Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кардиотропные эффекты низкомолекулярных пептидных фракций и ряда веществ, выделенных из тканей зимоспящих животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Кардиотропные эффекты низкомолекулярных пептидных фракций и ряда веществ, выделенных из тканей зимоспящих животных"

■>

С* МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М. В. Ломоносова. Биологический факультет

На правах рукописи

Негуляев Олег Викторович

КАРДИОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДНЫХ ФРАКЦИЙ И РЯДА ВЕЩЕСТВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ТКАНЕЙ ЗИМОСПЯЩИХ ЖИВОТНЫХ.

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1996.

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (заведующий кафедрой академик РАМН И.П.Ашмарин).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Г.С. Сухова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.М. Ковальзон

кандидат биологических наук Т. Г. Емельянова

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН г. Пущино

Защита диссертации состоится "23" декабря 1996 года в 15 час. 30 мин. на заседании Специализированного Совета Д.053.05.35. биологического факультета Московского Государственного Университета им. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "22" ноября 1996 года

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. При вхождении в состояние гибернации, во время спячки и при пробуждении в организме зимоспящего животного отмечаются существенные адаптационные перестройки биохимических и физиологических процессов. Эти естественные перестройки находятся под жестким контролем со стороны самого организма. Очевидно, что для индукции и регуляции этих процессов используется ряд эндогенных биологически активных веществ. Список известных на сегодняшний день таких веществ, вовлеченных в регуляцию зимней спячки, невелик, к тому же их физиологические проявления не отражают в полной мере феноменологию всех изменений, происходящих в организме гибернанта, что указывает на необходимость вести поиск новых эндогенных веществ -регуляторов гипобиоза.

В последнее время было показано, что фракции экстрактов тканей гибер-нирующих и адаптированных к холоду животных обладают гипометаболиче-скими, гипотермическими, ингибиторными кардиотропными эффектами, подавляют активность дыхательного центра, оказывают сомногенное действие к на зимоспящих животных и на животных, не способных впадать в оцепенение. Была выдвинута гипотеза о наличии в тканях зимоспящих животных биологически активных веществ- "триггеров" гибернации. Однако попытки выделения таких "триггеров" пока не увенчались успехом. Поиск и идентификация этих веществ остается актуальной задачей и представляет несомненный огромный научный и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Выявить гуморальные факторы регуляции, определяющие физиологическую специфику повышенной устойчивости сердец гибернирующих животных к вредящим факторам.

В работе ставились задачи:

1. Определить кардиотропную активность низкомолекулярных пептидных фракций экстрактов тканей гибернирующих и холодоадаптированных животных и сопоставить ее с активностью фракций экстрактов тканей летне-активных животных.

2. Выявить отдельные вещества, или комплексы веществ, определяющие активность фракций при действии на сердце лягушки.

3. Изучить действие некоторых выделенных из фракций нейропептидов на сердечно-сосудистую систему животных.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено поэтапное тестирование кардиотропной активности фракций экстрактов тканей зимоспящих животных в ходе их последовательного разделения. В результате работы было показано, что кардиотропная активность экстрактов тканей зимоспящих животных определяется кооперативным действием ряда

пептидов и нуклеотидов. Количественный и, возможно, качественный состав которых изменяется в зависимости от сезона. В настоящем исследовании показана способность пептидов (в частности неокиоторфина) модулировать эффекты входящих во фракции нуклеотидов. Работа открывает перспективу для изучения роли адениновых нуклеотидов как возможных регуляторов ги-побиоза.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Втором Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва 1995г.);'Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Воробьевы горы-94" и "Воробьёвы горы-95" (Москва, 1994, 1995 гг.); Международном симпозиуме "Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма" (Санкт-Петербург1, 1996 г.); на заседании кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ, 1996.

Структура работы. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Иллюстрирована таблицами и рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использованы фракции из уксуснокислых экстрактов мозга и сердца гибернирующих сусликов ( Citellus undulatus ) с молекулярной массой (М) меньше 1кДа и М 1-10 кДа, мозга адаптированных к холоду якутской лошади и бурого медведя с М 1-10 кДа, а также аналогичные по молекулярным массам фракции экстрактов тканей вышеперечисленных животных в летне-активный период. Фракции получены в лаборатории химии пептидов ИБХ РАН им. Шемякина М.М и Овчинникова Ю.А. по методике Amorese et al. (1981) с некоторыми модификациями. Фракции экстрактов мозга гибернирую-щего и активного суслика были подвергнуты дальнейшему разделению методами гель-фильтрации на колонке с сорбентом Toyopearl HW-40 и высокоэффективной хроматографии в обращенной фазе на колонках Nucleosil 7/С18 (4'250 мм) и Nucleosil 7/С18 (10250 мм) с использованием "System Gold" (Becman).

Аминокислотный анализ проводили с использованием аминокислотного анализатора D-500 (Durrum, США).

Спектры 1Н-ЯМР (500 Мгц) снимали на спектрометре WM500. Молекулярную массу веществ определяли с помощью FAB-масс-спектрометрии на приборе Kratos MS 50 TS.

Кроме компонентов фракций в экспериментах нами были использованы аденозин и 5'-АМФ фирмы Reanal ( Венгрия ), а также 5'-АМФ, 5'-АДФ и 5'-АТФ фирмы Sigma ( США).

1. Тестирование фракций из тканей гибернируюших и холодоадапти-ррванных животных.

Поскольку ингибиторные эффекты фракций на сердца теплокровных и холоднокровных животных были сопоставимы (Сухова Г.С. и др., 1992), тестирование фракций и их составляющих в настоящей работе проводили на препарате изолированное сердце лягушки (Rana temporaria L.) в условиях круговой перфузии.

