Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма угнетения митохондриальных функций сусликов Citelius undulatus во время зимней спячки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма угнетения митохондриальных функций сусликов Citelius undulatus во время зимней спячки"

п

РГЗ сл

РОССИЙСКАЯ АКАДШИЯ НАУК I' ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО!! БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Егорова Маргарита Владишровна

УДК 577.121.7:577.23

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА УГНЕТЕНИЯ НЯТОХОНДИИЛЬНЫХ ФУНКЦИИ СУСЛИКОВ С1ТЕШБ итимп/Б ВО ВРЕМЯ ЗЙШЕИ СПЯЧКИ

03.00.02 - "Биофизика"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 1994

Робота Ецпогшепа в Институте тесрзтЕческой п акспарнкентальпсй био&ззшш РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук,, ст.н.с. Н.Н.Брустовецкий

С£^цавлыща сапонзнти:

доктор биологических наук Г.Д.Киронова кандидат биологических наук А.А.Шарлвев

Егдадая оргапззащя:

Институт'физико-химической биологии ш.1. А.Н.Белозерского

Защита состоятся"» 1994 г. в ^^ час. на

заседании Специализированного Совета Д 2СЮ.22.01 Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 Московская область, г. Пудано, ИТЗБ РАН

С диссертацией мошо ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан " х993 г.

Ученый секретарь / / я'

Специализированного Совета, —"{'[( Щхиии П.А. Нелипович

кандидат биологических наук : [ь -ь 1 -

Актуальность проблем. Зимняя спячка млекопитащих - уникальное явление еивоЯ природы - характеризуется значительным понижением температуры тела (до 3-5 С), снижением частоты дыхательных движений (до 1 за 1-г минуты) и сердечных сокращений (от 100 в бодрствующем состоянии до 1 -2 ударов в минуту в спячко), а также значительным снижением (в 50-100 раз) уровня метаболизма. Важную роль при переходе животных из бодрствующего состояния в состояние зимней спячки играют процессы, происходящие в митохондриях (МХ), являюпцшзя основными потребителями кислорода и производящие большую часть тепла в клетка [Нхитшз-На^еп, 1976]. В настоящее время наиболее хорошо изучены МХ печени гибернирующих животных. Установлено, что во время зигшей спячки снижается активность многих митохондриальных систем: снижены скорости синтеза АТР [ае1шг1о11, Арг111е, 1988; БI■ШJtovetsl^y et а1., 1989] транспорта адэниновнх нуклеотидов [Ъегпег а1., 1972], транспорта

окислительных субстратов в МХ [ВгиМсг^вку, АтегкЬапочг, 1989], энергозависимого поглощения ионов К* и Са2+ [Рейо-ЬоЬета et а1., 1985; РеПоя1оЬ, Иап§, 1987; Ërustovetsky et а!.. 1992]. Практически все эти изменения могут быть объяснены частичной деэнэргизацией МХ гибернирующих животных, которая, в свою очередь, возникает вследствие подавления переноса электронов в средней части дыхательной цепи [СеЬпгхоЬ, Аргл.11е, 1988; ВтивЪо-геЬвку et а!., 1989, 1990]. В настоящее время не ясно, как происходит возникновение и устранение "блока" в дыхательной цепи при переходах спячка-бодрствование. Одним из возможных подходов в изучении механизмов ингибирования митохондриальных процессов у гибернирующих животных может быть поиск способов их активации. Регуляция активности дыхательной цепи может осуществляться в результате изменений объема митохондриального матрикса, происходящих при действии некоторых гормонов, а также при инкубации МХ в средах С различной тоничностью [На1евЪгар, 1989]. Нэ исключено, что изменение объема МХ имеет важное значение и для регуляции митохондриальных функций у зиннеспящнх животных в различных физиологических состояниях.

Ц&гь и задача исследования. Цель настоящей работы заключалась в поиске способов регуляции митохондриальных процессов у гибернирующих и бодрствующих сусликов, а также уточнение роли фосфолипазы ¿2 в этом процессе. В связи с этим были поставлены следующие задачи: I) Исследовать механизм Са^+-зависимой активации дыхания МХ гибернирующих сусликов. 2) Изучить влияние изменения тошчности среды на окислительную активность МХ бодрствующих и гибернирующих животных. 3) Изучить влияние гипотонии на скорость синтеза АТФ и транспорт ионов Са2+ и К+ в МХ печени гибернирующих сусликов. 4) Путем ингибирования активности митохондривльной

фосфолипазы А2 исследовать ее роль в регуляции митохондриалышх функций. 5) Провести сравнительный анализ структурного состояния КС печени гибернирущих и бодрствующих сусликов и их функциональной активности.

Научная новизна н практическая ценность работа. 1)Впервые показана активация исходно подавленных митохондриалышх процессов у гкбернируюцих животных^ при инкубации MX в гипотонической среде. 2Остановлено, что Са~+-зависимая активация дыхания митохондрий печени гибернирувдих сусликов сопровождается набуханием MX. 3)Установлено, что кнгибироваше фосфолипазы А2 предотвращает активацию митохондриальных процессов в условиях гипотонии, а так г:э набухание и повышение окислительной активности в условиях кальциевой нагрузки. 4)На основе проведенных электронномикроскопи-ческих исследований 1аХ в ткани печени к изолированных MX бодрствующих и гибернирукцих сусликов, а также сравнения структурного состояния MX и их функциональной активности у бодрствундих и гибернирущих животных, установлено, что для активации митохондриальных процессов у гибернирущих еквотных необходимы по крайней мере дао условия: набухание MX и активация фосфолипазы А2.

