Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности функционирования и регуляция эндогенными пептидами потенциал-зависимых Са2+ каналов кардиоцитов зимоспящих животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности функционирования и регуляция эндогенными пептидами потенциал-зависимых Са2+ каналов кардиоцитов зимоспящих животных"

ргь

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Алексеев Алексей Евгеньевич

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭНДОГЕННЫМИ ПЕПТИДАМИ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ Са2+ КАНАЛОВ КАРДИОЦИТОВ ЗИМОСПЯЩИХ ЖИВОТНЫХ

03.00.02 Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пущино, 1994г.

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии наук.

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук

Кокоз Ю.М.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Смо.гяниаов В. В.

доктор биологических наук Зинченко В.П,

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится " /5~~ "1994 года в. //

7—ОР

часов на

заседании Специализированного Совета Д 200.22.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142292 г.Пуши-но Московской области, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан " /У " А^иЛ-^^у' 1994 года.

\нтуплмюст1. проблемы- Зимняя спячка является уникальным способом хдаптацин организма теплокровных к экстремальным условиям. Феномен шмней спячки млекопитающих интересен с точки зрении способности ги-зернэторов сохранять интегративность физиологических функций о пере-иодный период спячка-бодрствование, т.к. вход в состояние гибернацин к выход из него согласованны на всех уровнях (субклеточном, клеточном, гкзневом, органном). Согласованно с состоянием зимоспяшмх должен изменяться и ионный транспорт. Нестандартная регуляция ионного транспорта у зимоспящих проявляется прежде всего в способности сохранять ионные градиенты в клетках в течении многих суток даже при температурах гела, близких к 0°С. Особенно ярко это проявляется в регуляции сердечной активности этих животных. Сердце гибернаторов сохраняет электрические Н механические свойства даже при температуре около 0°С, в 7 время как у негибернаторов при прохождении температурного порога 15 - 20°С возникает летальная аритмия, вентрикулярная фибрилляция и как следствие -остановка сердца. Имеющиеся литературные данные дают основания полагать, что в основе способности сердец гибернаторов нормально функционировать даже при низких температурах лежит модификация Са2+ транспорта.

Несмотря на огромный интерес к феномену спячки и определенные успехи в изучении механизмов гибернацин на различных уровнях исследований, вопрос о электрофизиологических характеристиках Са2+ токов гибернаторов по-прежнему остается открытым. Если предположение о подавлении потенциал-зависимого Са2+ тока во Бремя зимней спячки верно, неясно, чем вызвано это уменьшение: конформацнонными перестройками самих каналов или модификацией систем регуляции их проводимости либо действием эндогенных "факторов спячки", приводящих к падению тока в каждой отдельной клетке. Для ответа на этот вопрос необходимы сравнительное данные о величине и регуляции Са2+ токов у зимоспящих животных, полученные на изолированных кардиоцнтах.

Цель работы; проведение сравнительного анализа Са2+ токов в изолированных кардиоцитах тбернмруюших и спонтанно пробужденных сусликов с целью проверки факта модификации потеициало-завнсимого Са2+ транспорта гибернаторов, а также поиск причин, лежащих в основе этих модификаций. Достижение цели связывалось с решением следующих задач:

1. Разработка унифицированного метода получения Са2+ толерантных кардиоцитов как из сердец гибернпрующих, так и незимоспящих животных.

2. Общая характеристика Са2+ тока гибернпрующих сусликов (тип Са2+ проводимости и адекватность ее регуляции, сравнительный анализ амплитудных характеристик токов гибернпрующих и спонтанно пробужденных сусликов).

3. На основе математической модели Са2+ токов зимоспяших сравнить кинетические параметры исследуемой проводимости гибернирующих н спонтанно пробужденных животных.

4. Совместно с сотрудниками лаборатории химии пептидов И БХ РАН идентифицировать активные пептиды из фракций мозга эимоспящих сусликов и хладоадаптированной якутской лошади, регулирующие транспорт ионов Са2+ и исследовать действие синтетических аналогов этих пептидов на потенциал-зависимый Са2+ ток в кардноцитах суслика и крысы. Науччлп нопипип работы; с использованием метода перфорированного пэт-ча впервые проведены сравнительная оценка Са2+ токов гибернирующих п спонтанно пробужденных сусликов на уровне изолированных кардиоцитов. На основе анализа токовых кривых построена математическая модель Са2+ каналов кардиоцитов гибернаторов. Исследовано действие на потенциал-за-внснмый Са2+ ток ряда новых эндогенных пептидов, выделенных из мозга гибернирующих сусликов и хладоадаптированной якутской лошади. Теоретическая и практическая ценность работы: полученные данные о величине и регуляции Са2+ тока зимоспяших в различных физиологических состояниях, а также модельный анализ этих данных позволяют заключить, что ни температурная адаптация, ни ферментативная обработка клеток не устраняет различия о амплитудных п кинетических параметрах токов активных и гибернирующих сусликов. Установлено, что кинетические изменения Са2+ токов при гнбернпции нельзя объяснить только изменениями, вызванными в системе цАМФ-зависимон регуляции этих каналов. Это позволяет заключить, что существуют эндогенные факторы, которые вносят свои вклад в изменение кинетических параметров Са24" каналов. Предлагаема» модель может служить основой выработки теста для поиска эндогенных пептидов - регуляторов Са2+ токов, которые могли бы участвовать в регуляции переходных физиологических процессов гибернаторов. С этой точки зрения было изучено влияние ма Са2+" ток пептидов, выделенных из мозга гпбернирующего суслика н мозга хладоадаптированной якутской лошади. Дпробаиип работы и публикации. Основные результаты работы были доложены на ежегодной научной конференции Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущнно, 1994), на 21-ом Европейском пептидном симпозиуме (Barcelona, 1990), на 8-ом Советско-Германском симпозиуме по химии пептидов п белков (Aahen, 1991), на Советско-Испанском симпозиуме по физико-химической биологии (Киев, 1990), на Всесоюзном пептидном симпозиуме (Рига, 1990). По материалам диссертации опубликовано 1] работ.

ООтЛ'м 11 структура дисстацни. Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц и 37 рисунков. Список литературы содержит 208 наименований. Работа состоит из введения,

эбзора литературы, описания материалов и методов исследовании, резуль-гатов н их обсуждения, выводов, двух приложений и списка цитируемой литературы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Первый раздел обзора посвящен общей стратегии адаптации организма к экстремальным условиям а также имеющимся взглядам на механизмы адаптации ионного транспорта. Обсуждается существование н природа "триггеров" гибернации. Последующие разделы посвящены классификации и характеристикам Са2+ токов, структуре дигндропиридин-чувствнтепьного Са2+ канала и его цАМФ-зависпмой регуляции. Заключительные разделы посвящены методам исследований - достоинствам и недостаткам метода перфорированного пэтча и методам получения изолированных кардиоци-гов, устойчивых к Са2+ парадоксу. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Метод выделения кардиоцитоа. Изолированные кардиоцнты были получены из сердец якутских сусликов (О///и ип(1и1а)ш) и крыс \Vistar. Суслики Зылн отловлены в конце лета 1992 г. в Якутии и помещены в условия, Злизкие к естественным. Эксперименты проводились с декабря по март ме-:яц. Температура тела спящих животных составляла 6 7.5°С, спонтанно пробужденных: 37°С. Для получения клеток был модифицирован метод ВелсЗиШге г., ЬепЬе^ О., Юоскпег I/. (1985), основанный на использовании проназы в качестве основного протеолитнческого фермента. Внесенные а эту методику изменен..я позволили в значительной степени унифицировать выделение изолированных кардиомиоцитов из животных разного айда.

