3.1.2. Вклад каскада NO-PKG в регуляцию базального

Са2+ тока L-типа. Роль аргинина.

3.1.3. Действие активаторов NO-cGMP каскада на Са2+ токи L-типа,активированные изопротеренолом — агонистом p-адренергической системы. Роль NO-cGMP при взаимодействии (3-адренергической и холинергической систем.

3.2. NO-cGMP каскад в кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR.

3.3. NO-cGMP каскад в кардиомиоцитах гибернирующих сусликов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль NO в регуляции Ca2+ токов L-типа циклическими нуклеотидами в кардиомиоцитах нормотермных и гибернирующих животных"

Са~ каналы L-типа (Cav1.2 каналы) играют важную роль в процессах электромеханического сопряжения, мышечного сокращения, нейроэндокринной секреции, активации роста и программируемой гибели клеток. В сердечных клетках млекопитающих вход Са2+ через L-тип каналов вызывает выброс ионов Са2+ из саркоплазматического ретикулума и сокращение сердца, во многом определяя функционирование сердечной мышцы. Регуляция Са -тока через L-каналы осуществляется различными регуляторными каскадами, часть которых. действуют через циклические нуклеотиды - cAMP, cGMP. По литературным данным, сАМР является внутриклеточным мессенжером, участвующим в регуляции сердечной деятельности двумя основными регуляторными системами - адренергической и холинергической. Предполагается, что эти 2+ системы контролируют Са ток L-типа и внутриклеточную концентрацию

2+ ионов [Са ]j через регуляцию уровня сАМР-зависимого фосфорилирования протеинкиназой А (РКА). Другому циклическому нуклеотиду — гуанозинмонофосфату (cGMP), большинство исследователей отводили роль, противоположную сАМР, однако литературные данные по действию соединений, активирующих cGMP-завиеимое фосфорилирование, неоднозначны. В некоторых работах введение 8Br-cGMP - негидролизумого " аналога cGMP и одновременно активатора протеинкиназы G (PKG) или прямая инъекция в клетку cGMP приводило к ингибированию сАМР активированных Са2+ токов через прямое фосфорилирование канала PKG. У ' других исследователей 8Br-cGMP не оказывал никакого действия на активированные сАМР токи, подавление наблюдалось лишь при прямых инъекциях cGMP в клетку за счет активации фосфодиэстеразы PDE2, что усиливало распад сАМР.

• I

Однако, при некоторых условиях, наблюдалось увеличение Са тока вследствие ингибирования фосфодиэстеразы PDE3, что приводило к снижению гидролиза сАМР в клетке. Неоднозначность результатов была и на базальных токах — в одних работах эффекта cGMP-завиеимого фосфорилирования не наблюдалось, в других происходило ингибирование, как правило, незначительное, усиливающееся при дополнительном введении PKG в клетку. С открытием окиси азота (N0) как вторичного мессенджера и активатора цитозольной гуанилатциклазы, cGMP-завиеимое фосфорилирование стало рассматриваться как часть каскада, активируемого оксидом азота. В связи с этим вопрос о роли cGMP зависимого фосфорилирования в регуляции Са" тока L-типа в кардиомиоцитах стал еще более важным. Причем ситуация усложнилась, поскольку к описанным выше противоречивым данным по прямому действию cGMP и его негидролизуемого аналога добавились еще и cGMP-незавиеимые эффекты N0 (например, связанные с прямым * нитрозилированием различных белков). Наблюдаемые расхождения в результатах исследователи объясняли особенностями регуляции L-каналов в клетках различных типов (синус, предсердие, желудочек) или разных видов животных. С этим можно было бы согласиться, если бы результаты экспериментов на одних тех же объектах совпадали, однако на одном и том же препарате разные авторы получали неодинаковые, качественно различные данные.

Корректное изучение действия роли cGMP-завиеимого фосфорилирования и всего NO-cGMP каскада в регуляции Са2+ -транспорта в норме и патологии является актуальной задачей, поскольку данный каскад в сердечно-сосудистой системе участвует в большом количестве регуляторных процессов, в частности ангиогенезе (Kawasaki et al., 2003), поддержании работоспособности миокарда и его защите от гипертензии, гипертрофии и реперфузии (Gao et al., 2002; Massion et al., 2003; Fiedler and Wollert, 2004). В сердце перечисленные свойства каскада связаны непосредственно с регуляцией Са2+ гомеостаза и уровня [Са2+],. В качестве одной из экспериментальных моделей участия каскада в развитии ряда патологий могут служить спонтанногипертензивные крысы (SHR). Отличительная черта этих животных — повышенное давление, гипертрофия миокарда, диабет II типа (инсулиновая резистентность) и другие физиологические нарушения. В кардиомиоцитах этих крыс наблюдается нарушение Са2+ гомеостаза, повышенный по сравнению с нормой уровень [Са2+]; и развитие гипертрофии через активацию кальцинейрин/NFAT системы (Kempf and Wollert, 2004). Однако, причины, приводящие к подобным событиям у SHR до сих пор полностью не установлены. С другой стороны, на первичной культуре клеток желудочка сердца крыс линии Sprague-Dawley показано, что активация NO-cGMP каскада уменьшает активность кальцинейрин/NFAT системы за счет подавления входа Са в клетку через L-тип канала (Fiedler et al., 2002). Таким образом, крысы линии SHR представляют большой интерес для изучения причин развития сердечно-сосудистых заболеваний.

С другой стороны, есть группа животных, в которых также происходит серьезные изменения в регуляции Са гомеостаза. Эти животные - гибернанты. Во время зимней спячки у них происходит глобальное изменение регуляции Са2+ токов, позволяющие им поддерживать сердечную деятельность в условиях низких температур, повышенной вязкости крови и других неблагоприятных факторов. Однако, стоит заметить, что, несмотря на подобные изменения, у гибернантов патологических изменений в миокарде не происходит. И исследование возможного участия NO-cGMP-PKG каскада в регуляции Са тока L-типа во время гибернации может пролить свет на возможные причины подобного приспособления без серьезных патологических изменений.

1.Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Грушин, Кирилл Сергеевич

Выводы.

1. Показано, что в кардиомиоцитах крыс Spraque-Dowley в присутствии аргинина во всех рабочих средах активация cGMP-завиеимого фосфорилирования приводит к подавлению базального Са2+ тока L-типа и не проявляется на токах, активированных насыщающими концентрациями изопротеренола - активатора cGMP-завиеимого фосфорилирования.

2. Исследована роль ключевых звеньев NO-cGMP каскада в регуляции Са2+ токов L-типа. Показано, что добавка эндогенного или экзогенного источников NO уменьшает амплитуду базального тока на 29±9,6%. Наблюдаемый эффект связан с активацией оксидом азота растворимой гуанилатциклазы и последующей активацией cGMP-зависимого фосфорилирования и не связан с нитрозилированием Са2+ канала или активацией фосфодиэстеразы II.

3. Показано, что Са2+ токи L-типа, активированные насыщающими концентрациями изопротеренола, подавляются до базального уровня при совместном действии ацетилхолина и агонистов NO-cGMP каскада.