Полученные данные проясняют механизм подавления биоэнергетических процессов в ЮС печени сусликов ео время зимней спячки. Работа екээт но только саиостоатольный inrrepoc, как продвканге в познании механизма гибернации, ко и создает основу для практического признания в биологии и шдадане, напраиер, для разработки фвркакокоррекции ряда экстремальных состояний организма. Апробация работы. Результаты исследований докладывались на III Всесоюзной Егсоле-сегинвре "Моханпзмы кашей спячки" (Пущкно, 1988), на II Кэвдународаон симпозиума "living in the oold. II" (Страсбург, Сранцкя, I£39) и 6-ой Европейской биоэнергетической конференции (Нидерланды, 1930). Диссертационная работа в целом била представлена на совместном шялабораторнои семинаре Института теоретической и экспериментальной бпсфззики РАН и Института биофизики клетки РАН 29 ша I9S3 г., а тага» в виде публикаций в отечественных и зарубежных журналах.

ПублапЕЦка. По тек.е диссертации опубликовано Ю работ.

Структура дгссертадгл. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, списка цитированной литература. Диссертация содернит //#!стр., /Л рис., .О. табл. Список литературы включает /S/о. работ, из нихна иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИСОВДОВАНИН.

В экспериментах были использованы суслики citelius unduiatufs. Животных содержали в специально приспособленных помещениях в

условиях достатка пицц, вода и гнездового материала при температуре +3°С. Температура тела в момент забоя путем декапитации составляла 4-5°С у гибернирунцих животных и около 37°С у бодрствующих животных. МХ печени получали методом дифференциального центрифугирования в стандартной сахарозной среде, содержащей 300 мМ сахарозу, в мМ трис, рН 7,4. Суспензию МХ в процессе работы хранили на льду. Среда инкубации при определении поглощения кислорода содержала 250 мМ деионизированную сахарозу, 3 мМ Н3Р04, 3 мМ 8 трис, рН 7,4. Тоничность среди

инкубации изменяли путем изменения концентрации сахарозы. Среду инкубации, содержащую 250 мМ сахарозу, рассматривали как среду с нормальной тоничностью; гипотоническая среда содержала СО мМ сахарозу. Поглощение кислорода МХ определяли полярографически, при помощи электрода Кларка. Концентрации белка в суспензии МХ определяли методом Доури [Ьочггу et а1., 1951]. аф на внутренней мембране МХ определяли методом синтетических проникающее ионов с помощью тетрафеяилфосфониевого электрода [Кагоо et а1., 1979]. Скорость поглощения Са2+ измеряли по убыли катиона в среде при помощи Са2+-селективного электрода и соответствующей измерительной аппаратуры. Измерения проводили в термостатируемой ячейке объемом 2,0 мл при температуре 27°С и постоянном перемешивании при помощи магнитной мешалки. Основная среда инкубации содержала 250 мМ сахарозу, 3 кМ 1%С12, 3 '-<1 КНдР04, 10 мМ трис-НС1, рН 7,4. Аккумуляцию МХ ионов К+ оценивали по набуханию МХ в среде, содержащей 200 мМ сахарозу, 30 мМ ацетата калия, ю ММ трис-шп, рН 7,4, при температуре 27°С и постоянном перемешивании. Набухание МХ оценивали по изменению оптической плотности митохондриальной суспензии при длине волны 520 нм. Скорость синтеза АТФ оценивали по накоплению глюкозо-6-фосфата в присутствии 0,1 ед. гексокиназы и 10 мМ глюкозы. Концентрации глюкозо-6-фосфата определяли энзиматически, регистрируя флуоресценцию ШЩФН [ИИИатвоп, Согкеу, 1969]. Одновременно с измерением скорости синтеза АТФ определяли скорость поглощения 02 МХ при помощи электрода Кларка, что позволило оценивать эффективность окислительного фосфорилирования по величине отношения скорости синтеза АТФ к скорости потребления кислорода С^ф/"^). Ткань печени для электронной микроскопии фиксировали глютвровым альдегидом с последующей дофиксацией четырехокисьв осмия. Ткани после фиксации обезволивали в спиртах и заливали в ЭПОН-812. Срезы монтировали на бленды, покрытые формваровой пленкой, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе 1ШаоМ-12. Изолированные МХ, взятые со льда или после инкубации при температуре 27°С (в этом случае МХ предварительно осаждали в течение 15 сек. при 20000 §) помещали на несколько часов в альдегидный фиксатор и затем

фиксировали 156 ОвО . Фиксированные образцы обезвоживали серией спиртов и ацетоном4« заливали в ЭПОН-812. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты просматривали и фотографировали на электронном микроскопе ЕМ 100В.

активности МХ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Механизм Са^+-зависимой активации окислительной печени гибернирумцих сусликов.