Для контроля качества кардиомиоцитов были привлечены методы электронной и световой микроскопии, регистрации внутриклеточной концентрации ионов Са2+ с использованием флюоресцентного зонда <ЗШЫ 2-\М, а также измерения потенциалов покоя и потенциалов действия полуденных клеток. Все упомянутые методы контроля выявили хорошее качест-зо полученных при помощи модифицированного метода клеток. Метод перфорированного пэтча.

Раствор 1 (камерпьп'П: НаС1-80мМ, ТЭА-С1-20мМ, СбСМОмМ, КН2Р04 -1.2мМ, М&С12-5мМ, СаС12-2 мМ, глюкоза-20мМ, ХЕПЕС-ЮмМ, эН-7.3. Раствор ? СбС1 -130мМ, Г^С12 -5мМ, ХЕПЕС-ЮмМ, рН-7.3. зН доводился ^аОН-0.5№

Раствор для заполнена пипеток приготовлялся на основе раствора 2 [замена ионов К+ на использовалась для блокирования К+ токов). Концентрация амфотерицина в пипеточном растворе составляла в среднем 160-170 мкг/мл для мембран кардиомиоцитов крысы и 200-250мкг/мл дл)1 слеток суслика.

Все эксперименты проводили при комнатной температуре 20-22°С, Измеряемые токи регистрировали при помощи усилителя СКБ "Биоприбор". Дли проведения экспериментов использовался пакет программ "Шо-ОиехГ, разработанный Алексеевым А.Е. и Кокозом Ю.М., обеспечивающий сбор данных в режиме управляемого эксперимента и последующий их анализ.

Математические методы. Дли определения параметров модели Са2+ канала использовался метод наименьших квадратов. Для аппроксимации экспериментальных токовых кривых целевыми функциями применялся метод Хелдера-Мида (метод деформированного многогранника) по минимизации X2. Программная реализация, модифицированного метода Хелдера-Мида, приведена о Приложении А.

Все средние величины представлены как среднее±атндортная ошибка среднего (СО). На всех рисунках вертикальные бары соответствуют СО.

В качестве вспомогательных в работе были использованы метод регистрации токов от ооцитов, инъецированных поли(А)+РНК из мозга крысы и регистрации токов через одиночный АТФ-чувствитсльный К+ канал. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Общие характеристики Ся2+тока кардкоцитов суслика.

Разделение компонент входящего тока в изолированных кардиоцитах гибернатороо. На рис.1 представлена трехмерная реконструкция суммарного входящего тока на изолированных кардиоцитах крысы н активного суслика. Выходящая компонента тока заблокирована ионами С$+ н ТЭА. Величина вхопнщего тока (ось Z) отложена как функция мембранного потенциала (ось X) и поддерживаемого потенциала (ось У). Вольт-амперные зависимости получены при фиксации на мембране клетки потенциала пилообразной формы со скоростью нарастания 1 В/с. Основной пик (цифра I на правом рисунке) определяется током. Он чувствителен к тетродо-токсину и достигает максимума при поддерживаемых потенциалах меньших -ЮОмВ. Второй пик (цифра 2 на рисунке) связан с входом ноной Ся2+ п клетку. Следует отметить, что подобное разделение токов было зарегистрировано п на клетках крысы. Однако у крыс оно наблюдалось примерно в 40% случаев, когда как у сусликов смешение компонент не наблюдалось ни разу. Реконструкция токов у зтюешшш выявляет их важную особенность-разделение Ка+ и Са2+ компонент входящего тока при поддерживаемых потенциалах положитсльнее -60шУ. Такая особенность ионных токов в кардиоцитах гибернаторов (как спящих, так и активных) позволяет вести регистрацию Са2+ тока, не используя блокатор Ыа+ каналов - тетродоток-син. В случае регистрации токов на кардиоцитах крыс тетродотоксин использовался о концентрации 15-20 мкМ.

во Ем,и В

ЕимВ

го

ЕМ.МВ

РнсД Трехмерная реконструкция ионных токов в кардиоцитах крысы (слева) и суслика (справа), |цх- входящий ток; Ем - мембранный потенциал; - поддерживаемый потенциал. Объяснение в тексте.

Сравнительный анализ потенциал-зависимого Саг+ тока в изолированных кардиоцитах активного и гибернирующего суслика. На рис. 2 (А. и Б) приведены потенциал-зависимые Са2+ токи, полученные на изолированных кардиоцитах спящих и активных сусликов, соответственно.

А 5

-20м В

-А-

ЮОмс

0.2иЛ

-ЮмВ

ОмВ

+ 10мВ

+30мВ

Рис. 2. Токи, характерные дм гибернирующих (А) и активных (Б) сусликов. Токи зарегистрированы п ндентнчных условиях в ответ па деполяризующий импульс. Поддерживаемый потенциал -бОмВ. Справа указаны мембранные потенциалы для каждой пары трасс. Пунктирные линин соответствуют нулевому току.

Величины входящего Са2+ тока отражают характерную разницу между токами гнбернирующи.. и активных животных.

На рис. ЗА показаны усредненные вольт-амперные характеристики этих типов клеток. Вольт-амперные кривые строились по ликовым значениям Са2+ тока. Из приведенных результатов следует, что Са2+ ток в клетках спящих животных блокируется не полностью, как предполагалось ранее, хотя он и меньше, чем в клетках, полученных от активных сусликов: усредненные значения максимальной величины токов -0.133±0.02нА (п=26) и -0.335±0.04нА (п=16). Для оценки различия вольт-амперных характеристик кардпоцитов спящих и активных сусликов каждая из 26 и 16 юльт-ам-перных кривых приближалась с использованием метода наименьших к вод-. ратов 4-х параметрической теоретической кривой:

/=:al^E-aJ).[l■^cXp^(aJ'-£)/<гt}I^, (I) где / - ток, £ - потенциал мембраны, п/ - проводимость, определенная по наклону правой ветви вольт-амперной кривой, - кажующийся реверсивный потенциал для ионов Са2+, а] - потенциал лолумаксимальной активации, гг./ - параметр наклона активационной ветви вольт-амперной кривой. Затем результаты аппроксимации доя каждого параметра усреднялись (Таблица 1) и использовались для построения непрерывных кривых (рис.

ЗА) по соотношению (I). 1, иА

I, мА

-40 -20 0 20 40 -30 ~ЖО-Ю О Ю 20 30 40

Мембранный потеициол, мВ Мембранный потенциал, мП

Рис.З, А - усредненные вольт-амперные характеристики Са2* тока в кардиоцитах спя-щих(нсзапо.тснныс крулски) и спонтанно пробудившихся сусликов, построенные по данным 2$ и 16 экспериментам соответственно; Б - действие июпротеренала (окрашенные прямоугольники) на Са** ток в кардиоцшах спящих животных (п=6, незаполненные кружки - контроль).

