Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффекты неокиоторфина как потенциального регулятора процессов гипобиоза

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эффекты неокиоторфина как потенциального регулятора процессов гипобиоза"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

на правах рукописи

Закарян Армен Арникович

ЭФФЕКТЫ НЕОКИОТОРФИНА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНОГО РЕГУЛЯТОРА ПРОЦЕССОВ ГИПОБИОЗА

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (Зав. кафедрой - академик РАМН И.П. Ашмарин).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Г.С. Сухова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.Б. Кошелев доктор биологических наук Т.Г. Емельянова

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет Росздрава.

Защита состоится 24 апреля 2006 года в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного Ученого Совета Д 501.001.93 биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 23 марта 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук

Б.А. Умарова

¿л/г 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Зимоспящие животные обладают уникальной способностью при наступлении неблагоприятных климатических условий значительно снижать метаболизм и длительное время поддерживать его на низком уровне. Механизм вхождения животного в спячку и поддержания в течение продолжительного времени функционирования организма в экстремальных условиях не выяснен. Понимание механизмов спячки позволило бы надеяться на создание адекватной модели искусственного гипобиоза, подобной естественному, и необходимой для кардиохирургии, защиты организма от неблагоприятных факторов при действии гипоксии, радиации, интоксикации, а также для криобиологии и для криоконсервирования.

Одно из основных направлений в изучении физиологии зимней спячки связано с выявлением гуморальных факторов регуляции спячки и основано на тестировании свойств биологически активных веществ, выделенных из тканей зимоспящих животных.

В ряде экспериментов было показано, что пептидные фракции экстрактов тканей гибернирующих животных, при введении их как зимоспящим, так и незимоспящим животным, вызывают у них изменения в работе различных систем организма, характерные для гибернации. Это снижение уровня метаболизма, температуры тела, снижение частоты дыхания, частоты сердечных сокращений и другие изменения (Иваницкий и др., 1982; Хомутецкая и др., 1986; Игнатьев и др., 1987).

Известно, что в составе фракций, полученных из тканей гибернирующих животных и обладающих гипометаболическим и кардиоингибирующим действием, находятся пептидные и нуклеотидные компоненты (Зиганшин и др., 1994; Негуляев и др., 1995). В настоящее время из состава низкомолекулярных фракций выделено несколько десятков пептидов. Но физиологические свойства большинства пептидов, входящих в состав активной фракции остаются малоизученными.

Следовательно, выявление и изучение физиологических эффектов пептидов, возможных претендентов на роль регуляторов зимней спячки, является актуальным.

Пептид неокиоторфин (НКТ), исследуемЪш в настоящей работе, присутствует во фракциях тканей зимоспящих животных и в некоторых случаях может проявлять активность на зимоспящих животных, например при выходе из спячки (Игнатьев и др., 1992). Также избестны некоторые его эффекты на незимоспящих животнь!й0^Ип№адед^л^Г}99О; Емельянова и др.,

I БИБЛИОТЕКА / I С.Петербурй^ <

1992; Зиганшин и др., 1994), но его физиологические свойства изучены далеко не в полной мере.

Объектами настоящего исследования стали незимоспящие животные -мыши и крысы, с целью выявления эффектов неокиоторфина общих для зимоспящих и незимоспящих животных и перспективных для создания искуственного гипобиоза. В качестве исследуемой "мишени" для изучения действия неокиоторфина были выбраны сердечно-сосудистая система и система терморегуляции. Выбор был мотивирован тем, что именно эти системы наиболее значительно изменяют свою работу у зимоспящих животных при погружении в спячку и при выходе из нее (Lyman С.Р., 1958; Johanson, 1967; Жегунов, 1986,1988; Эмирбеков и др., 1991).

Цели и задачи исследования

Целью данного исследования стало решение вопросов:

Обладает ли пептид неокиоторфин физиологическими свойствами, необходимыми для регуляции гипобиоза? Может ли неокиоторфин изменять работу изолированного сердца?

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние неокиоторфина на сердечный ритм, артериальное давление и температуру тела в нормальных условиях и на модели искусственного гипобиоза.

3. Изучить влияние иммунизации к неокиоторфину на сердечно-сосудистую систему и температуру тела.

4. Изучить влияние неокиоторфина на изолированное сердце крысы в норме и после кардиоконсервирования.

5. Изучить влияние неокиоторфина на ионный состав кардиомиоцитов во время погружения животных в гипобиотическое состояние.

Научная новизна и практическая значимость

Описанные эффекты НКТ на сердечно-сосудистую систему и температуру теплокровных животных в модели искусственного гипобиоза расширяют существующие представления об эффектах НКТ на незимоспящих животных и способствуют дальнейшему углубленному изучению участия НКТ в механизмах регуляции гипобиотических состояний теплокровных животных.

Результаты работы, свидетельствующие о способности НКТ облегчать наступление гипобиотического состояния у теплокровных животных, открывают перспективу включения НКТ в состав физиологически активных смесей для моделирования гипобиоза с помощью эндогенных регуляторов.

Вработе впервые продемонстрирована эффективность иммунизации к НКТ для получения эффекта схожего с введением НКТ. Этот метод может быть использован для коррекции устойчивости организма к пограничным состояниям - глубокой гипотермии.

Впервые показана способность НКТ восстанавливать диастолическое давление желудочков сердца теплокровного животного после криоконсервирования. Кардиопротекторные свойства НКТ в перспективе могут быть использованы для кардиоконсервирования в трансплантологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Неокиоторфин, будучи неактивным или слабоактивным в нормальных условиях ускоряет погружение теплокровных животных в гипобиотическое состояние.

2. НКТ выступает как кардиопротекторный агент при действии на целом организме и на изолированном сердце в условиях гипотермии.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (20 февраля 2006 г.). Материалы диссертации доложены на втором российском национальном конгрессе " Человек и лекарство " 1995 г., на конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" 1995, на XVIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова 2001, на III Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения Ф.В. Овсянникова 2003 г., на российском симпозиуме по химии и биологии пептидов 2003 г., на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова 2004 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 6 статей.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 258 работу, из них 128 зарубежных авторов. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками.'

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 98 самцах крыс Wistar весом 230-260 г. и 189 самцах белых мышей весом 20-25 г. В работе использовали неокиоторфин (Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg), синтезированный Зиганшиным Р.Х. с помощью пептидного синтезатора Biosearch 9500 (Milligen/BioSearch) в лаб. химии пептидов ИБХ им. М.М. Шемякина - Ю.А. Овчинникова РАН.

Исследование параметров системной гемодинамики

Для определения эффектов НКТ на сердечно-сосудистую систему свободноподвижных ненаркотизированных крыс показатели гемодинамики -артериальное давление и ЧСС - регистрировали с помощью имплантированных в брюшную аорту катетеров. Давление регистрировалось датчиком MPX5050DPT (Motorola, США) с модифицированным входным портом.

При этом неокиоторфин, растворенный в физиологическом растворе, вводился в бедренную вену через венозный катетер и соединенный с ним переходник с помощью шприца. Равномерное поступление препарата с заданной скоростью обеспечивалось посредством инфузора. Раствор НКТ вводили в объеме 200 мкл в течение 30 секунд. Затем, с такой же скоростью катетер промывался 200 мкл физраствора. В качестве контроля отдельной группе крыс вместо препарата, при соблюдении указанных выше условий, вводили физиологический раствор (0,9 % NaCl).

В части опытов использовали интраназальное введение препарата с помощью микрошприца с пластиковой трубкой, надетой на кончик иглы. Пептид, растворенный в физрастворе, вводили в объеме 20 мкл, порциями по 1,5 мкл поочередно в каждую ноздрю крысе или мыши. Контрольным животным таким же образом вводили физраствор.

В других опытах пептид, растворенный в физрастворе, вводили внутрибрюшинно, в разных дозах в объеме 0,3-0,4 мл крысам и 0,05 мл мышам.

Регистрация ЭКГ и температуры

Для исследования влияния неокиоторфина на температуру и сердечный ритм в условиях гипотермии использовали хронически-оперированных крыс. В течение эксперимента у крыс непрерывно регистрировали температуру тела и ЭКГ. Температура регистрировалась терморезистором «ТРА-1» (Rt=12 кОм; к®0,01 °/Ом), закрепленном на спине под кожей. Для измерения температуры терморезистор с помощью тонких мягких проводов был присоединен к мостовой схеме (Ri=R2=1,2 кОм; R3=12 кОм; U=3 В). Для изоляции

терморезистора использовался клей «Момент». Разъем терморезистора и электродов пришивали нитками к коже между лопатками.

Электроды для регистрации кардиограммы были изготовлены из мягкого многожильного провода. Концы электродов освобождались от изоляции, облужались и закреплялись нитками под кожей по бокам грудной клетки и на спине крысы. Отводимая разность потенциалов усиливалась лабораторным усилителем УБП-2. Таким же образом регистрировали ЭКГ и у мышей.

Экспериментальное моделирование условий гипобиоза

Опыты проводили при нормальных условиях, а также в условиях этанолового наркоза или при гипотермии на фоне нарастающей гипоксии-гиперкапнии качестве модели искусственного гипобиоза. Воздействие гипоксии ослабляет терморегуляторные реакции организма на охлаждение. Гиперкапния - несколько усиливает эффект гипоксии и стимулирует дыхательный центр. Сочетание нарастающих гипоксии и гиперкапнии с охлаждением животного позволяет смоделировать естественные условия, при которых зимоспящие животные впадают в спячку.

Для создания таких условий герметически закрытый сосуд емкостью Зле крысой помещали в холодильную камеру (-10 °С). Сосуд представлял собой стеклянную банку, на дне которой находилась картонная подстилка, для предотвращения обмораживания конечностей животного. После 120-минутного охлаждения животные извлекались из сосуда и переносились в комнатные условия (+22 °С) при этом они постепенно восстанавливали свою температуру и сердечный ритм. Крысам непосредственно перед гипотермией вводили внутрибрюшинно НКТ, разведенный (1 мг/мл) в физиологическом растворе, в дозе 1,5 мг/кг. Контрольным животным вводили физиологический раствор.

Подобным образом моделировали гипобиоз и у мышей. Отличие состояло в том, что для мышей гипотермия создавалась в течение 100 минут при +8 °С, и сосуд, где из-за дыхания мыши создавалась гипоксия-гиперкапния, имел объем 0,8 л. Более мягкие условия гипотермии и гипоксии связаны с тем, что мышь, имея гораздо меньшие размеры тела чем крыса, легче подвергается охлаждению.

Мышам непосредственно перед гипотермией или в самом начале восстановления внутрибрюшинно вводили НКТ, разведенный (2 мг/мл) в физиологическом растворе, в дозе 0,015, 0,15 и 1,5 мг/кг. Контрольным животным вводили физиологический раствор.

У крыс регистрировали ЭКГ с помощью подкожных электродов и температуру тела с помощью терморезисторов. У мышей подкожно регистрировали ЭКГ.

Исследование иммунной реакции на неокиоторфин

Приготовление конъюгатов

Для иммунизации использовали конъюгат НКТ с бычьим сывороточным альбумином (БСА), в качестве антиген-носителя. Изготовление конъюгатов неокиоторфина с БСА, проводили через глутаровый альдегид в фосфатно-буферном растворе (0,1 М, pH = 7,9) при молярном соотношении носитель : пептид = 1 : 100. Концентрация глутарового альдегида составляла 2 %. Реакционную смесь постоянно перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 4-х часов при комнатной температуре, затем выдерживали в течение 20-ти часов при 4 °С в холодильнике. Конъюгаты очищали с помощью диализа вначале против дистиллированной воды (3-4 смены), затем против 0,15 М NaCl (не менее 3-х раз). Диализ проводили при температуре 4 °С. Конъюгаты хранили при 4 °С в холодильнике.