В качестве перфузионного раствора использовали раствор Рингера для холоднокровных ( NaCI-111 мМ, KCl- 2.0 мМ, CaCI2-1.2 мМ, NaHC03- 2.0мМ).

В опытах регистрировались механограмма сокращений изолированного сердца и кардиограмма. Регистрацию механограммы проводили с помощью индукционного механо-электрического преобразователя. Для регистрации кардиограммы сердца использовали фитильковые электроды, сигнал подавался на усилитель УБП-2. Запись механограммы и кардиограммы производили на самописце Н3031-4. Опыты проводили в осенне-зимний период.

В отдельной серии экспериментов проводили регистрацию потенциалов действия различных отделов изолированного сердца лягушки. Для этого применяли стандартную микроэлектродную технику и микроэлектроды "плавающего" типа. Сигнал, регистрируемый микроэлектродом, подавался на вход выносного блока предварительного усилителя, согласующего высокое сопротивление датчика с относительно низким сопротивлением усилителя. Усиленный сигнал поступал на вход осциллографа С1-18. С его экрана с помощью фоторегистратора ФОР-2 вели запись потенциалов действия на фотопленку .

Входной каскад усилителя постоянного тока (Сухова Г.С. и др., 1977) собран по схеме истокового повторителя на полевом транзисторе КП 303Е. Ток затвора ( ток входной цепи) не превышал 310'12 А. Для возможности применения микроэлектродов с широким диапазоном сопротивлений усилитель имел поддиапазоны коррекции с взаимным перекрытием и разными пределами R„3min- RM3max, при которых частотная характеристика не превышала допустимую неравномерность. Поддиапазоны коррекции проградуированы в величинах сопротивления микроэлектродов в мегаомах (0-15, 15-40, 40-70, 70-150 мОм). Искажение переднего фронта потенциала действия сердца -менее 1 %.

Сопротивление микроэлектродов в опытах было в пределах 50-90 мОм.

2.0. Исследование влияния иммунизации к неокиоторсЬину и кио-тооФйну на изменение гемодинамики крыс.

Серию экспериментов, по возможному инверсному влиянию пептидов, входящих во фракции, на сердечно-сосудистую систему животного in vivo проводили на белых беспородных крысах-самцах. Для этого животные были иммунизированы конъюгатами неокиоторфина и киоторфина с бычьим сывороточным альбумином.

2.1. Методика получения конъюгата киоторфина и неокиоторфина с бычьим сывороточным альбумином (БСА).

Конъюгирование киоторфина и неокиоторфина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) проводили через глутаровый .альдегид в фосфатно-буферном растворе (0.1' М, рН=7.9), при,.молярном соотношении носитель: пептид-1 :100. Концентрация глутарового^альдегида составляла 2%.

Реакционную смесь постоянно перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 4-х часов при комнатной.температуре, затем выдерживали в теченйе 20-ти часов при 4° С в холодильнике. Конъюгаты очищали с помощью диализа вначале против дистиллированной воды (3-4 смены), затем против 0.15 М NaCI (не менее 3-х раз). Диализ проводили при температуре 4°С.

Аналогичным образом готовили контрольный раствор БСА. После окончания диализа в растворах конъюгата и БСА определяли содержание белка по Лоури. Степень связывания киоторфина с БСА оценивали с помощью хроматографического анализа кислотных гидролизатов конъюгата и носителя, обработанного 2% глутаровым альдегидом, по изменению аминокислотного'состава.

Конъюгат по вышеприведенной методике был приготовлен в Институте общей патологии и патофизиологии РАН М.Ф. Обуховой.

2.2. Иммунизация животных.

Цикл иммунизации состоял из четырех введений конъюгатов. Каждое введение включало 4-ре инъекции подкожно в спину животного. Интервалы между первыми тремя введениями были равны и составляли 20 дней: Интервал между третьим и четвертым введением был 57 дней,. Первичную иммунизацию проводили с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ, Sigmar США). Доза вводимого коньюгата была 600 мкг белка/кг веса животного.? 'Три последующие иммунизации проводили с неполным адъювантом Фрейнда, коньюгат вводили в дозе 300 мкг белка/кг веса. Перед введением препарата коньюгат смешивала с'адъювантом Фрейнда в объемной пропорции 1:1 и тщательно перемешивали до состояния устойчивой эмульсии.

В качестве контрольных в этой серии экспериментов использовали две группы крыс. Животным одной из них в те же сроки аналогичным образом

вводили белок-носитель, обработанный связывающим агентом, с адъювантом (группа БСА), другой- только физиологический раствор (группа "контроль").

2.3. Иммуноферментный анализ сывороток крови крыс.

Уровень антител к киоторфину и неокиоторфину в антисыворотках, полученных после проведенного цикла иммунизации крыс конъюгатами пептидов с БСА, определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа на микропланшетах Linbro'Tiferfec" Flow Laboratories, Inc. В качестве антигена использовали растворы конъюгатов пептидов с гемоциани-ном, синтезированных через 1-этил-З (3-диметиламинопропил) карбодиимид солянокислый. Стандартные растворы конъюгатов были приготовлены на 0.1М фосфатном буфере с рН=7.0 (концентрация 100 мг/мл).

В лунки планшет вносили по 100 мкл стандартного раствора и инкубировали в течение 18-20 час. при 4° С. Раствор антигена удаляли и планшеты отмывали вначале 2-3 раза дистиллированной водой с последующей 3-кратной обработкой 300 мкл отмывочного буфера (NaCI - 8г, КН2ОРО4 -0.2г; Na2HP04'12H20 - 2.9 г; KCI - 2 г; твин 20 -0.5 г; дистиллированная вода -до 1л; рН = 7.4).