Одной из отличительные особенностей гибернирующих животных является глубокое угнетение окислительного метаболизма [Ьушап, 1982], которое связывают с подавлением митохондриального дыхания неидентифнцированными пока эндогенными факторами [НоЪег^я et а1., 19841. Причиной подавления окислительной активности МХ печени гибернирующих сусликов скорее всего является угнетение переноса электронов в средней части дыхательной цепи [аеЪпгхсь, АргШе, 1988; Bruвtovetвky et а1., 1989, 1990]. Ранее было обнаружено, что низкая окислительная активность ИХ печени гибернирующих сусликов значительно увеличивается в условиях кальциевой нагрузки [Брустовецкий и др., 1989]. Мы обнаружили, что при умеренной кальциевой нагрузке (30 нмолей Са^/мг белка) одновременно с ускорением дыхания происходит аккумуляция добавленного кальция (рис.1, 2)._

Рис.1 Са2+-заииси-ыая активащщ скорости дыхашш митохондрии печени ги-

бернйруЕЦзго суслика. Вяляняе циклоспорина А (цикло А) ояй-с-ащина (олиго) н КАТ.

Содержание митохондриального бежа -3,0 мг/мл.

После завершения аккумуляции Са'" скорость дыхания возвращается к

исходному уровню. Добавление ДНФ через 3-4 минуты после этого приводило к увеличении скорости дыхания, которое значительно превышало аналогичное ускорение в отсутствие предварительной кальциевой нагрузки МХ (рис Л, 1). Са^ """-зависимое ускорение дыхания после добавки ДНФ сопровождалось набуханием МХ (рис.2, 1). г предположим, что кальциевая нагрузка, приводящая к значительному увеличении окислительной активности МХ печени гибернирующих сусликов, является необходимым условием появления неспецифической проницаемости внутренней митохоцдриальной мембраны и, как следствие, набухания МХ. Установлено, что циклоспорин А, ингибитор

нвспещфгшской поры, олигомицин, ингибитор АТФ-синтетази, а так гее иягабнрование фэсфолипазы, способш предотвращать появление неспэцифкческой проницаемости внутренней мятохондрпальной мембраны [Crompton et al., 1988; Broekemeier et al., 1989; Broekemeier, Pfeiffer, 1939; Kovgorodov et al., 1990]. В hsst.ix экспериментах показано, что циклоспоркп Л, олигокицвн н • п-бромфенацилбромид (КЗ), ингибитор штохоодраальной фосфолшазы Ag» препятствовал:! повышения окислительной активности

Рис.г.С^ -записзмоэ набу-ХЕпта гтпяопдряа печепл -гийетаиоуЕргго суслит-.а.

влияйиэ" ц2кяоспорш1э л

(цикло А) и БФВ. А.-НВбуХЕШИВ митохондрий при умеренной кальциевол нагрузке-33 пмоля/мг белка Б.-набухание MX при большей кальциевой нагрузке -66 нмолей/мг оелка Содержание китохондоталь-ного белка - 3,5 мг7мл.

МХ под действием кальциевой нагрузки (рис.1, 2,3), а таккэ их набуханию в этих условиях (рис.2). С другой стороны, имеется достаточно свидетельств того, что возникновение неспецифической проницаемости зависит от конформационного состояния АТФ/АДФ-гореносчика: переход в С-конформацив, происходящий при добавлении карбоксиатрактилозида (КАТ), ингибитора

АТФ/АДФ-антшгортера, способствует появлению неспецифической проницаемости [Ье Оиоо, Ье Циоо, 19В8; и<㻧ого1от et а1., 1985 3. КАТ вызывал постепенное ускорение дыхания МХ, нагруженных кальцием (30 нмолай Са2*/мг белка), без добавления ДН$ (рис.1, 2). Необходимо подчеркнуть, что умеренная кальциевая нагрузка сама по себе не приводит к появлению неспецифической проницаемости, а лишь создает предпосылки для ее возникновения (рис.1, 2, рис.2, 1). Значительное увеличение проницаемости внутренней митохондриальной мембраны происходит в этом случае лишь после добавления ДНФ, снижающего л*. Это отражает зависимость индукции неспецифической проницаемости от величины ДФ ШоУёого<3.от еЪ а1., 1985].

При увеличении кальциевой нагрузки до БО нмолей на мг белка

активация дакания происходила даже в отсутствие ДНФ. В этом случае БФБ и циклоспорин- А также предотвращали эффекты Са2+ (рис.1, 3, рис.2, 2). В случае умеренной кальциевой нагрузки открытие неспецифической поры может происходить в результате падения л* после добавки ДНФ. При более высокой кальциевой нагрузке неспецифическая пора открывается без дополнительной деэнергизации MX ДНФ. Ингибирование фосфолипазы А2 предотвращает открытие яеспецифической поры. Этим объясняется предотвращение Са2+-индуцируемого набухания и отсутствие повышения окислительной активности MX в этих условиях. Однако, остается неясным, какой именно из двух процессов - активация фосфолипазы А2, происходящая при кальциевой нагрузке [Waite, sisson, 1972], или набухание MX -является- главным для повышения окислительной активности MX гибернирунцих сусликов. Эксперименты с циклоспорином А, казалось бы, дают ответ на этот вопрос: циклоспорин А, препятствуя набуханию MX и не влияя при этом на активность фосфолипазы А2 [Broekemeier et al., 19893, предотвращает повышение окислительной активности MX гибернирунцих животных под действием кальциевой нагрузки. Отсюда следует,' что основным процессом, приводящим к устранению "блока" в дыхательной цепи MX гибернирунцих сусликов, является их набухание. В связи с этим представлялось интересным исследовать влияние изменения объема MX гибернирущих сусликов в условиях различной тоничности среды на их окислительную активность.