Аналогичным образом готовили контрольный раствор БСА. После окончания диализа в растворах конъюгата и БСА определяли содержание белка по Лоури. Степень связывания неокиоторфина с БСА оценивали с помощью хроматографического анализа кислотных гидролизатов конъюгата и носителя, обработанного 2 % глутаровым альдегидом, по изменению аминокислотного состава. Количество связанного пептида составило 10-12 молекул на 1 моль БСА.

Конъюгат был приготовлен в соответствии с описанной выше методикой в институте нормальной физиологии РАМН зав. лаб. Обуховой М.Ф.

Иммунизация животных

Иммунизацию осуществляли по схеме, предложенной Мартьяновым A.A. (Мартьянов, 1992). Цикл состоял из четырех иммунизаций. Каждая иммунизация состояла из 4-х инъекций конъюгата под кожу на спине животного. Интервалы между первой, второй и третьей иммунизациями составляли 20 дней, четвертая иммунизация была через 57 дней. Для усиления эффективности первичную иммунизацию проводили с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ, Sigma, США). При этом доза вводимого конъюгата была 600 мкг белка/кг веса животного. Три последующие иммунизации проводили с неполным адъювантом Фрейнда, и конъюгат вводили в дозе 300 мкг белка/кг веса. Перед введением препарата коньюгат смешивали с адъювантом Фрейнда и физиологическим раствором в соотношении 1:1:0,3 из расчета содержания белка 2,3 мг/мл и тщательно перемешивали до состояния устойчивой эмульсии.

В качестве контрольных в этой серии экспериментов использовали две группы животных. Животным одной из них в те же сроки аналогичным образом вводили белок-носитель, обработанный связывающим агентом

(группа «БСА»), другой контрольной группе вводили только физиологический раствор (группа «контроль»).

Титр антител

Эффективность иммунизации определяли по изменению титра антител к конъюгату неокиоторфина с гемоцианином, полученному через карбодиимид-1 (СДИ-1) методом твердофазного иммуноферментного анализа. Кровь брали дважды: после последнего введения конъюгата и непосредственно после окончания эксперимента из надреза на кончике хвоста крысы. Кровь инкубировали 2 часа при комнатной температуре с последующим центрифугироваием (5000 об/мин - 2500 g) в течение 15 минут. Сыворотку хранили при -20 °С.

Титр антител к неокиоторфину определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (Егоров и др., 1991) на микропланшетах Linbro («Tiferfec» Flow Laboratories, Inc, США).

В качестве антигена использовали растворы конъюгатов неокиоторфина с гемоцианином, синтезированных через 1 -этил-3 (3-диметиламинопропил) карбодиимид солянокислый. Стандартные растворы конъюгатов были приготовлены на 0,1 М фосфатном буфере с рН=7,0 (концентрацией 100 мг/мл).

Определение содержания антител по вышеприведенной методике было проведено в институте нормальной физиологии РАМН зав. лаб. Обуховой М.Ф.

Этаноловый наркоз

Моделирование гипобиоза у иммунизированных крыс проводили с помощью этанолового наркоза. Крыс наркотизировали инъекцией 4,5 мл 25 % этилового спирта (сорт "Экстра") в физиологическом растворе (0,9 % NaCl). В течение эксперимента через каждые 20 минут у крыс измеряли ректальную температуру.

Перфузия изолированного сердца крысы

Для определения влияния НКТ на работу изолированного сердца крысы, лишенного регуляторных воздействий организма, использовался метод ретроградной перфузии по Лангендорфу.

Подготовка препарата изолированного сердца

Крысу декапитировали, извлекали сердце и помещали в ванночку с холодным (+4 °С) раствором Кребса-Хензеляйта. От момента извлечения сердца из животного до начала его перфузии проходило не более 3 минут.

Перфузию проводили в соответствии с традиционной схемой Лангендорфа. При помощи механизма, регулирующего глубину погружения катетера в канюлю, катетер для измерения давления вставляли в левый желудочек. В результате раствор Кребса-Хензеляйта из аорты поступал в коронарные артерии, питал сердце и выходил через вены сердца в правое предсердие. При сокращении правого предсердия и правого желудочка раствор вытекал через легочный ствол, верхнюю и нижнюю полые вены, омывая сердце.

Регистрируемые параметры сократительной функции сердца

Для определения сократительной функции сердца регистрировали давление в левом желудочке. Регистрация сигнала с датчика давления и подача его на аналого-цифровой преобразователь происходила каждые 5 миллисекунд (в среднем до 100 точек на сердечный цикл), что позволяло достаточно точно регистрировать кривую давления в левом желудочке.

Из исходной кривой давления вычислялись такие показатели, как систолическое давление (СД, мм рт.ст.), конечно-диастолическое давление (КДД, мм рт.ст.), развиваемое давление - амплитуда (А = СД - КДЦ). Также вычисляли частоту сокращений препарата изолированного сердца (ЧСС, уд/мин).

Криоконсервирование сердца

Для изучения влияния НКТ на «реперфузионный синдром» проводили криоконсервирование сердца. Для этого сердце после получасовой перфузии быстро (в течение 15 сек) снимали с установки и помещали в раствор без глюкозы и с высоким содержанием К+ (115 мМ), при этом происходила остановка сердца. После этого сердце в том же растворе помещали в холодильную камеру (+4 °С) на 2 часа. Затем, сердце подсоединяли к установке и возобновляли ретроградную перфузию.

При этом сердце находилось в состоянии контрактуры. По мере реперфузии происходило ослабление контрактуры и восстановление сердечной активности.

Электронно-зондовый микроанализ

Для определения влияния НКТ на содержание К+ в кардиомиоцитах крыс и мышей, пребывающих в гипобиотическом состоянии, использовали электронно-зондовый микроанализ. Опыты проводились в лаборатории электронно-зондового микроанализа института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино) под руководством зав. лаб. Погорелова А.Г.

Подготовка лиофилизированных криосрезов

Крыс в течение двух часов подвергали нарастающей гипоксии-гиперкапнии в закрытом сосуде емкостью 3 л в морозильной камере при -10 °С. Мышей охлаждали в закрытом сосуде емкостью 0,8 л в холодильной камере при +8 °С.

Метод подготовки лиофилизированных криосрезов мышечной ткани для электронно-зондового микроанализа описан ранее (Pogorelov et al., 1991; Echlin, 1992). По окончании охлаждения животных из левого желудочка сердца выделяли папиллярную мышцу. Ткань монтировали на держатель из меди и замораживали в жидком азоте (-196 °С). Криофиксированный образец помещали в криостат (-30 °С), где получали поперечные криосрезы толщиной 15 мкм.

В камере криостата срезы собирали в охлажденный медный контейнер, который в парах жидкого азота переносили на столик вакуумной установки Micro ВАЗ (Balzers, Лихтенштейн). Криосрезы лиофилизировали 12 часов в вакууме (10"5 Па) при постепенном повышении температуры столика до комнатной температуры. Высушенные криосрезы монтировали на бленды, вырезанные в медной сеточке для электронного микроскопа. Затем на поверхность срезов путем термического распыления в вакууме наносили слой углерода толщиной 20-40 нм. Для покрытия углеродом использовали вакуумную установку JEE-4B (JEOL, Япония).

Параметры электронно-зондового микроанализа

На лиофилизированных криосрезах папиллярной мышцы сердца проводили измерение концентрации элементов в миоцитах посредством электронно-зондового микроанализа (Pogorelov et. al., 1991; Goldstein et al., 1992). Для анализа использовали сканирующий электронный микроскоп JSM-U3 (JEOL, Япония), оснащенный кристалл-дифракционными спектрометрами рентгеновского излучения. Микроанализ проводили при ускоряющем напряжении 25 кВ, токе электронов зонда ~5 нА и времени накопления импульсов рентгеновского излучения 20 сек. Наиболее интенсивная Ка-линия характеристического спектра анализируемого элемента выделялась на кристалл-анализаторе PET (калий). Морфологию криосреза наблюдали в режиме вторичных (SEM) или прошедших (STEM) электронов. Более детально принципы выбора параметров анализа и условий наблюдения описаны ранее (Pogorelov et al., 1991, 1994).

Расчет концентрации элементов

В электронном микроскопе ускоренные электроны пучка ионизируют атомы образца, в результате чего возникает характеристическое рентгеновское излучение. Метод определения концентрации элементов основан на линейной

зависимости интенсивности характеристического рентгеновского излучения от концентрации элемента в образце. При этом интенсивность излучения, регистрируемая на образце, нормируется к интенсивности на стандарте, содержащем известную концентрацию элемента. С учетом задач, поставленных в данной работе, для стандартизации использовали минерал KA1Sí308 (калий). Указанное соединение устойчиво к воздействию ускоренных электронов зонда в вакууме. Детали методики определения концентрации элементов по данным электронно-зондового микроанализа криосрезов описаны ранее (Pogorelov et al., 1984; Pogorelov et al., 1991; Pogorelov et al., 1993; Pogorelov et al., 1994; Погорелов и др., 2005). Расчет проводили, используя выражение:

q _ К • (1рбр - Врбр.)

k (ICT "Вст)1

i

где: С - концентрация (мМ) калия в клетке; и 1ст - интенсивность характеристического рентгеновского излучения калия на образце и стандарте, соответственно; Во6р и Вст- интенсивность тормозного рентгеновского излучения (фон) на образце и стандарте, соответственно; К — коэффициент, учитывающий различие в физико-химических свойствах используемого стандарта и образца; к - поправка на массовую толщину среза; 1 - линейная толщина среза.

Обработка результатов

Регистрируемые физиологические показатели (ЭКГ, артериальное давление и температура) подавались на компьютер, где с помощью АЦП («La2a», ООО «Руднев-Шиляев», Россия) оцифровывались. Запись и последующая обработка сигналов (определение гемодинамических параметров) производилась специализированной программой «Pulsar», разработанной автором. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрических методов анализа данных: Манна-Уитни (U) и парного критерия Вилкоксона (Т).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние введения НКТ на сердечно-сосудистую систему

Введение НКТ интактным крысам (1,5 мг/кг) не оказало влияния на артериальное давление и ЧСС, которые регистрировали с помощью имплантированных катетеров. Неэффективными оказались как интраназальное, так и внутрибрюшинное, и внутривенное введения НКТ.

Для уверенности в том, что в нормальных условиях НКТ не влияет на сердечно-сосудистую систему не только крыс, но и мышей, были поставлены

опыты с внутрибрюшинным введением НКТ мышам (0,015-1,5 мг/кг) при регистрации ЭКГ. НКТ не оказал влияния и на сердечный ритм мышей.

Отсутствие эффектов НКТ на сердечно-сосудистую систему при нормальных условиях может быть связано с его слабым действием или же с тем, что это действие просто не заметно в связи с компенсаторными реакциями сердечно-сосудистой системы. В таком случае, можно предполагать, что в нормальных условиях НКТ может и не оказывать влияния на сердечнососудистую систему, а в других условиях, например, при гипофункциях сердечно-сосудистой системы и системы терморегуляции, может проявлять регуляторное влияние.

Действие неокиоторфина в модели гипобиоза

Следующим этапом стало исследование действия НКТ на сердечнососудистую систему и температуру тела в условиях искусственной гипоксии и гипотермии, в качестве модели гипобиоза.

Обнаружено, что при охлаждении крыс в условиях нарастающей гипоксии-гиперкапнии, НКТ, введенный внутрибрюшинно перед охлаждением, действует на начальном этапе гипотермии при снижении температуры тела до 20 °С. НКТ способствует более быстрому снижению сердечного ритма (рис. 1а) в первые 30 минут и затем более сильному охлаждению (на 40-60 минутах гипотермии) (рис. 16). При дальнейшем развитии гипотермии НКТ уже не оказывает влияния на сердечный ритм и на температуру тела.

Следовательно, НКТ может проявлять свое действие на сердечнососудистую систему и систему терморегуляции, в условиях развивающейся гипотермии, а точнее, на начальном ее этапе.