Для снятия неспецифической сорбции в ячейки планшет вносили по 100 мкл 1% раствора БСА на отмывочном буфере и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Раствор БСА удаляли и отмывали не менее 3-х раз отмывоч-ным буфером. Исследуемые сыворотки в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. вносили в лунки планшет по 100 мкл и инкубировали в течение 18-20 часов при 4сС. Растворы сывороток удаляли и вновь отмывали буфером, как указано выше. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело добавляли видовой конъюгат вторичных антител, меченых пероксидазой хрена, в рабочем разведении 1:1000, в объеме 100 мкл с последующей инкубацией в течение 1 часа при 37°С и отмывкой, как указано выше. Субстратом для ферментативной реакции служила смесь орто-фенилендиамина с перекисью водорода в фосфатном буфере 0.1 М с рН=6.0 (30 мг препарата растворяли в 20 мл буфера с добавлением 60 мкл 33% пергидроля). Изменение окраски хро-могенного субстрата, характеризующего пероксидазную активность, определяли с помощью автоматического микрофотометра (Multisean) при длине волны 492 нм. Степень связывания молекул КТ с БСА и НКГ с БСА: К = 8-12 молекул пептида на 1 молекулу БСА.

Для определения содержания антител в сыворотке крови крыс кровь брали непосредственно после окончания эксперимента через катетер, введенный в брюшную аорту. Кровь инкубировали 2 часа при комнатной температуре и центрифугировали при 5 тыс. об/мин в течение 15 минут. До проведения ИФА сыворотки хранили при -20°С.

' 2.4. Исследование системной гемодинамики и ее регуляиии v иммунизированных бодрствующих крыс.

Для непрерывной регистрации артериального давления (АД), частоты сердечных сокращений (ЧСС) и введения препаратов крысам имплантировали артериальные и венозные катетеры.

Перед операцией животных анестезировали гексеналом ("Farmsinteze", Латвия) (130 мг/кг внутрибрюшинно). Артериальный катетер, служащий для регистрации АД и ЧСС, вводился в брюшную аорту через левую бедренную артерию. Венозный катетер, служащий для введения препаратов, вводился в яремную вену. Свободные концы катетеров выводились наружу в межлопаточной области. Эксперименты начинали не ранее чем через 24 часа после операции.

Находящийся в брюшной аорте катетер через полиэтиленовый переходник подсоединяли к датчику давления ("Statham", Р23АА, США). С датчика давления, сигнал поступал на усилитель, а затем на самописец Н 3030-1 • Для предотвращения тромбообразования в течение всего времени регистрации проводили промывку 'артериального катетера гепаринизированным (10 ЕД/мл) физиологическим раствором при помощи инфузора "ВЭДА-2" (Россия) со скоростью 0.2 мл/час. В начале каждого эксперимента осуществляли калибровку давления с помощью калибровочной системы, присоединенной ко второму входу датчика давления.

АМФ вводился через венозный катетер и соединенный с ним переходник, предварительно заполненный раствором АМФ, в объеме равном ЮОмкл. Введение осуществлялось болюсно в течении 10 секунд.

В качестве контрольного раствора вместо АМФ при тех же условиях, в том же объеме отдельной группе крыс вводился 0.9% NaCI.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрических методов анализа данных: парного критерия Вилкоксона (Т) и Манна- Уитни-Вилкоксона (U) из пакета статистических программ Solo.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В результате экспериментов было показано, что фракции с М 1-10 «Да и М меньше 1кДа из уксуснокислых экстрактов мозга и сердца гибернирующих сусликов, с М 1-10 кДа из уксуснокислых экстрактов мозга адаптированных к холоду якутской лошади и бурого медведя обладают выраженным ингибитор-HbiM эффектом - снижают частоту и силу сердечных сокращений изолированного сердца лягушки. Наибольшими ингибиторными эффектами обладали фракции из экстрактов мозга суслика и якутской лошади. В концентрации 0,1 мг/мл они вызывали остановку сердца.

Фракция с М 1-10 кДа из экстракта мозга летне-активного суслика обладала достоверно меньшим ингибиторным эффектом, а фракции с М 1-10

кДа из экстрактов мозга якутской лошади в летний сезон и сердца летне-активного суслика активировали работу изолированного сердца лягушки (рис.1).

Рис.1. Сравнение эффектов исходных фракций с М 1-10 кДа из экстрактов мозга животных в зимний и летний сезоны на механическую активность изолированного сердца лягушки.

По оси ординат - изменение параметров относительно их исходного уровня в Д%.

Концентрация фракций из экстрактов мозга сусликов -0,1 мг/мл; концентрация фракций из экстрактов мозга якутских лошадей- 0,3 мг/мл; *- достоверность отличия р<0,001

С целью определения кардиотропных компонентов фракций, дальнейшему разделению были подвергнуты исходные фракции из экстракта мозга гибернирующего суслика, как обладающие наибольшими ингибиторными эффектами. Разделению была подвергнута и фракция из экстракта мозга летне-активного суслика с М 1-10 кДа.

Разделение этих исходных фракций выявило наличие большого количества кардиоактивных компонентов, как однонаправленного с исходными фракциями действия на активность изолированного сердца лягушки, так и противоположного.

Анализируя полученные нами результаты, а также результаты хромато-графических разделений, мы пришли к выводу, что ингибиторные эффекты всех исходных фракций складываются из суммы эффектов множества кардиоактивных веществ, входящих в их состав. Эти вещества, видимо, способ-

ны изменять, дополнять и модулировать эффекты друг- друга. Другими словами, имеет место "кооперативный" эффект веществ, входящих во фракции. Поэтому по мере разделения не происходило усиления кардиотропного эффекта составляющих, по сравнению с эффектами исходных фракций.