4. Показано, что NO-cGMP каскад в кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) и гибернирующих сусликов (Citellus undulatus) нарушен и имеет низкую активность.

Заключение.

Подводя итог проведенным исследованиям, можно заключить, что в кардиомиоцитах NO-cGMP каскад в целом, и cGMP-завиеимое фосфорилирование в частности, может играть важную роль в регуляции Са2+ тока через L-тип каналов.

Основной проблемой в исследовании cGMP-завиеимого фосфорилирования было практически полное отсутствие повторяемости получаемых результатов и в большинстве случаев не наблюдалось какого-либо эффекта на базальных токах. Объяснений данному порядку вещей по литературным данным достаточно много: специфика cGMP-завиеимой регуляции у разных видов животных и различных типов клеток, различия в экспериментальных методах и другие причины. Нами было предположено, что при отсутствии в рабочих средах единственного эндогенного источника NO (одним из основных действий которого является увеличение cGMP в клетке посредством стимуляции цитозольной гуанилатциклазы) - аргинина. И в этих условиях происходит изменение в функционировании NO- cGMP каскада, что и приводит к невоспроизводимым и, зачастую, противоречивым результатам. Действительно, если в стандартных условиях в наших экспериментах также не наблюдалось какой-либо значимого эффекта при добавлении активаторов NO-cGMP каскада (8Br-cGMP 1мкМ, аргинин 5мМ, SNP 1мМ) на базальных токах, то в присутствии 1мМ аргинина во всех рабочих средах активация cGMP-зависимого фосфорилирования при введении специфического активатора PKG 8Br-cGMP (1мкМ) приводило к подавлению базального Са тока L-типа в кардиомиоцитах крыс SD. Использование специфического блокатора PKG (КТ5823, 0,25-0,5 мкМ) подтвердило, что данный эффект вызван активацией этой протеинкиназы. Последующие эксперименты с использованием доноров NO - аргинина (5мМ) и SNP (1мМ) показали, что их добавление аналогично уменьшает амплитуду базального тока на 29±9,6%. Эксперименты с использованием ингибиторов основных звеньев NO-cGMP каскада показали, что наблюдаемый эффект, скорее всего, связан с активацией оксидом азота растворимой гуанилатциклазы и последующей активацией PKG фосфорилирования, а не с нитрозилированием Са канала или активацией фосфодиэстеразы II. Этот результат показывает, что в отсутствие аргинина в рабочих средах PKG-зависимая регуляция базального Са тока L-типа в кардиомиоцитах не проявляется, но в условиях более близких к нативным PKG участвует в регуляции базального тока. и

С Са токами, активированными сАМР-зависимым фосфорилированием п через активацию изопротеренолом (10" М) (312-адренорецепторов), ситуация оказалась сложнее: введение активаторов NO-cGMP каскада, в отличие от базальных токов, не вызывала какого-либо значимого изменения амплитуды разогнанных токов. Однако, если на фоне или совместно с активаторами NO-cGMP каскада (Br-cGMP (1мкМ), аргинина (5мМ) и SNP (1мМ)) вводилась насыщающая концентрация агониста М2-холинорецепторов ацетилхолина (10" 4М), то происходило полное возвращение разогнанных токов к базальным значениям, чего не наблюдалось при введении одного лишь ацетилхолина. Таким образом, cGMP, скорее всего, выполняет роль антагониста сАМР в регуляции Са2+ тока L-типа кардиомиоцитов при активации холинергического каскада.

Данный результат расходится с большинством литературных данных, где

2+ показано, что активаторы NO-cGMP каскада подавляют Са L-токи, активированные сАМР-зависимым фосфорилированием. Мы предполагаем, что возможной причиной этому может быть либо различие в методиках, либо может быть связано с тем, что при максимальной стимуляции (З-адренергического каскада Са2+ канал L-типа по каким-то причинам становится недоступным для фосфорилирования PKG. Либо присутствие 1мМ аргинина в среде, как и в случае с базальными токами, резко изменило ситуацию в регуляции активированных сАМР-зависимым фосфорилированием токах.

Из вышеприведенных результатов следует, что в нормально функционирующем организме NO-cGMP каскад выполняет роль тонкого регулятора входящего Са2+ тока, и соответственно, сердечной активности.

Для исследования роли NO-cGMP каскада в регуляции Са токов L-типа при различных отклонениях от нормы, были проведены эксперименты в двух других группах животных, характеризующихся изменением Ca2f гомеостаза -спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) и гибернирующих якутских сусликов. Эксперименты показали, что у этих животных NO-cGMP каскад в кардиомиоцитах нарушен и имеет низкую активность. Однако, исходя из литературных данных, мы полагаем, что данное нарушение имеет различные характер и последствия. Так, у SHR, данное нарушение носит патологический характер, и, скорее всего, является причиной развития гипертрофии миокарда и других заболеваний, свойственных этой группе. С другой стороны, у гибернирующих сусликов эти изменения, вероятнее всего, имеют приспособительный характер к условиям зимней спячки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грушин, Кирилл Сергеевич, Пущино

1. Игнатьев Д.А., Воробьев В.В:, Зиганшин Р.Х. Влияние некоторых короткихпептидов,, выделенных из мозга зимоспящего суслика, на ЭЭГ и поведение крыс. Журнал высшей нервной деятельности. 1996. Том 46, Вып. 6. С. 1049-1058.

2. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. Москва: Просвещение. 1987. С.815.

3. Турпаев К.Т. Роль окиси азота в передаче сигнала между клетками //

4. Молекулярная биология. 1998. V. 32. N. 4. Р. 581-591.

5. Abi-Gerges N., Ji G.J., Lu Z.J., Fischmeister R., Hescheler J., Fleischmann B'.K.

6. Functional expression and regulation of the hyperpolarization activated nonselective cation current in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes // J Physiol (Lond). 2000. V. 523. P. 377-389.

7. Achterberg P.W., Harmsen E., Jong J.W. Adenosine deaminase inhibition andmyocardial purine release during normoxia and ischemia // Cardiovasc Res. 1985. V. 19. P. 593-598.

8. Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure,function and inhibition // Biochem J. 2001. V. 357. P. 593-615.

9. Alekseev A.E., Korystova A.F., Mavlyutova D.A., Kokoz Yu.M. Potentialdependent Ca2+ current- in isolated heart cells of hibernators // Biochemistry and Molecular biology International. 1994. V. 33. N. 2. P. 365376.

10. Alekseev A.E., Markevich" N.I., Korystova A.F., Terzic A., Kokoz Y.M.

11. Comparative analysis of the characteristics of L-type calcium channels in cardiac cells of hibernators // Biophys. J. 1996, V. 70. P. 786-797.

12. Alkon, D.L., Naito, S. Long-term synergistic regulation ,of ionicchannels, by C-kinase and Ca" /СаМ-type II kinase // Adv Exp Med Biol. 1987. V. 221. P. 275-290.