Повышение окислительной активности MX гибернирупцнх сусликов в гипотонической среде. Моделирование состояния MX габернирущих сусликов в условиях гипертонии.

По мнению Халестрапа [Halestrap, 1989], изменение объема MX может влиять на скорость переноса электронов в среднем участке дыхательной цепи. На основании исследований по влиянию тоничности среда инкубации на окисление и фосфорилирование в MX крыс [siater, Oleland, 1953; Johnson, Lardy, 1958; Atsmon, Davis, 1967; Holtzman et al., 1978] можно сделать вывод, что при сжатии MX происходит подавление активности дыхательной цепи. Это позволило нам предположить, что в MX печени гибернирунцих сусликов активность дыхательной цепи снижена, возможно, в результате сжатия MX. Используя данный подход, мы впервые продемонстрировали активацию окислительной активности MX печени гибернирунцих сусликов путем понижения тоничности среда инкубации (табл.1).

Снижение тоничности среди практически не влияло на максимальную дыхательную активность MX бодрствующих животных, однако повышение тоничности среды, приводящее к сжатию MX бодрствующих животных, моделировало состояние MX гибернирунцих сусликов, приводя к

Таблица 1.

Скорости дыхания, дыхательного контроля (ДК) и АДФ/О МХ печени гиберяиружщих сусликов в условиях среды инкубации с пониженной тоничностью.

Тоничность Скорость .дыхания . кг вт 02 мин 'мг белка 1 ДК АДФ/О

среды -1- АДФ - АДФ + ДНФ

250 моем 31 ,7+4,3 26,9+3,7 49.6+5,0 1 ,18+0,04 0.57±0,04

125 моем 35,2+3,6 28,4+4,0 61,6+4,7 1 ,24+0,03 0,85+0,04

80 моем 66,8+3,9 37,4+2,8 19.7+6,3 1 ,79+0,05 1,01+0,03

бо ноем 82,2+5,0 40,7+4,1 129,7+6,6 2,02+0,04 1,10+0,05

40 моем 76,0+4,3 44,2+3,9 137,9+7,2 1 ,72+0,07 1,03+0,04

25 моем 77,0+4,8 51,6+4,3 145,3+5,6 1 ,49+0,04 0,90+0,03

ю моем 77,0+6,2 63,0+5,4 149,9+8,3 1 ,22+0,05 0,74+0,03

Субстрат окисления - 4 мМ сукцинат. Добавки: юо нмоль АДФ/мг белка; 40 мкМ ДНФ. Во всех случаях п = 4.

Все эксперименты проводились в присутствии 3 мкМ ротенона.

понижению скорости дыхания МХ печени бодрствунцих животных (табл.2).

Таблица 2.

Скорости дыхания, дыхательного контроля (ДК) и АДФ/О ?<К печени бодрствующих сусликов в условиях среды инкубации с различной тоничностью.

Тоничность среды Скорость .дыхания * нг ат 02 мин~'мг белка ' ДК АДФ/О

+ АДФ - АДФ + ДНФ

бо моем 250 моем боо моем 111,1+8,3 68,0+6,1 133,3+7,4 127,8+3,6 33,3±4,0 158,5+6,8 49,1+4,4 29,9+3,2 89,0+5,5 1,63+0,06 0,97+0,04 3,83+0,08 1,59+0,05 1,64+0,04 0,74+0,04

Субстрат окисления - 4 мМ сукцинат.

Добавки: 100 нмоль АДФ/мг белка; 40 мкМ ДНФ.

Во всех случаях п = 4.

Все эксперименты проводились в присутствии 3 мкМ ротенона.

Таким образом, представленные нами результата позволяют сделать вывод, что сжатие МХ печени гибернирукщих сусликов является одной из основных причин угнетения их окислительной активности. Влияние гипотонии на аф МХ печени гибернирупцих сусликов. Известно, что ингиОирование переноса электронов в дыхательной цепи сопровождается снижением д* [Sorgato et al., 1985]. Нак показано на рис.3 (рис.3, 1,2), угнетение окислительной активности МХ печени гибернирущих сусликов также сопровождается снижением д» в

сравнении с А® ЫХ бодрствуккдх пиеотшх.

Ряс.З. ДЕЭ пз аф ssz-

ГОГХЦЗГЛ СО,ГТлГГВЗТг?21 (1) J1

raüesüpyiErxi' (2,3) суолшгов в ЕО^ЗЙЬПОЛ (7,2) к гкиото-Езчаской (3) сродаг.

Субстрат - 4 сукцинат. Все эксперименты выполнены в присутствии 3 мхИ ротенона. Нормальная среда - 250 косм. Гшотонич. среда - 60 моем.