Помимо субфракций, ингибирующих или активирующих изолированное сердце, была отмечена тонкая субфракция, полученная в результате разделения активной фракции из экстракта мозга гибернирующего суслика, эффекты которой зависели от исходного ритма сердца. Мы полагаем, что в состав данной фракции могут входить вещества-регуляторы, эффекты которых проявляются в зависимости от состояния органа и, возможно, целого организма.

Возможные вещества или вещество с регуляторными свойствами может содержать и тонкая фракция из летних животных. В наших экспериментах было показано, что направленность ее эффектов зависит от концентрации. В более высоких концентрациях она ингибировала работу изолированного сердца, а при снижении концентрации на порядок - активировала.

К сожалению, структуры всех кардиоактивных веществ, входящих в состав этих фракций, пока не определены, что затрудняет анализ их физиологических проявлений.

Сравнивая эффекты субфракций с одинаковыми молекулярными массами, полученными в результате гель-фильтрации исходных фракций (М 1-. ЮкДа) из мозга зимоспящего и летне-активного сусликов, необходимо отметить тот факт, что некоторые аналогичные по своим весовым характеристикам субфракции имеют различное действие на изолированное сердце лягушки. Как мы полагаем, вероятней всего, различие эффектов этих исходных фракций связано с составами веществ именно в этих субфракциях. При сопоставлении эффектов субфракций были отмечены также пары и с однотипным ингибиторным действием.

После гель-фильтрации фракции с М 1-10 кДа из экстракта мозга гибернирующего суслика максимальным, ингибиторным эффектом в наших экспериментах обладали субфракции с молекулярной массой входящих в них веществ- 1-2 кДа. Фракции именно этого диапазона молекулярных масс были отмечены как наиболее активные в экспериментах по исследованию влияния фракций на ионйые токи предсердных волокон лягушки (Кокоз Ю.М. и др., 1987), на стадии развития зародышей морских ежей (Крамарова Л.И. и др., 1987), и именно из этих фракций в Институте биоорганической химии был выделен ряд пептидов, способных изменять проницаемость мембран предсердных волокон лягушки и кардиоцитов крысы (гудапэЫп Я.Н. е! а!., 1996; Панкина Д.А., 1996). В этой связи нами были проведены серии экспериментов по исследованию возможного воздействия некоторых пептидов, входя-

щих в состав суммарных фракций, на механическую и электрическую активность изолированного сердца лягушки.

ПЕПТИДЫ эффекты (Д%)

концентрация 1_д [мг/мл

шифр вид структура ■А -5 -6 -7 -8 -10 -14

ВЭ . суслик ОУ -7,9*2,4 ЯТ 0 0 0 0 - -

В1.-2 суслик УЕ 0 0 0 0 0 0 0

ЫКТ суслик ТБКУЯ 0 0 0 0 0 0 0

ВЬЗ суслик У(Ж -9,7± 4,9 ЯТ -25,9±17,8 ТР 0 0 0 0 ^ 0 0

яг-з суслик ЕУйН 0 0 0 - - -

суслик ТБКУ -11,4±1,6 ЯТ -18,6±9,7 ТР 0 0 0 0 0

Я2-6 суслик мсяст 0 0 0 0 - - -

Рис.2. Сводная таблица действия пептидов, выделенных из фракций экстрактов тканей гибернирующих животных, на изолированное сердце лягушки.

ВТ, ТР- интервалы кардиограммы сердца.

В таблице представлены изменения длин интервалов кардиограммы относительно исходных величин, выраженные в Д%; "О"- нет

эффекта, -тестирование не проводили.

На рисунке 2 представлена сводная таблица результатов тестирования выделенных пептидов. Как видно из представленных в таблице результатов, некоторые пептиды, входящие в состав фракций из тканей гибернирующих животных, могут оказывать прямое влияние на изолированное сердце лягушки, а именно изменять его электрическую активность. Однако, действие пептидов проявлялось в достаточно высоких концентрациях (10"4 моль/л). Часть пептидов вообще не вызывала никаких достоверных измене-

ний регистрируемых в нашем эксперименте показателей изолированного сердца. Таким образом, ни один из протестированных пептидов не обладал действием, подобным действию исходных фракций. Однако, в проведенных в Институте экспериментальной и теоретической биофизики РАН исследованиях (Зиганшин Р.Х., 1994; Панкина Д.А., 1996) было показано, что пептиды, которые в наших экспериментах были неактивны в отношении изолированного сердца, могут изменять ионные токи предсердных волокон лягушки и изолированных кардиомиоцитов крыс. Мы полагаем, что регистрируемая нами "неактивность" пептидов может быть связана с компенсаторными механизмами, происходящими в сердце на органном уровне. Можно также допустить, что активность этих пептидов может проявиться при определенных условиях, например, при изменении нормальной работы сердца. Не исключается участие этих пептидов и в регуляции других систем организма в норме и в экстремальных условиях. В связи с этим нам представилось интересным, изменив биохимический и физиологический статус организма крыс путем активной аутоиммунизации к пептидам, входящим в состав фракций, -неокиоторфину и его возможному метаболиту киоторфину, выявить возможные изменения сердечно-сосудистой системы у иммунизированных животных и сопоставить ответы сердечно-сосудистой системы иммунизированных и контрольных крыс на снижение артериального давления и частоты сердцебиений под действием агониста А1 пуринорецепторов 5'-аденозинмонофосфата (АМФ).