а б

ЧСС, уд/мин Т, °С

группа "конторль" -группа "контроль"

-^группа "НКТ" — группа "НКТ"

Рисунок 1. Изменение частоты сокращения сердца и температуры тела у крыс в условиях нарастающей гипоксии-гиперкапнии при введении НКТ (1,5 мг/кг в/б) и физраствора. • -Р(и)<0,05; п=9, 11.

Тот факт, что понижение сердечного ритма предшествует усилению охлаждения, позволяет предположить, что действие НКТ на температуру может быть опосредовано регуляторным влиянием на сердечно-сосудистую систему. То есть, замедление сердечного ритма в условиях гипотермии должно приводить к снижению уровня метаболизма и активности всех систем, после чего, как результат, можно наблюдать более сильное снижение температуры тела.

Как показали опыты по охлаждению мышей в условиях нарастающей гипоксии-гиперкапнии, НКТ подействовал в том же направлении, что и у крыс. Но на мышей действие НКТ оказалось более сильным и более длительным.

Так, НКТ, вводимый перед охлаждением, усилил снижение сердечного ритма при погружении в гипобиоз и довольно сильно замедлил восстановление сердечного ритма при отогреве животного (рис. 2а).

Этот эффект наблюдался при введении НКТ как до охлаждения, так и при введении в начале восстановления (рис. 26).

а б

- НКТ —- НКТ

Рисунок 2 Влияние НКТ (1,5 мг/кг в/б) на частоту сердечных сокращений во время гипотермии мышей при введении перед охлаждением (а) и после охлаждения (б), .-р(и)<0,05;п=11, 13, 7, 14.

Из этих опытов стало ясно, что НКТ проявляет свое действие на систему терморегуляции и сердечно-сосудистую систему животных в основном при измененном физиологическом состоянии организма (гипотермия) и не проявляет своего действия в нормальных условиях или же это действие маскируется регуляторными реакциями организма.

Иммунизация к неокиоторфину

Для более детального исследования НКТ были проведены эксперименты по изучению влияния иммунизации к НКТ на сердечно-сосудистую систему и

температуру тела крыс.

Измерения давления и сердечного ритма у иммунизированных крыс не выявили каких-либо отличий относительно контрольных крыс. Действие иммунизации к НКТ на сердечно-сосудистую систему в нормальных условиях не проявилось так же, как и прямое действие пептида не было обнаружено в предыдущих опытах.

Для решения вопроса будет ли сердечно-сосудистая система организма, иммунизированного к НКТ, более чувствительной по отношению к НКТ, были проведены опыты по введению НКТ крысам, иммунизированным к этому пептиду. Предполагалось, что вследствие иммунизации организм должен быть более восприимчивым к введению НКТ. Более того, для введения использовался НКТ, у которого при синтезе аминокислота серин была заменена на Б-серин. Эта замена повышает устойчивость пептида к протеазам и, следовательно, должна продлевать и усиливать действие пептида.

Как показали опыты, внутрибрюшинное введение такого пептида (0,5 мг/кг) вызывает подъем артериального давления в среднем на 8-10 мм рт.ст. (рис. 3). Данное повышение не является слишком большим, но, будучи достоверным, позволяет заключить, что чувствительность сердечно-сосудистой системы к НКТ у иммунизированных крыс повышается, в то время как у контрольных крыс НКТ не оказывает влияние на систолическое давление.

АД,

мм рт.ст. -*

135 т---

125

115

Рисунок 3. Систолическое давление после введения НКТ(0-8ег)(0,5 мг/кг в/б) контрольным крысам и крысам, иммунизированным к НКТ. .-рП)<0,01; п=10, 10.

контроль иммунизированные к

НКТ

□ Исходно В после введения НКТ

Наблюдение за снижением температуры тела иммунизированных крыс во время этанолового наркоза показало, что в группе крыс, иммунизированных против НКТ, температура опускалась ниже, чем у контрольных крыс. Этот

результат похож на результаты прямого действия НКТ на ЧСС и температуру крыс при гипотермии (рис. 2а).

Температура тела,

Рисунок 4. Падение температуры тела иммунизированных крыс при этаноловом наркозе.

• -р(и)<0,05, п=7, 6.

Мы полагаем, что ввиду небольших размеров молекул НКТ, их связывание с антителами не приводит к необратимой фиксации и последующему уничтожению, что характерно для крупных антигенов. Наоборот, скорость метаболизма и выведения НКТ, связанного с антителами замедлена, что приводит к депонированию НКТ в крови. Недостаток свободного эндогенного НКТ должен привести к повышенному новообразованию и секреции НКТ. В итоге происходит буферное накопление в крови НКТ, связанного с антителами.

Влияние неокиоторфнна на изолированное сердце

По описанным выше опытам можно заключить, что НКТ проявляет свою активность в основном при измененном физиологическом состоянии организма.

Поэтому на следующем этапе было решено выяснить, как будет действовать НКТ на изолированный орган - сердце крысы. Это исследование проводилось с целью выявления прямых эффектов пептида на сердце, не маскированных регуляторными нейрогуморальными влияниями целого организма.

Как оказалось, НКТ не обладает прямыми эффектами на деятельность изолированного сердца в относительно нормальных условиях, также как и в условиях целого организма. А именно, ни внутрижелудочковое давление, ни ЧСС не менялись при добавлении НКТ в перфузируемый раствор.

Криоконсервирование сердца

Следуя предположению об активности исследуемого пептида в измененных физиологических условиях, было проведено изучение влияния НКТ на восстановление сердечной деятельности после криоконсервирования.

При реперфузии (рис. 5а) наблюдается феномен «каменного сердца» или «реперфузионный синдром», вызванный кальциевой перегрузкой кардиомиоцитов.

(а) В контроле: Давление

О 100 200 300 100 200 300 100 200 300 100 200 300 100 200 300 время, мс

(б) После получасовой перфузии НКТ: ! Давление

ммрт ст. Исходно Начало реперфузии через 10 мин через 20 мин через 50 мин

О 100 200 300 100 200 300 100 200 300 100 200 300 100 200 300 время, мс

!

Рисунок 5. Пример восстановления формы кривой давления в левом желудочке во время реперфузии после двухчасового гипотермического криоконсервирования в контроле и после предварительного добавления в перфузат НКТ (2 Ш6 М)

Опыты показали, что предварительная перфузия НКТ ускоряет восстановление сердечной деятельности после пребывания в условиях ишемии и гипотермии (рис. 56). ' Действие НКТ связано со спадом контрактуры сердца и восстановлением

' диастолического давления (рис 6).

Время реперфузии, мин

— контроль ""после перфузии НКТ

Рисунок 6. Динамика восстановления диастолического давления после получасовой предварительной перфузии НКТ в концентрации 2- Iff6 М и двухчасового гипотермического криоконсервирования. Нулевое время соответствует моменту начала реперфузии. '-P(V)<0,05; п=6, 7.

Это позволяет предположить, что мишенью действия НКТ может являться один из механизмов развития ишемии.

Микроанализ содержания калия в кардиомиоцитах

Как известно, кальциевая перегрузка клетки во время ишемии проявляется на заключительном этапе. А в начале ишемии происходит дисбаланс токов Na+ и К+ (Vanheel et al., 1995). Это в свою очередь приводит к изменению содержания этих ионов внутри клетки (Silverman et al., 1994; Pierce et al., 1995; Погорелов и др., 2002) и в первую очередь ионов К+ (Hill et al., 1980; Shine, 1981; Kleber, 1984; Погорелов и др., 2005).

В связи с этим, заключительным исследованием было выяснение - может ли НКТ влиять на содержание К+ в кардиомиоцитах у животных, погружаемых в искусственный гипобиоз.

[К], мМ

[К], мМ

100

80 60 40

20 0

1

".и **

рЛ г* *

140 120 -100 -80 60 40 20 О

Норма Охлаждение Охлаждение + ф.р. + НКТ

1Л

•V

-

> 1

Норма Охлаждение + Охлаждение н ф.р. НКТ

Рисунок 7. Концентрация калия в клетках миокарда желудочка мыгией (а) и папилярной мышцы крыс (б). Приведены данные по интактным животным и животным, охлажденным в условиях гипоксии-гиперкапнии, после введения физраствора (контроль) и НКТ (1,5 мг/кг). .-р(и)<0,05;п=3,4,5,7, 7, 7.

Гипоксическая гипотрермия приводит к потере кардиомиоцитами К+. Как выяснилось, НКТ препятствует этому.

Так, предварительное введение НКТ увеличивает содержание К+ в кардиомиоцитах мышей во время гипоксической гимотермии относительно контроля (рис. 7а).

Микроанализ кардиомиоцитов крыс показал, что у опытных крыс во время гипотермии содержание К+ было достоверно выше, чем у контрольных крыс, подвергнутых охлаждению, и выше, чем у интактных крыс, находящихся в нормальных условиях (рис. 76).

Из данных этих серий экспериментов можно заключить, что неокиоторфин снижает утечку К+ из клетки во время гипотермической ишемии, вызванной охлаждением на фоне гипоксии-гиперкапнии. Таким образом, НКТ выступает как кардиопротекторный агент, помогающий кардиомиоцитам перенести гипотермию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог проведенным исследованиям можно заключить, что неокиоторфин будучи неактивным или слабоактивным регулятором в нормальных условиях, ускоряет погружение теплокровных животных в

гипобиотическое состояние и замедляющий выход из него. С другой стороны НКТ выступает как кардиопротекторный агент.

В связи с этим, неокиоторфин вполне может претендовать на роль одного из регуляторов гипобиоза. Хотя, следует оговориться, что полной картины действия НКТ, как на изолированное сердце, так и тем более на целый организм, пока не существует: еще не найдены рецепторы, не доказана секреция, и не полностью выявлены механизмы действия этого пептида. Это оставляет место для дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. Экзогенно вводимый неокиоторфин не оказывает влияния на артериальное давление и сердечный ритм животных в нормальных условиях.

2. Неокиоторфин снижает сердечный ритм и температуру тела крыс при погружении в гипобиоз.

3. Неокиоторфин снижает частоту сердечных сокращений мышей при погружении и выходе из гипобиоза. Действие неокиоторфина на организм мышей более выражено, чем у крыс.

4. Введение неокиоторфина иммунизированным к неокиоторфину животным приводит к подъему артериального давления в отличие от контроля.

5. У иммунизированных к неокиоторфину крыс гипотермическое действие этанолового наркоза более выражено, чем у контрольных животных.

6. Неокиоторфин не оказывает влияния на параметры сокращения изолированного сердца крысы в относительно нормальных условиях, но ускоряет восстановление работы сердца после криоконсервирования.