13. Alzuherri H., Chang K.C. Calcineurin activates NF-kappaB in skeletal muscle

14. C2C12 cells // Cell Signal. 2003. V. 15. P. 471-478.

15. Anwyl R. Modulation of vertebrate neuronal calcium channels by transmitters //

16. Brain Res Rev. 1991. V. 16. N. 3. P. 265-281.

17. Balbatun A., Louka F. R., Malinski T. Dynamics of nitric oxide release in thecardiovascular system // Asta Biochimica Polonica. 2003. V. 50. N. 1. P. 61-68.

18. Baillie G.S., Sood A., McPhee I., Gall I., Репу S.J., Lefkowitz R.J., Houslay

19. M.D. Beta-arrestin-mediated PDE4 cAMP phosphodiesterases recruitment regulates P-adrenoceptor switching from Gs to Gi // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100: P. 940-945.

20. Bauer P.M., Fulton D., Boo Y.C., Sorescu, G.P., Kemp B.E., Jo H., Sessa W.C.

21. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric oxide synthase // J Biol Chem. 2003. V. 278. P. 14841-14849.

22. Bayraktutan U., Yang Z.-K., Shah A. M. Selective dysregulation of nitric oxidesynthase type 3 in cardiac myocytes but not coronary microvascular endothelial cells of spontaneously hypertensive rat // Cardiovascular Research. 1998. V. 38. P. 719-726.

23. Bellamy T.C., Griffiths C., Garthwaite J. Differential sensitivity of guanylylcyclase and mitochondrial respiration to nitric oxide measured using clamped concentrations // J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 31801-31807.1. O-f

24. Blaeser F., Ho, N., Prywes R., Chatila T.A. Ca~ -dependent gene expressionmediated by MEF2 transcription factors. J Biol Chem // 2000. V. 275.:-P. 197209.

25. Bredt D.S. Nitric oxide signaling specificity the heart of the problem // Journal • of Cell Science. 2003. V. 116. P. 9-15.

26. Brenman J.E., Chao D.S., Gee S.H. Interaction of nitric oxide synthase with thepostsynaptic density protein PSD-95 and alpha 1-syntrophin mediated by PDZ domains // Cell. 1996. V. 84. N. 5. P. 757-767.

27. Buechler W.A., Nakane M., Murad F. Expression of soluble guanylate cyclaseactivity requires both enzyme subunits // Biochem Biophys Res Commun. 1991. V. 174, N. 1. P. 351-357.

28. Burkhardt M, Glazova M, Gambaryan S, Vollkommer T, Butt E, Bader B,

29. Heermeier K, Lincoln TM, Walter U, Palmetshofer A. KT5823 inhibits cGMP-dependent protein kinase activity in vitro but not in intact human platelets and rat mesangial cells //J Biol Chem. 2000. V. 275. P. 33536-33541.

30. Campbell D.L., Stamler J.S., Strauss H.C. Redox modulation of L-type calciumchannels in ferret ventricular myocytes. Dual mechanism regulation by nitric oxide and S-nitrosothiols // J Gen Physiol. 1996. V. 108. P. 277-293.,

31. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels // Annu.

32. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. V. 16. P. 521-555.

33. Chin-Dusting J.P.F., Willems L., Kaye D.M. L-Arginine transporters incardiovascular disease: A novel therapeutic target // Pharmacology and Therapeutics. 2007. V.l 16. P. 428-436.

34. Closs E. I., Graf P., Habermeier A., Cunningham J. M., Forstermann U. Humancationic amino acid transporters hCAT-1, hCAT-2A, and hCAT-2B: three related carriers with distinct transport properties // Biochemistry. 1997. V. 36. N. 21. P. 6462-6468.

35. Closs E.I., Simon A., Ve'kony N., Rotmann A. Plasma Membrane Transportersfor Arginine// J. Nutr. 2004. V. 134. P. 2752S-2759S.

36. Closs E.I., Boissel J.-P., Habermeier A., Rotmann A. Structure and Function of

37. Cationic Amino Acid Transporters (CATs) // J. Membrane Biol. 2006. 213. 6777.

38. Conti M., Richter W., Mehats G., Livera G., Park J.Y., Jin C. Cyclic AMPspecific PDE4 phosphodiesterases as critical components of cyclic AMP signaling //J Biol Chem. 2003. V. 278. P. 5493-5496.

39. Corbin J. D., Doskeland S. O. Studies of two different intrachain cGMP-bindingsites of cGMP-dependent protein kinase // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 11391-11397.

40. Cornwell T.L., Soff G.A., Traynor A.E., Lincoln T.M. Regulation of theexpression of cyclic GMP-dependent protein kinase by cell density in vascular smooth muscle cells//J Vase Res. 1994. V. 31. P. 330-337.

41. Crabtree G.R. Generic signals and specific outcomes: signaling through Ca2+,calcineurin, and NFAT // Cell. 1999. V. 96. P. 611-614.

42. Denninger J.W., Marietta M.A. Guanylate cyclase and the NO/cGMP signallingpathway // Biochimica et Biophysica Acta. 1999. V. 1411. P. 334-350.

43. Dittrich M., Jurevicius J., Georget M., Rochais F., Fleischmann B.K., Hescheler

44. J., Fischmeister R. Local response ofL-type Ca2+ current to nitric oxide in frog ventricular myocytes //Journal of Physiology. 2001. V. 534. N. 1. P. 109-121.

45. Dodge K.L., Khouangsathiene S., Kapiloff M.S., Mouton R., Hill E.V., Houslay

46. M.D., Langeberg L.K., Scott J.D. MAKAP assembles a protein kinase A/PDE4 phosphodiesterase cAMP signaling module // EMBO J. 2001. V. 20. P. 19211930.

47. El-Ayoubi R., Menaouar A., Gutkowska J., Mukaddam-Daher S. Imidazolinereceptors but not a2-adrenoceptors are regulated in spontaneously hypertensive rat heart by chronic moxonidine treatment // JPET. 2004. V. 310. P. 446-451.

48. El Husseini A.E., Bladen C., Vincent S.R. Molecular characterization of a type IIcyclic GMP-dependent protein kinase expressed in the rat brain // J Neurochem. 1995. V. 64. P. 2814-2817.

49. Espiner E.A. Physiology of natriuretic peptides // J Intern Med. 1994. V. 235. P.527.541.

50. Fiedler В., Lohmann S. M., Smolenski A., Linnemuller S., Pieske В., Schroder F.,

51. Molkentin J. D., Drexler Ы., Wollert К. C. Inhibition of calcineurin-NFAT hypertrophy signaling by cGMP-dependent protein kinase typel in cardiac myocytes // PNAS. 2002. V. 99. N. 17. P. 11363-11368.

52. Fiedler В., Wollert K.C. Interference of antihypertrophic molecules and signalingpathways with the Ca -calcineurin-NFAT cascade in cardiac myocytes. Cardiovascular Research // 2004. V. 63. P. 450- 457.