Г "

Как показал иммуноферментный анализ в сыворотках крови иммунизированных крыс были обнаружены специфические антитела. Титр антител к неокиоторфину в сыворотках животных группы НКГ составил 1/3200. Титр антител к киоторфину у группы КТ..был - 1/6400. В контрольных группах животных титр антител был достоверно ниже.

Измерение у иммунизированных животных, артериального давления (АД) и массы тела не выявило достоверных отличий в опытных и контрольных группах животных, хотя, необходимо отметить тенденцию к повышению давления у крыс групп БСА, НКТ и КТ, вероятно связанное с последствиями собственно иммунизации. Измерение частоты сердечных сокращений (ЧСС) выявило достоверное ее увеличение (р< 0,05) у крыс, иммунизированных к НКТ, относительно таковой у крыс БСА.

При введении в яремную вену АМФ у всех исследуемых групп крыс наблюдали снижение ЧСС и АД с последующим их восстановлением. При этом максимальное снижение ЧСС относительно исходного уровня у группы НКТ составило 70,8%, что достоверно ( р<0.05) выше, чем таковое у группы КТ (53%). Достоверных отличий в максимальном падении АД в контрольных и опытных группах отмечено не было.

1

0) 5 X о X <0

2 о

о -10 -20 + -30 -40 + -50 -60

■ ■ Л-*

время, мин.

—а—НКТ, п=9 —БСА, п=8 —КГ, П=7 - * - контроль, п=7

-20 --

20 т Ю < 0

8" -10

1 -30 + I -40-® -50--§ -60 -70 + -80

АМФ

и

20

-а*

Б.

* *** * * * *

* А.» *

40 60 80 100

время, мин.

—а— НКГ,п=9 —»—БСА, п=8 —*—КТ, п=7 • * ■ контроль, п=7

Рио.З. Динамика изменений артериального давления (АД) (А) и частоты сердечных сокращений (ЧСС)(Б) у иммунизированных крыс при внутривенном введении им 100 мкл АМФ из расчета 14 мг/кг массы животного. По оси абсцисс время в минутах;

по оси ординат изменение параметра относительно исходного уровня (Д%);

момент введения АМФ отмечен стрелкой; *

- достоверность отличия р< 0.05(11);

**

- достоверность отличия р< 0.005(и).

В ходе сопоставления динамики восстановления АД было показано достоверно более медленное его восстановление у крыс группы НКТ и досто верно более быстрое у крыс, иммунизированных к КТ по сравнению с контрольной группой БСА (рис. 3 А). При этом, достоверных отличий в динамике изменений АД у крыс контрольных групп не отмечалось.

На рисунке 3 Б представлена динамика изменений частоты сердечных сокращений относительно исходных значений (Д%). После падения ЧСС, вызванной введением АМФ, у всех групп крыс наблюдалось резкое ее увеличение компенсаторного характера с последующим снижением ритма до нормального уровня. Восстановление исходного ритма у всех опытных и контрольных групп наблюдалось к 20 -25 минуте после введения АМФ. Достоверных отличий в изменениях ЧСС в этом временном промежутке между опытными и контрольными группами выявлено не было. С 30 по 90 минуту после введения АМФ у крыс, иммунизированных конъюгатами НКТ-БСА и КТ-БСА отмечалось увеличение ЧСС относительно исходного уровня (рис.ЗБ). При этом относительные изменения ЧСС у крыс группы НКТ-БСА с 35 по 65 минуту были достоверно отличны от относительных изменений ЧСС у контрольной группы БСА.

Таким образом, иммунизация крыс к неокиоторфину и киоторфину приводит к изменениям физиологических параметров реакции .сердечно- сосудистой системы, что предполагает участие этих пептидов в регуляции сердечнососудистой системы крыс в норме и некоторых экстремальных для организма условиях.

В наших экспериментах было показано, что в состав исходных фракций помимо веществ пептидной природы входят и непептидные компоненты.

В результате наработки и анализа пика вещества, полученного в результате последовательных разделений исходной фракции с М меньше 1 кДа и обладающего сильным ингибиторным эффектом на изолированное сердце лягушки, методом ЯМР была показана его идентичность АМФ (аденозин 5'-монофосфату), при этом количество посторонних примесей соответствовало величине менее 1%. В состав субфракции, активирующей сердце, как было установлено, входили два других адениновых нуклеотида АДФ и АТФ. Впоследствии, методом ионообменной ВЭЖХ, было показано, что вышеназванные нуклеотиды (АМФ, АДФ и АТФ) входят в состав не только фракции с М меньше 1кДа, но и во фракции с М 1-10кДа из экстрактов мозга гибернирующего и летне-активного сусликов. Тестирование этих фракций на препарате изолированного сердца лягушки показало, что фрак-

ции с большим содержанием АМФ обладали ингибиторным действием, а с большим содержанием АДФ - активаторным.

Предварительное сравнение количеств вышеназванных адениновых нуклеотидов в исследуемых нами исходных фракциях экстрактов мозга ги-бернирующего и летне-активного животных выявило некоторые различия. Было показано, что содержание АМФ3>АМФл; АДФ3<АДФЛ; АТФ3>АТФл, где литера "л"-содержание у летне-активных животных, а "з"- в зимний сезон.

Известно, что адениновые нуклеотиды являются агонистами пуриновых рецепторов и обладают кардиотропным действием. Чтобы оценить вклад каждого из нуклеотидов в суммарный эффект фракций, нами была предпринята попытка, оценив предварительно действие каждого из них на изолированное сердце лягушки, сопоставить его с эффектами соответствующих пептидных фракций.