7. Неокиоторфин препятствует утечке калия из кардиомиоцитов при погружении крыс и мышей в гипобиоз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Ашмарин И.П., Закарян A.A., Игнатьев Д.А., Негуляев О.В., Обухова М.Ф., Сухова Г.С., Сухов В.П., Темнов A.A., Темнов A.B. Влияние иммунизации к биологически активным веществам из тканей зимоспящих животных на терморегуляцию и сердечно-сосудистую систему крыс и мышей // Ж. Эволюционной Биохимии и Физиологии РАН, 1999. - Т. 35, № 3. - С. 199

2. Игнатьев Д.А., Михалева И.И., Сосулина Л.Ю., Закарян A.A., Сухова Г.С., Зиганшин Р.Х. Пептид TSKY замедляет выход суслика из состояния спячки //

Ж. Эволюционной Биохимии и Физиологии РАН, 2001. - Т. 37, № 3. - С. 201 -205

3. Сухова Г.С., Негуляев О.В., Закарян A.A., Михалева И.И., Зиганшин Р.Х., Ухорская М.Ю. Кардиотропное действие фракций (мол. вес < 1 kDa) уксуснокислого экстракта и отдельных пептидов, выделенных из мозга зимоспящих и холодоадаптированных животных // Успехи Физиологических Наук, 1994. - Т. 25. №4.-С. 82-83

4. Погорелов А.Г., Сухова Г.С., Погорелова В.Н., Хренова Е.В., Закарян A.A. Анализ Na/K баланса в мышечной клетке сердца при гипотермии // Цитология, 2003. - Т. 45. № 9. - С. 911-912

5. Сухова Г.С., Игнатьев Д.А., Зиганшин Р.Х., Артеменко О.И., Закарян A.A., Ляшков А.Е., Сосулина Л.Ю., Ашмарин И.П. В поисках регуляторов гибернации: кардиотропные эффекты некоторых сигнальных молекул // Успехи функциональной нейрохимии / Под ред. С.А. Дамбиновой и A.B. Арутюняна - СПб: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. - С, 94-107

6. Гольдштейн Д.В., Закарян A.A., Кузьмин B.C., Погорелов А.Г., Сухова Г.С., Хренова Е.В. Доклиническое изучение активности кардиотропных препаратов на модели изолированного сердца // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004. - Т. 137 № 6. - С. 644-645

Тезисы:

7. Сухова Г.С., Закарян A.A., Негуляев О.В., Обухова М.Ф., Сухов В.П., Зиганшин Р.Х., Михалева И.И. Физиологические эффекты неокиоторфина (НКТ) при прямом и инверсном действии на организм // Второй Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", 10-15 апреля 1995 г., Москва, 1995.-С. 152

8. Закарян A.A., Негуляев О.В. Исследование возможностей коррекции устойчивости организма к алкогольной интоксикации методом иммунорегуляции // "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" - Материалы конференции молодых физиологов и биохимиков России, Санкт-Петербург, 1995. - С. 76

9. Ляшков А.Е., Закарян A.A., Негуляев О.В., Сосулина Л.Ю., Артеменко О.И., Баранник А.П., Зиганшин Р.Х., Сухова Г.С. Модулирующая роль пептидов как факторов контроля реакции сердца на различные биологически активные вещества и воздействия // XVIII съезд физиологического общества им.

И.П. Павлова. Казань. 25-28 сентября 2001 г. Тезисы докладов. - С. 380

10. Алексеенко A.A., Закарян A.A., Сухова Г.С.. Влияние неокиоторфина на сердечный ритм и температуру тела крыс и мышей в условиях гипотермии и нарастающей гипоксии // III Всероссийская конференция с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем", посвященная 175-летию со дня рождения Ф.В.Овсянникова, Санкт-Петербург, Россия, 29 сентября - 1 октября 2003 г. Санкт-Петербург, 2003. - С. 16-17

11. Закарян A.A., Погорелов А.Г. Влияние неокиоторфина на содержание калия в кардиомиоцитах в условиях нарастающей гипотермии и гипоксии-гиперкапнии // III Всероссийская конференция с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем", посвященная 175-летию со дня рождения Ф.В.Овсянникова, Санкт-Петербург, Россия, 29 сентября - 1 октября 2003 г. Санкт-Петербург, 2003. - С. 112-113

12. Алексеенко A.A., Закарян A.A., Зиганшин Р.Х., Кузьмин B.C., Ляшков А.Е., Сухова Г.С. Действие неокиоторфина (НКТ) на миокард теплокровных животных при гипоксии и гипотермии // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. 17-19 ноября 2003 г., Москва. Тезисы стендовых сообщений. - С. 56

13. Алексеенко A.A., Закарян A.A., Зиганшин Р.Х., Кузьмин B.C., Сухова Г.С. Поиск регуляторов гибернации: кардиотропные эффекты некоторых сигнальных молекул // XIX Съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова. Тезисы докладов. Часть 2 // Рос. физиол. жури. им. И.М.Сеченова, 2004. - Т. 90, № 8. - С. 203

Список сокращений

АД - артериальное давление

БСА - бычий сывороточный альбумин

НКТ - неокиоторфин

ПАВ - полный адьювант Фрейнда

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭКГ - электрокардиограмма

Подписано в печать 23.03.2006 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 504 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

¿A SP

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Закарян, Армен Арникович

1. Введение.

2. Обзор литературы

2.1. Гипобиоз и зимняя спячка.

2.2. Физиологические изменения и особенности у гибернантов во время спячки.

2.3. Энергообмен зимоспящих животных.

2.4. Мозговая активность во время спячки.

2.5. Модели искусственного гипобиоза.

2.6. Роль медиаторов в зимней спячке.

2.7. Роль гормонов в зимней спячке.

2.8. Поиск триггера спячки.

2.9. Эффекты фракций из тканей гибернантов.

2.10. Неокиоторфин.

3. Цели и задачи.

4. Объекты и методы исследования.

4.1. Вещества и препараты, используемые в работе

4.2. Объекты исследования.

4.3. Введение препарата в организм животного.

4.4. Изготовление и имплантация катетеров.

4.5. Регистрация параметров системной гемодинамики

4.6. Регистрация ЭКГ и температуры у крыс.

4.7. Экспериментальное моделирование условий гипобиоза

4.8. Исследование иммунной реакции на неокиоторфин

4.8.1. Приготовление конъюгатов.

4.8.2. Иммунизация животных.

4.8.3. Титр антител

4.9. Регистрация давления и сердечного ритма.

4.10. Этаноловый наркоз.

4.11. Перфузия изолированного сердца крысы.

4.11.1. Подготовка препарата изолированного сердца.

4.11.2. Схема установки для перфузии изолированного сердца

4.11.3. Регистрируемые параметры сократительной функции сердца

4.11.4. Криоконсервирование сердца.

4.12. Электронно-зондовый микроанализ

4.12.1. Подготовка лиофилизированных криосрезов.

4.12.2. Параметры электронно-зондового микроанализа.

4.12.3. Расчет концентрации элементов.

4.13. Обработка результатов.

5. Результаты

5.1. Действие неокиоторфина на организм животного

5.1.1. АД и ЧСС у крыс при разных способах введения НКТ

5.1.2. Температура и ЧСС у крыс в модели гипобиоза, протекающего на фоне действия НКТ.

5.1.3. Влияние НКТ на ЧСС у мышей в нормальных условиях

5.1.4. ЧСС у мышей в модели гипобиоза, протекающего на фоне действия НКТ.

5.2. Иммунизация к НКТ.

5.2.1. АД и ЧСС у крыс, иммунизированных к НКТ.

5.2.2. АД и ЧСС при введении НКТ крысам, иммунизированным к НКТ.

5.2.3. Температура тела иммунизированных крыс в условиях этанолового наркоза.

5.3. Действие НКТ на препараты сердца in vitro.

5.3.1. Регистрация сократительной активности изолированного сердца крысы при введении НКТ

5.3.2. Эффекты НКТ на изолированное сердце крысы после кардиоконсервирования.

5.4. Результаты электронно-зондового микроанализа концентрации калия в мышечной клетке сердца животных . . 89 5.4.1. Внутриклеточная концентрация калия при моделировании гипобиоза у мышей на фоне действия НКТ.

5.4.2. Внутриклеточная концентрация калия при моделировании гипобиоза у крыс на фоне действия НКТ

6. Обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эффекты неокиоторфина как потенциального регулятора процессов гипобиоза"

Зимоспящие животные обладают уникальной способностью при наступлении неблагоприятных климатических условий значительно снижать метаболизм и длительное время поддерживать его на низком уровне. Исследования физиологических особенностей зимоспящих показали, что эти животные имеют многочисленные приспособления к холоду. Механизм вхождения животного в спячку и поддержания в течение продолжительного времени функционирования организма в экстремальных условиях не выяснен. Понимание процессов спячки млекопитающих помимо научного имеет и огромный практический интерес. Выяснение механизмов спячки позволило бы надеяться на создание адекватной модели искусственного гипобиоза подобной естественному гипобиозу.

Наиболее ярким примером использования искусственного гипобиоза на сегодняшний день является клиническая гипотермия в кардиохирургии. Обратимый гипобиоз может стать перспективным методом защиты организма от неблагоприятных факторов при действии гипоксии, радиации, интоксикации и прочих. Изучение механизмов гипобиоза требуется и для криобиологии и для криоконсервирования. Выявление гуморальных регуляторов спячки также может представлять практический интерес для решения некоторых геронтологических проблем.

Одно из направлений в изучении физиологии зимней спячки связано с выявлением гуморальных факторов регуляции спячки и основано на тестировании свойств биологически активных веществ, входящих в состав фракций, выделенных из тканей зимоспящих животных. Отсутствие видоспецифичности действия, а также широкий спектр физиологических эффектов таких фракций предполагает полифункциональность этих "триггеров" и наличие специфических рецепторов для их восприятия во многих органах и тканях организма как у зимоспящих, так и у незимоспящих животных. Попытки выделения таких "триггеров" пока не увенчались успехом. Поиск и идентификация этих веществ остается актуальной задачей и представляет несомненный научный и практический интерес.

В настоящее время известен довольно большой ряд пептидов, которые могут претендовать на роль эндогенных регуляторов сезонных изменений физиологических состояний у зимоспящих животных. Среди них выделяют такие широко известные как серотонин, катехоламины, бомбезин, холецистокинин, тиролиберин, соматостатин, нейротензин, а также малоизученные регуляторные пептиды: киоторфин, неокиоторфин, BS, RZ-8, RZ-13 и другие. Как правило, фракции содержат вещества и непептидной природы, обладающие физиологической активностью.

Однако эффекты известных на сегодняшний день веществ -возможных регуляторов процессов гипобиоза - не могут объяснить всей феноменологии этого состояния. Следовательно, на данном этапе актуальным является изучение физиологических эффектов пептидов, возможных претендентов на роль таких регуляторов.

Пептид неокиоторфин, исследуемый в данной работе, в некоторых случаях может проявлять активность на зимоспящих животных - при выходе из спячки, известны некоторые его эффекты на незимоспящих животных. Несмотря на это, его физиологические свойства изучены далеко не в полной мере.

Объектами настоящего исследования стали незимоспящие животные -мыши и крысы, с целью выявления эффектов неокиоторфина общих для зимоспящих и незимоспящих животных и перспективных для создания искусственного гипобиоза. В качестве исследуемой "мишени" для изучения действия неокиоторфина были выбраны сердечно-сосудистая система и система терморегуляции. Выбор был мотивирован тем, что именно эти системы наиболее значительно изменяют свою работу у зимоспящих животных при погружении в спячку и при выходе из нее (Lyman С.Р., 1958; Johanson B.W., 1967; Жегунов Г.Ф., 1986, 1988; Эмирбеков Э.З. и др., 1991).

Для определения эффектов неокиоторфина, как потенциального регулятора спячки, животных исследовали в разных физиологических состояниях, моделирующих гипобиоз.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Закарян, Армен Арникович

8. Выводы

1. Экзогенно вводимый неокиоторфин не оказывает влияния на артериальное давление и сердечный ритм животных в нормальных условиях.

2. Неокиоторфин снижает сердечный ритм и температуру тела крыс при погружении в гипобиоз.

3. Неокиоторфин снижает частоту сердечных сокращений мышей при погружении и выходе из гипобиоза. Действие неокиоторфина на организм мышей более выражено, чем у крыс.

4. Введение неокиоторфина иммунизированным к неокиоторфину животным приводит к подъему артериального давления в отличие от контроля.

5. У иммунизированных к неокиоторфину крыс гипотермическое действие этанолового наркоза более выражено, чем у контрольных животных.

6. Неокиоторфин не оказывает влияния на параметры сокращения изолированного сердца крысы в относительно нормальных условиях, но ускоряет восстановление работы сердца после криоконсервирования.

7. Неокиоторфин препятствует утечке калия из кардиомиоцитов при погружении крыс и мышей в гипобиоз.

7. Заключение

Подводя итог проведенным исследованиям можно заключить, что неокиоторфин проявляет себя с одной стороны, как кардиопротекторный агент, а с другой стороны, как агент, ускоряющий погружение теплокровных животных в гипобиотическое состояние. В связи с этим, неокиоторфин вполне может претендовать на роль одного из регуляторов гипобиоза.