53. Fischmeister R., Harzell H.C. Cyclic guanosine 3', 5'-monophosphate regulatesthe calcium current in single cells from frog ventricle-// J Physiol'(Lond). 1987. V. 387. P. 453-472.

54. Foster D.C., Wedel B.J., Robinson S.W., Garbers D.L. Mechanisms of regulationand functions of guanylyl cyclases // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 1999. V. 135. P. 1-39.

55. Forstermann U., Closs E.I., Pollock J.S., Nakane M., Schwarz P., Gath I., Kleinert

56. H. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification; molecular cloning, and functions // Hypertension. 1994. V. 23. P. 1121-1131.

57. Francis S. H., Corbin, J. D. Cyclic nucleotide-dependent protein kinases:intracellular receptors for cAMP and cGMP action // Crit. Rev. Clin.; Lab. Sci. 1999: V. 36. P. 275-328.

58. Francis S. H., Poteet-Smith- C., Busch J. L., Richie-Jannetta R., Corbin, J. D.

59. Mechanisms of autoinhibition in cyclic nucleotide-dependent protein kinases // Front Biosci. 2002. V. 7. P. d580-d592.

60. Friebe A, Wedel B; Foerster J, Harteneck C, Malkewitz J, Schultz G, Koesling D.

61. Function of conserved cysteine residues on soluble guanylyl cyclase // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 1194 -1198.

62. Friebe A., Koesling D. Regulation of Nitric Oxide-Sensitive Guanylyl Cyclase //

63. Circ Res. 2003. V. 93. P. 96-105.

64. Fujii M., Ogata Т., Takahashi E., Yamada K., Nakabayashi K., Oishi M.,

65. Ayusawa D. Expression of the human cGMP-dependent protein kinase II gene is lost upon introduction of SY40 T antigen or immortalization in human cells // FEBS Lett. 1995. V. 375. P. 263-267.

66. Fulle H.J., Garbers D.L. Guanylyl cyclases: a family of receptor linked enzymes //

67. Cell. Biochem. Funct. 1994. V. 12. P. 157-165.

68. Fukao M., Mason H. S., Britton F. C., Kenyon J. L., Horowitz В., Keef K. D.

69. Cyclic GMP-dependent protein kinase activates cloned BKCa channels expressed-in mammalian cells by direct phosphorylation at serine 1072 // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 10927-10935.

70. Fulton D., Gratton J-P. Sessa W.C. Post-translational control of endothelial nitricoxide synthase: why isn't calcium/calmodulin enough? // J Pharmacol Exp Ther. 2001. V. 299. P. 818-824.

71. Furchgott R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in therelaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine // Nature. 1980. V. 288. P. 373-376. .

72. Gainullin R.Z., Saxon M.E. Positive inotropic effect of ryanodine on rabbitventricular muscle: dependence on the intracellular calcium load // Gen Physiol Biophys. 1989. V. 8. N. 6: P; 555-568.

73. Gallo M:P:, Ghigo D:, Bosia A., Alloatti G., Costamagna C., Penna C., Levi R.C.

74. Modulation of guinea-pig cardiac L-type calcium current by nitric oxide synthase inhibitors// Journal of Physiology. 1998. V.506.N.3. P. 639-651.

75. Gambaiyan: S., Butt E., Marcus K., Glazova M'., Palmetshofer.A., Guillon G.,

76. Smolenski' A. cGMP-dependent protein kinase type II regulates basal level of. aldosterone production by zona glomerulosa cells without ncreasing expression of the steroidogenic acute regulatory protein- gene // J Biol Chem. 2003. V. 278. P. 29640-29648.

78. Nitric oxide, mediates the: antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemia-reperfusion. The roles of PI3-kinase, Akt, and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation// Circulation. 2002. V. 105. P. 1497-1502.

79. Garcia-Cardena G., Fan R., Stern D.F., Liu J., Sessa W.C. Endothelial nitricoxide synthase is regulated by tyrosihe phosphorylation and interacts with caveolin-1//J Biol Chem. 1996. V. 271. P. 27237-27240.

80. Garthwaite, J.j Charles, S.L., Chess-Williams, R. Endothelium-derived relaxingfactor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain //Nature. 1988. V. 336. N. 6197. P. 385-388.

81. Geiselhoringer A., Werner M., Sigl K., Smital P., Worner R., Acheo L., Stieber J.,

82. Weinmeister P., Feil R., Feil S., Wegener J., Hofmann F., Schlossmann J, IRAG is essential for relaxation of receptor-triggered, smooth muscle contraction by cGMP kinase // EMBO J. 2004. V. 23. P. 4222-4231.

83. Hanoune J., Defer N. Regulation and role of adenylyl cyclise isoforms // Annu

84. Rev Pharmacol Toxicol. 2001. V. 41. P. 145-174.

85. Hartshorne D. J., Ito- M., Erdodi F. Role of protein phosphatase type 1 incontractile functions: myosin phosphatase // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 37211-37214.

86. Hartzell H.C., Fischmeister R. Opposite effects of cyclic GMP and cyclic AMP on

87. Ca2+ current in single heart cells //Nature. 1986. V. 323. P. 273-275.

88. Hartzell H.C. Regulation of cardiac ion channels by catecholamines, acetylcholineand second messenger systems // Prog. Biophys. Molec Biol. 1988. V. 52. P. 165-247.

89. Harvey R.D., Belevych A.E. Muscarinic regulation of cardiac ion channels //

90. British Journal of Pharmacology. 2003. V. 139. P. 1074-1084.

91. Hayashi Y., Nishio M., Naito Y., Yokokura II., Nimura Y., Hidaka H.,Watanabe

92. Y. Regulation of neuronal nitric-oxide synthase by calmodulin kinases // J. Biol. Chem. 1999. V. 274'. P. 20597-20602.

93. Hofmann F., Gensheimer H. P., Gobel C. cGMP-dependent protein kinase.

94. Autophosphorylation changes the characteristics of binding site 1 // Eur. J. Biochem. 1985. V. 147. P. 361-365.

95. Hofmann F. The Biology of Cyclic GMP-dependent Protein Kinases // JBC. 2005.1. V. 280. N. 1. P. 1—4.

96. Hosoda K., Nakao K., Mukoyama M., Saito Y., Jougasaki M., Shirakami G., Suga

97. S., Ogawa Y., Yasue H., Imura H. Expression of brain natriuretic peptide gene in human heart. Production in the ventricle // Hypertension. 1991. V. 17. P. 1152-1155.

98. Houslay M.D., Adams D.R. PDE4 cAMP phosphodiesterases: modular, enzymesthat orchestrate signaling cross-talk, desensitization and compartmentalization //Biochem J. 2003. V. 370. P. 1-18.

99. Ни H., Chiamvimonvat N., Yamagishi Т., Marban E. Direct inhibition ofexpressed cardiac L-type Ca2+ channels by S-nitrosothiol nitric oxide donors // Circulation research, 1997. V. 81. P. 742-752.