Тестирование АДФ и АТФ (Sigma) на препарате изолированного сердца лягушки показало, что АДФ обладает активаторным эффектом и в дипазоне концентраций бЮ^-бЮ"2 мг/мл увеличивает силу и частоту сердечных сокращений. АТФ в наших условиях в диапазоне концентраций 510'5-10'2 мг/мл вызывал положительный инотропный и отрицательный хронотропный эффект, а в концентрации 5' 10'2 мг/мл снижал и частоту и силу сердечных сокращений (рис.4). При сопоставлении эффектов АДФ и АТФ с эффектами фракции Sxsn5 с М меньше 2 кДа из мозга летне-активного суслика, обладающей активаторным действием на сердце, было показано, что фракция обладает подобным с АДФ ино- и хронотропным эффектом. Однако действующая пороговая концентрация для фракции была на три порядка ниже. Таким образом, акгиваторный эффект фракции обусловлен в какой-то степени эффектами, входящих в нее АДФ и АТФ, но их действие не определяет полностью эффект данной фракции.

Тестирование на препарате изолированного сердца лягушки выделенного из фракции АМФ показало, что АМФ (выд.) в диапазоне концентра-ций10"7-1,6'10"5 М вызывал снижение частоты и силы сокращений изолированного сердца лягушки, а в концентрации 1,6"10'® М - остановку сердца (рис.5).

Сопоставляя эффекты выделенного АМФ с эффектами АМФ коммерческого (Reanal) и аденозина (Reanal) на изолированное сердце лягушки, в наших экспериментах было показано, что эффекты АМФ (выд.) сравнимы с эффектами (АМФ (ком.)) и аденозина. При этом действие АМФ (ком.) и аденозина в исследуемом диапазоне концентраций достоверно не отличалось (р>0.05). Они обладали ингобиторными эффектами, не вызывая остановки сердца в высоких концентрациях. В отличие от них АМФ(выд.) в концентрации 1,6'10"s М в 100% случаев вызывал остановку сердца лягушки (рис.5).

в) 5 X й> X в)

£

2 Ч

в> о х

л Ц

р 5

X

5

8

6 -4 --

2 О -2 -4

ШАДФ

Овхэпв

□АТФ

*

-+-

0,000005 0,00005 0,00 ).5 *

концентрация, Йг/мл *

Рис.4. Сравнение эффектов 5'-АДФ, 5-АТФ и фракции Бхвпб из экстракта мозга летне-активного суслика на изолированное сердце лягушки.

* -достоверность отличия р< 0.001

А.

О -£

X

О) X 0) г

п 5

о -20 -40 -60 -80 -100 -120

0 $

1 «

г

п 5

5 га з-

0 -20 -40 --60 --80 -100 + -120

* « » ^^^^ . \

—•— АМФ(выд) * АМФ(ком) ■ *■ аденозин

-1-1-1-1-1-- 1- 7,5 -7 -6,5 -6 -5,5 -5 -4,5 ид[С] Б.

—АМФ(выд) —»—АМФ(ком) ■ аденозин 1 ....... и . 1 ........ 1 * .1........

-7,5

-7

-6,5

-6 -5,5 ьд[С]

-4,5

5

Рис.5. Зависимость изменений амплитуды (А) и частоты сердечных сокращений (Б) изолированного сердца лягушки от концентрации пуринов в перфузате.

АМФ (выд.) - препарат АМФ, выделенный из мозга гибернирующего суслика; АМФ (ком.)-препарат АМФ фирмы Реапа!; аденозин- коммерческий препарат аденозина (Реапа!).

По осям ординат изменения амплитуды (А) и частоты (Б) сердечных сокращений относительно исходного уровня, выраженные в Д%.

По осям абсцисс - десятичный логарифм молярной концентрации веществ.

Каждая точка представляет медиану не менее 6 опытов. В диапазоне концентраций 10"7 -10"5 М в 100% случаев АМФ, выделенный из мозга гибернирующего суслика, вызывал остановку сердца. Коммерческие препараты во всем исследуемом диапазоне концентраций не вызывали прекращения сердцебиений.

Таким образом, ингибиторное действие на изолированное сердце лягушки выделенного АМФ в концентрации 1,610"5 М достоверно сильнее действия АМФ (ком.) и аденозина. Анализ АМФ (выд.) методом FAB-масс-спектроскопии выявил наличие трех молекулярных ионов с массами 204, 304 и 348 (соответствует АМФ). Аминокислотный анализ фракции АМФ (выд.) показал присутствие следовых количеств (однако превышающих уровень фона)следующих аминокислот: Asx, Glx, Gly и Val. Мы полагаем, что различие в силе эффектов вышеназванных веществ связано с этим обстоятельством, а именно с модуляторным действием этих аминокислот или пептидов, состоящих из них, на эффекты АМФ. Однако это предположение требует тщательной экспериментальной проверки.

В следующей серии экспериментов мы сопоставили ингибиторный эффект выделенного АМФ с ингибиторным эффектом исходной фракции Fg2 (М 1-10 кДа) из экстракта мозга гибернирующего суслика. На рисунке 6 представлены кривые доза-эффект для АМФ (выд.), фракции Fg2 и АМФ(ком.). Все три кривые в диапазоне концентраций 10"* -510"2 мг/мл достоверно не отличаются. В более высоких концентрациях ино- и хронотроп-ные эффекты АМФ (выд.) и фракции сильнее ингибиторного эффекта АМФ (ком.). Как было описано выше, введение в перфузат в определенных концентрациях АМФ (выд.) и Fg2 вызывает остановку сердца. Однако, АМФ (выд.) останавливает сердце лягушки в концентраций на порядок ниже, чем фракция. Надо отметить, что процентное содержание АМФ во фракции составляет приблизительно 0.01-0.001%. Таким образом, ингибиторный эффект фракции не может быть объяснен только действием АМФ. Хотя роль АМФ в суммарном эффекте фракций очевидна. Возможно, во фракциях есть помимо АМФ вещества, способные ингибировать работу сердца. Сопоставляя эффекты АМФ (выд.) с АМФ (ком.), мы предполагаем наличие во фракциях и веществ-модуляторов, скорее всего пептидной природы, способных усиливать или ослаблять эффекты некоторых кардиоактивных веществ.

Возможность такой модуляции была показана в наших экспериментах по исследованию действия АМФ на изолированное сердце лягушки при его совместном введении с HKT.

После хроматографического разделения фракции, обладающей сильным ингибиторным действием, было отмечено, что в ее составе при незначительном содержании АМФ присутствует пентапептид НКГ в количестве, на порядок превышающем количество нуклеотида. Это послужило предпосылкой для исследования возможного модуляторного воздействия неокиоторфина на эффекты АМФ.

Рис.6. Сравнение ингибиторных эффектов 5'-АМФ коммерческого (АМФ(ком.)), АМФ, выделенного из мозга гибернирующего суслика (АМФ(выд.)), и исходной фракции с М..1-10 кДа из мозга гибернирующего суслика (Фракция) на изолированное сердце лягушки.

А- изменение амплитуды (Д%);

Б- изменение частоты сердечных сокращений (Д%);

*- достоверность отличия р<0,01

Как было показано, НКТ в диапазоне концентраций Ю^-Ю"4 М не вызывал достоверных изменений механической и электрической активности изолированного сердца лягушки (рис. 2).

Исследование совместного действия АМФ ( Яеапа!) и НКТ на изолированное сердце лягушки показало, что НЮ" в концентрации 10"5 М усиливает ингибиторный кардиотропный эффект АМФ. Что достоверно показано для концентраций АМФ 10"®, 10"*, 510"5 М (р<0.05 II) (рис. 7). В концентрации 10"7 М достоверных отличий в действии АМФ и смеси АМФ+ НКТ выявлено не было.

Таким образом в наших экспериментах показано, что во фракции входят вещества как прямого действия на сердце, так и модуляторы их эффектов. Не исключена вероятность нахождения во фракциях и других пептидов-модуляторов.

Еще одним свидетельством того, что ингибиторное действие фракций не сводится только к эффектам АМФ являются и наши электрофизиологические эксперименты по сравнению действия АМФ и активной фракции Яд2 (М 1-10 кДа) из экстракта мозга гибернирующего суслика.

Было показано, что действие АМФ и фракции на клетки венозного синуса приводило к уменьшению частоты сердечных сокращений, длительности потенциала действия и снижению скорости медленной диастолической деполяризации. Однако, в отличии от действия АМФ, действие фракции характеризовалось устойчивой гиперполяризацией (рис. 8).

При аппликации АМФ и фракции Яд2 на предсердие были зарегистрированы подобные эффекты. А именно, как при действии АМФ, так и при действии Fg2 наблюдали уменьшение частоты сердечных сокращений, падение амплитуды и длительности потенциала действия. В концентрации 0.1мг/мл АМФ, как и фракция, вызывали полную остановку предсердия (рис.8).

Эффект фракции Рд2 на клетки желудочка, как и на клетки предсердия, выражался в ускорении реполяризации и исчезновении плато потенциала действия. В отличии от фракции АМФ не обладал таким действием на клетки желудочка. В наших экспериментах АМФ или не изменял характеристики потенциала действия совсем, или приводил к незначительному увеличению амплитуды и длительности потенциала действия (рис.8).

Таким образом, форма ПД при аппликации АМФ и суммарной фракции на клетки предсердия достоверно не отличается. Реакция клеток пейсмекера отличалась наличием гиперполяризации при действии фракции. В клетках желудочка АМФ не вызывает ускорения реполяризации и уменьшения длительности ПД, которые возникают при аппликации фракции.

Рис.7. Сравнение ингибиторных эффектов 5'-АМФ (Реапа!) и смеси 5'-АМФ (Реапа!) и неокиоторфина ( НКТ) на изолированное сердце лягушки.

По оси абсцисс- десятичный логарифм концентрации АМФ,' выраженной в мг/мл. При совместном введении АМФ+НКТ НКТ вводился в таком количестве, чтобы его концентрация в перфузате была 10'5 моль/л. По оси ординат - изменения амплитуды (А) и частоты (Б) сердечных сокращений относительно их исходного уровня (Д%). * - достоверность отличия р<0.05 (Т).

В г д . Е К

\\ \2 \ 30 мВ \\

- 0.2 с VI J

Рис.8. Сравнение изменений биоэлектрической активности различных отделов сердца лягушки, вызванных действием АМФ (0.07 мг/мл) и суммарной фракции Рд2 с М 1-10 кДа (0.1 мг/мл), выделенной из экстракта мозга гибернирующего суслика. А - изменение ГЩ венозного синуса при действии исходной пептидной фракции Рд2; Б - изменение ПД венозного синуса при действии АМФ; Пунктирной линией на рис. А и Б отмечен уровень максимального диастолического потенциала, стрелкой - момент введения препарата в перфузат. Следует отметить развитие гиперполяризации (рис.А) после действия фракции. В - изменение ПД клеток предсердий при действии Рд2; Г - изменение ПД клеток предсердий после действия АМФ; Д - изменение ПД клеток желудочка после действия Рд2; Е - изменение ПД клеток желудочка после действия АМФ На рисунках В - Е приведено наложение исходных ГЩ (1) и ПД в момент максительного эффекга(2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Обобщая полученные результаты по тестированию фракций из экстрактов тканей зимоспящих животных, необходимо в первую очередь отметить присутствие в них огромного количества биологически активных веществ. Причем, это не только вещества пептидной природы, как считалось раннее, но и вещества непептидной природы в том числе и нуклеотиды, способные оказывать прямое действие на сердце. Наши.результаты показали, что активность исходных фракций не сводится к эффектам одного вещества, а является результатом суммации и модуляции эффектов веществ пептидной и непептидной природы. К сожалению, на сегодняшний день определены структуры не всех веществ, входящих в кардиоактивные субфракции, что затрудняет анализ их действия. Тем не менее, наши результаты стали еще одним шагом на пути к разгадке феноменальной активности фракций из тканей гибернирующих и адаптированных к холоду животных.