Таблица 1.

Параметры функции (1) Спонтанно пробужденные суслики Гибериирующне суслики Дсйстаие изопротсрсноля на токи гнбериирующих сусликов

й/(нС) 4.6 ± 0.6 2.4 ± 0.3 7.5 ± 2.7

л^(мВ) 97.8 ± 4.8 96.8 ± 10.2 84.4 ± 10.0

л?(мВ) 6.5 ± 2.6 2.3 ± 3.0 2.0 ± 3.2

лЛмВ) 7.0 ±0.7 7.7 ±0.3 7.4 ±0.5

Из таблицы следует, что Са2+ токи в кардиоцитах спящих и активных сусликов достоверно (р<0.05 по »-критерию) отличаются лишь проводимостью (параметр я;). Из равенства параметров а^ следует, что в условиях наших экспериментов при одинаковой внешней температуре внутриклеточная концентрация несвязанных ионов Са2+ в кардиоцитах гибернирующих и спонтанно пробудившихся животных одинакова. Недостоверность различия вольт-амперных кривых по параметрам аз и 04 позволяет заключить, что потенциал достижения максимума токов в клетках спящих и активных животных не отличается и составляет «ЮмВ.

Влияние изопротерепола, форсколина, и пифедипииа, на потенциал-зависимый Са2* ток у зилюспящих. Поскольку Са2+ ток у животных в состоянии гибернации подавлен не полностью, возник вопрос, а не является ли оставшаяся компонента тока - током через Са2+ каналы другого типа, например через Т- или И- каналы? Хотя известно, что каналы N типа почти не встречаются в мышечных клетках, а Т-каналы активируются при более отрицательных потенциалах все же мы сочли необходимым проверить это предположение прямыми экспериментами, поскольку имеющиеся литературные данные не относятся к зимоспяшим.'Установлено, что нифеднпин (5мкМ) полностью блокировал Са2+ ток в кардиоцитах как активных, так н гибернирующих сусликов, что свидетельствует о том, что потенцнал-зави-снмый входящий ток в обоих типах клеток является только Са2+ током 1--тнпа и, следовательно, при межсезонных переходах в состоянии этих животных претерпевает модификацию именно этот тип Са2+ проводимости.

Данные по усредненным вольт-амперным кривым, полученным на изолированных кардиоцитах спящего суслика под действием нзопротерено-ла (п=6), представлены на рис.ЗБ, Из них следует, что клетки спящего животного сохраняют чувствительность к изопротеренолу. Мы не обнаружили статистически достоверной разницы между параметрами Л/, 02, а у и . (1) для кардиоцитов спящих животных после добавления 2мкМ изопротерепола н пробудившихся без изопротеренола (Таблица 1). Аналогично действует на Са2+ ток гибернирующих сусликов и форсколин - непосредственный активатор аденилатцнклазы. Отсюда можно полагать, что в клетках гнбернаторов во время спячки сохраняется система цАМФ-зависимой регуляции Са2+ тока. В наших экспериментах Са2+ токи кардиоцитов спящих животных под действием насыщающей концентрации нзопротере-иолз (2мкМ) были более, чем вдвое меньше токов, полученных при аналогичном воздействии на кардиоциты активных животных. Возможным объяснением этого могло бы быть уменьшение активности аденилатцнклазы и протеинкиназ в состоянии спячки. Однако это предположение противоречит недавно опубликованным данным (Моте Б.А. е( а1., 1993), где показано, что активность аденилатцнклазы у животных в состоянии гиберна-

цнм значительно выше, чем у активных животных. Таким образом, напрашивается вывод о том, что фосфорилирование-дефосфорилирование каналов, вероятно, не единственный фактор, регулирующий Са2+ ток у зимо-спящих, По-видимому, наряду с цАМФ-зависимой регуляцией определенную роль в подавлении Са2+ тока во время спячки должны играть и некие иные регуляторы, например пептидной природы.

Действие Д600 па Со2* ток кардиоцитов сусликов. Д600 - блокатор Са2+ каналов, действие которого связывают с механизмом частотно-зависимого блокирования. Никаких отличий в реализации механизма частотно-зависимого блокирования Д600 на кардиоцитах сусликов обнаружено не было. Однако, неожиданностью был тот факт, что добавление 2 мкМ изопроте-ренола в раствор с 2мкМ Д600, инициировало падение Са2+ тока до нуля даже при низкой частоте стимуляции (0.025 Гц, п=4). Этот результат позволяет предположить, что фосфорилирование Са2+ каналов влияет не только на вероятность их перехода б открытое состояние, но и на их сродство к блокаторам, по крайней мере к Д600.

Кинетические параметры Са1+ тока зимоспящнх. Выбор модели и способ определения параметров. Помимо общей сравнительной характеристики Са2+ токов гибернаторов важно определить, существует ли разница в кинетических параметрах Са2+ тока у животных в различных физиологических состояниях. В основу выбранной модели Са2+ канала был положен формализм Ходжкнна-Хакслн:

Вместо дифференциальных уравнений системы (2) в качестве целевой функции для вычисления использовалось ее решение:

{/--{Го-^е4'1'}", (3)

где ¡¡о и /<? стационарные значение активационнои и ннактивационнои токовых компонент при поддерживаемом потенциале соответственно. Поскольку порог активации Са2+ каналов находится при более положительных, чем поддерживаемый, потенциалах, значения этих параметров выбирались предельными (г/<7=0, /о=1). <.(£),/.(£) - стационарные нормализованные проводимости соответственно активации и инактивации, а тД£) - характерные времена этих компонент проводимости. При использовании метода Хелдера-Мида дли минимизации х* эти параметры под-

бирались таким образом, чтобы решение системы (2) наилучшим образом описывало экспериментальные кривые развития Са2+ тока во времени.

Параметр gCa определялся для каждого эксперимента наилучшим приближением методом наименьших квадратов соответствующей вольт-амперной кривой соотношением (1). При подгонке токов уравнением (3) использовался теоретический Eq, (по различным источникам он находится в пределах от 140мВ до 200мВ). Нами, в большинстве случаев, использовался Ео,я +175мВ.

В результаты вычислений </_(£) и /.(Е) оказалось, что при используемой аппроксимации кривые d_(E) и /_(£) немонотонны. Варьирование значениями показателей степени m и п (1,2), (1,4), (2,2) не приводит к желаемому результату, Если при т**2 и удавалось достичь монотонности /»(£). то немонотонная зависимость d_(E) наблюдалась при обработке каждого из анализируемых экспериментов для указанных значений показателей m и л. Таким образом в рамках модели, описанной системой (2), представить кинетику активации и инактивации Са2+ тока в кардиоцитах зимоспяишх животных как одноэкспоненциальный процесс не удалось. Поэтому была рассмотрена другая модель Са2+ канала, которая включает не один, а два независимых ннактивационных процесса:

где /¡н/г- переменные первой и второй инактивации, т/у и ту? - их постоянные времени, я; и - показатели степени. Как и п случае использования системы (1), в качестве целевой функции приближения использовалось решение системы (4):

Применяя процедуру подгонки уравнения (5) к экспериментальным записям Са2+ токов, были вычислены параметры г/.(Я), /,.(£), Д_(Я), т<), То и тя как для клеток спящих, так и активных животных. Наилучшее совпадение модели с экспериментом было получено при м=>2, «/=2, п/= 1.

