Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности функционирования митохондрий печени сусликов (Citellus undulatus) в состоянии бодрствования и зимней спячки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности функционирования митохондрий печени сусликов (Citellus undulatus) в состоянии бодрствования и зимней спячки"

ргз ол

51

{., ^ ¡¿¿и

российская академия наук институт теоретической и экспериментальной биофизики

На правах рукописи

амерханов Зариф Гарриевич

УДК 577.121.7:577.23

особенности функционирования митохондрии печени сусликов (СИеПиз игкШгагиз) в состоянии бодрствования И зимнел спячки

03.00.02. - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

пущино - 1994

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР и в Институте биофизики клетки РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, H.H. БРУСТОВЕЦКШ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю.В. ЕВТОДИЕНКО

кандидат биологических наук, ' A.A. ШАРЫШЕВ

Ведущая организация - Институт физико - химической биологии им А.Н.Белозерского, МГУ

Защита диссертации состоится "20" 1994 г. на /¿7 **

заседании специализированного совета Д 200.22.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (142292 Московская обл., г. Пущино, ИТЭБ РАН).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированно: совета, кандидат биологических нау:

П.А.Нелипович

Актуальность проблемы. Для многих представителей животного мира характерна способность резко снижать уровень жизнедеятельности и в таком состоянии переживать неблагоприятные условия среды. Для гомойотермов возникновение такого рода состояний сопряжено с мощной перестройкой регуляторных механизмов и всего метаболизма. Такое явление выделяют среди прочих случаев гипобиоза как зимнюю спячку, или гибернацшо (hibernation). У истинных зимнеспящих спячка продолжается 5-8 месяцев и состоит из единичных циклов (баутов) продолжительностью от нескольких дней до трех недель. В перерыве между Оаутами животное возвращается в нормотермное состояние на несколько часов или дней. В течение же баута t& тела у них падает до О - +4°С, число сердечных сокращений - до 5 ударов в мин., число дыхательных движений - до I - 2-х в мин., потребление 02 снижается в 50 - 100 раз (см. Калабухов 1985; Wang 1988). Эти изменения контролируются нейро-гуморальшми механизмами и сопровождаются изменениями на биохимическом, клеточном , тканевом, физиологическом уровнях. В частности, в механизмах входа, поддержания и выхода животных из состояния гибернации могут участвовать процессы клеточного дыхания и окислительного фосформирования.

Действительно, начиная с 60-х годов было показано, что митохондрии (MX) гибернируицих животных обладают существенно меньшей скоростью дыхания в фосфорилирущем и разобщенном состоянии (Chaffee, 1961; Roberts and Chaffee, 1972;Pehowich and Wang,1984; Fedotclieva et al.,1985; Gehnriolv and JLprille, 1988) .Однако, механизмы ингибирования дыхания MX гибернирукщих животных остаются во многом еще не выяснены. Показано, что снижение скорости дыхания MX в состоянии зимней спячки не связано с изменением количества цито-хромов. При этом активность аденилаттранслоказы в таких MX в 4 раза ниже (Lerner et al.,1972). Авторы считают причиной снижения скорости дыхания подавление активности аденилаттранслоказы КоА-эфирами ацилов жирных кислот. В других работах наблюдали снижение пула адениновых нуклеотидов в MX (Gelmrich and Aprille, 1988; Бронников, 1990). Г.Е.Вронников с соавторами связывают с этим значительные изменения в кинетических свойствах АТРазы в MX печени гибернирующих сусликов. На основе ингибиторного анализа и "теории контролирующие сил" приводятся данные в пользу того, что окислительное фосфорилирование в MX гиберн. животных лимитируется Н^АТРазой. Однако, ингибирование ^-АТРазы и ATP/ADP-транслоказы не может объяснить ингибирование дыхания MX печени гибернирующего суслика на 70% в присутствии разобщителя, наблюдаемое как в наших работах, так и в большинстве других работ. Другие авторы наблюдали значительное подавление сукцинатоксидазной активности в MX гибернирующих сусликов, которое приблизительно наполовину снималось изоцитратом (Кондрашова и др., I98S). В этих работах обосновывается мнение, что наблюдаемое снижение скорости дыхания MX целиком обусловлено ингибированием сукцинатдегидрогеназн в том числе за

- I -

счет накопления оксалоацетата. Однако, такое предположение не позволяет объяснить столь ке высокий уровень ингибирования дыхания в присутствии других субстратов (см. Fedotoheva et al.,1985: Gehnrich and Aprille, 1988). Вместе с тем, имеется работа (Roberts and Chafíee,1972) в которой авторами было показано, что, кроме одновременного ингибирования большинства дегидрогеназ, причиной наблюдаемого подавления окислительной активности ИХ гибернирущих животных может быть подавление на уровне дыхательной цепи.

Целью настоящей работы являлось изучение механизмов, лежащих в основе угнетения окислительной активности МХ печени гибернирувдих сусликов (Cltellua vndulatua), возможных путей ее регуляции и выяснениие причин подавления других митохондриальных функций.

Основные задачи исследования были следущие;

1) В связи с имеющимися в литературе противоречиями проанализировать в наших условиях параметры дыхания МХ активных и гибернирукщих сусликов в присутствии различных субстратов и в различных метаболических состояниях.

2) Выявить стадии в механизме функционирования МХ, ингибиро-вание (изменение) которых могло бы являться причиной наблюдаемого подавления дыхания в суспензии МХ печени гибернирующего суслика.

3) Показать, что частичное ингибирование дыхательной цепи и вызванная этим частичная деэнергизация МХ печени активных животных моделирует изменения характерные для МХ гибернирущих животных.

4) Изучение возможных механизмов регуляции окислительной активности в МХ гибернирущих животных, в частности, исследование воздействия на МХ гиберниругацих и активных сусликов ионов Са2+.