100. Huk I. Nanobashvili, J., Neumayer C., Punz A., Mueller M., Afkhampour K.,

101. Ignarro L.J., Buga G.M., Wood K.S., Byrns R.E., Chaudhuri G. Endotheliumderived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide // Proc Natl Acad Sci USA. 1987. V. 84. P. 9265-9269.

102. Ignarro L.J. Biosynthesis and metabolism of endothelium-derived nitric oxide.

103. Annu Rew Pharmacol Toxicol. 1990. V. 30. P. 535-560.

104. Ignarro L.J. Haem-dependent activation of guanylate cyclase and cyclic GMPformation by endogenous nitric oxide: a unique transduction mechanism for transcellular signaling // Pharmacol Toxicol. 1990. V. 67. P 1—7.

105. Imai Y., Jiang В., Pappano A.J. Mechanism for muscarinic inhibition of I(Ca(L))is determined by the path for elevating cyclic AMP in cardiac myocytes // Cardiovasc Res. 2001. V. 51. N. 2. P. 331-343.

106. Jarchau Т., Hausler C., Markert Т., Pohler D., Vanderkerckhove J., Jonge H.R.,1.hmann S.M., Walter U. Cloning, expression, and in situ localization of rat intestinal cGMP-dependent protein kinase II // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91. P. 9426-9430.

107. Joshi M.S., Ferguson T.B., Johnson F.K., Johnson R.A., Parthasarathy S.,1.ncaster J.R. Receptor-mediated activation of nitric oxide synthesis by arginine in endothelial cells // PNAS. 2007.

108. Kaab S., Nuss H.B., Chiamvimonvat N., O'Rourke В., Рак P.H., Kass D.A.,

109. Marban E., Tomaselli G.F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure // Circ Res. 1996. V. 78. P. 262-273.

110. Kamp, T. J., Hell, J. W. Regulation of cardiac L-type calcium channels by proteinkinase A and protein kinase С // Circ Res. 2000. V. 87. P. 1095-1102.

111. Kanagy'N.L. a2-Adrenergic receptor signalling in hypertension // Clinical

112. Science. 2005. V. 109. P. 431-437.

113. Keef, K.D., Hume, J.R., Zhong, J. Regulation of cardiac and smooth muscle Ca2+channels (Cavl.2a,b) by protein kinases // Am J Physiol Cell Physiol. 2001. V. 281. P. C1743-C1756.

114. Kelm M., Feelisch M., Spahr R., Piper H.M., Noack E., Schrader J. Quantitativeand kinetic characterization of nitric oxide and EDRF released from cultured endothelial cells // Biochem Biophys Res Commun. 1988. V. 154. N. 1. P. 236244.

115. Kempf Т., Wollert К. C. Nitric oxide and the enigma of cardiac hypertrophy //

116. BioEssays. 2004. V. 26. P. 608-615. 9.3. Kimura H., Mittal C.K., Murad F. Appearance of magnesium guanylate cyclase activity in rat liver with sodium azide activation // J Biol Chem. 1976. V. 251. N. 24. P. 7769-7773.

117. Klein G., Drexler H., Schroder F. Protein kinase G reverses all isoproterenolinduced changes of cardiac single L-type calcium channel gating // Cardiovasc Res. 2000. V. 48. N. 3. P. 367-374.

118. Knowles R.G. Nitric oxide biochemistry // Biochem Soc T. 1997. V. 25. P. 895901.

119. Kobialka M., Gorczyca W.A. Particulate guanylyl cyclases: multiple mechanismsof activation // Asta Biochimica Polonica. 2000. V. 47. N. 3. P. 517-528.

120. Koesling D. Studying the structure and regulation of soluble guanylyl cyclase //

121. Methods. 1999. V. 19. N. 4. P. 485-493.

122. Koesling D., Friebe A. Soluble guanylyl cyclase: structure and regulation // Rev

123. Physiol Biochem Pharmacol. 1999: V. 135. P. 41-65.

124. Kondo N., Shibata S. Calcium source for excitation-contraction coupling in myocardium of nonhibernating and hibernating chipmunks // Science. 1984. V. 225. P. 641-643.

125. Korn S.J., Bolden A., Horn R. Control of action potentials and Ca" influx by the

126. Ca -dependent chloride current in mouse pituitary cells // J. Physiol (Lond). 1991. V. 439. P. 423-437.

127. Kostic M.M., Erdogan S., Rena G., Borchert G., Hoch В., Bartel S., Scotland G.,

128. Huston E., Houslay M.D., Krause E.G. Altered expression of PDE1 and PDE4 cyclic nucleotide phosphodiesterase isoforms in 7-oxo-prostacyclin-preconditioned rat heart // J'Mol Cell Cardiol. 1997. V. 29. P. 3135-3146.

129. Kulaksiz H., Schmid A., Honscheid M., Eissele R., Klempnauer J., Cetin Y.

130. Guanylin in the human pancreas: a novel luminocrine regulatory pathway of electrolyte secretion via cGMP and CFTR in the ductal system // Flistochem Cell Biol. 2001. V. 115. P. 131-145. •

131. Kulaksiz H., Rehberg E., Stremmel W., Cetin Y. Guanylin and functional coupling proteins in the human salivary glands and gland tumors : expression, cellular ocalization, and target membrane domains // Am J Pathol. 2002. V. 161. P. 655-664.

132. Kulaksiz H., Schlenker Т., Rost D., Stiehl A., Volkmann M., Lehnert Т., Cetin

133. Y., Stremmel W. Guanylin regulates chloride secretion in the human gallbladder via the bile fluid // Gastroenterology. 2004. V. 126. P. 732-740.

134. Kumar R., Namiki Т., Joyner R.W. Effects of cGMP on L-type calcium currentof adult and newborn rabbit ventricular cells // Cardiovasc Res. 1997. V. 33. N. 3. P. 573-582.

135. Layland J., Li J.M., Shah A.M. Role of cyclic GMP-dependent protein kinase inthe contractile response to exogenous nitric oxide in rat cardiac myocytes // J Physiol. 2002. V. 540. P. 457-467.

136. Levi R.C., Alloati G., Fischmeister R Cyclic GMP regulates the Ca-channelcurrent in guinea pig ventricular myocytes // Pflugers Arch. 1989. V. 413. P. 685-687.

137. Levine S.N., Steiner A.L., Earp H.S., Meissner G. Particulate guanylate cyclaseof skeletal muscle: effects of Ca2+ and other divalent cations on enzyme activity//Вiochim Biophys Acta. 1979. V. 566. N. 1. P. 171-182.

138. Levitan E.S., Kramer R.H. Neuropeptide modulation of single calcium and potassium channels detected with a new patch clamp configuration // Nature. 1990. V. 348. N. 6301. P. 545-547.

139. Lewis S. J., Bhopatkar M. Y., Walton Т. M., Bates J. N. Role of voltagesensitive calcium-channels in nitric oxide-mediated vasodilation in Spontaneously Hypertensive rats // European Journal of Pharmacology. 2005. V. 528. P. 144-149.

140. Lincoln T.M., Corbin J.D. Characterization and biological role of the cGMPdependent protein kinase // Adv Cyclic Nucleotide Res. 1983. V. 15. P. 140192.