Хотя, следует оговориться, что полной картины действия НКТ пока не существует: еще не найдены рецепторы, не доказана секреция, и не полностью выявлены механизмы действия этого пептида. Это оставляет место для дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Закарян, Армен Арникович, Москва

1. Алексеев Н.Д. Физиологические особенности якутской лошади: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1984. - 24 с.

2. Алламуратов Ш.И. Энергетический обмен тепло- и холоднокровных организмов при различных гипометаболических состояниях: Автореф. дисс. док. биол. наук Ташкент, 1999. - 41 с.

3. Анджус Р., Хозич Н. О границах продолжительности клинической смерти у некоторых зимоспящих и незимоспящих при температуре тела 0 °С и о возможности искусственного продления этого состояния // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1965. № 9. - С. 38-42.

4. Арбузов С.Я. Пробуждающее и антинаркотическое действие стимуляторов нервной системы. — J1., 1960. 270 с.

5. Ахременко А.К., Игнатьев Д.А., Загнойко В.И. Гипотермический-гипометаболический эффект фракции (1-10 кДа) мозга якутской лошади: Сб. науч. тр. / Биохимические аспекты холодовых адаптаций. Харьков, 1991.-С. 21-25.

6. Ашмарин И.П. Регуляторные пептиды, происхождение и иерархия // Ж. эволюционной биохимии и физиологии, 1982. Т. 18, № 1. - С. 3-10.

7. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды, функционально непрерывная совокупность // Ж. Биохимия, 1986. Т. 51, № 4. - С. 531 -545.

8. Бахметев П.И. Рецепт дожить до XXI века // Ж. Естествознание и география, 1901.- №8. С. 103-107.

9. Бахметьев П.И. Итог моих исследований об анабиозе насекомых и план его исследований у теплокровных животных // Изв. Акад. Наук, 1902. Т. 17, №4. -С. 161-166.

10. Бахметьев П.И. Теоретические и практические следствия из моих исследований анабиоза у животных // Ж. Природа, 1912. Т. 1, № 12. - С. 1427-1442.

11. Белошицкий П.В. Некоторые физиологические показатели у крыс в состоянии продолжительной гипотермии: Тез. докл. конференции, посвященной проблеме гибернации и искуственной гипотермии. JL, 1966.-С. 22-24.

12. Белявский М.А., Матвеева Н.Б., Бейлина С.Е. Действие низкомолекулярных фракций из тканей зимоспящих на клеточный цикл и двигательную активность Physarum polycephalum: Сб. науч. тр. / «Механизмы зимней спячки»-Пущино, 1987.-С. 133-137.

13. Брустовецкий H.H., Маевский Е.И., Гогвадзе В.Г., Возможные биохимические механизмы подавления окислительного метаболизма у зимоспящих животных // Механизмы зимней спячки. Пущино, 1987. - С 32-39.

14. Брустовецкий H.H., Амерханов З.Г. Ингибирование транспорта сукцината ß-оксибутирата и глутамата в митохондрии печени гибернирующих сусликов // Ж. эволюц. биохим. физиол., 1989. Т. 25, № 6. - С. 718-723.

15. Брустовецкий H.H., Амерханов З.Г., Гришина Е.В., Маевский Е.И. Влияние токсичности среды на скорость дыхание и окислительное фосфорилирование в митохондриях печени активных и гибернирующих сусликов // Биохимия, 1990. Т. 55, вып. 2, - С. 201-209.

16. Брустовецкий H.H., Егорова М.В., Маевский Е.И. Окислительная активность и AT митохондрий печени активных и гибернирующих сусликов при различных условиях инкубации // Биохимия, 1991. Т. 56, вып. 8.-С. 1522-1527.

17. Буков В.А., Кривицкий В.Н. Новая методика пролонгирования гипотермии для экспериментального и клинического использования: Тез. докл. II Всесоюзного симпозиума "Острая ишемия органов и ранние постишемические расстройства" М., 1978. - С. 378-379.

18. Вальтер А.П. О действии холода на организм животных // Современная медицина, 1863. С. 836-843.

19. Винокуров В.И., Ахременко А.К. Популяционная экология длиннохвостых сусликов Якутии. Якутск: Изд-во Якутского филиала СО АН СССР, 1982.-С. 164.

20. Волкова Н.В., Васильева Т.В., Цвиркун Д.В., Обухова М.Ф., Мартьянов A.A. Увеличение секреторной активности щитовидной железы у крыс после иммунизации трийодтиронин-альбуминовым конъюгатом // Вестн. Моск. ун-та, 2000. Сер. 16. Биология, № 3. - С. 10-13.

21. Гаврилюк Б.К. Устойчивость к пониженной температуре культур клеток и тканей, выделенных из органов зимоспящих животных // Криобиология, 1985.-№3,-С. 28-30.

22. Гольбер JI.M., Кандрор В.И., Крюкова И.В. Гипертиреоз и симпато-адреналовая система. М.: Изд. ВНИИМИ, 1978. - С. 99.

23. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991. - 288 с.

24. Жегунов Г.Ф. Электрофизиологические параметры функционирования сердца сусликов Citellus undulatus в процессе пробуждения от зимней спячки // Криобиология, 1986. — № 1. С. 31-34.

25. Жегунов Г.Ф. Электрофизиологические характеристики функционирования сердца и интенсивность синтеза белков кардиомиоцитов при пробуждении сусликов от зимней спячки // Ж. Эволюц. биохим. и физиол., 1988. -№ 1. С. 40-47.

26. Жегунов Г.Ф. Роль сердца в разогреве тела зимоспящих при пробуждении //Физиол. Ж. им. Сеченова, 1989.-Т. 75,№ 1.с. 105-109.

27. Зиганшин Р.Х. Выделение и биологические свойства пептидов из мозга зимоспящих и холодоадаптированных животных: Автореф. дисс. канд. хим. наук, -М., 1994. 17 с.

28. Зиганшин Р.Х., Свиряев В.И., Васьковский Б.В., Михалева И.И., Иванов В.Т., Кокоз Ю.М., Алексеев А.Е., Корыстова А.Ф., Сухова Г.С.,

29. Емельянова Т.Г. и др. Биологически-активные пептиды, выделенные из мозга гибернирующих сусликов // Ж. биоорганическая химия, 1994. Т. 20,№8-9,-С. 899-918.

30. Иванов К.П. Мышечная система и химическая терморегуляция. М. - Д.: Наука, 1965.- 127 с.

31. Иванов К.П. Биоэнергетика и температурный гомеостаз. Л.: Наука, 1972. -140 с.

32. Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Сухова Г.С. и др. Изучение физиологических эффектов неокиоторфина на зимоспящих и незимоспящих животных: Тез. докл. Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов. -Пущино, 1990.-С. 70.

33. Игнатьев Д.А., Сухова Г.С., Сухов В.П. Эффект серотонина на частоту сердечных сокращений суслика Citellus undulatus зависит от температурыокружающей среды // Ж. эвол. биохим. и физиол., 1991. Т. 27, № 2. - С. 206-210.

34. Игнатьев Д.А., Сухова Г.С., Сухов В.П. Зависимость частоты сердечных сокращений от температуры внешней среды // Журн. эволюц. биохим. и физиол., 1992. Т. 28, № 5. - С. 582-590.

35. Игнатьев Д.А., Загнойко В.И., Сухова Г.С., Баканева В.Ф., Сухов В.П. К вопросу о биололгически активных веществах из тканей гибернирующих животных // Ж. Общей биологии, 1995. Т. 56, № 4. - С. 450-469.

36. Игнатьев Д.А., Воробьев В.В., Зиганшин Р.Х. Влияние некоторых коротких пептидов, выделенных из мозга зимоспящего суслика, на ЭЭГ и поведение крыс //Ж. высшей нервной деятельности, 1996. Т. 46, вып. 5. - С. 10491057.

37. Игнатьев Д.А., Воробьев В.В., Сухова Г.С., Зигпншин Р.Х., Сухов В.П., Темнов A.B., Темнов A.A., Ашмарин И.П. Зимняя спячка и искусственный гипобиоз (изучение нейрохимических факторов гибернации) // Нейрохимия, 1998. Т. 15, № 3. - С. 240-263.

38. Игнатьев Д.А., Михалева И.И., Сосулина Л.Ю., Закарян A.A., Сухова Г.С., Зиганшин Р.Х. TSKY пептид, ингибирующий выход сусликов из спячки // Ж. эвол. биохим. и физиол., 2001. Т. 37, № 3. - С. 201-205.

39. Игнатьев Д.А., Воробьев В.В., Ахременко А.К. Эффекты фракций 1-10 кДа из мозга черного медведя (Ursus arctos) на крыс и мышей // Ж. эвол. биохим. и физиол., 2004. Т. 40, № 4. - С. 432-437.

40. Игнатьев Д.А., Воробьев В.В., Зиганшин Р.Х. Эффекты искусственного аналога пептида TSKY, выделенного из мозга гибернирующих сусликов, на крыс и мышей // Ж. высшей нервной деятельности, 2005, Янв-Фев; Т. 55, вып. 1.-С. 84-90.

41. Калабухов Н.И. Спячка животных. Изд. 3-е. Харьков, 1956. - 276 с.

42. Калабухов Н.И. Спячка млекопитающих. Москва: Наука, 1985. - 154 с.

43. Кассиль Г.Н. Гемато-энцефалический барьер. М.: Изд-во АН СССР, 1963. -408 с.

44. Кокоз Ю.М., Белоярцев Ф.Ф., Фрейдин A.A. Ионные механизмы действия больших доз морфина // Вестник АМН СССР, 1981.-№8.-С. 27-33.

45. Колпаков М.Г., Колаева С.Г., Красс П.М. и др. Механизмы сезонных ритмов кортикостероидной регуляции зимоспящих. Новосибирск: Наука, 1974.- 160 с.

46. Коростышевская И.М., Максимов В.Ф., Мизеров А. В. Сердечная деятельность у краснощеких сусликов при естественном и экспериментальном охлаждении с длительным прерыванием кровотока: Сб. науч. тр. /

47. Эколого- физиологические характеристики природных гипометаболических со-стояний. Пущино, 1992. - С. 3-8.

48. Корякина JI.A. Сезонные изменения в реакции гипофизарно-надпочечниковой системы на действие адреномиметиков у суслика Citellus erythrogenys //Ж. эвол. биохим. и физиол., 1976. Т. 12. - С. 444-437.

49. Крамарова Л.И., Колаева С.Г., Пастухов Ю.Ф., Рожанец В.В., Юхананов Р.Ю. О роли нейропептидов в индукции состояния зимней спячки // Журнал общей биологии, 1984. Т. 45, № 3, - С. 400-409.

50. Кудрявцева Н.Н., Попова Н.К. Содержание серотонина в различных отделах головного мозга во время зимней спячки и пробуждения // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1973. Т. 75, № 4. - С. 44-47.

51. Кудрявцева Н.Н. Содержание серотонина в некоторых органах и тканях краснощеких сусликов во время зимней спячки, бодрствования и при пробуждении: Сб. науч. тр. / Механизмы зимней спячки млекопитающих. -Владивосток: ДНЦ АН СССР, 1977. С. 118-124.

52. Лауэр Н.В. К вопросу об устойчивости к недостатку кислорода дыхательного центра зимнеспящих сусликов: Сб. нач. тр. / Вопросы гипотермии. Киев: Изд. АН УССР, 1959. - С. 134-143.

53. Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия. М.: Медицина, 1971. - 344 с.

54. Малыгин A.M. Влияние на организм животных пролонгированной кранио-церебральной гипотермии: Материалы II Всероссийской конференции /Теоретические проблемы действия низких температур на организм. Л., 1969.-С. 87-88.