Научная новизна работы. Нами показано, что снижение скорости дыхания в суспензии интактных МХ печени гибернирующего суслика по сравнению с МХ активных животных наблюдается во всех метаболических состояниях и в присутствии различных, как НАДН-зависимых, так и флавопротеид-зависимых субстратов. Кроме того, в МХ гибернирую-щих сусликов наблюдается снижение скорости транспорта ионов К+и снижается скорость транспорта субстратов, а также падает внутримитохондриальная концентрация АТР. Нами было показано, что общей причиной наблюдаемых явлений является ингибирование дыхательной цепи в области boj комплекса и связанное с этим снижение мембранного потенциала. Впервые показано, что повышение концентрации ионов Са2+ вызывает почти полное восстановление максимальной скорости дыхания МХ гибернирующего суслика и снимает "блок" в области boj комплекса дыхательной цепи. Обнаружено, что действию Са2+ на МХ гибернирующего суслика препятствуют ингибиторы фосфолипазы Ag, на основании чего выдвинута гипотеза о том, что появление и исчезновение "блока" в области boj-комплекса при переходе из состояния гибернации в активное и наоборот связано с изменением активности митохондриальной фосфолипазы А2 и вызываемым этим ферментом изменением физико-химического состояния митохондриальной мембраны.

- 2 -

Научно-практическая значимость работы. Проведенные исследования расширяют представления о внутриклеточных механизмах возникновения и поддержания природных гипометаболкческих состояний у млекопитающих, а также о возможных путях регуляции биоэнергетических процессов в клетке. Результаты выполненной работы могут в дальнейшем найти применение в области биофизики, биохимии и физиологии, а также в области экспериментальной медицины для решения проблем, связанных с искусственным гипобиозом, консервацией органов и тканей, выживанием в экстремальных условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представления на XIX Всесоюзной школе-семинаре "Механизмы зимней спячки млекопитающих", Пущшю, 1988. г. ; на II Международном симпозиуме посвященном проблемам гипотермии (Living in the cold -11), Страстбург (Франция), 1989 г.; на VI Европейской биоэнергетической конференции, (Нидерланды), 1990 г.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы , описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения в пяти главах, заключения , выводов и списка цитируемой литературы (¿^Зссылок). Работа изложена наЮОстраницах, включаая 8 таблиц и 17 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах были использованы суслики Gltellua unctulatus. Животных отлавливали в Якутии в летнее время. Зимой содержали при t°2-4°C. В опыты брали глубоко спящих (гибернирующих) животных с t° тела 4-6°С. Для контроля использовали животных в активном состоянии между Свутами спячки, у которых в момент забоя t° тела была 37°С. MX печени выделяли по модифицированной методике Schneider (1948) в среде, содержащей 0,3 М сахарозу, 10 мМ трис-НС1, рН 7,4. Концентрацию белка в суспензии MX определяли методом Лоури. Скорость дыхания MX измеряли полярографически с помощью электрода Кларка при t° 27°С. и концентрации белка в пробе 1-2 мг/мл. Стандартная среда инкубации: 0,25 М сахароза, 3 мМ НзР04, 3 мМ MgClg, 10 мМ трис, рН 7,4. При необходимости концентрация Са2+ задавалась с помощью Са^+- ЭГТА буфера, засчитанного согласно работе (Fabiato A. and Р. 1979). Вход и выход К+ из MX

измеряли с помощью Са2+ и К+-селективных электродов. Аккумуляцию ионов К+ оценивали по набуханию MX в среде, содержащей 200 мМ сахарозы, 30 мМ ацетата калия, 10 мМ трис-HCi, рН 7,4, в присутствии 4 мМ сукцината. Проницаемость MX для анионов (субстраты окисления, НдР04 Уценивали по набуханию MX в 100 мМ растворах их аммонийных, солей, содержащих 20 мМ трис-HCl, рН 7,4. О набухании MX судили по снижению оптической плотности при 520 нм. Величину мембранного потенциала (Ду) оценивали по распределению ионов К+ в присутствии валиномицина (Hitohell and Moyle,1969) и по распределению липофильного катиона ТФФ+, с помощью

- 3 -

ТФФ+-селективного электрода (Karao et al.,1979). Концентрацию свободных кирных кислот (СЖК) в суспензии ' MX определяли по образованию окрашенного комплекса предварительно экстрагированных СЖК с ионами меди в присутствии дифенилкарбазида (Nixon and Chan,1979). Сукцинат-феррицианид, Сукцинат-ОоНл И QgHg-UKTOxpoM С-редуктазная активность измерялась на двухволновом спектрофотометре согласно общепринятым методам (Ziegler and Rieske.1967; Lee et al.1967; Hatefi,1978). Концентрацию ATP.ADP.AMP и глюкозо-6-фосфата (по накоплению последнего в присутствии гексокиназы оценивали скорость синтеза АТР) определяли энзиматически, регистрируя флуоресценцию НАД(Ф)Н (Williamson and Corkey,1969).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Торможение дыхания митохондрий печени гибернирувдего суслика