141. Lyman C.P. Pharmacological aspects of mammalian hibernation // Pharmacol.

142. Ther. 1984. V. 25. P. 371-393.

143. Lyman C.P., Blinks D.S. The effect temperature on the isolated hearts of closelyrelated hibernators and nonhibernators // J. Cell Сотр. Physiol. 1959. V.54. P. 53-63.

144. Lui H., Maurice D.H. Expression of cyclic GMP-inhibited phosphodiesterases

145. ЗА and 3B (PDE3A and PDE3B) in rat tissues: differential subcellular localization and regulated expression by cyclic AMP // Br J Pharmacol. 1998. V. 125. P. 1501-1510.

146. Lundberg J.O., Weitzberg E., Lunberg J.M., Alving K. Intragastric nitric oxideproduction in humans: measurements in expelled air // Gut. 1994. V. 35. P. 1543-1546.

147. M.A.G. van der Heyden, Wijnhoven T.J.M., Opthof T. Molecular aspects ofadrenergic modulation of cardiac L-type Ca2+ channels // Cardiovascular Research. 2005. V. 65. P. 28-39.

148. Mann, G. E., Yudilevich, D. L., Sobrevia, L. Regulation of amino acid andglucose transporters in endothelial and smooth muscle cells // Physiol Rev. 2003. V. 83. N. 1 P. 183-252.

149. Manganiello V.C., Degerman E. Cyclic nucleotide phosphodiesterases: diverseregulators of cyclic nucleotide signals and inviting molecular targets for novel therapeutic agents // Thromb Haemost. 1999. V. 82. P. 407-411.

150. Marietta M. Nitric oxide synthase: aspects concerning structure and catalysis //

151. Cell. 1994. V. 78. N. 6. P. 927-930.

152. Martinez S.E., Wu A.Y., Glavas N.A., Tang X.B., Turley S., Hoi W.G.J., Beavo

153. J.A. The two GAF domains in phosphodiesterase 2A have distinct roles in dimerisation and in cGMP binding // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99. P. 13260-13265.

154. Massion P.B., Feron O., Dessy C., Balligand J.-L. Nitric Oxide and Cardiac

155. Function. Ten Years After, and Continuing // Circ Res. 2003. V. 93. P.388-398

156. McAllister-Lucas L.M., Haik T.L., Colbran J.L., Sonnenburg, W.K., Seger D.,

157. Turko I.V., Beavo J.A., Francis S.H., Corbin J.D. An essential aspartic acid at each of two allosteric cGMP-binding sites of a cGMP-specific phosphdiesterase //J Biol Chem. 1995. V. 270. P. 30671-30679.

158. Meldolesi, J., Pozzan, T. Pathways of Ca2+ influx at the plasma membrane:voltage-, receptor-, and second messenger-operated channels // Exp. Cell Res. 1987. V. 171. P. 2. P. 271-283.

159. Mery P.F., Lohmann S.M., Walter U., Fischmeister R. Ca2+ current is regulatedby cyclic GMP-dependent protein kinase in mammalian cardiac myocytes // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. V. 88. P. 1197-1201.

160. Michell B.J., Chen Z., Tiganis Т., Stapleton D., Katsis F., Power D.A., Sim A.T.,

161. Kemp B.E. Coordinated control of endothelial nitric-oxide synthase phosphorylation by protein kinase С and the cAMP-dependent protein kinase // J Biol Chem. 2001. V. 276. P. 17625-17628.

162. Mikami, A., Imoto, K., Tanabe, Т., Niidome, Т., Mori, Y., Takeshima, H., Narumiya, S., Numa, S. Primary structure and functional expression of the cardiac dihydropyridine-sensitive calcium channel // Nature. 1989. V. 340. N. 6230. P. 230-233.

163. Milner R.E., Michalak M., Wang L.C.H. Altered properties of calsequestrin andthe ryanodine receptor in the cardiac sarcoplasmic reticulum of hibernating mammals //Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1063. P. 120-128.

164. Milson W.K., McArthur M.D., Webb C.L. Control of breathing in hibernatingground squirrels. Living in the cold // Elsiver, Amsterdam New-York. 1986. P. 469-475.

165. Morales-Ruiz M., Fulton D., Sowa G., Languino L.R., Fujio Y., Walsh K., Sessa

166. W.C. Vascular endothelial growth factor-stimulated actin reorganization and migration of endothelial cells is regulated via the serine/threonine kinase Akt // Circ Res. 2000. V. 86. P. 892-896.

167. Movsesian M.A. PDE3 cyclic nucleotide phosphodiesterases and the compartmentation of cyclic nucleotide-mediated signaling in cardiac myocytes. //Basic Res Cardiol. 2002. V. 97. N. l.P. 183-190.

168. Mukoyama M., Nakao K., Hosoda K., Suga S., Saito Y., Ogawa Y., Shirakami

169. Nakane M., Murad F. Cloning of guanylyl cyclase isoforms // Adv Pharmacol.1994. V. 26. P. 7-18.

170. Nathan C., Xie Q. Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls // Cell. 1994.1. V. 78. N. 6. P. 915-918.

171. Nascimento J.H., Salle L., Hoebeke J., Argibay J., Peineau N. cGMP-mediatedinhibition of cardiac L-type Ca(2+) current by a monoclonal antibody against the M(2) ACh receptor // Am J Physiol Cell Physiol. 2001. V. 281. N. 4. P. C1251-C1258.

172. Neher E., Sakmann B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres //Nature. 1976. V. 260. N. 5554. P: 799-802.

173. Nowycky, M.C., Fox, A.P., Tsien, R.W. Three types of neuronal calciumchannel with different calcium agonist sensitivity // Nature. 1985. V. 316. N. 6027. P.440-443.

174. Nuss H.B., Kaab S., Kass D.A., Tomaselli G.F., Marban E. Cellular basis ofventricular arrhythmias" and abnormal automaticity in heart failure // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1999. V. 277. P. H80-H91.

175. Obejero-Paz C.A., Auslender M., Scarpa A. PKC activity modulates availabilityand long openings of L-type Ca2+ channels in A7r5 cells // Am. J. Physiol. 1998. V. 275b. N. 2. P. C535-C543.

176. Ono- K., Trautwein W. Potentiation by cyclic GMP of p-adrenergic effect on

177. Ca2+ current in guinea-pig ventricular cells // J Physiol (London). 1991. V. 443. P. 387-404.

178. Palmer R.M., Ferridge A.G., Moncada S. Nitric, oxide release accounts for thebiological activity of endothelium-derived relaxing factor // Nature. 1987. V. 327. P. 524-526:

179. Papapetropoulos A., Fulton D., Lin M.I., Fontana J., McCabe T.J., Zoellner.S.,

180. Garcia-Cardena, Zhou Z., Gratton J.-P., Sessa W.C. Vanadate is a potent activator of endothelial nitric-oxide synthase: evidence for the role of the serine/threonine kinase Akt and the 90-kDa heat shock protein // Mol Pharmacol. 2004. V. 65. P. 407-415.