Кек показано вше (твбл.1), овшзекэ тоничностя сродо Енкубацна приводит к устранению "бхоха" в .^тгательвой цашг ИХ начет гкбернирукщих сусликов. Естественно было екгадать, что б денном случае долзно ноблвдаться увеличение трансиембранного потенциала. Дэйствзтельго шхачЕна аз Ж пэчени гнбврнирукдаз: сусликов, инкубировавшихся в гипотонической ерэде, практически совпадала с величиной а» МХ бодрствукдих навотшх (рнс.З, 1,3). Одновременно с повышением аф в условиях гипотонии уменьшалась чувствительность аф к разобщителям; канатика изменения аф в ответ на добавление АДФ приближалась к кинетике изменения а« бодрствующих нивотных (рзс.З, 1,3). Величина д» МХ бодрстЕуисгзх ппготкых пра инкубации в гипотонической среда практически кэ менялась.

Таким образом, устранение "блока" в дыхательной цепи путем инкубации в гипотонической среда, приводящее к усилению окислительной активности, сопровождается увеличением аф НХ печени гибернирунцих

еивотных.

блгаиге гепотоизз пз схссхлгелыюз оо^српЕ^рованае в 5-3 пзчзпа гпЗернзрлс^гх сусга-юв.

Известно, что даке незначительное снижение трансыембранного потенциала приводит к существенному сникению АТФ-скнтезирукчей активности МХ [Николе, 1985], поэтому обнаруженное в наиих экспериментах снижение величины дч? долзно существенно отраааться на скорости синтеза АТФ. Действительно, в ЫХ печени гибернирующих сусликов наблюдается значительное снижение скорости синтеза АТФ в сравнении с МХ печени бодрствуюдих сусликов (табл.З). Ш предполо-

гялд, что кедяенвое восстановление д* послэ добввленяя АДФ (рис.3, 5) связано в первую очередь с ториояением АТФ-синтатазной реакции в ".!Х гибернируща сусликов, ккевщах более низкую исходную величину аф; такое снижение д* вследствие возникновения "блока" в дцхательнсй цепи может Сыть основной причиной подавления синтеза АТФ. '"и показали, что при инкубации МХ печени гибернлрующих сусликов в гипотонической среде наблюдалось существенное повыиение скорости синтеза АТФ (табл.3); при этом падала эффективность окислительного фосфорилирования, то есть снижалось соотношение 7лтф/70 (табл.3).

В нашей груше Амерхановым З.Г. было показано, что частичное лоббирование антимицином А дыхательной цепи МХ печени бодрствующих сусликов, приводящее к снижению аф до величин, характерных для МХ бодрствующих животных практически точно воспроизводило угнетение синтеза АТФ, наблюдаемое в Ж гибернярующж сусликов. В результате м прнпли к выводу, что подавление окислительного фосфоралировония во время зимней спячки

Таблица 3.

Скорость синтеза АТФ С^т®' 11 эффективность окислительного ^сформирования в ИХ печени бодрствущях и

гябернарующик сусяасов при рааггшой тоничноетя среды.

Тспичность сседа Ео дрс т ву кя5:э Гкберпиругс^ю

;АТО I ''АТФ' "АТФ | 'АТФ7;о

250 60 98,0 ± 4,2 1,23 + 0,04 90,2 + 5,0 1,20 + 0,05 4В,4_+ 3,3 1,79 + 0,03 75,2 +■ 4,7 1,31 + 0,04{

Субстрат окисления - 4 кЧ сукцкнат. п = 4. яг?;зрялл з емоль ;.та_1ка мг бэлна

есть следствие торможения переноса электронов в дыхательной цепи и снижения дф и кэ связано нарушениям в работе самой АТФ-синтетазы. Устранение "блока" в дыхательной цепи в условиях гипотонии, приводящее к повышенна д«, активирует скорость синтеза АТФ.

ллгтпзецпя е"р.ргозее:"с2'50го трвеспсрта поесз СЭ2+ п К+ в 1,3 ПвЧвШ

гиберикруг^зх оусслЕсз пря пцягбац^я з гппотошческсЗ среде.

Кроме снижения скорости дыхания, падения дф и снижения скорости синтеза АТФ 1.СС печени габернирукщих сусликов характеризуются так 21Э значительны;,! подавлением транспорта ионов Са2'"'" и К+ внутрь МХ по сравнению с МХ печени бодрствующих животных (рис. 4, табл.4) и [Ре<3о1:о11ета ек а1., 1985; РеЬоя1оЬ, ТГатщ, 19873. Подавление поглощения ионов Са"+ и К+, как и снижение скорости синтеза АТФ, может быть следствием падения трансмембранного потенциала [ТейевЫгх, 1981]. Исходя из сказанного, можно было огвдать, что, повышение Дф будет приводить к росту скорости аккумуляции ионов

Са2+ и К+. Нами показано, что при инкубации МХ печени гибернирувдих сусликов в гипотонической среде (что приводит к увеличении Д1*, как показано выше) происходила активация входа ионов К+ как за счет работы эндогенных К+-трзнспортирущих систем (рис.4), так и в присутствии валиноьпщина. Активировался также вход ионов Са^+ (табл.4) в митохондриальный матрикс.

Рис.4.Влияние условий инкубации на набухание MX печени бодрству»-^их и гибершруицах сусликов в средах, содернащих ацетат калия.

A.- митохондрии бодрствующего (I) и гибернирущего (2) сусликов. Тоничность среда - 250 моем.

B.- MX бодрствующего (I) и гибернирумцего (2-4) сусликов в_

отсутствие (2) и в присутствии 25 мкМ БФБ (3) и I мМ ЭГТА с A23I87 (0,2 мкг/мл)(%). Тоничность среды - 60 моем.