Полученные результаты показали, что скорость дыхания MX гибе-рнирупцих сусликов заметно снижена при окислении как ФАД-зависимых (сукцинат) ,так и НАЦ.Н-зависимых (/5-оксибутират) субстратов во всех метаболических состояниях (табл.1.). В особенности значительное подавление окислительной активности MX печени гибернирувдих сусликов по сравнению с MX активных животных наблюдается в фосфо-рилирувдем (Vj) и в разобщенном (Уднф) состояниях (см. также габл.З.). Стпень ингибирования дыхания при этом достигала 60-80Я . Для MX гибернируицих сусликов в этом случае оказалось характерно снижение коэффициента дыхательного контроля. Однако, в литературе сообщалось, что величины дыхательного контроля, ADF/0 и Р/0, полученные для MX печени гибернируицих и активных животных, были одинаковыми или отличались незначительно (Даудова,1968; Roberts and Chaffee,1972; Gehnrioh and Aprille,198ö). Следует сказать, что в отличие от указанных работ, в наших экспериментах MX обычно выделялись и хранились в отсутствии хелаторов ионов Са^+ и не подвергались дополнительному переосаждению. Среда . инкубации и среда выделения не содержала альбумина. Преследовалась цель как можно меньше подвергать MX дополнительным воздействиям в процессе выделения, которые могут маскировать физиологические, эффекты (Кондрашова и др., 1987). Подобные изменения дыхательного контроля наблюдались в работе других авторов (Fedotoheva et al.,1985) При оценке величины коэффициента дыхательного контроля необходимо учитывать его зависимость от скорости дыхания в 3-ем метаболическом состоянии - V3 (Николе, 1985). Величина последней может лимитироваться различными процессами (см. "обзор.литературы"). В связи с этим необходимо отметить, что пониженная величина дыхательного контроля в MX гибернируицего суслика сочетается с чрезвычайно низкими скоростями в состоянии покоя v2 и v4, что обычно не характерно в случае частичного разобщения дыхания в MX

- 4 -

например в случив солодовой адаптации животных (Скулачев и др.,1963) или при "старении" суспензии MX в результате хранения (Scarpa and Lindsay, 1972; Chan and Higgine, 1978).

Таблица I. Скорость лнтания иитохондрий печени гибернирующих и активных сусликов в различных метаболических состояниях, в присутствии сукцината и /?-оксибутирата.

Группы животных V4 тдн» да

Субстрат - сукцинат ( 4 мМ )

Активн. Ги^е^н. 17±2 12+2 128+6 31+3 33+4 26+4 138+7 43+5 3,8+0,2 1,2+0,1

Субстрат - ii-оксибутират ( 4 мМ )

Активн. (5) Гибели. 13+2 ** 9+1 56+5 18+3* I7+I ** 13+3 74+4 26+2* 3,2+0,1 1,4+0,1

Среда инкубации и условия проведения экспериментов описаны в "методах исследования". Добавки: 0,1 мМ АИР. 40 мкМ ДНФ. 72,?3,74,'ДНФ ~ скорости дыхания (нг-ат.02 мин--'- на 1мг белка) в соответствующих метаболических состояниях. В скобках - число кивотных. * - Р < 0,01. ** - Р < 0,05 между группами! активных и гибернирующих животных

Таблица 2. Скорость разобщенного дыхания митохондрий активных и гибернирующих сусликов в присутствии сукцината и г?-оксибутирата. Влияние ротенона, изоцитрата и ыалоната.

Субстрат Добавки нг-атО мин 1 мг-1 Степень ингибирования

Активн. Гиберн.

С^кц^нат Ротенон (1мкМ) Изоцитрат (2(Л0 Малонат (2мМ) 148+6 130+5 I5I+7 104+9 78+4* 40+4 42+3 38+3 27+4 23+3 73,0 67.7 74.8 74,3 70,0

/?-оксибутират (4мМ) г

Скорость разобщенного дыхания определяли в присутствии 40 мкМ ДНФ. Концентрация митохондриального белка составляла 1,5 - 2 мг/мл. * - Р < 0,05. Между группами активных и гибернирующих животных Р < 0,01. В остальных случаях различия не достоверны. Число животных п = 5.

В качестве возможной причины подавления оксидазной активности MX печени гибернирукщих сусликов рассматривается ингибирование на уровне дегидрогеназ (Кондрашова и др.,1986; Pedotelieva et ai., 1985). Эти авторы наблюдали значительное востановление окислительной активности MX печени гибернирукщих сусликов под действием факторов, препятствующих избыточному накоплению оксалоацетата. В нашем случае на разобщенную скорость дыхания в присутствии сукци-ната и наблюдаемую при этом степень ингибирования дыхания митохондрий печени гибернирукщих животных ни изоцитрат, ни ротенон, никакого влияния не оказывали (табл.2.). В присутствии fi-оксибутирата ингибирование сукцинатдегидрогеназн малонатом не приводило к заметному снижению степени ингибирования дыхания в MX гибернирую-щих сусликов то сравнению с MX активных животных. Это ставит под сомнение предположение о том, что наблюдаемое в присутствии НАДН-зависимых субстратов ингибирование дыхания MX печени гибернирувде-го суслика определяется в основном ингибированием сукцинатдегидрогеназн. К заключению о том, что подавление оксидазной активности в MX гибернирукщих животных не связано с накоплением оксалоацетата и вызванным им ингибированием сукцинатдегидрогеназн пришли и другие авторы (Roberte and Cliaffee,1972). Непосредственное измерение сукцинатдегидрогеназной активности в митохондриях бодротвуидах и гибернирукщих сусликов, по восстановлению 2,6 -дихлорфенолиндо-фенола, показало в обоих случаях близкие результаты (см. ниже).

Транспорт субстратов в митохондрии печени активных и гиОарнирущих сусликов.

Одним из факторов, определящих интенсивность дыхания митохондрий в фосфорилируицем и разобщенном состоянии может быть транспорт субстратов (Николе, 1985). Скорость электронейтрального транспорта различных метаболитов в матрикс МХ может быть оценена по набуханию МХ в присутствии изоосмотических растворов их аммонийных солей (сьарреЫ,1967)- Проведенные эксперименты показали, что скорость набухания МХ гибернирукщих животных в растворах аммониевых солей сукцината, г?-оксибутирата и глутамата в 2-3 раза ниже, чем скорость набухания МХ активных животных (рис.1.,а-в). Эти результаты позволяют сделать заключение о снижении активности переносчика дикарбоновых кислот (сукцинат) и переносчика глутамата. Кроме того, заметно снижена проницаемость митохондриальной мембраны для кетоновых тел (^-оксибутират), являющихся важным энергетическим субстратом для митохондрий гибернирукщих животных <КгИо»1аг,19в5). Транспорт дикарбоновых ни слот и глутамата происходит в обизн на фосфат (см.БсНосЯиехЧЬ ала. ьа Нопе, 1985). Необходимо было выяснить, не является ли уменьшение проницаемости митохондриальной мембраны для данных субстратов следствием подавления транспорта фосфата. Измерения показали, что скорость набухания

- 6 -

митохондрий гибернирувдих и активных животных в 0,1 М растворе фосфата аммония практически одинакова (рис.1.,г).

2 мин

РисЛ.Набухание митохондрий печени активных и гиберниругщих сусликов в изотонических (100мМ) растворах ашюнийных солей% (А)-сукцината; (Б)-глютамата; (В)- /Ч-оксибутирата; (Г)- фосфата.

1- МХ активн.животных

2- МХ гиберн.животных

В случае сукцината и глутамата добавляли 3 мМ Ш^Р04. Во всех случаях добавляли

антимицин А(0,5 мкг/мл)

+ Бутилмалонат

+ Буталмалонат

Рис.2.Изменение скорости дыхания митохондрий печени гибернирупцих (А) и активных (Б) сусликов в присутствии разобщителя в ответ на добавку сукцината (С). Добавки: 40 мкМ ДНФ, 4мМ сукцинат, 2мМ бутил-малонат

100 нг-ат 0,

I мин

Мы попытались также оценить скорость транспорта сукцината по изменению скорости дыхания МХ. В отсутствии экзогенного субстрата скорости дыхания МХ гибернирующих и активных животных близки по величине во всех метаболических состояниях. Опираясь на это наблюдение, мы изменили обычную последователность добавок. Внесение сукцината на фоне предварительно добавленного разобщителя вызывало б'-струю и значительную активацию дыхания МХ активных животных

- 7 -

(рис.2.,а). Скорость дыхания МХ гибернирущих животных тоже повышалась, но не сразу, а с некоторым лаг-периодом, достигая в максимуме 30-35% от скорости разобщенного дыхания МХ активных животных (рис.2.,б). Бутилмалонат предотвращал в обоих случаях активацию дыхания в ответ на добавку сукцината. Наличие лаг-периода при установлении равновесия после добавления сукцината к предварительно разобщенным МХ гибернирущих животных указывает на уменьшение проницаемости митохондриальной мембраны для сукцината.

Однако оказалось, что обработка МХ печени гибернируицего суслика неионными детергентами луброл та или тритон х-100 в присутствии избытка субстрата не приводит к активации дыхания. Ранее Роберте и Чаффи (1972) показали, что жесткая гомогенизация митохондрий печени гибернирущих сусликов в присутствии субстрата также не вызывает заметного увеличения скорости дыхания. Кроме того, использование искусственного аналога Коа , дурохинола, в качестве субстрата не приводило к заметному снижению степени ингибирования дыхания (см. ниже), хотя он не нувдается в проникновении в матрикс МХ. Это дает основания считать, что угнетение транспорта субстратов в МХ печени гибернирукщих сусликов не является основной причиной подавления их окислительной активности.

Ингибирование транспорта электронов в дыхательной цепи

митохондрий печени гибернирукщих сусликов.

Низкая скорость разобщенного дыхания МХ гибернирукщих животных может быть следствием ингибирования дыхания на уровне дыхательной цепи. Для того, чтобы выявить место ингибирования в дыхательной цепи, была определена степень торможения разобщенного дыхания МХ гибернирукщих сусликов по сравнению с МХ активных животных в присутствии различных естественных и искусственных субстратов, окисляющихся в различных участках дыхательной цепи (табл.3.). В присутствии НАД.Н-зависимых субстратов (/?-оксибутирата, малат+глутамат), субстратов, окисляющихся через флавопротеиды (сукцинат, палмитоил-Ь-карнития), а также в присутствии искусственного субстрата (аналог убихинона) дурохинола, который окисляется непосредственно Ьо1-комплексом дыхательной цепи, скорость дыхания митохондрий гибернирущих животных оставалась на 70-80% ниже по сравнению с митохондриями активных животных. В то же время, в присутствии другого искусственного субстрата ТМФД + аскорбат, который окисляется на последнем участке дыхательной цепи через цитохром о , скорость разобщенного дыхания МХ печени гибернирущих сусликов приближалась к скорости дыхания МХ активных животных. Это говорит о том, что местом ингибирования дыхательной цепи является область Ьо1-комплекса. К аналогичному выводу, о существовании блока в областити Ъс-ркомшгекса дыхательной цепи МХ гибернирующих сусликов независимо от нас пришли и другие авторы (0еп1Ч.о11 ала. АргИ1е,198а).

Таблица 3. Скорость разобщенного дыхания митохондрий печени активных и гиберннрупщи сусликов при окислении различных субстратов.

Параметры Скорость дыхания нг-аг02 мин-1 мг белка-* Степень ин-гибирования дыхания %

Груша Животных Субстраты Активные Гибернирукщие Гибернирующие по сравнению с активными

Л-Оксибутират (4мМ) 81,3 + 7,4 22,7 + 4,0 72,1

Глютамат (4 мМ) + Малат (2,5 мМ) 85,4 + 6,3 21,5 + 3,2* 74,8

а-Квтоглютарат(4мМ) 96,3 + 5,9 21,5 ± 3,8 77.7

Сукцинат (4 мМ) 131,7 + 8,5 39.6 ± 4,6 69.9

Пальмитоил-ь-карнитин (100 мкМ) 101,0 + 7,4 29.0 ± 4,0* 71,3

Дурохинол (200 мкМ) 137,4 + 9.3 42.3 ± 6,1 69,3

Аскорбат (4 мМ) + ТМФД (400 мкМ) 134,0 + 7,1 119,7 ± ЮЛ 10,7

Время инкубации митохондрий в ячейке до добавления разобщителя - 5 мин. Разобщитель - С1ССР, 2 мкМ. Во всех случаях число

животных п = 5. Р < 0,01-0,001.

Были проведены также эксперименты по непосредственному спектрофотометрическому измерению сукцинатферроцианидредуктазной , сукцинат-Ноо-редуктазной и КоаНд-цитохром-о -редуктазной активности в препаратах МХ печени активных и гибернирувдих сусликов. В МХ гибернирующих сусликов по сравнению с активными животными наблюдалось 5-ти кратное снижение сукцинатферроцианидредуктазной акти- . вности (рис.3.), в то ке время, сукцинат-Коо-редуктазная активность МХ бодрствующих и гибернируго-цих сусликов, оцениваемая но восстановлению 2,6- дихлорфенолиндо-Еенола, была практически одинаковой (557+31 и 568+27 нмоль сукци-?ата/ мг белка в мин- соответств-

- Э

- различия не достоверны.

Сукцинат Сукдинат

I

Fe Су

I

FeCy

Рис. 3. Сткцинвтферроцианвдредук-тазная активность митохондрий печени активных,А.,и габерниру-щих сусликов, Б.,Среда содержала 3 мкМ ротвнон, I мкМ СЮСР, 2мМ КСН. Добавки:1 мМ ферроциа-нида (геСу), 10 мМ сукцината. Концентрация белка -0,80 мг/мл.

енно). Наличие блока в области boj-комплекса также подтверждается ингибированием на 8556 Коо'^-цитохром-с-редуктазной активности: IV,6 ± 1,2 и 2,6 ± 0,5 мкМ восст.цитохрома 0 / мг белка в мин в MX активных и гибернирующих сусликов соответственно. Эти результаты свидетельствуют о том,что снижение окислительной активности в препаратах MX гибернирующих животных в значительной мере обусловлено возникновением блока в дыхательнот цепи в области bcj-комплекса.

Представлялось интересным попытаться выяснить механизм инги-бирования переноса электронов в boj-комплексе дыхательной цепи. Все известные в настоящее время ингибиторы переноса электронов в Ьо1-комплексе оказывают различное влияние на восстановление цитохромов b и о, что связано с функционирования в bo1-комплексе Q-цикла (Von Jagow and Link, 1986). Была измерена скорость восстановления цитохромов ь и о по мере исчерпания кислорода в присутствии высокой концентрации митохондриального белка (рис.4.).

Рис.4. Восстановление цнтохромов Ь ( 562 ни) и с+с1 ( 551 вы) в суспензии митохондрий активных (Д) и гибернирупцих сусликов (Б).

Среда содержала ротенон и С1ССР. Измерение проводилось в присутствии избытка субстрата (10 мМ сукцинат) и при отсутствии притока кислорода в измерительную кювету. Обе кюветы содержали 3,3 мг/мл митохондриального белка. За 100 % принималась величина ДА для цитохромов, восстановленных дитионитом.

В МХ гибернирующих животных, скорость восстановления для цитохромов b и с (с + Cj) оказалась одинаково понижена по сравнению с МХ активных животных. Это говорит о том, что в данном случае сайт ингибирования не совпадает с известными участками ингибирования Ъс-ркомплекса и место ингибирования в этом случае, возможно, лежит на восстанавливающем участке цитохромов ь и с1. Другим объяснением может быть снижение подвижности убихинона в мембране митохондрий гибернирующих сусликов, что, однако, требует проверки. Приведенные выше результаты убедительно свидетельствуют о том, что основной причиной снижения оксидазной активности в митохондриях печени гибернируицих сусликов является ингибироваяие переноса электронов в области boj-комплекса дыхательной цепи.

Падение величина Ду и изменения в энергозависимых процессах (транспорт ионов Са^Т - К4', и АРР/АТР обмен) в МХ гиберниру-ющих сусликов, моделирование этих изменений в МХ активных животных под действием антимицина А.

Так как величина ду зависит от протонодвижущей силы и, как правило, снижается при ингибировании дыхательной цепи (Эогйа^ et а1.,1985), были все основания полагать, что МХ печени гибернирую-щих сусликов имеют пониженный Ду в сравнении с МХ бодрствующих животных. Измерения величины Ду по распределению ионов К+в присутствии валиномицина (19612 и 175+3 мВ - для активных и гибернирую-щих животных соответственно) и с помощью липофильного катиона Т5Ф+ (рис.5.) дали сходные результаты. В присутствии сукцината Ду на мембране МХ гибернирующих животных на 15-20 мВ ниже чем соответственно у активных животных. Однако, при окислении аскорбата+ТМФД величины д* были практически одинаковыми (рис.5.).

Рис.5. Величина трансиеибранного потенциала (Ду) и его чувствительность к добавкам разобщителя в суспензии митохондрий печени активных я гибернирупцкх сусликов, при использовании в качестве субстрата 4 мМ сукцината (А) и 400 мкМ ТМФД + 4 мМ аскорбат (Б)

А: I - МХ актив.сусликов; 2---+ 5• 10-8 М антимицина А ; 3 - МХ

гиберн. сусликов. Б: I - МХ актив., и 2 - МХ гиберн.сусликов. Использовали Т5Ф±селектитвный электрод. С1ССР-0,2мкМ где стрелки.

При окислении сукцината, но не аскорбата+ТМФД, между МХ печени активных и гибернирующих животных наблюдались четкие различия в чувствительности Ду к действию низких концентраций разобщителя, (С1ССР). Частичное ингибирование антимицином А дыхательной цепи МХ печени активных животных, приводящее к снижению потенциала Ду до уровня, характерного для МХ гибернирующих животных, одновременно повышало его чувствительность к добавкам разобщителя. В той же концентрации (5-Ю-8 М) антимицин А снижал скорость разобщенного

- II -

дыхания MX активных животных до уровня, характерного для MX гибернирующих сусликов.

Интересно, что скорость снижения Ду митохондрий гибернирующих животных после добавления ADP существенно меньше, чем у митохондрий активных животных. Ранее уже сообщалось об ингибировэнии аденилаттранслоказы в митохондриях печени гибернирующего суслика длинноцепочечными ацилами КоА (berner et al-,1985). Действительно, альбумин, связывающий длинноцепочечные ацилы КоА, существенно увеличивал скорость снижения Ду в MX гибернирующих сусликов. В то же время, снижение исходной величины ду в MX активных животных под действием антимицина А до величины, характерной для MX гибернирующих животных, приводило к уменьшению скорости падения ду после добавки ADP. Учитывая последний факт, и энергозависимую природу ADP/ATP-обмена, можно предположить, что причиной угнетения аденилаттранслоказы в MX гибернирующих животных является не только накопление длинноцепочечных ацилов КоА, но и пониженная величина Ду на внутренней мембране этих митохондрий.

Во время гибернации процессы ионного транспорта в MX существенно угнетены (Миронова и др.,1986,1987; Pedotoheva et al., 1985; Pehowich and Wang,1937). Как скорость аккумуляции ионов К+ (не показано), так и ионов Са2+ (табл.4.) в MX активных животных могла быть снижена до величин, характерных для MX гибернирующих сусликов, добавкой антимицина А, в дозе около 5'IO^M. Это дает основание полагать, что снижение энергозависимого транспорта К+ и Са2+ в MX гибернирующих животных во многом может определяться низкой величиной ду на внутренней мембране этих митохондрий.

Таблица 4 .Начальная скорость энергозавимшого поглощения ионов митохондриями печени активных и гиберннружщих сусликов.

Группа животных Добавки Скорость поглощения Са2+ нмоли Са2+/мин на I мг белка

Активные (6) 412 + 27

Активные (6) Антимицин А 5-Ю-8 M 131 ± 14

Гибернирующие(8) 124 ± 17

Субстрат - 4 мМ сукцинат. В среду инкубации был добавлен CaClg (100 нмоль на I иг белка ). Р < 0,01 для митохондрий гибернирующих и активных животных в отсутствии антимицина А .

Полученные результаты позволяют рассматривать частичную деэнергизацию митохондрий, возникающую вследствии ингибирования в области Ъод—комплекса дыхательной цепи, как основную причину угнетения таких энергозависимих функций, как абр/атр - обмен и энергозависимый транспорт ионов.

- 12 -

3.3. Активация дыхания митохондрий под действием ионов Ca2t Известно, что ионы кальция во многих случаях играют роль внутриклеточных мессенджеров гормональных воздействий, и в то же время способны оказывать мощное регуляторное воздействие на функции MX (Wllianson et al.,1981; Gunter and Pfeiffer, 1990). Поэтому была предпринята работа с целью изучения влияние Ca на дыхательную активность MX гибернирущих сусликов. Оказалось, что нагрузка MX гибернирущих животных ионами Са^"1" в диапазоне концентраций (15-90 нмоль Са2+/мг белка), вызывает постепенное нарастание скорости дыхания и востанавливает на 70 - 80% максимальную скорость дыхания MX гибернирующих сусликов. Следует отметить, что одновременно это приводило к разобщению дыхания (рис.6). Добавление к MX альбумина, связывающего продукты гидролиза фосфолипи-дов (Bjonvtorp et al.,1964), или локального анестетика совкаина (аналога нуперкаина), являющегося специфическим ингибитором мито-хондриальной фосфолилазы А^ (Waite and Sieson,1972), препятствует развитию Са24"-индуцируемой активации дыхания. Такое же действие эказывает и рутениевый красный - специфический ингибитор транспорта Са2+ в MX (Moore,1971). Действие рутениевого красного в данном злучае обьясняется тем, что фосфолипзза А2, расположенная во внутренней мембране MX, активируется ионами кальция со стороны «атрикса (Северина и Евтодгонко,1981).

М MX,

Рис.6. Влияние Са2+ на дыхание митохондрий печена активных (MX а) и гибернирущих (MX г) сусликов:

1 - эффект совкаина (300 мкМ),

2 - рутениевого красного (I мМ),

3 - альбумина (0,5i);

4 - MX в отсутствии прочих добавок. Добавки Ca24' г 55 нг-ион /мг белка для MX активных,15 нг-ион/мг белка для MX гиберн. животных.

было показано, что основной причиной угнетения кислительной активности MX гибернирущих сусликов является инги-ирование переноса электронов в области boj-комплекса дыхательной впи, естественно было предположить, что активация дыхания под эйствием Са2+ сопровождается устранением ингибирования транспорта лектрона в этом участке. Мы сравнили действие ионов Са2+ на эксимальную скорость дыхания митохондрий гибернирующих животных в рисутствяи различных субстратов (табл.5.). Оказалось, что ионы э2+ активируют дыхание в присутствии всех исследованных субстра-5в, кроме ТМФД+аскорбат. Ингибитор фосфолилазы Ag, п-зомфенацилбромид (De Winter et al.,1994), препятствовал активации аания под действием ионов Са2+, при этом, в данной концентрации > оказывая заметного влияния на цитохромоксидазную активность.

- 13 -

Таблица 5. Действие ионов Са2+ на разобщенное дыхание митохондрий печени гиОернирунцего суслика. Влияние п-броыфенацилбромида.

Субстрат дыхания Скорость дыхания нг-ат 02 мин мг белка-*

^-Оксибутират (4 мМ) - Са2+ + Са2+ + Са2+и БФБ

22,7 ± 4,0 53,5 + 4,1 22,1 + 3,0

Сукцинат (4 мМ) 39,6 + 4,6 98,8 + 8,7 34,1 ± 5,1

Аскорбат (4 мМ) + ТМФД (400 мкМ) 119,7 + 10,1 108,3 + 9,6 ПО,6 + 8,8

Митохондрии выделяли и инкубировали в сахарозной среде без ЭГТА . CaCl (30 нМоль на 1 мг митохондриального белка) и п-бромфенацилбромид 20 мкМ (БФБ) вносили в среду инкубации перед добавкой митохондрий. Время инкубации митохондаий в ячейке до добавления разобщителя- Ъшн. Разобщитель - CiCCP, 2мкМ. Число животных п = 5. * - Р < 0,01. ** - различия не достоверны.

При добавлении Са2+ к MX печени активных животных наблюдается быстрое усиление дыхания и переход на новый уровень дыхания, близкий к исходному. Разобщение при этом наступало при гораздо более высоких концентрациях. В связи с этим, наш была измерена кальциевая емкость MX, измеряемая по накоплению Са*-"1" до начала его самопроизвольного выхода. Она составила 62±3 и 24+2 нг-ион/мг белка для MX активных и гибернирующих сусликов (соответственно) в отсутствии эндогенного субстрата и (соответственно) 340+20 и 100+10 в присутствии 4 мМ сукцината. Имеются сведения, что кальциевая емкость находится в обратной зависимости от активности митохондриальной фосфэлипазы А2 (Cheah. et al., 1985). С другой стороны, подавление ингибиторами фосфолипазы А2 Са2+-зависимой активации дыхания MX гибернирующих сусликов позволяет предположить что активность фосфолипазы А2 в этом случае изначально понижена.

Активность фосфолипазы Ар в митохондриях печени

гибернирующих и активных сусликов.

Имеются еще некоторые признаки того, что фоефэлипазная активность в митохондриях печени сусликов во время зимней спячки подавлена. Об этом свидетельствует сниженное на 60$ содержание свободных жирных кислот в суспензии изолированных MX гибернирующю животных по сравнеию с MX активных сусликов. Кроме того, известно, что повышение скорости окисления экзогенного НАДН по внешнему, Ht чувствительному к ротенону и к антимицину А, пути сопровождаете* повышением активности митохондриальной фосфолипазы Ag (Агуреев i др.,1981). Действительно, MX печени гибернирующих животны: обладают меньшей скоростью дыхания при окислении экзогенного НАД по внешнему пути (7,2±0,8 нг-ат 02/мг белка в мин) в сравнении

- 14 -

MX активных животных (12,4+1,0 нг-ат 02/мг белка в мин). Итак, есть основания считать, что активность фосфолипазы в

митохондриях печени гибернирующих сусликов понижена.

Интенсивность окислительного фосфорилирования и состояние

аденилатной системы в митохондриях гибернирующих сусликов.

Проведены измерения концентрации адениновых нуклеотидов в суспензии МХ печени активных и гибернирующих сусликов при двух различных концентрациях внешнего Са^+ ([Са2+]ех). При [Са2+]ех 10"'м в суспензии МХ гибернирующих сусликов понижено содержание АТР (2,8+0,2 нмоль/мг белка против 3,8+0,3 - в случае активных животных) и отношение atp/adp (0,61+0,07 против 0,93+0,1 - в случав активных животных). Остальные параметры аденилатной системы различаются очень незначительно. Повышение [Са2+]ех до 10_6М мало отражается на параметрах аденилатной системы МХ активных животных, приводя лишь к небольшому снижению отношения atp/adp. в отличии от них, Fix гибернирующих сусликов очень остро реагируют на повышение [Cs^lex. Уровень АТР в митохондризльной суспензии снижается более чем в 1,5 раза, почти в 2 раза падает величина отношения атр/анр.

Была измерена скорость синтеза АТР при [Са2+]ех =10~7М. Она оказалась существенно выше в МХ активных животных (86,1+9,7 и 48,4+5,3 нмоль/мг бежа в мин для активных и гибернирующих животных соответственно). Однако, при повышении [Са^+]ех до 10~6М снижение скорости синтеза АТР в МХ гибернирующих животных было еще более значительным (65,0±3,7 и 28,6+2,2 нмоль/мг белка в мин).Это, видимо, отражает показанную наш ранее повышенную чувствительность барьерных свойств мембраны МХ гиберниругацего суслика к ионам Са",+ (см. выше). С другой стороны, в МХ осуществляется как гидролиз, так и ресинтез фосфолипидов. Реакции, приводящие к реацилированию лизофосфолшшдов, АТР или ГТР-зависимы (Groot et al.,1974) и, вследствии этого, наблюдаемая низкая скорость фосфорилирования и пониженная внутримитохондриальная концентрации АТР может быть причиной низкой кальциевой емкости МХ гибернирующих животных.

Выводы.

1. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии значительного вклада в механизм подавления окислительной активности в МХ гибернирующих сусликов ингибирования на уровне дегидрогеназ (и сукцинатдегидрогеназы в частности).

2. Обнаружено, что транспорт субстратов в МХ гибернирующих сусликов в значительной степени подавлен, что однако не является основной причиной подавления окислительной активности в МХ гибернирующих животных.

3. Основной причиной подавления окислительной активности митохондрий печени гибернирующих сусликов является ингибирование дыхательной цепи в области Ьс-ркомплекса.

4. Показано, что сайт ингибирования в Ъо^-комплексе не совпадает в данном случае с участками ингибирования для известных в настоящее время ингибиторов переноса электронов в Ъо^-комплексе дыхательной цепи. Возможной причиной ингибирования переноса электронов в области убихинона и Ьо|-комплекса дыхательной цепи МХ печени гибернируицих сусликов может быть снижение подвижности убихинона в мембране.

5. Ингибирование дыхательной цепи МХ гибернирующих сусликов приводит к снижению поддерживаемого в них мембранного потенциала и, вследствии этого, к снижению скорости энергозависимых процессов (аккумуляция ионов К+ и Са2+, АТР/АвР-обмен). Это подтверждается тем, что ингибирование дыхательной цепи МХ активных сусликов антимицином А в одной и той же концентрации приводит к снижению окислительной активности , величины лу, скорости аккумуляции ионов К+ и Са2+ и скорости падения величины Лу в присутствии АБР, до величин, характерных для МХ гибернирующих сусликов.

6. Ионы Са2+ устраняют ингибирование дыхательной цепи в области Ьс^-комплекса дыхательной цепи и активируют окслительную активность митохондрий печени гибернируицих сусликов.

7. Факторы, препятствующие активации ионами Са2+ митохондри-альной фосфолипазы А2 или накоплению продуктов ее активности, предотвращают Са2+^индуцируемую активацию дыхания МХ печени гибернируицих сусликов. По-видимому, изменение скорости переноса электронов в области ьо1-комплекса дыхательной цепи каким-то образом сопряжено с изменением активности митохондриальной фосфолипазы А2.

8. Получены результаты, свидетельствующие о низкой активности фосфолипазы А2 в митохондриях печени гибернирующих сусликов.

9. Причиной обнаруженной низкой кальциевой емкости МХ печени гибернирующих сусликов может быть наблюдаемое в них снижение скорости синтеза АТР , снижение концентрации АТР и отношения АТР/АВР.

Список работ то материалам диссертации.

1. Брустовецкий Н.Н., Гришина Е.В., Амерханов З.Г., Маевский Е.И. Интенсивность окислительного фосфэрилирования и состояние аденилатной системы в митохондриях печени активных и гибернирующих сусликов Ci.tell.us ипаи1аи1з. - Ж. эв. биохимии и физиологии, 1989, Т.25, N0 4, с.448-453.

2. Брустовецкий Н.Н., Амерханов З.Г. Ингибирование транспорта сукцината, ^-оксибутирата и глутамата в митохондрии печени гибернирующих сусликов. - Ж. эв. биохимии и физиологии, 1989, Т.25, N0 6, с.718-722.

3. Брустовецкий.Н.Н., Гришина Е.В., Маевекий Е.И., Амерханов З.Г., Ким Ю.А. Активность фосфолипазы Ag определяет скорость дыхания зимне спящих животных. - Бюллетень эксп. Оиол. и медицины,

1989, Ю 10, с.488-490.

4. Брустовецкий Н.Н., Амерханов З.Г., Гришина Е.В., Маевский Е.И. Влияние тоничности среды на скорость дыхания и окислительное фосфорилирование в митохондриях печени активных и гибернирующих сусликов. - Биохимия,1990, т.55, вып.2, с.201-208.

5. Брустовецкий Н.Н., Амерханов З.Г..Егорова М.В., Мохова Е.Н., Скулачев В.П. Участие ATP/ADF-антшюртера и жирных кислот в разобщении окислительного фосфорилирования в митохондриях печени сусликов при зимней спячке и пробуждении. - Биохимия, 1991, т.56, вып.5, с.947-953.

6. Brustovetsky N.N., Mayevsky E.I., Grisliina E.V., Gogvadze Y.G., Amerkhanov Z.G., Hegulation of the rate of respiration and oxidative phosphorylation in liver mitochondria from hibernating ground Bquirrels, Citellus undulatus.- Сотр.Biochem.Physiol, 1909, V.94B, No 3, p.537-541. .

7. Brustovetsky N.N., Amerkhanov Z.G., Popova E.Yu., Konstantinov A.A. Reversible inhibition of eleotron transfer in the ubiquinol: cytochrome с reductase segment of the mitochondrial respiratory chain in hibernating ground squirrels. - FEBS Lett.,

1990, v.263, No 1, p.73-76.

6. Brustovetsky N.N., Amerkhanov Z.G., Egorova M.E., Mokhova E.N., Skulaohev V.P. Carboxyatraotylate-sensitive uncoupling in liver mitochondria from ground squirrels during hibernation and arousal. - FEBS Lett., 1990, v.272, No 1,2, p.190-192.

9. Brustovetsky N.N., Amerkhanov Z.G., Grishina E.V., Mayevsky E.I. The influence of the tonicity of the medium on the rate of respiration and oxidativ phosphorylation in liver mitochondria of active and hibernating gophers. - Biomedical Sciense, 1990, v.1, No 1, p.102.

10. Amerkhanov Z.G., Brustovetsky N.N. Inhibition of the transport of oxidation substrates in liver mitochondria from hibernating ground Bquirrels. - in Living in the cold -11, Abstract of Int. Symp., Strasbourg (Prance) 1989, p.1.

11. Brustovetsky N.N., Amerkhanov Z.G., Grishina Б.7., Mayevsky E.I. Role of phospolipase Ag in . regulation of the functions of liver mitochondria of hibernating ground squirrels. -in Living in the cold -11, Abstract of Int.. Symp., Strasbourg (France) 1989, p.8.

12. Brustovetsky N.N., Amerkhanov Z.G., Grishina B.V., Kayevsky E.I. bc^ —complex is the main regulatory site of respiratory chain of the liver mitochondria of hibernating ground squirrels.-V1 Europ.Bioenerg.Conf. .Short reports, Noordwijkerhout (Netherlands) 1990,v.6, p.12.

2.11.93 г. Эак.5838Р. Тир. 100 экз. Уч.-иэд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ГШ РАН