181. Parkinson SJ, Jovanovic A, Jovanovic S, Wagner F, Terzic A, Waldman SA.

182. Regulation of nitric oxide-responsive recombinant soluble guanylyl cyclase by calcium. Biochemistry. 1999. V. 38. N. 20. P. 6441-6448.

183. PetroffM.G., Kim S.H., Pepe S., Dessy C., Marban E., BalligandJ-L., Sollott S.J.

184. Endogenous nitric oxide mechanisms mediate the stretch dependence of Ga2'+ release in cardiomyocytes //Nat. Cell Biol. 2001. V. 3. P. 867-873.

185. Pfeifer A., Aszodi A., Seidler U., Ruth P., Hofmann F., Fassler R. Intestinalsecretory defects and dwarfism in mice lacking cGMP-dependent protein kinase II // Science. 1996. V. 274. P. 2082-2086.

186. Pfeifer A., Ruth P., Dostmann W., Sausbier M., Klatt P., Hofmann F. Structureand function of cGMP-dependent protein kinases // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1999. V. 135. P. 105-149

187. Rae J., Cooper K., Gates P., Watsky M. Low access resistance perforated patchrecordings using amphotericin В // J Neurosci Methods. 1991. V. 37. N. 1. P. 15-26.

188. Reinhardt R.R., Chin E., Zhou J., Taira M., Murata Т., Manganiello V.C., Bondy

189. C.A. Distinctive anatomical patterns of gene-expression for cGMP-inhibited cyclic-nucleotide phosphodiesterases // J clin Investig. 1995. V. 95. P. 15281538.

190. Rybalkin S.D., Bornfeldt K.E., Sonnenburg W.K., Rybalkina I.G., Kwak K.S.,

191. Hanson K., Krebs E.G., Beavo J.A. Calmodulin-stimulated cyclic nucleotide phosphdiesterase (PDE1C) is induced in human arterial smooth muscle cells of the synthetic, proliferative phenotype // J Clin Investig. 1997. V. 100. P. 26112621.

192. Rybalkin S.D., Rybalkina I.G., Shimizu-Albergine M., Tang X.B., Beavo J.A.

193. PDE5 is converted to an activated state upon cGMP binding to the GAF A domain // EMBO (Eur Mol Biol Organ). 2003. V. 22. P. 469-478.

194. Ruth P., Pfeifer A., Kamm S., Klatt P., Dostmann W. R., Hofmann F. Identification of the amino acid sequences responsible for high affinity activation of cGMP kinase Ialpha // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P: 1052210528.

195. Sadhu K., Hensley K., Florio V.A., Wolda S.L. Differential expression of thecyclic GMP-stimulated phosphodiesterase PDE2A in human venous and capillary endothelial cells //J Histochem Cytochem. 1999. V. 47. P. 895-905.

196. Sakai R., Shen J.B., Pappano A.J. Elevated cAMP suppresses muscarinic inhibition of L-type calcium current in guinea pig ventricular myocytes // J Cardiovasc Pharmacol. 1999. V. 34. N. 2. P. 304-315.

197. Schmidt H.H., Lohmann S.M., Walter U. The nitric oxide and cGMP signaltransduction system: regulation and mechanism of action // Biochim Biophys Acta. 1993. V. 1178. N. 2. P. 153-175.

198. Schroder F., Klein G., Fiedler В., Bastein M., Schnasse N., Hillmer A., Ames S.,

199. Gambaryan S., Drexler H., Walter U., Lohmann S.M., Wollert K.C. Single L-type Ca(2+) channel regulation by cGMP-dependent protein kinase type I in adult cardiomyocytes from PKG I transgenic mice // Cardiovasc Res. 2003. V. 60. N. 2. P. 223-225.

200. Schulz S., Yuen P.S., Garbers D.L. The expanding family of guanylyl cyclases //

201. Trends Pharmacol Sci. 1991. V. 12. N. 3.P. 116-120.

202. Schulz S., Wedel B.J., Matthews A., Garbers D.L. The cloning and expression ofa new guanylyl cyclase orphan receptor // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 10321037.

203. Sears, C.E., Bryant, S.M., Ashley, E.A., Lygate, C.A., Rakovic, S., Wallis, H.L.,

204. Neubauer, S., Terrar, D.A., Casadei, B. A cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling // Circulation. 2002. V. 106. P. 11-178.

205. Shah A.M., Spurgeon H.A., Sollott S.J., Talo A., Lakatta E.G. 8-bromo-cGMPreduces the myofilament response to Ca2+ in intact cardiac myocytes // Circ Res. 1994. V. 74. P. 970-978.

206. Shen J.-B., Pappano A. J. On the role of phosphatase in regulation of cardiac Ltype calcium current by cyclic GMP // JPET. 2002. V. 301. P. 501-506.

207. Shorofsky S.R., Aggarwal R., Corretti M., Baffa J.M., Strum J.M., Al-Seikhan

208. B.A., Kobayashi Y.M., Jones L.R., Wier W.G., Balke C.W. Cellular Mechanisms of Altered Contractility in the Hypertrophied Heart : Big Hearts, Big Sparks //Circ. Res. 1999. V. 84. P. 424-434.

209. Soderling S.H., Beavo J.A. Regulation of cAMP and cGMP signaling: new phosphodiesterases and new functions // Curr Opin Cell Biol. 2000. V. 12. P. 174-179.

210. Stone J.R., Marietta M.A. Soluble guanylate cyclase from bovine lung: activation with nitric oxide and carbon monoxide and spectral characterization of the ferrous and ferric states // Biochemistry. 1994. V. 33. N. 18. P. 56365640.

211. Sumii K., Sperelakis N. cGMP-dependent protein kinase regulation of the L-type

212. Ca2+ current in rat ventricular myocytes // Circulation research. 1995. V. 77. 4. P. 803-812.

213. Sumii K., Imazu M., Yamakido M., Sperelakis N. Cyclic GMP-dependent protein kinase regulates the L-type calcium current in rat ventricular myocytes //Heart Vessels. 1997. V. 12. P. 62-65.

214. Surks H. K., Mochizuki N., Kasai Y., Georgescu S. P., Tang К. M., Ito M.,1.ncoln Т. M., Mendelsohn M. E. Regulation of myosin phosphatase by a specific interaction with cGMP- dependent protein kinase Ialpha // Science. 1999. V. 286. P. 1583-1587.

215. Tang, S., Yatani, A., Bahinski, A., Mori, Y., Schwartz, A. Molecular localizationof regions in the L-type calcium channel critical for dihydropyridine action // Neuron. 1993. V. ll.N. 6. P. 1013-1021.

216. Thakkar J.,. Tang S.B., Sperelakis N., Wahler G.M. Inhibition of cardiac slowaction potentials by 8-bromo-cyclic GMP occurs independent of changes in cyclic AMP levels // Can J Physiol Pharmacol. Л 988; V. 66. P. 1092-1095.