На рис.4 представлен пример результатов такой подгонки. Из рис.4Б видно, что все кривые, характеризующие стационарные значения активации и обоих инактнваций, приняли ожидаемый монотонный вид во всем диапазоне потенциалов. Они хорошо описывались уравнением Больцмана:

, (4)

(6)

где потенциал, при котором стационарное значение активации достигает своего половинного значения, к4 - параметр, характеризующий крутизну кривой. Соответственно, для инактиваций параметры Е", Е", к„ и кп имеют аналогичный смысл.

В

-30 -20 -10 О 10 20 да 40 50 Мембранный потенциал, нВ

Б '-о 1 1 1 I I

ол

0.» х

ол /V

о.г

0.0 . . ^У* 1 1 . .

-«о -го о го <о МсибршныЯ попиши, мВ

•20*В

- -10мВ

ОмВ

' +10мВ

+30мВ

ЮОмс

РнС.4. Промер подгонки Са** токов в кардиомиаците активного суслика уравнением (5). А-вольт-аыперная характеристика, построенная по пнкоюым значениям исследуемых токов. Б - значения нормализованных лроводнмостен: незакрашенные кружки - актиюшт, закрашенные кружки - медленна)! инактивации или инактивации 1 рода, треугольники -быстра»! инактивация или инакгмшиш 2 рода, пол ученные в результате подгонкн то-кзсых трасс уравнением (5) н аплроксимирооаиных уравнением Больцмина (б) - непрерывные кривые. В - реконструкция Са2+ то ко о по результатам подгонкн. Пунктирные кривые • экспериментальные токи, непрерывные кривые • теоретические. Вдоль линии нулевого тока отложена погрешность приближения, как результат вычитания теоретических крниых из экспериментальных.

Кинетическая схема Са2+ канала зимосиящих. Для построения кинетической схемы функционирования Са2+ капала у зимоспящих дифференциальные уравнения системы (4) удобнее переписать в другой стандартной форме:

¿ = а„и-</)-М • , ,

где связь констант а и [$ с известными параметрами определяется как:

он«

р,»-—-а,;

\ ¡4,2

В терминах открытия и закрытия активацнонных и инактивационных ворот параметры а4,ап,аГ1 и ,рГ1, р/г имеют смысл констант скоростей, соответственно, открытия и закрытия актпоацнониых, инактивационных /} - типа, инактивационных /г - типа ворот. Если учесть, что согласно определенным значениям показателей степени т, П] и "2, канал условно имеет 2 активациоииых, 2 инактивационных// - типа н 1 инактивпционные /2 - типа ворота, то схемы активации и инактивации можно представить следующим образом (для активации рпс.5):

где с!сс, с!с0, с!ос, с!00 - это состояния канала, в которых, соответственно, двое активациоииых ворот закрыты; одни порота открыты, другие -закрыты; двое ворот открыты. Или с учетом того; что состояния с!со и с1°° макроскопически неразличимы:

2а, а,

Рис. 5, Р'р7~* Р| < 2(3, >Р" (9)

где = с!«, О) = (а« + <1с0), о0 =

Аналогично (8) выглядит кинетическая схема для медленной инактивации (инактивации / г типа) с той лишь разницей, что состоянию с1сс, будет соответствовать состояние Г]сс, состояниям с!00 и с!с0 - состояния ¡"1°° и и состоянию с100 - состояние Г(°0. Вновь, п силу неразличимости состояний, {1е0 и кинетическая схема инактивации 1 рода преобразуется б вид:

>Р,с >Р0 (10)

л /I

где Р2 = Ас0, Р, = (П™ + Г,«), Р0 = Г1°°.

о

Для инактивациитипа: С| <■ > Оо , (11)

где и во - соответственно состояния с закрытыми и открытыми воротами /2 - типа.

На основе схем (9), (10), (11) можно построить общую кинетическую схему Са2+ канала, которую из-за ее малой наглядности, по-видимому следует опустить. Отметим лишь, что оиа включает 18 состояний (У=0,2; к-0,1), переходы между которыми, в силу независимости процессов активации и инактивации обоих типов, происходят с теми же константами скоростей, что и в схемах (9), (10), (11).

Для определения всех кинетических параметров, в рамках предложенной модели, описанной выше процедуре анализа были подвергнуты Са2+ токи полученные от пяти активных (спонтанно пробужденных) и пяти гибернирующих сусликов. Кроме того, чтобы выяснить роль цАМФ-зави-симого фосфорилирования в модификации Са2+ тока, были также обрабо-

таны токи спящих животных (п=4) под действием 1мкМ изопротеренола. Учитывая обилие параметров оценки кинетики Са2+ тока, приведем его сравнительный анализ отдельно по каждой компоненте. Кинетика активации.

Рис.б. Усредненные стационарные характеристики активации Са** тока. Обозначении: закрашенные кружки - нормализованная проводимость у животных в состоянии гнбсрнашш; незакрашенные кружки - у активных; треугольники - действие изопротеренола на Саг+ токи в кардноцнтов гиборнируюшнх животных. Непрерывные кривые построены по результатам подгонкн данных уравнением (6). Параметры, полученные в результате аппроксимации, приведены в таблице 2.

Из приведенных на рис.6 данных следует, что стационарные характеристики активации активных л спящих животных различаются незначительно. Отличие становится более заметным при потенциалах отрицательнее -ЮмВ.

Таблица 2.

-10 -49 -19 о Ж9 40

Мембранный иотсицнял, мО

Активные Гнбсрннрующие Гибернируюшис + изопротереиол

Е°/, мВ мВ -15.6414.72 17.93±1.50 -9.96±2.08 14.55±2.36 -19.28±2.97 16.35±1.34

Де Л стопе изопротеренола сдвигает кривую активации в сторону ги-перполярпзацпн приблизительно на ЮмВ. Это свидетельствует о влиянии процессов фосфорилирования на кинетику активации Са2+ тока и частично подтверждает гипотезу о недостаточном фосфорилировании каналов в кар-диоцитах спящих животных. Более убедительное различие было обнаружено между характерными временами активации у' животных в различных физиологических состояниях (рис.7).

" 1 1 1 ' ' ' 1 Рис.7 .Усредненные характерные вре-

мена активации Са** тока. Обозначения тс же, что и на рис.б.

Различие между этими параметрами много заметнее, чем различие в нормализованной проводимости. Характерные времена активации активных и спящих сусликов достоверно отличаются на всем диапазоне исследуемых потенциалов. Как и на рис.б, изопротереиол сдвигает характерные времена к значениям, близким к временам у активных животных. Зависимости от мемб-

-зо -го -ю о ю и ло Мембрышый потенциал, мВ

ранного потенциала констант скоростей для кинетической схемы (9) приведены на рис.3. Согласно этим результатам, можно сделать заключение, что процесс открывании/закрывания активационных ворот может быть представлен в виде одностадийного конформационного перехода для Са2+ каналов кардиоцитов животных как в состоянии гибернацин, ток и активном состоянии. Кривые зависимостей от потенциала а,/ и р„> имеют наклоны разного знака. Переменная активации при этом аппроксимируется функцией:

т-1

в/ ( ге')

(12)

из которой нетрудно вычислить валентность активационного воротного заряда га (о! н - константы при £~0мВ (см. рис.8): Результаты вычислений при помощи подгонки усредненных данных на рис.б уравнением (12) приведены в таблице 3. С учетом кинетической схемы (9), в которой предполагается наличие двух активационных ворот, суммарный эффективный заряд, переносимый воротными субъединицами при активации Са2+ капала сусликов, находящихся в активном состоянии составляет величину «3, что хорошо согласуется с данными в отношении воротных зарядов Са2+ каналов других объектов.

0.09

• III

-м-яо-го-ю о ю ¡о зо л> ¡о -м-зо-г -ю о ю го зо 40 ю Мембранный ютсишми, мВ Мембранный потенциал, мВ

Рнс.8. Константы скоростей длп кинетической сеемы (9), рассчитанные из соотношений (7). Обозначении те же, что и на рис.б.

Таблица 3.

а", мс' (5°, мс'1 I

Активные животные Гнбериирующне Гибсрннрующис+птопротсренол 0.195±0.0182 0.110±0.014б 0.204±0.0480 0.0879±0.013б 1 1.515±0.15 0.0490±0.0073 1 1.905±0.22 0.0603±0.0144 1 1.591 ±0.(3

Любопытно, что эффективная валентность воротного заряда гибернн-рующих сусликов несколько выше и приближается к 4. Под действием изо-протеренола на Са2+ каналы кардиоцитов гиберннрующих сусликов эффективная валентность, как видно из таблицы, возвращается к значениям близким к 3.

Нпакпшеацшг 2-го рода или быстрая инактивщм, Более значительная разница в кинетических параметрах Са2+ токов активных и гнбериирующих

сусликов была обнаружена в нормализованной проводимости быстрой инактивации (или инактивации 2-го рода). На рисунке 9 и в таблице 4 (результаты аппроксимации данных уравнением 6) представлены данные по этому параметру.

Таблица 4.

Активные Гибсрнирующне Гибернируюшнс + изопротеренол

Е}\, мВ кгг, мВ 23.14±1.63 -24.59±2.04 29.14±2.93 -15.66±1.32 1б.36±4.98 -22.5210.77

150 -1-г-,-1-1-1-г

-вО -46 -20 О 20 40 во -30 -20 -10 0 10 20 Л 0 40 £0

Мембранный ютсицмм, «В Мембраниий потенциал, иВ

Рис.9. Усредненные стационарные характеристики быстрой инактивации Са2* тока о кар-диоцитах сусликов. А - нормалиэовпшшя проводимость. Б - характерные времена. Обозначения тс же, "по и на рис.б.

По данным рнсунко и таблицы видно, что заметно различается крутизна кривых инактивации активных л спящих животных. При потенциалах отрицательнее Оч-ЮмВ вклад данной компоненты в общую Са2+ проводимость клеток спящих сусликов очень не значителен, в то время как в клетках активных животных она проявляется практически вблизи порога активации каналов. Как и в случае кинетики активации, действие нзопро-теренола на Са2+ токи кардиоцитов гибернирующих сусликов сдвигает нормализованную проводимость инактивации в сторону гнперполяризации' к величинам близким активным животным. Установлено, что зависимости от потенциала параметров о.р и р/2 кинетической схемы (II), имеют одинаковый наклон. При деполяризации мембраны происходит не только сдвиг равновесия в сторону инактивации каналов, но и к едновременному увеличению скорости прямой и обратной стадий быстрой инактивации /¿.(Е). Косвенно это указывает на то, что процесс инактивации может включать дополнительные быстрые потенциал-зависимые стадии. Так, аномальное увеличение скорости выхода из быстрой инактивации при деполяризации, т. е. увеличение ар(Е), означает, что для быстрой инактивации более справедлива не схема (11), а следующая схема:

о,«-

■ю.

где О ) - также состояние с закрытыми инактивационными воротами, но не способное переходить в состояние во- Тогда при условии, что к1 и к^ много больше а/2 и Руг, т.е. между состояниями 0'| и 01 справедливо равновесное соотношение С^к/О^кг, уравнение для быстрой инактивации системы (4) Модифицируется в следующее уравнение:

Отсюда понятно, что если отношение к ¡/к 2 круто падает при деполяризации мембраны, то эффективная константа выхода из инактивации +к]/к2) может увеличиваться.

Результаты представляемой работы позволяют выдвинуть еще одну гипотезу о механизме инактивации Са2+ каналов. Она базируется на анализе действия нифедипи-на на Са2+ ток кордиоцитов сусликов (рис. 10). Влияние этого селективного блокатора Са2+ каналов Ь-типа сказывается только на кинетике активации и медленной инактивации (верхняя и средняя панели), оставляя без изменений быструю инактивацию (нижняя панель). Нечувствительно к нифедипину и характерное время быстрой ~ео инактивации Таким образом, принимая во внимание действие нзопротеренола на эту инактивацию, а также аномальную зависимость от потенциала а/2 и Ру?, с определенным основанием можно считать, что кинетика быстрой инактивации, в основном, определяется цАМФ зависимым фос-форилированием.. Эти данные ставят под сомнение реализацию в данном случае механизма ток-зависимой инактивации (Са2+

подгонкой Са** токов

кардиоцита зависимое блокирование Са^ тока), по-

суаика под действием нифедипина, скольку Са2+ Проводимость 0 данном ЭКС-

Неокошенные кружки - контроль, пернменте, определенная по наклону пра-

окрашенние - 5мкМ нифедипина. ^ ^ „ольт_амперной кр1ШоП пр)| п0.

мощи уравнения (1), в контроле составляла 2.87нС и под действием нифедипина 0.99нС. Так же, примерно в три раза, отличаются и пиковые значе-

-40 -го о го 40 в» Мембранный потенциал, мВ

Рис, 10. Стационарные нормализованные проводимости рассчитанные

пни тока, а значит и пропорционально уменьшилось количество вошедшего через каналы Са1+. Однако стационарная нормализованная проводимость быстрой инактивации не претерпевает при этом каких-либо изменений. Инактивация 1-го рода или медленная инактивация.

Таблица 5.

Активные Гибернирующие Гибернирующие + нзопротеренол

E}U мВ kft, мВ -26.26±3.88 -24.01 ±2.58 -13.61±4.86 -14.67il.15 -39.6б±3.87 -24.19±2.13

-40 -го с го 40 ео ~4о -го о го 40

Мембранный поте кия ад, иВ Мембранный потенциал, мВ

РИС.11. Усредненные стационарные характеристики медленной инактивации Са3* тока в кардиацитах сусликов. А - нормализованная проводимость. Б - характерные времена. Обозначения те же, что и на рис.б.

В отличие от быстрой инактивации, инактивация 1-го рода определяет Са2+ токи на поздних стадиях его развития и характеризуется как более замедленными характерными временами, так и низкими скоростями переходов ау/ и Ру7 для кинетической схемы 10 (рис.11,12).

Как видно из рис.1), параметры инактивации 1-го рода Са2+ токов кардиоцитов активных животных, подобно двум предыдущим составляющим проводимости, сдвинуты относительно параметров гибернирующих сусликов в сторону гиперполяризации. Аналогичный сдвиг, но на большую величину, возникает при действии изопротсренола на Са2+ каналы и кар-диоцитах спящих животных.

Характер зависимости су; и от мембранного потенциала d зависимости от состояния животных, в отличие от инактш цин 2-го рода, претерпевает некоторые изменения. Для Са2+ токов активных животных и гибернирующих + цзопротеренол оба параметра уменьшаются при росте мембранного потенциала (т.е. имеет одинаковый наклон). И напротив, параметры с// и р/7 инактивации Са2+ тока кардиоцитов сусликов, находящихся в состоянии гибернации, имели противоположный наклон. Однако, характер зависимости от потенциала констант скоростей при действии изопротсренола (в 3-х случаях из 4-х) на Са2+ токи клеток гибернирующих

сусликов менялся. Из рисунка 12 видно, что под действием изопротеренола увеличивается как скорость обратного перехода руу приблизительно в 2 - 3

раза, так и меняется знак наклона ее зависимости от потенциала.

° - • -

Ъ 0.01$

о.ооо

_1_I_I_1_1_1---1-1_I—

-40-зо-го-ю о ю го зо -зо-го-ю о ю го зо 40 во

Мембранный потекиидл, мО Мембранный ногснннял, мВ

Рис.12. Шнененче характера зависимости от потенциала констант скоростей кинетической схемы (10) для медленной инактивации Са* тока юрдионита гибернирующего суслика (Л) и иод действием изопротеренола (Б).

Если оставаться в рамках концепции о независимости процессов активации и инактивации Са2+ канала, предложенной в этой работе, то можно попытаться дать следующую интерпретацию этому факту: медленная инактивация представляет из себя кок потенциал-зависимый процесс, так и процесс ток-зависпмой инактивации. Причем, в случае значительного (в несколько раз) уменьшения входящего тока, в случае спячки или под действием некоторого блокатора, например нифедппина, процесс ток-зависимой инактивации не сказывается на общем ииактивационном процессе. При этом остается только первая, потенциал-зависимая компонента инактивации. Удивительно, пожалуй, то, что вычисленный подгонкой данных уравнением (12) инпктивационный поротный заряд получился, против ожидания, достаточно значительным. Усредненный по трем экспериментам, по Са2+ токам от кардиоцитов гибернирующих сусликов, он составил £//=-1.83±0.2, Как и в случае активации эффективная величина воротного заряда в два раза больше, поскольку модель предполагает наличке двух ннак-тивационпых ворот. Косвенным подтверждением данной интерпретации может служить то, что действие любого соединения, вызывающего рост Са2+ тока, приводит к сдвигу нормализованной проводимости медленной инактивации в сторону гиперполяризацни, вследствие нницнгш'ш ток-заан-симого процесса, и, напротив, ьсе блокаторы вызывают противоположное изменение нормализованной проводимости (см. нифедппин, рпс.10). Более того, принимаемые для расчета модели ток-зависимой инактивации константы скоростей быстрой и медленной инактивации составляют О.Змс-1 и 0.005мс-', соответственно, что практически точно совпадает с величинами констант скоростей быстрой и медленной инактивации полученные в нашей модели.

Регуляция Са1+ тока эндогенными пептидами.

В обсуждении полученных результатов указывалось на невозможность объяснить модификации Са2+ проводимости гибернаторов только за счет фосфорилирования, В связи с этим представляется важным знать роль пептидных регуляторов в модификации ионного транспорта и, в первую очередь, Са2+ тока. Ранее мы сообщали, что совместно с лабораторией пептидов Института биоорганической химии удалось выделить, установить первичную" последовательность и синтезировать два пептида с противоположными свойствами (М[к1ш1суа 1.1., е1 а1., 1989).' Пептид-активатор оказался известным ранее пептидом - неокиоторфнном, а' блокатор, получивший название ВБ, имел структуру Азр-Туг. Отметим, что поиск этих пептидов был основан на их влиянии на Са2+ токи в трабекулах предсердия лягушки. Естественно, вызывает интерес действие обнаруженных пептидов на • Са2+" токи теплокровных и, особенно, истинных гибернаторов, которое исследовать ранее не представлялось возможным.

Действие на Сог+ ток кардиоцитов суслика и крысы. Против всех ожиданий блокирующего эффекта этого пептида на Са2+ токи теплокровных нам обнаружить не удалось. Напротив, приблизительно в 70% случаев действие ВБ, на этих препаратах, характеризовалось активацией Са2+ каналов Ь-типа.

Рис.13. Влияние пептида ДГ на Са&токи кардиоцчтоа сусликоо и крыс. Вверху: действии 10л|кМ С5 на Са2+ ток кардноцнта активного суслика. 1 - контроль, 2 - 5-тц минутное действие пептида, '3-от-мыв. Внизу: пютограмма, построенная по результатам 3-х экспериментов для каждого бура. По вертикальной оси отложено увеличение контрольного Са2* тока в процентах под денстпнем 10 мкМ ВБ.

Из рис. 13 видно, что видоспецифнчность эффекта ВБ не ограничивается только действием на токи теплокровных и холоднокровных. Действие пептида но Са2+ токи сусликов заметно выше, чем крысы.

На следующем рисунке представлены данные о концентрационной зависимости эффекта ВБ. Концентрационная кривая, приведенная на рис. 14 (справа) получена приближением усредненных значений уравнением Хилла:

* на сегодкншынй день подобных пептидов насчитывается более двух десятков.

1+х/

1с. яЛ

о -контроль »-«0 мкМ •-50 мкМ '•ЮЗ икМ

> О 20 40 во вО

Мембранный потеишал, и В

* 1й1ВЗ|, м

РиС.14. Концентрационная зависимость действия № на Са** токи кардиоцитов крыс. Слей: вольт-амперные характеристики Са*1, тока полученные в одном эксперименте последовательным увеличением концентрации пептида. Справа; концентрационная зависимость активации Со2+ тока по данным трех экспериментов.

где кт - максимальный эффект, .г - концентрация пептида, к« - константа диссоциации, п - коэффициент Хилла, характеризующие! кооперативность взаимодействия. В результате подгонки эти параметры приняли следующие значения: кт=Ю.2% (эффект насыщения), ¿¿=8{)мкМ, //=1.51. На рис.15 представлен результат анализа действия пептида на Са2+ ток кардиоцитов крысы, в рамках описанной в предыдущем разделе модели. Наиболее значительное воздействие ВБ оказал на нормализованную проводимость быстрой инактивации /¿.(Е) (нижняя панель), которая, как обсуждалось выше, отражает кинетические изменения при фосфорилировонии канала. Вполне вероятно, что данный пептид каким-то образом модифицирует систему цАМФ - зависимого фосфорилировання,

-40 -го О 10 40 во во ,.

мрачный натешим, и и что приводит к активации Саг+ канала 1« -

Рис.15. Стационарные нормализован- типа. Косвенным подтверждением этой ги-

ные проводимости полученные подгон- „„.„.. ..„,„_„„.„,,..„ „„

т> Са» тока кардиощта крысы, п<ггезы может служтъ анализ действия пе-

Незакрашешшс квадраты-коитроль, птида на аденилатциклазный комплекс закрашенные- действие 50 мкМ В5. плазштичесК||Х мсмбра„ легочной ткани

крыс (Крымская В.К., неопубликованные данные). На этом препарате В5,

-о.г

в концентрации 10"5+10"6М увеличивал активность аденилатцнклазы на 40% (для сравнения - эффект изопротеренола, в тех же концентрациях, в этих экспериментах составлял 100% от базальной активности). На мысль о таком механизме действия BS наталкивают и данные экспериментов, проведенных на ооцитах лягушки Xenopus, инъецированных поли(А+)РНК из мозга крысы. При концентрации 1мкМ в омывающем растворе, в 4 экспериментах из 6, BS приблизительно в 1.8-2 раза обратимо увеличивал Са2+-зависнмый хлорный ток. Рост хлорного тока свидетельствует об активации экспрессированных Са2+ каналов под действием BS. Если учесть, что инъецирование РНК в ооцит приводит к функциональной экспрессии в основном только Са2+ каналов Р-типа, резко отличающихся по своей регуляции от каналов L-типа, то фосфорилирование, вероятно, является тем общим звеном, которое связывает действие BS на эти типы Са2+ проводимости.

Влияние неокиоторфипа (НКТ) на ЛТФ-чуаствитслъпые А'+ каналы. Активность НКТ была обнаружена на одиночных АТФ-чувствительных К+ каналах кардиоцнтов крыс. В конфигурации inside-out неокиоторфин, в концентрации ЮмкМ блокировал эти каналы. Простой анализ приведенных данных показывает, что пептид вызывает на этом типе каналов увеличение вероятности их пребывания в закрытом состоянии. Эффект НКТ обнаружен и на цГМФ-зависимой проводимости фрагментов наружных сегментов фоторецепторнои клетки (палочки сетчатки лягушки Xenopus laevis), где, как и в случае АТФ-зависимых К+ каналов, он оказался блокатором. Если учесть, что ток через потенциал-зависимые каналы сердечных клеток зависит от внутриклеточного уровня цАМФ, то явно прослеживается связь между мишенями действия BS и НКТ - как регуляторов нуклеотнд-завнси-мых каналов различной природы.

Влияние пептида RZ-6 /ш Са1* токи трдиоцитов крысы. В целом этот пептид, состоящий из 6 аминокислотных остатков, обладал свойствами активатора. Эффект был всегда обратим. Действие RZ-6 как активатора несколько отличалось от действия других, исследованных ними пептидов. Отличие заключалось в относительно быстром развитии активации. Обычно эффект других пептидов развивался спустя 3-5 мпн после добавления в омывающий раствор. Активация Са2+ токов RZ-б начиналась сразу, вероятно еще до того, как концентрация пептида d камере достигала заданного значения. Достигнув пика на 3-5 мин, эффект действия пептида спонтанно уменьшался и токи возвращались к контрольным значениям примерно через 10 мин. Десенситизация возникала и в случае повторной добавки пептида. Максимальная активация (-40%) достигалась при концентрации 5 мкМ. При больших концентрациях степень активации токов уменьшалась.

Пептиды - блокаторы Со2* токов сердечных клеток крысы. Еще одним пептидом, выделенным из низкомолекулярнон фракции мозга гибернирую-щего суслика был Thr-Ser-Lys-Tyr, получивший название RZ-5, который является производным неокиоторфнна, без С-концевого Arg. Пептид RZ-5 блокировал Са2+ токи крыс, взятых при мембранных потенциалах около ОмВ, на 32.1±8.4% (п=3). Эта величина несколько увеличивалась при более отрицательных потенциалах.

Другим представителем низкомолекулярных пептидов - блокатороо является RZ-3, состоящий из 4 аминокислот. Эффективность действия пептида близка к активности RZ-5. RZ-3 в концентрации 5мкМ блокировал Са2+ токи кардиоцитов крыс на 27.3±6.2% (п-1).

Пептид RZ-S, выделенный из мозга хладоадаптированной якутской лошади, был идентифицирован в параллельном тестировании, проводимым Емельяновой Т. Г., как обладающий выраженным птотермическим эффектом, Это оказался пептид, состоящий из 18 аминокислот со следующей последовательностью:

Ala-Val-His-Leu-Pro-Aiii-Aip-Plie-Tlir-Pio-Ala-Val-His-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys.

В наших экспериментах RZ-8 блокировал Са2+ токи кардиоцитов крыс в концентрации 5мкМ на 35.5±6.9% и в концентрации 25 мкМ на 59.8±10.2% <и=5).

ВЫВОДЫ

1. Метод перфорированного пэтча использовался для Изучения потенциал-зависимых Са2+ токов в изолированных сердечных клетках якутских сусликов (Grelins undulattis) в период гибернацин. Модификация методов выделения кардиоцитов позволила получить Са2+ толерантные клетки от спящих (с температурой тела Т(,=6.5-<-70С) и спонтанно пробудившихся (Ть=37°С) животных.

2. Показано, что, вопреки установившейся точки зрения, о карди-оцитах гнбернаторов, потенциал-зависимый Са2+ ток во время спячки подавлен не полностью. Максимальные значения Са2+ тока в кардиоцитах, выделенных из спящих животных составили -0.133± 0.02нА (и= 26), из пробудившихся -0,335±0.04иА (п=1б); кажущиеся потенциал л реверсии: 97.8 ±4.8мВ и 9б.8±10.2мВ; потенциал полуактнвацни тока: -б.5±2.6мВ и -2.3±3.0мВ; положительный наклон проводимости вольт-амперных кривых 4.б±0.6нС н 2.4±0.3iiC; наклон правой ветви вольт-амперных кривых 7.0±0.7мВ и 7.7±0.3мВ соответственно.

3. Ни ферментативная обработка, ни температурная адаптации, при получении изолированных кардиоцитов, не устраняют факторы, подавляющие Са2+ ток животных в состоянии гибернацин. Оставшийся Са2+ ток у гибериируюшнх животных классифицируется как Са2+ ток L-тнпа и регулируется агонпстам» и антагонистами этих каналов.

4. Изопротеренол в насыщающих концентрациях (1-2мкМ), на клетках, полученных от спящих животных (н=6), увеличивает наклон проводимости правой ветви вольт-амперных кривых Са2+ тока до 7.5± 2.7нС; кажущийся потенциал реверсии, потенциал полуактивации и параметр наклона (84.4±10.0мВ, -2.0±3.2мВ, 7.4±0.5мВ соответственно) достоверно не отли-. чаются от тех же параметров токов кардиоцитов активных животных. Тот факт, что пиковые значения тока и проводимость, под действием изопро-теренола на токи спящих животных лишь достигают значений, полученных от клеток активных сусликов, позволяет заключить, что фосфорилнрова-ние/дефосфорнлирование не единственный фактор, ответственный за модификацию Са2+ тока при гибернации.

5. При построении математической модели Сп2+ токов установлено следующее:

О Са2+ токи кардиоцитов гибернаторов (сусликов) удовлетворительно описываются моделью й2^^, основанной на концепции независимости процессов активации и инактивации. Модель подразумевает наличие двух активационных ворот, двух инактивацпонных (^-типа) и одних инактивационных ^-типа ворот.

О Процесс активации связан с переносом воротного заряда »3 и регулируется фосфорилированием.

Ф Процесс инактивации 2-го рода (быстро!! или Гг-ннактивации) нельзя представить как простой одностадийный конформацпоннын переход, связанный с переносом воротного заряда. Эта инактивация, в основном, регулируется фосфорилированием.

О Процесс инактивации 1-го рода (медленной или ^-инактивации) является смешанным процессом, обусловленным воротным механизмом и ток-зависимой инактивацией. Вычисленный в условиях подавленного входящего Са2+ тока, эффективный воротный заряд находится в пределах от -3,5 до -4.

О Кинетические параметры Са2+ токов активных и гибернирующих сусликов сохраняют адекватную регуляцию дигидропиридиновым блокатором нифедипииом и активатором изопротеренолом.

6. Сравнительная оценка кинетических параметров Са2+ токов кардиоцитов активных н спящих сусликов показала следующее:

О Кинетические различия наблюдаются практически по всем компонентам. У гибернирующих сусликов наиболее заметный сдвиг в сторону деполяризации испытывают нормализованные проводимости обеих инактиваций и в меньшей степени активации.

О Са2+ токи гибернирующих сусликов характеризуются замедленными и 1.5-2 раза характерными временами (т</, тд, хр) для всех

компонент проводимости по сравнению с токами активных животных.

О Обнаружена модификация активационного воротного заряда Са2> каналов кардноцнтов сусликов в состоянии гибернации. Эффективная валентность заряда меняется от -3 у активных до »4 у спящих животных.

0 Фосфорилирование, вызванное действием насыщающих концентраций изопротеренола, возвращает характерные времена токов гибернирующих животных к величинам токов, близким активным животным, но сдвигает нормализованные проводимости в сторону гиперполярнзации на величины, превышающие разность между проводимостями активных и спящих сусликов. Однако, это не обеспечивает рост Са2+ токов до величин характерных активным животным при аналогичном воздействии.

7. Совместно с сотрудниками лаборатории пептидов Института бно-органнческой химии из низкомолекулярной пептидной фракции ги-бернирующего суслика и хладоадаптированной якутской лошади выделен ряд пептидов - активаторов и блокаторов потенциал-зависимых Са2+ токов, которые потенциально могут участвовать в регуляции состояния гибернации. BS и неокиоторфин, по-видимому, являются регуляторами нуклео-тид-зависимых процессов. Кроме того, обнаружено, что пептид BS обладает видоспецифическим действием на Са2+ токи сердечной ткани холоднокровных и теплокровных животных. В первом случае он обладает свойствами блокатора, во втором - активатора. Эффект активации Са2+ токов пептидом RZ-б характеризуется быстрым развитием и последующим спонтанным сладом. Пептиды RZ-3 из мозга гибернирующего суслика и RZ-8 из мозга якутской лошади, обладающего гипотермическим действием, оказывали блокирующее воздействие на Са2+ ток кардиоцитоь крысы.

Список.работ рщЕлнковапнмх. по кме диссертации:

1. Alekseev А.Е., Kotystóva A.F., Malyutova D.A., KokozY.M. Potenlial-dependent Ca2+ currents in isolated heart cells of hibernators. Biochemistry and molecular biology international. 1994, v33, No2, 365-376.

2. Знганшин P.X., Свиряев В.И., Васьковский Б.В., Михалева И.И., Иванов В.Т., Кокоз Ю.М., Алексеев А.Е., Корыстова А.Ф., Сухова Г.С., Емельянова Т.Г., Усенко А.Б. Биологически активные пептиды, выделенные из мозга энмосплщих сусликов. Биоорганическая хшшя 1994, N.8-9, C.S99-918.

3. Kokoz Y.M., Filatov G.N., Nikonov S.S., Luybarsky A.L. Alekseev A.E., Mikhaleva 1.1., Fesenko E.E., Ivanov V.T. A new 'peptide regulator of

membrane cationic conductance. 2nd Soviet - Spanish Symp, Phys. Chem. Biol. Kiev, USSR, 1990, p.20.

4. Svieryev V.l., Vaskovsky B.I., Zigansliin R.H., Mikhaleva I. I„ Ivanov V.T.; Kokoz Y.M., Povzun A.A., Aleksecv A.E., Sukliova G.S. Peptides from hibernating ground squirels and tlieir phisiological activity. Abstracts of the 21 European Symposium. Barselona, Spain, 1990, p.229.

5. Svieryev V.l., Vaskovsky B.I., Zigansliin R.H., Mikhaleva I. 1., Ivanov V.T.; Kokoz Y.M., Povzun A.A., Alekseev A.E., Sukliova G.S. Peptides from hibernating ground squirels and their phisiological activity. Proceeding ofthe2l European Symposium. Peptides 1990, Eds. E.Giralt, and D.Andreu, p,751 -752, Escom, Leiden 1991. '

6. M'khaleva I.I., Svieryev V.l., Vaskovsky B.I., Zigansliin R.H., Kokoz Y.M., Povzuii A.A., Alekseev A.E., D.A.Ignatiev, Sukhova G.S., Emelyanova T.G., Ivanov V.T. The peptides from braine of hibernating ground squirels and their biological effects. Abstracts of the 8th FRG-USSR Symposium on chemistry of peptides and proteins. Aahen 1991, p.27.

7. Mikhaleva I.I., Svieryev V.l., Vaskovsky D.I., Zigansliin R.H., Kokoz Y.M., Povzun A.A., Alekseev A.E., D.A.lgnatiev, Sukliova G.S., Emelyanova T,G., Ivanov V.T. The peptides from braine of liibemating ground squirels and their biological effects. Proceedings of the 8th FRG-USSR Symposium on chemistry of peptides and proteins. 1991.

8. Mikhaleva 1,1., Svieryev V.l., Vaskovsky B.I., Zigansliin R.H., Kokoz V.M., Povzun A.A., Alekseev A.E., D.A.Ignaticy, Sukhova G,S., Emelyanova T.G., Ivanov V.T. The peptides from braine of hibernating ground squirels and their biological effects. Chemistry of peptides and proteins, 1993, DWL Repots, y5-6, p.299-308.

9. Mikhaleva I.I., Svieryev V.l., Vaskovsky B.I., Zigansliin R.H., Kokoz V.M., Povzun A.A., Alekseev A-E., D.A.lgnatiev, Sukhova G.S., Emelyanova T.G., Ivanov V.T. Isolation, identification, and specific biological activity of peptides from hibernating groun squirrels. Chemistry of peptides and proteins, 1993, DWI Repots, v5-6, p.287-297.

10. Zigansliin R.H., Mikhaleva 1,1., Svieryev V.l., Vaskovsky B.I., Kokoz Y.M., Povzun A.A., Aleksecv A.E., V.T.lvanov, Peptides regulators of the Ca ond K intercellular transport and their role in hibernation. Abstracts of the first All* Union Peptide Symposium, Riga, 1990.

11. Mikhaleva I.I., Svieryev V.l., Vaskovsky B.I., Zigansliin R.H., Ivanov V.T.; Kokoz V.M., Povzun A.A., Alekseev A-E., Ignatiev D.A., Sukliova G.S. Isolation, identification and specific biological activity of peptides from hibernating ground squirrels, /«: "Chemmistry of peptides and proteins1989, V.5, p.538 - 541. Eds. W.Voeltcr, E.Bayer, V.T.lvanov, Walter de Gruyter. Berlin, New York.