Вход. К индуцировали добавлением 4 МЫ сукцината (ЯК) в присутствии 3 мкМ ротенона. Время инкубации до добавления ЯК - 5 минут.

Таблица 4.

Начальная скорость энергозависимого поглощения ионов Са^+ митохондриями печени бодрствующих и гибврнирупщх сусликов.

Группы животных Тоничность среды, добавки Скоростьопоглощения Са^1" нмоль Са^ VMfffl/MT белка

Бодрствующие Гибврнирунцие Гибетаирунцие Гибернирукидае 250 моем 250 моем 60 моем 60 моем + 25 мкМ БФБ 412 + 27 (6) 124 + 17 8 381 + 24 8 139 + 13 7)

Субстрат - 4 мм сукцинвт. с<3 Л у мг «■

Передо измерением скорости транспорта Са" МХ не менее 5 минут инкубировались в соответствующей Среде. Все эксперименты проводились в присутствии 3 мкМ ротенона. В скобках указано число повторов (л).

Это подтверждает наше предположение о связи падения д* и угнетения транспорта ионов Са2+ и К+ в МХ гибернирунцих печени сусликов.

Воспроизведение угнетения энергозависимого поглощения ионов Сай и К+, наблюдаемого в МХ печени габернирующих сусликов, на МХ печени бодрствующих животных при ингибировашш дыхательной цепи внтимицяном А [Брустовецкий и др., 1991], является дополнительным подтверждением нашего предположения о том, что угнетение зноргоза-висимых юттохондриальных функций в МХ гибернирувдих ¡штатных обусловлено снижением л*, то есть частичной доэнергизацией ИХ.

Роль фосфолипазы А2 в активами китохондрлальных функций в условиях гипотонии.

Известно, что важную роль в регуляции митохондриальных функций играют мембранные липиды [Р1а^ег et а1., 1976; Сгетег еЬ а1., 1979; Иа1воп, 1981]. Изменение липидного состава мембран моено вызвать за счет активации гидролиза фосфолипидов в результате инкубации МХ в гипотонической среде: набухание МХ в гипотонической среде сопровождается активацией митохондриальной фосфолипазы Аг [Каргаполов, 1979]. Как было показано ранее, максимальная активация дыхания МХ габернирующих животных достигается через Са2+-активацию митохондриальной фосфолипазы Аг [БI■ustovetsky et а1., 1988]. Для проверки предположения о том, что устранение "блока" в дыхательной цепи МХ печени гибернирущих сусликов при инкубации их в среде с пониженной тоничностью может быть связано с активацией фосфолипазы А2 исследовали действие ее ингибиторов на дыхание МХ в условиях нормо- и гипотонии.

Добавление ингибитора фосфолипазы А2 БФБ [БеГСзх^ег et а!., 1984; сьптщ et а1., 1987] в среду инкубации (равно как и истощение внутримитохондриального пула Са2* комбинацией ЭГТА+А23187 (Са2+ необхода! для активации фосфолипазы А2 [иаоЬЬаиег et а1., 1972])), предотвращало вызываемую гипотонией активацию дыхания МХ печени

Таблица 5.

Скорость дыхания МХ печени бодрствующих и гибернирукзщих сусликов в зависимости от тоничности среды и присутствия БФЕг.

Тонич- Скорость дыхания нг ат о, мин 'на мг белка '

ность - АДФ + АДФ | + С1ССР

моем Бодрств. Гибернир Бодрств. j Гибернир. Бодрств. Гибернир.

250 3&.0+4.8 19.2+4,0 145.0+10,8 60 51.4+8,3 25.7+3.8 111,1+8,4 250___ 42,7±6,4 25,9+4,4 147,8+11,4

46,6+5,8 216,6+14.7 57,5+4,1

91,3+7,2 208,3+18,3 160.6+9,8

48,4+6,0 204,0+10,1 69,6+5,7

210,2+12,1 72,4+6,1

(+БФБ)

38,8+5,1 23,7±3,0 138,9+10,4 : 50,0+5,6

(+БФБ)

Субстрат - 4 мЧ сукцлнат.

Лобавйи: АДФ - 100 мкМ; С1ССР - 1 мкМ; БФБ - 10 мкМ. Все эксперименты выполнены в присутствии 3 мкМ ротенонв. Во всех случаях п=4.

гибернирущих сусликов (табл.5). Дойствие ингибиторов наблюдалось на сразу, а через несколько минут инкубации, что, по-видимому, объясняется необходимостью некоторого времени для осуществления перестроек в митохондриальной мембране. На дыхакиз Мл печени бОДрСТВуКДКХ сусликов ингибиторы фОСфОЛШЮЗН ¿2 ВЛИЯНИЯ ЕЭ оказывали. БФБ почти нэ влиял на объем МХ печени гЕбернкрукщих сусликов: по данны).! нзмэрониЯ оптической плотности митохондриальной суспензии, происходило очень незначительное скатив МХ. Увеличение окислительной активности ИХ печеш; гибернарупчих кивотных происходило такие при их нагрузке (рис.1), при набухании ИХ в нормотонической среде, содержащей ацетат калия (особенно в присутствии валиномицина) (табл.6), клл после трехкратной процедуры замораживания-оттаивания в сахарозной среде с нормальной тоничностыо (табл.6).

Таблица 6.

Окислительная активность МХ печени гибернирующих сусликов пр;: различных условиях инкубации.

Условия инкубации Скорость дыхания нг ат 02 мин 'на кг белка 1

Контроль Опыт доиавки:

БФБ ЭГТА С А23187

Нагрузка Са2+ 3-хкратное звмо-раЕив.-огтаиван. Набухание в среде с ацетатом калия 40+4 (7) 36±3 (6) 37+4 (5) 110+8 (7) 85+9 (6) 89+7 (5) 42+3 (5) 44+5 (5) 39+2 (5) 42+4 (5) 45+3 (4)

Субстрат - 4 мМ сукцинат.

Добавки:75 нмолей Са2+на мг белка; 25 мкМ БФБ;

1 мМ ЭГТА + 0,2 мкг/мл А23187.

Все эксперименты выполнены в присутствии 40 мкМ ДНФ.

В скобках указано число повторов (п). Ингибирование митохондриальной фосфолипазы А2 при помощи БФБ или комбинацией ЭГТА+А23187 не только предотвращало увеличение окислительной активности МХ печени гибернирующих сусликов в условиях гипотонии, но также препятствовало увеличению лф МХ печени гибернирущих сусликов при инкубации их в среде с пониженной тоничностыо (рис.3). На величину дф МХ печени бодрствующих животных ингибиторы фосфолипазы А2 влияния не оказывали. Помимо предотвращения активации дыхания и увеличения дф ингибирование фосфолипазы А2 препятствовало ускорению синтеза АТФ (табл.5), а так же активации энергозависимого поглощения ионов Са^+ и К+ МХ печени гибернирущих кивотных (рис.4; табл.4) в условиях гипотонии. На эти же параметры МХ печени бодрствующих сусликов ни БФБ, ни ЭГТА+А23187 в использовавшихся нами концентрациях не оказывали заметного влияния.

Таким образом, можно предположить, что фосфолипаза к^, активирующаяся в условиях гипотонии [Каргаполов, 1979], при заморакивании-оттаивании МХ [ffaite еЬ з1., 1969] и при нагрузке МХ кальцием [НаоЫзаиег е1 а1., 1972], играет значительную роль в регуляции окислительной активности и других митохондриальных . функций печени гибернирующих сусликов.

Взаимосвязь структуры н фузкцяа МХ печени гибернирупзпх сусликов.

В связи с тем, что набухание МХ печени гибернирукдих животных в гипотонической среде приводит к восстановлению их функций, мы предположили, что во время зимней спячкй происходят структурные изменения МХ, приводящие к угнетению транспорта электронов и других митохондриальных функций. Для проверки этого предположения были проведены электронномикроскопическиэ исследования МХ в ткани печени и изолированных МХ активных и гибернирущих сусликов, а также проведено сравнение структурного состояния МХ и их функциональной активности.

На электронномикроскопических препаратах ткани печени нами показано, что МХ печени активного суслика имеют характерную для этой ткани ультраструктурную организацию: основной объем МХ заполнен матриксом, кристы немногочисленны; отчетливо видно, что они представляют собой простые складки внутренней мембраны, расположенные перпендикулярно длинной оси Ж. В печени гибернирующих сусликов Ж находятся в конденсированном состоянии. Сни характеризуются сзкатым матриксом, увеличенным объемом меямембранного пространства, уменьшенным общим объемом. Обнаруженные на«л структурные изменения ИХ печени гибернирующих сусликов по морфологическим параметрам соответствуют изменениям, происходящим с ИХ в условиях частичной или полной деэнергизации МХ [Бакаева и др., 1971; Бакеева, Ясайтис, 1972]. Функциональные изменения МХ гибернирущих сусликов такие могут быть объяснены их частичной девнергизацией.

Структурные изменения и деэнергизация ИХ в ткани печени гибернярующего суслика могли быть следствием низкой температуры тела штотного (около 5°С) в момент забоя. Однако, в пользу того, что структурные и функциональные изменения МХ гибернирующих .тавотных скорее всего связаны с внутренней перестройкой самих МХ, а не являются следствием низкой температуры тела во время зимней спячки, свидетельствуют результаты электронномикроскопического исследования изолированных МХ печени активных и гибернирующих сусликов. Они показали, что, хотя изолированные МХ печени как гибернирукдих, так и активных сусликов, хранящиеся на льду, находятся в сжатом состоянии, инкубация изолированных МХ печени активных сусликов в присутствии сукцината при 27°0 в нормальной среде приводит к их набуханию, тогда как МХ гибернирующих животных

в этих ке условиях остаются относительно сжатыми (рис.5,А,Б). При »

' Ч* £ У''¿Л * 1 1 - > ч» Д , [...: г Б Ь-'-.* ' ' л

г-- - " ' ; 8 1 - "г ! г { • •'"' * 1....... . ■■ 1 Г \ ■

Ркс,5.ПзаироваЕше 83 печени Оодрствувцаро (А,В) и геберщрущз-го (Б,Г) суыикоз после 4 чин инкубации с 4 сукщтвтса цш тешературэ 27 С в нормальной (А,Б) и гипотонической (В,Г) сводах.