217. Tohse N., Sperelakis N. cGMP inhibits the activity of single calcium channels inembryonic chick heart cells//Girc Res. 1991. V. 69. P. 325-331.

218. Tsuchida K., Watajima H. Cyclic. AMP-mediated increase in L-type- calciumcurrent (ICa,L) by nitroglycerin in guinea-pig ventricular myocytes // Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2002. V. 48. N. 2. P. 179-185.

219. Vaandrager А. В., Hogema B. Ml, Edixhoven Mi, van den Burg С. M., Bot A. • G., Klatt P., Ruth, P., Hofmann F., Van Damme J., Vandekerckhove, J., de

220. Jonge H. R. Autophosphorylation of cGMP-dependent protein kinase type, II // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 28651-28658.

221. Vandecasteele G., Verde L, Rucker-Martin C., Donzeau-Gouge P., Fischmeister

222. R. Cyclic GMP regulation of the L-type Ca2+ channel current in human atrial myocytes // Journal of Physiology. 2001. V. 533; N. 2. Pi 329-340.

223. Ve'kony N., Wolf S.,. Boissel J. P., Gnauert K., Closs E. I. Human cationicamino acid transporter hCAT-3 is preferentially expressed in peripheral' tissues //Biochemistry. 2001. V. 40. P. 12387-12394.

224. Wahler G.M., Dollinger S.J. Nitric oxide donor SIN-1 inhibits mammalian cardiac calcium current through cGMP-dependent protein kinase // Am J Physiol. 1995. V. 268. P. C45-54. i

225. Waldman S.A., Murad F. Cyclic GMP synthesis and function // Pharmacol Rev.1987. V. 39. N. 3. P. 163-196.

226. Wall M.E., Francis S.H., Corbin J.D:, Grimes K., Richie-Jannetta R., Kotera J.,

227. Macdonald B.A., Gibson R.R., Trewhella J. Mechanisms associated with cGMP . binding and activation of cGMP-dependent protein kinase // PNAS. 2003. V. 100. N. 5. P. 2380-2385.

228. Wang Y., Goligorsky M.S., Lin M: A novel, testis-specific mRNA transcriptencoding an NH2-terminal truncated nitric-oxide synthase // J Biol Chem. 1997. V. 272. N. 17. P. 11392-113401.

229. Wang H.G., Pathan N., Ethell I.M., Krajewski S., Yamaguchi Y., Shibasaki F.,

230. McKeon F., Bobo Т., Franke T.F., Reed, J.C. Ca2+-induced apoptosi's through calcineurin dephosphorylation of BAD // Science. 1999. V. 284. Pi 339-343 .

231. Wang S.Q., Lakatta E.G., Cheng H., Zhou Z.Q. Adaptive mechanisms of intracellular calcium homeostasis in mammalian hibernators // The Journal: of Experimental Biology. 2002. V.205. P. 2957-2962.

232. Wechsler J., Choi Y.H., Krall J., Ahmad F., Manganiello V.C., Movsesian M.A.1.oforms of cyclic nucleotide phosphodiesterases PDE3A in cardiac myocytes // J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 38072-38078.

233. Wedel B, Humbert P, Harteneck C, Foerster J, Malkewitz J, Bohme E, Schultz

234. G, Koesling D. Mutation of His-105 of the 1 subunit yields a nitric oxide-insensitive form of soluble guanylyl cyclase // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91. P. 2592-2596.

235. Wedel B.J., Garbers D.L. New insights on the functions of the guanylyl cyclasereceptors //FEBS Lett. 1997. V. 410. P. 29-33.

236. Wedel В., Garbers D. The guanylyl cyclase family at y2k // Annu Rev Physiol.2001. V. 63. P. 215-233.

237. Weller R., Pattullo S., Smith L., Golden M., Ormerod A., Bendjamin N. Nitricoxide is generated on the skin surface by reduction of sweat nitrate // J Invest Dermatol. 1996. V. 107. P. 327-331.

238. Wendt D.J., Starmer C.F., Grant A.O. Na channel kinetics remain stable duringperforated-patch recordings // Am J Physiol. 1992. V. 263. N. 6. P. С1234-C1240.

239. Woodard-M. H., Dunn W. A., Laine R. O., Malandro M., McMahon R., Simell

240. O., Block E. R., Kilberg M. S., Plasma membrane clustering of system y+ (CAT-1) amino acid transporter as detected by immunohistochemistry // Am. J. Physiol. 1994. V. 266. P. E817-E824.

241. Wu G., Morris S.M. Arginine metabolism: nitric oxide and beyond // Biochem.1. J. 1998. V. 336. P. 1-17.

242. Xu K.Y., Huso D.L., Dawson T.M., Bredt D.S., Becker L.C. Nitric oxide synthase in cardiac sarcoplasmic reticulum // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96. P. 657- 662.

243. Yang Q., Paskind M., Bolger G., Thompson W.J., Repaske D.R., Cutler L.S.,

244. Epstein P.M. A novel cyclic GMP stimulated phosphodiesterase from rat brain //Biochem Biophys Res Commun. 1994. V. 205. P. 1850-1858.

245. Yang L., Liu G., Zakharov S.I., Bellinger A.M., Mongillo M., Marx S.O.- Protein

246. Kinase G Phosphorylates Cav 1.2 ale and (32 Subunits // Circ Res. 2007. V. 101. P. 465-474.

247. Yatani A., Kim S.-J., Kudej R.K., Wang Q., Depre C., Irie K., Kranias E.G.,

248. Vatner S.F., Vatner D.E. Insights into cardioprotection obtained from study of cellular Ca2+ handling in myocardium of true hibernating mammals // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004. V. 286. P. H2219-H2228.

249. Zahradnilcova A., Minarovic I., Venema R.C., Meszaros L.G. Inactivatiomof thecardiac ryanodine receptor calcium release channel by nitric oxide // Cell Calcium. 1997. V. 22. P. 447-454.

250. Zhao A.Z., Yan С., Sonnenburg W.K., Beavo J.A. Recent advances in the studyof Ca /CaM-activated phosphodiesterases: expression and physiological functions // Signal Transduct Health Dis. 1997. V. 31. P. 237-251.

251. Zhou Z.Q., Liu В., Dryden W.F., Wang L.C.H. Cardiac mechanical restitution inactive and hibernating Richardson's ground squirrel // Am J Physiol. 1991. V. 260. P. R353-R358.

252. Ziolo M.T., Katoh H., Bers D.M. Positive and negative effects of nitric oxide on

253. Ca+2+ sparks: influence of b-adrenergic stimulation // Am J Physiol. 2001. V. 281. P. H2295-2303.

254. Zweier J.L., Wang P., Samouilov A., Kuppusamy P. Enzyme-independent formation of nitric oxide in biological tissues // Nature Medicine. 1995. V. l.P. 804-809.

Информация о работе

Грушин, Кирилл Сергеевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Роль NO в регуляции Ca2+ токов L-типа циклическими нуклеотидами в кардиомиоцитах нормотермных и гибернирующих животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы