Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция ионного транспорта эндогенными пептидами, выделенными из мозга гибернирующих животных, и внутриклеточным РН

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция ионного транспорта эндогенными пептидами, выделенными из мозга гибернирующих животных, и внутриклеточным РН"

•ХСКС-ШЙ ОРДЕНА Ш1Ж, С?ША ОКТЯБРЬСКОЙ РЕЕаЧЩЗ! И Ж'ДОВОГО КРАСНОГО зодш ЛГОЗТОТВЕШК ЗдаВЕИИКР ••bVOJSí И. S. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 612.014.42.

ПОЗЗУК .АЛЕКСЛЩР ;ЩДРЕЕВ:-1Ч

тшлтш ИОННОГО ТРАНСПОРТА ЭЩОГЕНШШ ПЕЛТМЛЛ?.'!'-ВДДОЕШ&Н 1'13 1.СЗГЛ :':<БЕРНН?УЩ;А ЖВОТШХ И

вкутркк/Т^ШК,: рн

(с.'З.СО. S3 -- "ийзиолог:'.я челнока и зквоггегс")

А з о V s ф s р а ? ELCcepïàiyii! ка сохск&зне учений с-гэпокп кс^лэдатп оиолйгкчясхих наук

Пущине

- 1991

Работа выполнена б Института б&ож>гачееко;Г физики Ш СССР»

г. именно

Научшгэ руководители:

доктор басюгкчосгшх науке профессор ¿..II,

кандидат физико-чатематич-зсхж наук ЮЛ.!. Каков

Официальные оппонэкты:

доктор биологических наук, профессор А.Ю. Буданцэг

доктор биологических к~ук, ст.н.с. Г.Е. Са:,;скиш

Вадуцээ учрэядвшэ:

Институт проблем передачи ккфгрмации iH CGC?

Защита состоится ^¿¿^PW^ iQ^fr. з часов и;

сасоданш Слецкалмзироьлкног'о Совзта Д. 053 . 05. 35 Биологической

факультета Московскоп Государственного Унивэрситэта им М.В. ЛОИО-

г-осовз

€ ;'д;:саэртацшЁ мокао- ознакомиться в библиотеке Московского госу-.притаенного ушвэрситога и:. М.В, Ломоносова.

•лоргфэрат разослав

■'Jpaff Х&ЭЗГ.

изкрзтсрь ïJ£3iipcsaiiiîorc со:

Актуальность темы. В основе представляемой работы лежат задачи связанные с механизмами регуляции одного из самых интересных биологических феноменов - зимней спячки кивотных. Зимняя спячка гибернантов - адаптация этих животных, к экстремальным условиям. Способность к такого рода изменениям уникальное свойство гибернантов.

Основное отличие гибернантов от негибернантов - способность к согласованному на всех уровнях >,глеточном, субклеточном, тканевом, органном) переходу от состояния бодрствования к состоянию спячки. Частичное объяснение этому - адаптация различных тканей и органов гибернантов к экстремальным условиям, что можно видеть, на примере центральной нервной системы (Wurmeiberg et al.,1986), сердечнососудистой системы (South et al.,19C7; Lyman 1984), изолированного сердца (Burlington оt al., 1986), ионного транспорта (HIlory. Willis 1982; Kamm et al.,1979; Klmzey, Willis 1971; Marshai 1957, Marshai, Willis 1962; Riason, Lyons 1971; Willis 1979, 1986), механизма сопряжения "визбуздение-сокращение" (Langer 1980) и др. Примеров такой адаптаци-î достаточно много, однако вопрос о ее механизмах до сих остается открытом.

В работе рассматриваются два аспекта этой пробл:мы применительно к функционирований сердечко-сос}диетой системы: роль эндогенных пептидов, выделенных из мозга гибершруодкх ¡киеотных, и роль внутриклеточного pH. Гипотеза, так называемых, "антимэгаболи-чеоких" пептидов предполагает наличке у гибернирукщих ззшотных соединений способных подавлять метаболизм и поникать температуру тела. На эту ра.<ь претендовало.дгет-точно много соединений. Прездя всего это пептиды промоторы ска, (Heller et al.,1978, Berger 1Ç34K Ko такая гипотеза не подтверждается экспериментальными данными (Krueger,.Shoham 1986).

Увеличение уровня мет- и лей-внкефалинов в мозге гибернирую-щих животных (Kramarova et al., I9S3), функциональное сходство состояний животных шеле инъекции морфкна а е период тсрпиднсстя (Beckman 1936), резкое сокращение» дтотальности баута либо просгпа-ние спяшх кивозтих посла введения антагонистов опиоидов - нэток-пли-иалтрексона (Margules 1979; Кгсшег 1980) позволяют утверздзть, что в процессы регулирующие гибэрнащпо могут быть в:слючэнн эндо-гешше oinioii.rj. Од^гкс, до сих пор но ясно, какие природные огаюи-да могут рассматриваться как "триггер*«" гнберпаиди, хотя я этом направлении есть опрэделенное успехи.

Кеодкократко нрэдпргашмались гопытки вадолошм энд.огекких пептидов иь тканей ¡кивотных споссбшх впадать в состояние горпорз

(Daws, Spurrier 1969; Keirihani 1979, t9S3; Swon Qi al., 1969; Swon, Schatte 1977). К зокаленш) все попытки закончилась неудачно. Либо, чаще всего, на одно? из стадам происходила потеря активности,- либо вздзленный. :;ептид не обладал нужными свойствами. Однако, анализ этих результаты привел нас к .выводу, что подобный поиск ао-кет быть успешным.

С 1.ашей точки зрения, одним из ключевых моментов в нестапио-нашых режимах у аимоспящих является регуляция транспорта ионов Са2+ черэз потешиалозавиошже каналы. Поэтому вся работа фактически проводилась в направлении поиска новых "эндогенных пептидов -регуляторов транспорта зтого иона. В качестве модели были выбраны волокна предсердия лягушки (Rana rtälbunäa) и проводился поиск со-единэний по их влиянию на Са2+-ток. Такой подход ранее никем не использозался, хотя о существенной модификации трзктюпта этого иона у зимоспящих было известно давно.

Неыеныпий интерес представляют и изменения внутриклеточного pH у зимоспядах, Еще Dubois в 1896 г высказал гипотезу об ингиби-торной роли ацидоза в гибернащгл.

Действительно, колебания pH крови гпбернантов на 0,2-0,3 сд. являются нермой (Hand, Somero 193?) на такую яе величину, как было шказано в нашей лаборатории, поникен и рН^ кардиомиоцитоп спящих сусликов (Cltellus undulatus). Возникает естественный вопрос: существенно ли покидание pH* гибернирующих гивотлых для функционирования сердечных клеток, ги в частности, какую роль играет ацидоз в электрической активности клеток миокарда гибернантов? Отмети»?, чхо влияние изменения внеклеточного pH на ионный чранопорт в интересу-идем нас диапазоне 7,1-7,4 к значительшм изменениям транспорта .ионов черэз мембрану, для рассматтжвае1дгх типов каналов, иэ приводят. (BsÜardinalli, 7ogе* 1979; Vogel, Sperelakls 1977).

Что ко касается кальциевых каналов, то к>: зависимость о- внутриклеточного pH была мало изучена (Umbach 198?; Zucker 1931), а литературных данных о влиянии ■ рН^ на Са2+-ток обнаружить не удалось.

Цель работы. I). Совместно с сотрудниками лаборатории химии пептидов ИйХ АН СССР идентифищпювать активные гчптиды из„фракций мозга зиыоешщих животных, регулирующие транспорт ионов Са^.и исследовать действие их синтетических аналогов. 2). Оцонить роль изменений внутриклеточного pH в сордечшгх клетках зкмоспящих в регуляции потенциалозавксимого Са^+-тока.

Научная новизна результатов. Впервые в результате направленного отбора пептидов из мозга гибернирующих животных выдилэнн дьл

г

типа пептидов - регуляторов транспорта ионов Са2+ через потенциало-завиошио кг-лалы. Поскольку вход Са'"+ по этим каналам играет существенную роль во всех клеточных процессах, то есть основания полагать, что выделенные пептиды имеют определенное отношение к естественным регуляторам физиологического состояния организма. Обнаруженные к настоящему времени свойства синтетических аналогов выделенных пептидов позволяют предположить, что пептида могут представлять самостоятельный интерес при использовании их в экспериментальной практике и медицине.

Ппедсдавленная работа, вероятно, первая в которой подробно изучалось влияние соединений, менятагх внутриклеточный рН, на по-тенциалозсвисимый Са2+-ток предсердгя лягушки. Неожиданным Опазася результат о возможной рож цГЖ>-зашсимой регуляции 1Са п^и малых сдвигах рН в щелочную сторону. Возможное участив цГМФ в регуляции этого тока постулировалось практически с момента установления роли цАШ> в увеличении 1Са. Однако, до настоящего времени прямого участия цГШ? в регуляции тока не показано.

Научно-практическое значение. Результаты работы расширяют наши представления о переходных процессах у зимоспящих и подтверждают две известные гипотезы о механизмах регуляции перо/одних состояний. Одна из гипотез - роль природных "триггеров" в спячке, другая - роль сдвигов Енутршсль точного р.Ч при входе в спячку и пробуждении. Полученные результата могут быть полезными при решении проблем искустЕенного анабиоза, сохранении генофонда в экстремальных условиях и, вероятно, найдут применение в экспериментальной и практической медицине.

Апробация работы. Материалы дассерта'ши докладывались на II Всесоюзной школе "Механизмы зимней спячки" (Пущино, 1987), 7-мсм советско-западногерманском симпозиуме глмин пептидо? и белков (Ди-лижан 1989), 11-ом Американском пептидном симпозиуме ;Сзн-Диего, 1989), 21-ом Европейском пептидном симпозиуме (Барселона. 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения и трех частей включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов исследования и их обсуздение, а такко выводов и списка цитированной литературы.

ЗДДОИШ И ШЧЩ* НСКШ&ОБйШй

Оокогпал часть psGoin Еглюжзка вг урязокудат: предсердия ля-гу-ьки rtaíáíi.ida при темгаратурэ 18-20°С. По?ашз токи рзп.ст-рировали в услоглях ®ш;сацш мэ.^брзншго потенциала с использованием ме.ода двойного сахарозного моста (Rougler ct al., 1568). В качества контрольного использована pacu'coü Риьгорг слодущего состава (.vil): KaCl - 100, ЕС1 - 2.5, !JgS04 - 1 .25, Ca012 - 2, KalI2P04 - 1.2, глюкоза - Ъ, IIEPES - 10. рН доводам ilaOH до ?.4-7.5. В растворе такого состава при его непрерывной оксигенащш кислородом можно устолчизо регистрировать кальциевый тез: в течение 2-3 часов.

Входящий натриеви-г ток блокировали тзгродотокешюм в концентрации 0,5 кМ.

Для контроля Ш1 использовав аспартатсодерказцнй деполярпзуы-икй раствор, в котором ионы С1~ заменяли на аспартат, а концонтра-цию IT" доводили до внутриклеточной. В нем содержались (ití.1): одно-замэщэниый зспарга? калия - 140, NaCl - 8, CaCig - 2.5. MgSO/ -1.25, NaQH - 7 NaHGOo - 1.2, КН2Р0л - 1.2, глюкоза - 2.Б, рН 7Л-7.5.

Для изменения внутриклеточного рН использовал;: ьонексип (Lacérela et al., 1990), КН4С1 и С02 (Kidv/ay -et ai.,1977, lacerda et al.,1988).

Измерение внутриклеточной концентрации Са2+ проводили на кар-диомиоцитах самцов крыс .детки Wlstar весом 150-180 г и находящихся в состоянии спячки сусликов (Cíteliиз ипаи1а?чз>. Клетки выделяли о коллагоназой в растворе содержащем (мМ): líaCl - 120, КС1 - 5.8, .MgS04 - 1.5, KH2PO,t - 1.4, NaHC03 - 4.3, глюсоза - 14Л, HEPES -10, pll - 7.0 при температуре 37°С (Ьинчекко и др., I9S8).

Измерения внутриклеточной концентрации к эльция проводчли с использованном флуоресцентного зонда Quin-2, чувствительного к изменению C0a2+]j_. При измерении [Са--+ ] ^ регистрировали флуоресценции на длине волны 490 гол при возбужгеши: на 334 нм.

Все разделанная и очистка фракций мозга, а также идентификация и синтез пептидов выделенных из огих фракций проводи.™оь в Институте биоорганичоокой химии им. Шемякина ЛН СССР, сотрудниками лаборатории химии пептидов. Результаты их исследований приводится исключительно для болов полного понимания смасла работы.

I.Роль OH -OV-.os ~ зчгуялпгг v: депорт

Покояксу '¡С¿ХрЭ.Г^рТГСЛ'.г-Ол в о,:зк-

троф!1вио.1гсп14ос.и1>: иссле,7юиг.1&ях явлкатся -пналлз ие:.:онэнпя форды потенциала действия (Г;1!К о ?птп;:э известно, что форма ЦЦ зимоспя-цих резко отличается от шзнмосп'тщдх. (Шскег IS8S), предварительный отбор ¡фракций рэздолечкых по молекулярному весу ггровод!Ш1 по их влиянию и? потенциал действия трабекул лягупки.

Нсслодовалксь фракции, выделенные из глоага спящих зивотных, содержащие Евщества с молекулярной массой з интервалах: порзая -до 1000, вторая - от 1000 до 10 ООО и третья - больше 10 ООО Дальтон. В наших скеперимэнтах первая и трэтья фракщта не оказывали заметного влияния на форму потенциал действия, поэтому основное внимание было удедеьл второй: фракции, под влиянием которой ГЩ приобретал форму типичную для зимостгдкх. При дальнейшем тестировании нормальны!! раствор Рннгера добавлялось 10мг/л лисфилизированной фракции с молекулярной массой ÍC00-IG ООО Дальтон.

На рис.1 показаны записи Са^+-тока в контроле, в присутствии

ПОСЛе ю-мйнутеой ЭКСПОЗИЦИИ, и П0СЛ9 iü-минутйого 01шы-

— , вольт-амперные кривые Са2+-токг, построенные по этил зрпи-: Видно, что вещества, содержащиеся во фракцгч, узэ через 10 .л-глут "дзоэ подавляют Са2+-ток. Посла 1С-г.ппзутного действия эффект блокирования тока частично счишотся при 10-?.<ьнутном отмзвэ. Jo-■тенцнал реверсии 0а2+-тока сдвигается влэ~о на 4-5 ыВ, существенно уменьшается суммарная прово^даость с^ствьи Са^+-канадоз, чем н обьясняотся уменьшение Са^+-тока. , _

Ркс.1.

Действие веществ, содержащихся, во фраицгш 1000-10 ООО Д

на СгР-+тски золокон гтдсердия ля:ушкк. I - контроль,'2 - действие фргпацтч ь твчегмо 10 мин, j - после 10 айн. отмыв?. Слева - записи токов., справа - построенные зтх"г! записям вольт-

2МШрЩ-!и КСИР'^ CS¿+-tokt¡ (внизу) и 'üBG рху) .

2. Эндогенные пептида - регулятора по^енциалозависимого Са3+-тока.

При дальнейшем отбора фракций пришлось отказаться от анализа ПД, поскольку стало ясно, что вещества, содержащиеся во фракциях, обладают более широким спектром действия, чем предполагалось вна- . чале. Идя отбора активных фракций использовалась только регистрация ионных токов.

2.1 Неокиотсрфин.

Ужо на гтором шаге использования ВЭЗХХ-метода, появились сложности с определением активной компоненты, поскольку из экспериментов следовало, что во фракциях могут содержаться пептида как активирующие, так и блокирующие Са2+-токи. Поэтому дальнейшее разделение проводилось ВЗ"Х-методом на колонке с обращенно-фазным сорбентом. В результате разделения была уточнена область, содержрцая ве-даэстви, блокирующие Са2+-токи (рис.?) и получена узкая зона, с пептидом активатором (рис.3). ... . . . . ........

Рис. 2 .и и ?а ио п« н) пу

Блокирующее дей ствие соединений, содержащиеся во фракции 10. эта йракш"? в дальнейшем была исходным материалом для идентификации пептидов - блокато-

тзоз Са^+-транспорта. Слева - записи токов в одном из типичных экспериментов, справа -построенные по этим токам вольт - амперные кривые. 1-контроль, 2-после 15 мин. действия фракции 3-отмыв 15 мин.

К 6? 50 ЦС т'

V

Рис. 3 Активирующее, действие соединений, содыр-жаяихся во фракции II, Слева - записи то.сов в одном из типичных экспериментов, справа . -по с военные по этим то-::.?••! ьольт-эмпешые кри-1_- контроль, 2 -л-ч-ле мин.* действия

Г: .'-.КЦНД. 3 - ОТМЫВ 16

Из со:ш г'!::1!? : тид, установлена его Время выхода сзн'го

. гхгаиг^ 'Гг.' "-'"ска ил пьп-

п-.^вччиач ?г(/ука-уса ч .тронодзл его счнтез, Фасного :":пп:'г)гз 'л ;:дг--тт;.чег!Шф?«йнксго поитнда на :фонатогр£:."'пх п&йгтялчскн ¡"сатадоют. I •:•:?.•=лось, что даренная последовательность ъп^еленного пептида (Т1гг~Бег-Ьуз-Туг-Аг-£) полностью повторяет структуру шокиоторфяна - природного пептида, обладающего аи^лгетичзскит.ы свойствами, и выделенного из мозга быка т 1983г. японскими исследователями et а!., 1982). Однако,

как выяснилось позже, аналитическая активность неокиоторфина значительно ниже, '1эгл у ряда известных; природных опиоидов (К1га,дау/а е1 а!., 1983) и, вероятно, с этим связано отсутствие работ по исследованию действия этого пептида и его применению. Синтезированный аналог природного неокиоторфина оказывает сходное действие на Са2-ток. На рис.4 приведены вольт-а/ятеркые характеристики этого тс-ка в контроле д пря действие япокиоторфина в концентрации 10~ЬМ.

(з бо _ Д8_ IV

Рис. 4

А-стдЕнрующее действие сия-трезанного кэокисторряка на

сгхост ионов Са2+ г> -трабоку-,..--<■■; шзоДсвтздйя лягушка. Слева -:.. тийк при различных потенциалах на нгмбранв трабекул предсердия лягушки, справа- по-Суроонвне по эти;., токем вольт-амперные характеристики. I-ксчтсоль, г-кеокзготорфяг (10 \зш." действия), З-посдз ±5 ман. ст?гыва.

Сходство этих золът-ашерных характеристик с приведенными на

рйС.з оч0бидко0.

Действие неогагаторфааа обратимое, после 15 кин. отк-нва регистрируемые токи практически неотличимы от ^сков в' контроле (еольт-ошерше кривые 1,3). Синтезированный пептид, как и фракция, содержащая природный т.зптид, кикб'глку токов практически не меняет, в обоих случаях на 5-7 уменьшается по -онилал активащш и более

V—

ВО ___

газа*»« ^тпа

ч^л яа Са2+-тока.

10 м

здшгэ

я рпразо кгг<ущийся ь Кривая доз'1.- дойс^ь'ло неокиоторфина (ркс.5)

^тешщал реверсии

З-обрезную форму: функционально заичтагоь тид знчкрзйт уав з кащмп-ракчя 10~7М,

шлее? обычную увеличение Са2+

сатт-п-лум

-тока действия -

Ю~%, насыщение достигается при концентрации 10~"М. При построе нии кривой доза - действие по оси У отложены максимальные значения Са2+-токов на вольт-амперных кривых, . снятых при соответствующе коцентрациях пептида. Приведены данные полученные в непрерывно?* эксперименте на одном волокне, результаты других экспериментов мало отличаются от приведенных.

1ч10~ 7 А

Рис. 5 РСривая доза-действие неокиоторфина. Внизу при-

веденч записи Са^+ токов при различных концентра цияхтгептвда. Приведенная концентрационная зависимость получена в непрерывном эксперименте, на одном волокне.

kortlro!

s J,M

ï5kt

Найденное нами свойство неокиторфина активировать транспорт конов Са^+ через пстенциалозависимне каналы и возможное jчастно его в прсдессг.: регуляции зимней спячки - новые свойства этого пептида.

.Начиная с концентрации КП^М неочиоторфин вызывает рост внутриклеточной концентрации ионов кальция. При этом вначале наблюдается довольно быстрое увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, которое затем прекращается, и постепенно возвращает-

ся к неходкой. Таке к&ртина 'сохраняется в присутствии блокатора потенциалозавасимнх Са^-каналоз DG00 (Ю~5Ы). Для онредэления источника ионов Са2+ ряд' экспериментов проводился в безкальциевой среде, и в атом случае внутриклеточная концентрация ионов Са-+ увеличивалась практически с тойке кинетикой. Неочиоторфин увеличивает [Cc^Jj как на клетках гибернируюцего суслика, т"к и на клетках крысы. Полученные результаты показывают, что рост [Са2*^ осу-дес?£1яэтся за счет мобилизации его из внутриклеточных депо. Можно было предположить, что рос. [Са24]-^ определяете.! изменением по-аерхностного заряда мембраны за счет двух аминокислот входящих в структуру неокиоторфина и имеших положительно заряженные полярные гругли (Lys, Arg). Сднако КС1 (30 мМ), как известно, деполяризует :-;.?• !,срг;н" на 40 мЗ, но в безкальцневой среде [Се2+].]_ не изменяется

совсом, а в присутствии блокатороо потоишалсоависимых каналов кинетика изменений iCa"'1 зная (Burlington 1967).

Наши результату позволяют предположить что, неокЕоторфга, пмэот ст.-цафачаскно ;,!<эста сзязнзаяия на мембранах ?гяокардаальных клеток и м^ает принимать участие в сопряжении цикла возбуждение. -сокращение у гиберпантов, поскольку известно, что у них, в отличие от других ззгвотшх, это сопряжение осуществляется в основном за счет внутриклеточных запасов ионов Ca'd+ (Burlington 1968, Byerly 1986, Caiapble 1988).

"2.2 Дальнейшее разделение фракции. Блокатор Са 2+-каналов.

На втором шаге разделении активной фракции ВЭКХ-методом, на хромотограме был найдены два ronca активности. Один из них соответствовал неокиоторфину, а другой - блокатору Са2+ токов. В результате последовательного разделения зоны, содержащей блокатор, на колонках разного mía удалось вкЛти на узкий пик хроматограмн из -которого и была прочитана структура блокатора -каналов. Оказалось, что-эти пептид состоит лз двух аминокислот (Asp-Tyr) и по аминокислотному составу совпадает с даыэптидом N-конца несуль-фярозанного октопепткда холецистокинина - известного регулятора сокращения ¡яелчнсго пузыря и стимуляторг секреции пищеварительных <ч -¿мотов поджялудочной аелозой. Врэмя выхода синтетического и природного пептидов с колонки отличались незначительно. Кроме того сохранилось соотношение времени выхода неокиоторфина и пептида-бюкатора. Эти обстоятельства свидетельствует в пользу того, что структура идентифицированного пзптида мало отличается ст природного. лак и фракция, синтезированный пептид блокировал потенциалоза-висимый Са -ток (рзс.6). ________________________ _____________

50 а те я та аа ta mv

Pîîc.5

„ 9, Блокирующее действие на Са~ -ток синтезированного пептида Азр-Туг (1СГ%). Слева -

записи Са2+-токои при различных потенциалах, справа пХгрэенный по записям токов Больт-аяперннэ кшчне. I- контроль, 2- :э тл. дёйетьля пептида, 3-15 tria. откывэ.

UXf'A

На рис„7 приведена кривая доза-зф&экт Из этой кривой следует, что наснщакцал концентрация пептида - 10-оМ, а пръ. Ю.У ток блокируется вдвое. Как г в случае с наокиоторфягтом при построении кривой доза-действие на рисунке по оси ¥ отлоаены максимальнее значения Са2+-токов на ьольт-ампершх кривых, снятых при соответствующих коцентрациях пептида. Приведении данные, получение в непрерывном эксперименте на одном волокне. Следует отметить, что эффективность синтезированного пептида нике окидаомой, поскольку Кт, оцененная по кривой доза-действио, порядка 5*1СГЬМ, в то время как ожидаемая 1^= 10~7М. Кроме того следует отметить, что во всзл экспериментах (п=4) наблюдался значительный роса К+

11x10"1 А

-компоненты точа.

X

Рис. 7

Ктзивая дос.а - действие не с у льсйиривашого пептида

Aso-Туг hp Са2+-ток. Внизу - ííOHEbT току при различных концентрациях пептида. Приведенные данные получены на одном волокне в непрешвном г-кспериыэнте.

Пряро^шй октапептид го.'^щ :стокинина - сульфированный, и велика вероятность, что ввдэленЕНй дипэптид-блокатор тоаэ должен быть в сульфировчнной ф^рыэ. Исходя из этих соображений, естественно бнло проанализировать влияние сульфированного аналога пепти-да-бдокатора на потенциалозавнсимые токи. Такой neiiiiy; был получен £ ИБК АН СССР в гр. Михалевой И.11. На рис.8 прртд&ни кривая звви,-сжоал Са2+-тока от концентрации пепт;:да (вверху) и ислше токи (внизу), по которым была построена верхняя кривая. Прежде всего вид?.:-, что действие сульфированного аналога более специфично: в -.«го присутствии не изменяется К+-компонента тс.са. Кром"1 того, в ст.п/гг. ••> от не сульфированного аналогу аыгссксимаш.л показывает, что г тот пептид блокирует не весь Са^-ток. Хотя специальных ио-.

в этом яапрс

здании но проводилось, но можно высказать

л„2+

г-ижбяд®, что еу-ьфироааш..1й дкпоптид блокирует -каналы ь-тша. Касвеным доводом в пользу такого утверждения может

бить то, что во всех экспериментах доля заблокированного тока составляла значительную часть от исходного,что сотвотсгвует приблизительному соотношению Ъ я Т етшсм Са2+-каналов на прэдсардных волокнах- лягушки. Его Ки- ЬЛО-7" — — "----

сульфироваишй дипептид.

Рис.8.

Кривая доза-действие сульфированного пептида Asp-

Туг на Са2+-тот:. Виизу -ионные токи 'при различных концентрациях пептида. Приведенные данные получены на одном волс:ше в непрерывном эксперименте. Сульфированный

пенти," блокирует Са2+-ток,

не меняя .выходящую К^-компо-ненту суммарного тока.

Кроме того ч последней ■v-r. ¿шр.я зона на хроматограме, содержащая илокатор иа~'-токов, в ч .„рой по данным аминокислотного анализа пептид Asp-Туг не содер-:лгася. Повидимаму, нами сделан шаг вперед по идентификации пепта-дов-блокаторсв, но вероятней всего, что обнаруженный пептид не единственнный п ьв самый эффективный.

II. Влияние внутриклеточного рН 'на потевциалозависимый Са2+-ток миокарда лягушки

В настоящей работе исследовалось влияние изменения внутриклеточного рН, индуцилуемого моненсином (Pressman 1976), Boron 1967 Roos 1981/ и С02 (Boron 1967, Puole-Wilson 19СЭ, Roos 1981; на характер функционирования готенцичлозависимых кальциевых каналов на препаратах предсердия лягушки. pri ' внеклеточной ерьды во всех описанных нш«з эксперт,тентах поддерживался постоянным.

I. Изменения 1Са при повышении pH-j

1.1 Влияние моненсина на кальциевый ток.

Ыоненсин з концентрацы 0,Б-1 мнМ вызываят увеличение амплитуда 1Са(п=11 ) через ¿-4 минуты пос.э добавления. максимальная пко-рость тэоста тока наблюдается j диапазоне от 7 до 15 минут. При болев длительном воздействии Минэн^ина (дс 30 мин) амплитуда тока

, UVJJiCJU s ЧСГД iTJ

IxlO~ 7 A

3 2 H

S HsM

cepini экспериментов была обнаружьна

;joeojiiefiö'j.' i'e •С, 420 VSJW

p.i,iapHO s дз

лпчиватьея, но значительно кедяошеэ. «а р::с,г 15 smys поело дсоаяденля ::олоих>ра 1Са возрастает pasa, в течение слэ.ц,15 ¡omvt наблюдаете-: небольшое дополыгтаглюо увеличоние тока, йаэдщийся потенциал реверсии при атом меняется незначительно (рис.96).

S3 „1S

Рис.9.

Дзйствие монепсина на кальциевый ток. А - супер-позяшш записей токов, зарегистрированных при различных4 зйачешях глэмбран-шго потенциала В - вольт-амперные характеристики ICa I - контроль; 2,? -

действие моненеша (п,5 iNüif.í) через 15 глин и 30 мин соответственно.

.2 Действие ПН/01 на

i, W 'A

Известно, что НН4С1 высызает слонные изменения внутрикл-эточ-ого рК, обусловленные разной проницесмостью мембран Для №13 и

Дсбав ценив Ш4С1

ÍS4+ (Ьогоп 1967»Roes 1981, Vaugüan-Jones 1987;. в перфузирухзций раствор приводит к разному повышению рН^ (на 0,-3-Q,í од.) вследствие того, что Iffig свободно прогиказт через :-:;р'бра-ну и связывает часть прогонов в цитоплазме. После 5 глин действия ÍIH^CI первоначальное яовшешю рН^ сменяется его постепздзш спя-кениэи, обусловленным нра^ишоьэынем в цитопиазму исков КН4+. Однако vi через 15-20 мзкут действия Ш14С1 значение р^ остаэт-я пс-ьышошшл', по сравнению с исходным. Удалекче Ш-С1 из дэрфузкрукщего раствора вызывает резкое понижение prI-¡_ (на 0,3-0,4), которое после стькта в течение Ь-10 минут возвращается к корме за счет KaVtT-обковного механизма.

Ь наших экспериментах воздействие Ш4С1 всеще в^з^вало усилена* входа Ca*''' через потенцналозависнмье какалн. На ряс. 10 вдд-'л-, что через 15 минут после добавления -ШДС1 амплитуда тока увэ-.игптлась почти а 3 раза по сравнению с контролем. Максимальная с;;срг пъ роста 1Са всегда наблюдается в первгэ минусы после добчв-í\r-\на Ш4С1 (через 3-5 мин ажлитудй тока увеличивается более чем з 2 сзса). Это совпадает по времени с моментом максимального новы-енля pHj, индуцируемс го этим агентом> и шяат свидетельствовать в

пользу того, что ссяонпоэ з%";!яппо IW.|C1 на калытяепй ток осупэсг-зляотся pKt-jr.piîcii/.niï образец.' Однако характзр жздсзэнгл If.., як.' дейол. js 5 KrLOi хюсколько стлмчаэуся от хпрхяеэра"iWmo-

пвт&г. pïî-i : рост тока, хо™я .л болга иодлгшга« чоп в поргчо /"туте, цродолк2этсл 3 "-04si3t0 ес9го д-эйствпя ШдС1 (10 тогда ksic

явшоиочальпсз попшзониа рЫ-j обычно сменяется его постепенным по-НИ£8КЫ»1.

Рас.10.

Влияние 1Ш.;С1 л з 1Са.

Экспериментальные записи (А) и вольт-ашэршш характеристики гг,оков (В) в контроле (1); через х5 мин от начала аппликации ЧН4С1

в концентрации 20 мУ (3); через 30 мин после .удалений Ш4С1.

Удаление T-1H4C1 из порфузирующого раствора в наших эксперцмон-тах обычно не вызывало резких изменений кальциевого тока, в то время как аналогичная процедура рерко пошпкает рН^ по отношению к контролю, /амплитуда тока либо продолжат? некоторое время увеличиваться, либо стабилизируется на ;*,ос"игнутом уровне и только через 4-5 минут начинает постепенно уменьшаться. Создается впечатление, что NH4C1 но только влияет на величину внутриклеточного рН, но и вызывает дополнительные эффекты сопрянк-шшэ с активацией механизмов, участвующих в регуляции Се2+-каналов. Это может вносить свой вклад в характер изменения 1Са и в некоторой степени искажать истинную картину pH-j-зависимого действия Ж4С1. Однако, для проверю: итого предположения требуются специальные исследования.

2. Изменения .Тца при понижении рН^.

2.1 Влияние "шепираторного" ацидоза "а 1Сд.

Увеличение концентрации С02 в порфузируящом растворе обычно вызывает умоньшоние внутриклеточного рК- ("ростарторшпУ ацидоз), обусловленное способностью С02 свободно проникать через гпмбрану (Boron 1467¿Poos ¡981). Б наших Рксмери?лш1 jx а условиях СО^-индуцированного почтения pHj набл^даятсч гначнтолыю э подсг<ле:-л:э

Са^-тока. Как видно из рас .11а, уменьшение амплитуды токасопро-вовдается замедлением кинетики его активации. Положение вольт-амперных характеристик относительно ^"и потенциалов н кажущийся потенциал реверсии (¡ас.116) практически не меняются. Помимо изменений входящего тска наблюдается незначительная стимуляция выходящего тока.

Рис.11.

Подавление 1Са в условиях С02-индуцированного

ацидоза. Экспериментальные записи (А) и вольт-амперные -характеристики (Б) токов в контроле (I): через 7 мин (2) и через 15 мин (3) от начала аппликации С02 -содержащего раствора. Значе ние ПП - 5С мВ.

гс

на

ей

иВ

х, ta1*

Показано также, что в условиях щелочных рН1 определенную роль в регуляции потенциалос-ависимого Са2+-тока может играть внутриклеточный уровень цГМФ

вывода

1. Совместно с сотрудниками лаб. "химии пептидов" ИБХ АН СССР из фракций мозга гибсрнирующих животных выделенч пептиды - регуляторы транспорта ионов Са2+ через потенцкалозависише каналы. В ИБХ АН СССР установлена их первичная структура. Нами оценено действие синтетических аналогов выделенных пептидов на Пептид со структурой Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg (неокиоторфин) активирует ток с К,п 5*10~7М; пептида Ala-leu-Trp и Asp-Туг блокируют 1Са.с Кш =■-• ÍÚ .Значения Кш природных и синтезированных аналогов практически совпадают. Синтетические аналоги выделенных, пептидов оказались полифункционалыш.. Неокиоторфин шзываот дозазависшое увеличено внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в кардиоцитах, блокирует 1а компоненту калиевого тока,участвующую в регуляции частоты пейс-мекерной активности нейронов моллюске, увеличивает вероятность пребывания АШ зависимого К+-канала в закрытом состоянии, илгиби-

рует катиониуи проворность мембран фэтсрецептора, участвует в регуляции дыхания,сердечной деятельности и тррмогенеза. Пепт:ц, Asp-Туг по предварителх:гым даннчм замедляет клеточный.цикл.

2.Показано, что моненсин и Ш^СЬ, сдвигающие рН в щелочную сторону, увеличивают потенциалозависимый Са2+-ток в несколько раз. При сдаете рН в кислую • сторону при "респираторном" ацидозе 1Са уменьшается более, чем вдвое.

3.Установлено, что причиной изменения 1Са при изменении внутриклеточного рН может быть сГМ^зависимая регуляция этого тока, более с-аметная при сдвиге внутриклеточного рН в щелочную сторону. При рН близких к нейтральным такой рефляции на выявлено.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Сухова Г.С., Левашова В.Г., Крамарова Л.И., Свиряев В.П., Зиганшин Р.Х., Колаева С.Г., Михалева И.И., Повзун А.А. Кардиотропнря активность пегтидшх препаратов из тканей гибернирувдих сусликов. ДАН СССР- 1989, т.307, с .15121514.

2. Накипова О.В., Лазарев А.В., Хшуташвили Т.Ш., Крупенин В.А-., Фрейда А.А., Пови/н А.А. Регуляция инсулшсм двух кинетически различных типов кальциегого тока. Физиологический журнал СССР, 1989, т.75, с.804-^11.

3.'Накипопа О.В., Кокс о ЮЛ/.., Повзун А.Л. .Лазарев А.З. Влияние внутриклеточного рК на потенциалозависимый кальциевый ток миокарда лягушки. Биологические мембраны, 1989, т.6, с.126^-1295.

4. Vaskovsky B.V., Ivanov V.T., Mlkhaleva I.I., Sviryaev V.I., Koiaeva S.G., Коков Yu.M., Povzun A.A., Ziganshln E.H., Sukhova G.S., Ignatiev L.A. Neokyotorphin from the brain of hibernating ground squirrels can participate in heart activation and arousal from hibernation. Peptides. Proceeding of the elevent American peptide slinposlum. 19rV, p.302-305.

5. Mlkhaleva I.I., Svlryaev V.I., Vaskovsky B.V., 1v.jiov V.■!'.■, Kokoz Yu.K., Povzuu A.A., Kolaeva S.G. Nuokyotorphin from the brain of hibernating ground squirrels and its specific biological activity. . Journal of celiul.or bioch»-raictry. 1990, supplement 14 C, p.244, CK 3:1.

6. Svlryaev V.I., Vaskovsky B.V., Ziganshln R.H., Ivar.or V.T:, MlKhalova I.I., Koxlz Yu.M., iovzun А.л., Svkhcva G.S. Weo'cyotorphin from the brain of ft-lberiatlng ¿round

squirrels' can participate in heart activation and arousal from hibernation. Abstract ol XXIth European peptide Simposium, fapain, 1950, p.229.

7. Mlkhaleva I.I., Sviryaev V.l., Vaskovsky B.V., Ziganshin R.H., Ivanov V.T., Kokoz Yu.M., Povaun A.A., Sukhova G.S., Kolaeva S.G.Ignaoiev D.A. Isolation, identification and cpeciiic biological activity of the peDtides from the train of hibernating ground squirrels Abstract of 7thsimposi-um of chemistry of peptides and proteins. Dllizhan, 1989, p.10.

8. Sviryaev V.l., Vaskovsky B.V., Ziganshin R.H., Mlkhaleva I.I., Ivanov V.T., Kokoz Yu.M., Povzun A.A., Alekseev A.E. .Sukhova G.S. Peptides from hibernating ground squirrels fnd their physiological activity. Peptides. Proceeding of the tventy-first European peptide slmposlum. 199", p.751-752.