ВЫВОДЫ.

1. Низкомолекулярные пептидные фракции из уксуснокислых экстрактов мозга и сердца тобернирующих сусликов, мозга якутской лошади и бурого медведя ингибируют работу изолированного сердца лягушки: снижают амплитуду и частоту сердечных сокращений. При действии аналогичных по молекулярным массам фракций, из экстрактов тканей летне-активных животных ингибиторные эффекты менее выражены или активаторные.

2. В результате последовательного разделения и тестирования фракций получены активные субфракции и отдельные вещества, которые имеют как однонаправленное с исходными фракциями действие, так и противоположное. Эффекты некоторых субфракций зависят от исходного ритма изолированного сердца лягушки, эффекты других могут меняться на противоположные в зависимости от их концентрации в перфузате.

3. Выделенные из тканей зимоспящих животных вещества пептидной природы обладали меньшим действием на изолированное сердце лягушки, чем исходные фракции.

4. В пептидных фракциях есть кардиоактивные вещества непептидной природы. Это- 5'-АМФ, 5'- АДФ и 5'- АТФ. АМФ вносит вклад в величину ин-гибиторного эффекта, а АДФ и АТФ принимают участие ' в акгиваторных эффектах исходных фракций из экстрактов тканей зимоспящих животных. Ингибиторное й активаторное действие пептидных фракций на сердце лягушки не сводится к эффектам . выделенных одиночных нуклеотидов или пептидов.

5. Пентапептид неокиоторфин, выделенный из фракций, при совместном введении с АМФ усиливает ингибиторный эффект последнего.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Негуляев О.В., Сосулина Л.Ю., Сухова Г.С., Зиганшин Р.Х., Михалева И.И., Ашмарин И.П. Кардиотропное действие компонентов пептидных фракций из мозга гибернирующих сусликов // Нейрохимия, 1995, том 12, вып. 4, стр. 16-22.

2. Сухова Г.С., Негуляев О.В., Сосулина Л.Ю., Закарян A.A., Михалева И.И., Зиганшин Р.Х. Кардиотропная активность АМФ из пептидных фракций тканей гибернирующих животных. II Тез. докл. II Российского национального конгресса " Человек и лекарство ", 10-15 апреля 1995г., Москва, тезисы, стр. 152.

3. Негуляев О. В. Кардиотропная активность пептидных фракций из тканей гибернирующих и холодоадаптированных животных // Тез. докл. Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ленинские горы-94" ( тезисы в печати).

4. Закарян A.A., Негуляев О.В. Исследование возможностей коррекции устойчивости организма к алкогольной интоксикации методом иммунорегу-ляции. Тез. докл. конф. молодых физиологов и биохимиков России, Санкт-Петербург, 1995, стр. 76.

5. Негуляев О. В. Кардиотропная активность АМФ из пептидных фракций тканей гибернирующих животных II Тез. докл. Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Воробьевы горы-95" (тезисы в печати).

6. Сухова Г.С., Закарян A.A., Негуляев О.В., Обухова М.Ф., Сухов В.П., Зиганшин Р.Х., Михалева И.И. Физиологические эффекты неокиоторфина (НКТ) при прямом и инверсном действии на организм. // Тез. докл. II Российского национального конгресса "Человек и лекарство", 10-15 апреля 1995г., Москва, стр. 152.

7. Сухова Г.С., Негуляев О.В., Закарян A.A., Михалева И.И., Зиганшин Р.Х., Ухорская. Кардиотропное действие фракций ( мол. вес < 1 кДа) уксус-но-кислого экстракта и отдельных пептидов, выделенных из мозга зимоспя-щих и холодоадаптированных животных. // Тез. докл. Съезда Физиологического общества при РАН, 2-4 ноября 1993 г., Пущино, Успехи физиологических наук, т. 25, №4,1994 г., стр. 82.

8. Ашмарин И.П., Закарян A.A., Игнатьев ДА, Негуляев О.В., Обухова М.Ф., Сосулина Л.Ю., Сухов В.П., Сухова Г.С. Обратимое подавление некоторых физиологических функций в связи с проблемой гипобиоза; эффекты киоторфина и АМФ. II Международный симпозиум Теронтологические аспек-

ты пептидной регуляции функций организма", Санкт-Петербург, 25-28 ноября 1996г., стр.19.

Я искренне благодарен моему научному руководителю Галине Сергеевне Суховой за огромную поддержку и оказанную помощь в работе. Большое спасибо всем моим коллегам и друзьям, принимавшим участие в этой работе, и лично Рустаму Хусмановичу Зиганшину, Марии Федоровне Обуховой, Людмиле Юрьевне Сосулиной, Ирине Борисовне Фигури-ной.

Я признателен также за ценные советы академику РАМН Игорю Петровичу Ашмарину.

Благодарности.