55. Малыгин A.M., Логинов С.И. Функциональные изменения сердечнососудистой системы при пролонгировании кранио-церебральной гипотермии: Сб. нач. тр. / Глубокая кранио-церебральная гипотермия (механизмы терморегуляции). Владимир, 1978. - Вып. 6. - С. 70-84.

56. Мартьянов A.A. Физиологические следствия иммунизации крыс ковалентными конъюгатами тиролиберина с белками-носителями: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1992. - 16 с.

57. Мартьянов A.A., Емельянова Т.Г., Обухова М.Ф., Волкова Н.В., Рябинина М.А., Вакулина О.П., Сахаров И.Ю., Ашмарин И.П. Физиологические эффекты активной иммунизации крыс трийодтиронином // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1998, Том 126, № 11, стр. 497-501.

58. Маршак М.Е. Физиологическое значение углекислоты. М. Медицина, 1969. стр. 143.

59. Медведев О.С. Современные методические возможности для изучения механизмов адаптационных реакций сердечно-сосудистой системы //Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия "Физиология человека и животных", 1990, №41, с. 35-67.

60. Негуляев О.В., Сосулина Л.Ю., Сухова Г.С., Зиганшин Р.Х., Михалева И.И., Ашмарин И.П., Кардиотропное действие компонентов пептидных фракций из мозга гибернирующих сусликов // Нейрохимия, 1995. Т. 12, №4.-С. 12-16.

61. Негуляев О.В. Кардиотропные эффекты низкомолекулярных пептидных фракций и ряда веществ, выделенных из тканей зимоспящих животных: Дис. канд. биол. наук,-М., 1996. 131 с.

62. Осадчий О. Е. Нейротензин: физиологические свойства и роль в регуляции функций организма // Успехи физиологических наук, 2004. Т. 35, № 2. -С. 3-21.

63. Пастухов В.А. Эффект центральных и периферических серотонин-реактивных структур на сердечно-сосудистую систему и дыхание // Физиол. ж. им.И.М. Сеченова, 1983.-Т. 69,№ 1.с. 1569-1574.

64. Пастухов Ю.Ф., Чепкасов И.Е. Изменение терморегуляции белых мышей под действием эндогенных веществ из кишечной ткани гибернирующих сусликов // Физиол. ж. СССР, 1983. Т. 69, №11.- С. 1485-1490.

65. Пастухов Ю.Ф. Сон и оцепенение // Итоги науки и техники, 1986. Т. 31. -С. 59-110.

66. Петров И.Р., Гублер E.B. Искуственная гипотремия. Л.: Медгиз, 1961. -С. 227.

67. Погорелов А. Г., Погорелова В. Н., Дубровкин М. И., Демин И. П. Анализ элементного состава (Na/K/Ca) мышечной клетки при ишемии на модели перфузиро-ванного сердца // Цитология, 2000. Т. 42, № 1. - С. 62-65.

68. Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Дубровкин М.И., Демин И.П., Хренова Е.В. Активация специфических мембранных механизмов в миокардиальных клетках на ранних стадиях ишемии // Биофизика, 2002. -Т. 47. №4. С. 744-752.

69. Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Хренова Е.В., Дубровкин М.И., Демин И.П., Гольдштейн Д.В. Роль "спящих" механизмов в регуляции K/Na баланса мышечной клетки сердца при гипоксии // Ж. эвол. биохим. и физиол., 2004. Т. 40, № 4 - С. 353-358.

70. Попова Н.К. Угнетающее действие 5-окситриптофана на теплорегуляцию при пробуждении от зимней спячки // ДАН СССР, 1973. Т. 210, № 2. - С. 496-498.

71. Попова Н.К., Науменко Е.В., Колпаков В.Г. Серотонин и поведение. -Новосибирск: Наука, 1978. 304 с.

72. Попова. Н.К. Серотонин и зимняя спячка: Сб. науч. тр. / Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. Л., 1986. - С. 25-31.

73. Репин И.С. Гиперкапния как средство для временного выключения теплорегуляции при проведении гипотермии у теплокровных: Сб. науч. тр. / Искусственная гипотермия. Ташкент, 1961.- С. 134-139.

74. Слоним А.Д. Экологическая физиология животных. JL: Наука, 1979 (Т. 1, гл. 4.-С. 258).-448 с.

75. Соколов В.Е., Сухов В.П., Сухова Г.С., Игнатьев Д.А. Суточные и сезонные изменения температуры и сердечного ритма длиннохвостого суслика Citellus undulates //Доклады Академии Наук, 1995. Т. 334, № 2. -С. 282-286.

76. Сухова Г.С., Левашова В.Г., Игнатьев Д.А. и др. Кардиотропная активность пептидных фракций из тканей зимнеспящих животных: Сб. науч. тр. -Пущино, 1992.-С. 125-131.

77. Сухова Г.С., Сосулина Л.Ю., Негуляев О.В., Зиганшин Р.Х., Михалева И.И. Об участии 5'-АМФ в кардиотропных эффектах экстрактов из тканей зимоспящих животных // Ж. эвол. биохим. и физиол., 1998. Т. 34, № 1. -С. 43-49.

78. Терещенко О.С., Загнойко В.И. Проявление жаропонижающего и противовоспалительного эффекта в действии низкомолекулярных фракций (1-10 кД), выделенных из тканей зимнеспящих и холодоадаптированных животных // Проблемы криобиологии, 1994. №4. - С. 23-27.

79. Тимофеев H.H. Искусственный гипобиоз. -М.: Медицина, 1983. — 190 с.

80. Тимофеев H.H. Проблемы искусственного гипобиоза: Тез. докл. / V Всесоюзная конференция по теоретическим и практическим аспектам влияния низких температур на организм. Новосибирск, 1982. - С. 179180.

81. Тимофеев H.H. Нейрохимические основы химической терморегуляции и искусственный гипобиоз // Физиология человека, 1985. Т. 11, № 5. - С. 839-851.

82. Тимофеев H.H., Прокопьева Л.П. Нейрохимия гипобиоза и пределы криорезистентности организма: Состояния гипобиоза (нормотермического и сверхглубокого). М.: Медицина, 1997. - 208 с.

83. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988. -568 с.

84. Чернявский Ф. Б. Механизмы зимней спячки млекопитающих. -Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1977. С. 8-17.

85. Чистяков В.Н., Липовецкий Г.С., Кортер А.Я., Зимин Н.К. Метод глубокой гипотермии в условиях эксперимента: Сб. науч. тр. / Научные труды НИИ трансплантологии и искусственных органов. М., 1972. - С. 59-63.

86. Штарк М.Б. Мозг зимнеспящих. Новосибирск: Наука, 1970. - 240 с.

87. Шугалей B.C., Шортанова Т.Х., Самойлик Н.И., Головина Т.Н. Некоторые показатели азотистого обмена и интенсивность спонтанного перикисного окисления в тканях зимоспящих сусликов // Криобиология, 1988. № 1. -С. 43-45.

88. Эмирбеков Э.З., Львова С.П., Энергетический метаболизм при гибернации у представителей разных филогенетических групп // Успехи физиол. наук, 1991, Т. 22, №1.-С. 97-111.

89. Abbotts В., Wang L.C., Glass J.D. Absence of evidence for a hibernation "trigger" in blood dialyzate of Richardson's ground squirrel // Cruobiology, 1979. -V. 16.-P. 179-183.

90. Alekseev A.E., Markevich N.I., Korystova A.F., Terzic A., Kokoz Y.M. Comparative analysis of the kinetic characteristics of L-type Calcium channels in cardiac cells of hibernators // Biophysical Journal, 1996. V . 70, № 2. - P. 786-797.

91. Allen D.G., Orchard C.H. Myocardial contractile function during ischemia and hypoxia// Circulation research, 1987. V. 60, № 2. - P. 153-168.

92. Amorese D.A., Swan H., Bamburg J.R. Extracts from the brains of hibernating and alert ground squirrels: effects on cells in culture // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982. V. 79, № 20. - P. 6375-6379.

93. Andjus R.K. Suspended animation in cooled, supercooled and frozen rats // J. Physiol., 1955,-V. 128, №3.-P. 547-56.

94. Aponte G., Leung P., Gross D., Yamada T. Effects of somatostatin on food intake in rat//Life Sci., 1984. V. 35, № 7. - P. 741-746.

95. Aston R., Cowden W.B., Ada G.L. Antibody-mediated enhancement of hormone activity // Mol. Immunol., 1989. V. 26, № 5. - P. 435-446.

96. Azzali G. II comportamento dell' apparato neurosecretorio ipotalamo-ipofisario nell-ibernatione e nell'ipotermia artificiale // Acta Neuroveget, 1955, V. 11, № 1-4.-P. 72-89.

97. Barraco R.A., Phillis J.W., Campbell W.R., Marcantonio D.R., Salah R.S. The effects of central injection of adenosine analogs on blood pressure and heart rate in the rat // Neuropharmacology, 1986. V. 25, № 7. - P. 675-680.

98. Barraco R.A., Marcantonio D.R., Phillis J.W., Campbell W.R. The effects of parenteral injections of adenosine and its analogs on blood pressure and heart rate in the rat // General Pharmacology, 1987. V. 18, № 4. - P. 405-416.

99. Baudinette R.V. Physiological correlates of barrow gas conditions in the California ground squirrel // Comp. Biochem. and Physiol., 1974. V. 48A, №4. -P. 733-743.

100. Beckman A.L., Liados-Eckman C., Staton T.L., Alder M.W. Physical dependence on morphine fails to develop during hibernation state // Science, 1981.-V. 212. № 4502. P. 1527-1529.

101. Belke D.D., Milner R.B., Wang L.C. Seasonal variations in the rate and capacity of cardiac SR accumulation in a hibernating species // Cryobiology, 1991. V. 28, №4.-P. 354-363.

102. Berne R.M., Rubio R., Curnish R.R. Adenine nucleotide metabolism in the heart // Circ. Res., 1974. V. 35, Suppl. 3. - P. 262-271.

103. Bert Paul. Leçons sur la physiologie comparée de la respiration professées au Muséum d'histoire naturelle. Paris, Londres, Madrid: J B Baillières, 1870. -In-8 de XXXV, (1).-588 p.

104. Borlongan C.V., Wang Y., Su T.P. Delta opioid peptide (D-Ala 2, D-Leu 5) enkephalin: linking hibernation and neuroprotection // Front Biosci., 2004. V. 9.-P. 3392-3398.

105. Bronnikov G., Dolgacheva L., Zhang S.J., Galitovskaya E., Kramarova L., Zinchenko V. The effect of neuropeptides kyotorphin and neokyotorphin on proliferation of cultured brown preadipocytes // FEBS Lett., 1997. V. 407, № l.-P. 73-77.

106. Burlington R.F., Darvish A. Low temperature perfomance of isolated working hearts from a hibernator and nonhibernator // Physiol Zool, 1988. V. 61, № 5. -P. 387-395.

107. Burlington R.F., Milson W.K. Differential effects of acetylcholine on coronary flow in isolated hypothermic hearts from rats and ground squirrels // J. of Experim. Biology, 1993.-V. 185.-P. 17-24.

108. Castex Ch., Bras V., Hoo-Paris R., Sutter B. Ch. J. Pancreatic A cell response to arginine in the hibernating hedgehog (Erinaceus europaeus) // Gen. And Comp. Endocrinol., 1983.-V. 50, № 1.-P. 81-86.

109. Chatfield P.O., Lyman C.P. Circulatory changes during processes of arousal in hibernating hamster // Amer. J. Physiol., 1950. V. 163. - P. 566-574.

110. Connaughton P.J., Lewis F.J. Hypothermia below 25°C for one day in the rat // J. Appl. Physiol., 1962.-V. 17, № l.-P. 107-109.

111. Dawe A.R., Spurrier W.A. Effects of hibernation and season on formed elements of the blood of the 13-lined ground squirrel // Fedn. Proc. Fedn. Am. Socs. exp. Biol., 1968.- V. 27,-P. 2715.

112. Dawe A.R., Spurrier W.A. Hibernation induced in ground squirrels by blood transfusion// Science,-N.Y., 1969.-V. 163.-P. 298-299.

113. Dawe A.R., Spurrier W.A. More specific Characterization of the blood "trigger" for Hibernation// (Hibernation-Hypothermia IV Symp.) Cryobiology, 1971. V. 8.-P. 302-310.

114. Draskozy P.R., Liman C.P. Turnover of catecholamines in active and hibernating ground squirrels // J. Pharmacol. Exper. Therap., 1967. V. 155, № l.-P. 101-111.r

115. Dubois Raphaël. Physiologie comparée de la Marmotte. Etude sur le mécanisme de la thermogénèse et du sommeil chez les mammifères. Paris: Masson et Cie éditeurs, 1896.-268 p.

116. Dubois V., Nedjar-Arroume N., Guillochon D. Influence of pH on the appearance of active peptides in the course of peptic hydrolysis of bovine haemoglobin // Prep Biochem Biotechnol, 2005. V. 35, № 2. - P. 85-102.

117. Duker G.D., et al. Hypothermic effects on cardiac action potentials: difference between hibernator, hedgehog and a nonhibernator, guinea pig. In book: Living in the Cold. -N.-Y: Elsevier., 1986, p.565-572.

118. Echlin P. Low-temperature microscopy and analysis. New York: Plenum Press, 1992. - 539 p.

119. Feist D.D., Blocade of arousal from hibernation by inhibition of norepinephrine synthesis in the golden hamster // Life Sci., 1970. V. 9, pt. 1. - P. 1117-1125.

120. Feist D.D., Galster W.A. Changes in hypothalamic catecholamines and serotonin during hibernation and arousal in the arctic ground squirrel // Comp. Biochem. Physiol. A, 1974. V. 48, № 4. - P. 653-662.

121. Figlewicz D.P., Sipols A., Porte D.Jr., Woods S.C. Intraventricular bombesin can decrease single meal size in the baboon // Brain Res. Bull., 1986. V. 17, № 4.-P. 535-537.

122. Florant G.L., Weitzaman E.D., Jayant A., Cote L.J. Plasma catecholamine levels during cold adaptation and hibernation in woodchucks (Marmota monax) // J. Therm. Biol., 1982.-V. 7,№3.-P. 143-146.

123. Folk G. E. Textbook of environmental physiology. 2nd Edition. Philadelphia: Lea a. Febiger, 1974. - 468 p.

124. Freed W.J., Perlow M.J., Wyatt R.J. Calcitonin: inhibitory effect on eating in rats // Science, 1979. V. 206, № 4420. - P. 850-852.

125. Galster W.A., Morrison P.R. Gluconeogenesis in Arctic ground squirrels between periods of hibernation // Amer. J. Phisiol., 1975. V. 228, № 1. - P. 325-330.

126. Galster W.A. Failure to initiate hibernation with blood from the hibernating arctic ground squirrel, Citellus undulatus, and eastern woodchuck, Marmota monax II Therm. Biol., 1978. V. 3, № 2. - P. 93.

127. Gharib A., Sarda N., Bobillier P., Pacheco H. Autoradiographic localization of 14C.8-S-adenosyl-L-homocysteine in rat brain //Neurosci. Lett., 1984. V. 44, №2.-P. 205-209.

128. Giaja J. Hypothermie, hibernation et poikilothermie experimentale // Biologie médicale (Paris), 1953. V. 42, № 6. - P. 545-552.

129. Giaja J., Markovic L. Hypothermia and the toxicity of carbon dioxide // Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des sciences, 1953. V. 236, №25.-P. 2437-2439.

130. Godlevsky L.S., Shandra A.A., Mikhaleva I.I., Vastyanov R.S., Mazarati A.M. Seizure-protecting effects of kyotorphin and related peptides in an animal model of epilepsy //Brain Res Bufll., 1995. V. 37, № 3. - P. 223-226.

131. Goldstein J.I., Newbury D.E., Echlin P., Joy D.C., Fiori C., Lifshin E. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: A Text for Biologists, Materials Scientists, and Geologists, 2nd edition. New York: Plenum Press, 1992. 673 p.

132. Hawkins M.F., Avery D.D. Effects of centrally-administered bombesin and adrenalectomy on behavioral thermoregulation and locomotor activity // Neuropharmacology, 1983.-V. 22,№ 11.-P. 1249-1255.

133. Hill J.L., Gettes L.S. Effect of acute coronary artery occlusion on local myocardial extracellular K activity in swine // Circulation, 1980. P. 61, № 4. -P. 768-778.

134. Holder A.T., Aston R., Preece M.A., Ivanyi J. Monoclonal antibody-mediated enhancement of growth hormone activity in vivo // J. Endocrinol., 1985. V. 107, №3.-P. 9-12.

135. Hudson J.W. Temperature regulation and torpidity in pygmy mouse Baiomys taylori II Physiol. Zool., 1965. V. 36. - P. 243-254.

136. Inokuchi A., Oomura Y., Nishimura H. Effect of intracerebroventricularly infused glucagon on feeding behavior // Physiol. Behav., 1984. V. 33, № 3. -P. 397-400.

137. Jacob J., Girault J.M., Piendaries R. Actions of 5-hydroxytryptamine and 5-hydroxytryptophan injected by various routes on the rectal temperature of rabbit // Neuropharmacology, 1972. V. 11, № 1. - P. 1-16.

138. Jansky L., Lehouckova M., Vibiral S., Bartunkova R., Stefl B. Effect of serotonin on thermoregulation of a hibernator (Mesocricetus auratus) // Physiol, bohemosl., 1973.-V. 22, №2.-P. 115-124.

139. Jansky L. Neuropeptides and the central regulation of body temperature during fever and hibernation // J. Therm. Biol., 1990. V. 15, № 3-4. - P. 329-347.

140. Johanson B.W. Heart and circulation in hibernants. In: Fisher K. C. et al. (Hrsg.) Mammalian Hibernation III. - Edinburgh, London: Oliver & Boyd, 1967. -P. 200-218.

141. Johansson B.W. Cardiac Responses in Relation to Heart Size // Cryobiology, 1984. V.21, № 6. - P. 627-636.

142. Joseph L.I., Desai K.B., Ganatra R.D., Patel M.N. Thyroid function and thyrotropin levels in rabbits immunized to produce antibodies against thyroid hormones//Nucl. Med. Biol., 1987.-V. 14, № 5. P. 511-514.

143. Karelin A.A., Philippova M.M., Ivanov V.T. Proteolytic degradation of hemoglobin in erythrocytes leads to biologically active peptides // Peptides, 1995.-V. 16, №4 -P. 693-697.

144. Kase R., Sekine R., Katayama T., Takagi H., Hazato T. Hydrolysis of neo-kyotorphin (Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg) and Met.enkephalin-Arg6-Phe7 by angiotensin-converting enzyme from monkey brain // Biochem Pharmacol., 1986. -V. 35, № 24. P. 4499-4503.

145. Kayser Ch., Aron M. Le cycle saisonnier des glandes endocrines chez les hibernants //Arch. anat. histol. et embriol., 1950. -V. 33. P. 21-42.

146. Kayser Ch., Schwartz J. Evolution saisonnière de l'élimination urinaire des 17-cetosteroides et des steroides formaldehydogeniques chez le hamster ordinaire (<Cricetus cricetus) // Comp. Rend. Soc. Biol., 1960. V. 154, № 4. - P. 778.

147. Kayser C. The physiology of natural hibernation. Oxford:Pergamon Press, 1961.-325 p.

148. Kayser Ch., Malan A. Central nervous system and hibernation // Experientia, 1963.-V. 19.-P. 441-445.

149. Kayser C. Hibernation // Physiological mammology. New York: London Acad. Press., 1965.-V. 2.-P. 179-211.

150. Kleber A.G. Extracellular potassium accumulation in acute myocardial ischaemia // J. Mol.Cel.Cardiol., 1984. V. 16, № 5. - P. 389-394.

151. Kolaeva S.H., Lee T.F., Wang L.C., Paproski S.M. Effect of intracerebroventricular injection of neokyotorphin on the thermoregulatory responses in rats // Brain Res. Bull., 1990. V. 25, № 3. - P. 407-410.

152. Kramarova L.I., Kolaeva S.H., Yukhanonov R.T., RozhanetsV.V. Content of DSIP, enkephalins, ACTH in some tissues of active and hibernating ground squirrels // Comp. Biochem. and Physiol., 1983. V. 74, № 1. - P. 31-33.

153. Laborit H., Huguenard P. L'hibernation artificielle par nioyens pharmacodynamiques et physiques en chirurigie // Presse med., 1951. V. 59, №64.-P. 1329-1332.

154. Laborit H., Huguenard P. L'hibernation artificielle chez le grand choque // Presse med., 1953. -V. 61, № 49. p. 1029-1030.

155. Laborit H., Wober B., Chekler C., Baron C. Etude préliminaire concernant le role possible du tissu conjonctif dans l'etablissment de l'hypothermie profonde // Adressologie, 1965. -V. 6, № 1. P. 63-75.

156. Lachiver F. Cycle annual de l'oide thyroidienne d'un hibernant: le Lerot (Eliomys guercinus) // J. Physiol., 1952. V. 44, № 2. - P. 279-282.1 fjn

157. Landau B.R., Dawe A.R. Respiration in the hibernation of the 13-lined ground squirrel // Amer. J. Physiol, zool., 1958. V. 194, № 1. - P. 75-82.

158. Langendorff O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen // Eduard Friedrich Wilhelm Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere (Bonn), 1895. V. 61. -P. 291-332.

159. Langendorff O. Geschichtliche Betrachtungen zur Methode des überlebenden Warmblüterherzens IIMünchener medizinische Wochenschrif, 1903. -V. 50. -P. 508-509.

160. Lee T.F., Nürnberger F., Wang L.C.H. Possible involvement of endogenous adenosine in hibernation. In: Life in the cold. - Boulder-San-Francisco-Oxford: Westview Press., 1993. - P. 315-322.

161. Lopes S.C., Fedorov A., Castanho M.A. Lipidic membranes are potential "catalysts" in the ligand activity of the multifunctional pentapeptide neokyotorphin. // Chembiochem., 2005. V. 6, № 4. - P. 697-702.

162. Louis- Coindet J., Sarda N., Pacheco H., Jouvet M. Effect of S-adenosyl-L-homocysteine upon sleep in p-chlorophenylalanine pretreated rats // Brain Res., 1984. V. 294, №2. - P. 239-245.

163. Lyman C.P., Chatfield P.O. Physiology of hibernation in mammals // Physiol. Rev., 1955. V. 35, № 2. - P. 403-447.

164. Lyman C.P. Oxygen consumption, body temperature and heart rate of woodchucks entering hibernation // Amer. J. Physiol., 1958. V. 194, № 1. - P. 83-91.

165. Lyman C.P., O'Brien R.C. Mammalian hibernation. XVIII. Circulatory changes in the thirteen- lined ground squirrels during the hibernating cycle // Bull. Museum Comp. Zool. Harvard Coll., 1960. V. 124. - P. 352-372.

166. Lyman C.P., O'Brien R. Autonomic control of circulation during the hibernating cycle in ground squirrels // J. Physiol., 1963. V. 168. - P. 477-499.

167. Lyman C.P., Willis J.S., Malan A., Wang L.C.H. Hibernation and torpor in mammals and birds. N.Y.: Lond. Acad. Press, 1982. - 303 p.

168. Margules D.L. Beta-endorphin and Endoloxon: Hormones of the Autonomic Nervous System for the Conservation of Expenditure of Bodily Resources and Energy in Anticipation of Famine or Feast // Neurosci. and Biobehav. Rev., 1979. -V. 3. P. 155-162.

169. Meeker R.B., Myers R.D., McCaleb M.L., Ruwe W.D., Oeltgen P.R. Suppression on feeding in the monkey by intravenous or cerebroventricular infusion of woodchuck hibernation trigger // Physiologist, 1980. V. 22. - P. 98.

170. Mihailovic, L. J. Cortical and subcortical electrical activity in hibernation and hypothermia. In: Hibernation and Hypothermia, Perspectives and Challenges. - New York: Elsevier, 1972. - P. 487-534.

171. Mikhaleva I.I., Svieryev V.I., Vaskovsky B.V. et al. Isolation, identification and specific biological activity of peptydes from hibernating ground squirrels // Chemistry of Peptides and Proteins. New York. 1989. - V. 5. - P. 538-541.

172. Mikhaleva I.I., Svieryev V.I., Vaskovsky B.V. et al. The peptides from brain of hibernating ground squirrels and their biological activity. // Chemistry of Peptides and Proteins / 1993. V. 5/6, part A. - Berlin-New York: DWI Reports. - P. 299-308.

173. Morrison P., Galster W. Patterns of hibernation in the arctic ground squirrel // Can. J. Zool., 1975. V. 53, № 9. - P. 1345-1355.

174. Mrosovsky N. Hibernation and the hypothalamus. New York: Appleton-Century-Crofts, 1971.-287 p.

175. Muchlinski A.E., Ho F.J., Chew P., Yamada T. The concentrations of four neuropeptides in various brain areas of summer active and hibernating Spermophilus lateralis // Comp Biochem Physiol C., 1983. V. 74, № 1. - P. 185-189.

176. Munro D., Thomas D.W. The role of polyunsaturated fatty acids in the expression of torpor by mammals // Zoology (Jena), 2004. V. 107, № 1. - P. 29-48.

177. Myers R.D., Oeltgen P.R., Spyrrier W.A. Hibernation " trigger" injected in brain induces hypothermia and hypophagia in the monkey // Brain Res. Bull. 1981.-V. 7, №6.-P. 691-695.

178. Narita H., Nagao T., Sato M., Nakajima H., Kiyomoto A. Ischemia-reperfiision induced elevation of diastolic tension in the isolated guinea pig heart and the effects of calcium antagonists // Jpn Heart J., 1983. V. 24, № 2. - P. 277-288.

179. Nieschlag E., Herrmann J., Usadel K.H., Schwedes U., Schoffling K., Kruskemper H.L. Thyroid hypertrophy and hyperfunction caused by active immunization with thyroid hormones // J. Endocrinol., 1973. V. 57, № 3. - P. 555-556.

180. Oeltgen, P.R., Bergman, L.C., Spurrier, W.A., Jones, S.B. Isolation of a hibernation inducing trigger(s) from the plasma of hibernating woodchucks // Prep. Biochem., 1978. V. 8, № 2-3. - P. 171-188.

181. Oeltgen P.R., WalshJ.W., Hamann S.R., Randall D.C., Spurrier W.A., Myers R.D. Hibernation "trigger": Opioid-like inhibitory action on brain function of monkey. Pharmacol//Biochem. Behav. 1982.-V. 17, №6.-P. 1271-1274.

182. Oeltgen P.R., Nilekani S., Nichols P.A., Spurrier W.A., Su T.P. Further studies on opioids and hibernation: d-opioid receptor ligand selectively induced hibernation in summer-active ground squirrels // Life Sci., 1988. V. 43, № 19. -P. 1565-1574.

183. Pajunen I. A comparison of the heart rate at different ambient temperatures during long-term hibernation in the garden dormouse, Eliomys quercinus L. // Cryobiology, 1992. V. 29, № 3. - P. 414-421.

184. Pell J.M., Aston R. Active immunization with a synthetic peptide region of growth hormone: increased lean tissue growth // J. Endocrinol., 1991. V. 131, № l.-P. 1-4.

185. Pierce G.N., Czubryt M.P. The contribution of ionic imbalance to ischemia/reperfusion-induced injury// J. Mol. Cell. Cardiol., 1995. -V. 27, № 1. -P. 53-63.

186. Pogorelov A.G., Allachverdov B.L. Microprobe quantitation procedure that calculates concentrations of chemical elements in soft biological tissue sections //Micron &Microsc. Acta, 1984.-V. 15.-P. 177-180.

187. Pogorelov A., Allachverdov B., Burovina I., Mazay G., Pogorelova V. Study of potassium deficiency in cardiac muscle: quantitative X-ray microanalysis and cryotechniques // J. of Microscopy/Oxford, 1991. V. 162, pt. 2. - P. 255-269.

188. Pogorelov A., Pogorelova V., Repin N., Mizin I. Quantitative biological electron probe microanalysis with a wavelength dispersive spectrometer // Scanning Microscopy, Suppl., 1994. V. 8. - P. 101-108.

189. Pogorelov A., Pogorelova V., Smirnova S., Spiridonov N. EPMA of dried biological substances // Mikrokimica Acta, 1994. V. 115/116. - P. 405-411.

190. Popova N.K., Konusova A.V. Brain and peripheral effects of serotonin on thermoregulation // Biogenic Amines, 1985. V. 2, №3. - P. 203-210.

191. Popovic V. Lethargic hypothermia in hibernators and nonhibernators // Ann. N.Y. Acad. Sci., 1959. -V. 80. P. 320-331.

192. Popovic V. Endocrines in hibernation // Bull. Mus. Comp. Zool., 1960. V. 124. -P. 104-130.

193. Popovic V. Physiological characteristics of rats and ground squirrel during prolonged lethargic hypothermia // Am. J. Physiol. 1962. V. 199, № 3. - P. 467-471.

194. Popovic V.M., Davidovic V. Le taux des catecholamines surrenalinnes shez spermopphille en cours des differences saisons de l'annel // J. Physiol. (France), 1972. V. 65, № 5. - P. 678-679.

195. Reinhard F.G. Suppression of DNA- and protein biosynthesis in cell cultures by a peptide isolated from the brain of aestivating lungfish Protopterus // Acta Universitatis Carolinae 1981 Biologica, 1979. -V. 9. - P. 275-276.

196. Sauerbier I., Lemmer B. Seasonal variations in the turnover of noradrenaline of active and hibernating hedgehogs {Erinaceus europaeus) II Comp. Bio-chem. Physiol., 1977. V. 57, № 1. - P. 61-63.

197. Shine K.I. Ionic events in ischemia and anoxia // Am. J. Pathol., 1981. V. 102, №2.-P. 256-261.

198. Silverman H.S., Stern M.D. Ionic basis of ischaemic cardiac injury: insights from cellular studies // Cardiovasc. Res., 1994. V. 28, № 5. - P. 581-597.

199. Smith AU. Experimental hypothermia in animals // Lectures on the scientific basis of medicine., 1955-1956.-V. 5.-P. 19-35.

200. Spafford D., Pengelley E. The influence of neurohumor serotonin on hibernation in the golden-mantled ground squirrel Citellus lateralis II Comp Biochem. and Physiol. A, 1971. V. 38, № 2. - P. 239-250.

201. Spurrier W.A., Oeltgen P.R., Myers R.D. In: Living in the cold // Abstr. of Int Symp. California Stanford Univ., 1985. - P. 236.

202. Swan H, Jenkins D, Knox K. Anti-metabolic extract from the brain of Protopterus aethiopicus //Nature, 1968. -V. 217, № 129. P. 671.

203. Swan H., Schatte C. Antimetabolic extract from the brain of the hibernating ground squirrel (C. tridecemlineatus) // Science, 1977. V. 195, № 4273. - P. 84-85.

204. Swan H., Becker P.L., Schatte C.L. Physiologic effects of brain extracts from hibernating and non-hibernating rodents on isolated perfused rat heart // Comp Biochem Physiol C., 1981. V. 68C, № 2. - P. 175-179.

205. Swan H., Reinhard F.G., Caprio D.L., Schatte C.L. Hypometabolic brain peptide from vertebrates capable of torpor // Cryobiology, 1981. V. 18, № 6. - P. 598602.

206. Szentmiklosi A.J., Nemeth M., Szegi J. Papp J.G., Szekeres L. Effect of adenosine on sinoatrial and ventricular automaticity of the guinea pig // Naunyn-Scmied. Arch. Pharmacol., 1980.-V. 311, № 2.-P. 147-149.

207. Takagi H., Shiomi H., Ueda H., Amano H. A novel analgesic dipeptide from bovine brain is possible Met-enkephalin releaser // Nature, 1979. V. 282, № 22.-P. 410-412.

208. Takagi H., Shiomi H., Fukui K., Hayashi K., Kiso Y., Kitagawa K. Isolation of a novel analgesic pentapeptide, neo-kyotorphin, from bovine brain // Life Sciences, 1982.-V. 31,№ 16-17.-P. 1733-1736.

209. Takagi H. Physiological and pharmacological actions of a neuroactive dipeptide, kyotorphin, and its precursor, L-arginine, and clincal application // Nippon-Yakurigaku-Zasshi, 1990. V. 96, № 3. - P. 85-96.

210. Toien O., Drew K.L., Chao M.L., Rice M.E. Ascorbate dynamics and oxygen consumption during arousal from hibernation in Arctic ground squirrels // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2001. - V. 281, № 2. - P. 572-583.

211. Ueda H., Ge M., Satoh M., Takagi H. Non-opioid analgesia of the neuropeptide, neo-kyotorphin and possible mediation by inhibition of GABA release in the mouse brain//Peptides, 1987.-V. 8, №5.-P. 905-909.

212. Uuspaa V.J. The 5-hydroxytryptamine content of the brain and some other organs of the hedgehog during activity and hibernation // Experientia, 1963. V. 19.-P. 156-158.

213. Vanheel B., Van de Voorde J. Differential influence of extracellular and intracellular pH on K+ accumulation in ischaemic mammalian cardiac tissue // J. Mol. Cell. Cardiol., 1995. V. 27, № 7. - P. 1443-1355.

214. West G.A., Belardinelli L. Correlation of sinus slowing and hyperpolarization caused by adenosine in sinus node // Europ. Jn. Physiol., 1985. V. 403, № 1. -P. 75-81.

215. Winn H.R., Welsh J.E., Rubio R., Berne R.M. Brain adenosine production in rat during sustained alteration in systemic blood pressure // Am. J. Physiol., 1980. -V. 239,№5.-P. 636-641.

216. Wojtczak L., Schonfeld P. Effect of fatty acids on energy coupling processes in mitochondria//Biochim Biophys Acta., 1993.-V. 1183,№ 1.-P.41-57.

217. Yarbrough G.G., McGuffin- Clineschimidt J.C. In vivo behavioral assessment of central nervous system purinergic receptors // Eur. J. Pharmacol., 1981. V. 76, №2-3.-P. 137-144.

218. БСА бычий сывороточный альбумин

219. ГГНС гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

220. КДД конечное диастолическое давление1. К калий

221. КТ киоторфин (дипептид Туг-А^)

222. НАФ неполный адъювант Фрейнда

223. НКТ неокиоторфин (пентапепид 8ег-Туг-А1^)

224. ПАФ полный адъювант Фрейнда

225. ЧСС частота сердечных сокращений1. ЭКГ электрокардиограмма1. С02 углекислый газ1. Ог кислород

226. Р(т> уровень значимости по непараметрическому парномукритерию Вилкоксона.

227. Р(и> уровень значимости по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.10. Используемые сокращения1. АД артериальное давление

228. БСА бычий сывороточный альбумин

229. ГГНС гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

230. КДД конечное диастолическое давление1. К калий

231. КТ киоторфин (дипептид Туг-Ал^)

232. НАФ неполный адъювант Фрейнда

233. НКТ неокиоторфин (пентапепид ТЬг-8ег-ЬуБ-Туг-А^)

234. ПАФ полный адъювант Фрейнда

235. ЧСС частота сердечных сокращений1. ЭКГ электрокардиограмма1. СОг углекислый газ1. Ог кислород

236. Р(т) ~ уровень значимости по непараметрическому парномукритерию Вилкоксона.

237. Р(и> уровень значимости по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.