набухшему состоянию МХ активных сусликов соответствует высокая окислительная активность, сжатому состоянию МХ гибернирунцих животных*- низкая окислительная активность (табл.1). Инкубация МХ активных и гибернирунцих сусликов в гипотонической среде (60 моем) вызывала их набухание (рис.5,В,Г). При атом окислительная активность МХ активных, сусликов остается практически без изменений, тогда как окислительная активность МХ гибернирунцих сусликов значительно увеличивается (табл.1). Полученные результаты привели нас к выводу, что сжатие МХ гибернирунцих сусликов является одной . из основных, причин угнетения окислительной активности • и других митохондриальных функций во время зимней спячки.

Выше было показано, что предотвращение активации окислительной активности МХ гибернирунцих сусликов при инкубации их в гипотонической среде в присутствии БФБ сопровождается, по данным измерений оптической плотности, незначительным сжатием МХ. Данные электронной микроскопии подтверждают эти результаты. Необходимо подчеркнуть, что БФБ приводил к незначительному сокращению и МХ активных животных, но в этом случае снижения окислительной активности практически не происходило. Из всего этого следует, что

гезначптольное сяатяэ ИХ гиберапрукдах сусликов под действием EIB ::а мокэт быть причиной предотвращения активации их дыхания в условиях гипотонии, которое обусловлено лнгиСироввнием фосфолипазы -'о, и это приводят нас к предположению, что структурные изменения и иагибирозание митоховдриальннх процессов печени гибернируащах сусликов могут Сыть связана со сшиюнием фосфолипазной активности и изменением липидного состава мембран.

Еывода

1. Представленные неми результаты показывают, что во время зимней спячки происходят структурные изменения I.OC печени сусликов, приводящие к угнетению митохондриальных функций.

2. Саатие ЬК печени гнбернирующих сусликов является одной х:з основных причин угнетения их окислительной активности. С;:этое состояние MX гибершрупцих гопзотшх сохраняется и посла их выделения и инкубирования в стандартных условиях.

3. Набухание MX печени гибарнирущих сусликов в гипотонической срэде- Базнвает увеличение их окислительной активности.

4. Увеличение окисгителькой активности НХ печени гибернарукцих су основ з гЕПотсаичесхоЗ среде сспровоздаэтся повышением д-р.

5. В условиях гипотонии происходит вэтавацвя исходно подавленных сиятесз АГЗ и впергозаЕНсеттого помгсщекая коков Ca6* и К+ ютохондриига печени гпбэрниругщях сусликов.

G. Енгкбированиэ фосфодягвзы А2 предотвращает активация митохондриальных процессов у гибернярующях кивотных в г:шотс2П1чэс:ссЗ срэдэ, а твкз набухание ьктохояцраЯ гзберпируп^п суопсгоз и акт::вацшэ нх дахисш в условиях кальциевой ногрук'л. 7. Для активации ьштохондртальннх процессов гибврнкруязях яивотннх необходим как шнвдум два процесса: набухание иитохоядрий и активация митохондриалъной фосфолипазн Ag.

СПИСОК РАБОТ, ОПУЕЛИСОВАИШХ ПО <№В ДИССЕРТАЦИИ.

1. БрустовецкиЗ H.H., Амерханов З.Г., Егорова М.В., Мохова E.H., Сяулачев В.П. (1991) Участие ATP/ADP-внтжгортера и жирных кислот в разобщении окислительного фосфорялирования в митохондриях печени сусликов при зимней спячке и пробувдении. Езопзяя Бб, 5, 947-953.

2. Брустовецкий H.H., Егорова М.В., Маезский Е.И. (1391) Окислительная активность и дф митохондрий печени активных и гнбернирующих сусликов при различных условиях инкубации. Биохимия 56, 8, 1522-1527.

3. Брустовецкий H.H., Егорова М.В., Гришина Е.Б., Маевский Е.И. (1991) Активация окислительного фосфорилирования и энергозависимого поглощения ионов Са2+и К+ митохондриями печени гибернирущих сусликов в гипотонической среде. Еиохиыия 56, 8, 1528-

4. Bmetovetsky N.N., Amerkhaaov Z.G., Egorova M.V., Mokhova E.N., Skulaohev T.P. (1990) Carboxyatraotylate-Bensitive unooupling in liver mitoohondria from ground squirrels during hibernation and. arousal. KEBS Letters 272, 190-192.

5. Brustovetsky N.B., Egorova M.V., Gnutov D.Yu., Gogvadze V.G., Mokhova E.N., Skulaohev V.P. (1992) Thermoregulatory, carboxy-atraotylate-sensitive unooupling in heart and skeletal musole mitoohondria of the ground squirrel oorrelates with the level of free fatty aoids. FEBS Letters 305, 15-17.

6. Brustovetsky N.H., Egorova M.V., Mayevsky E.I. (1992) Regulation of oxidative activity and A* of liver mitochondria of active and hibernating gophers. Tlie role of phospholipase Ag. Comp. Biochem. Physiol. 1G2B, 635-638.

7. Brustovetsky N.N., Egorova M.V., Grishina E.V., Mayevsky E.I.

(1992) AnalyBÏB of the causes of the suppression of oxidative phosphorylation and energy-dependent oationio transport into liver raitoohondria of hibernating gophers, Citellus undulatus. Coup. Biochem. Physiol. 103B, 755-758.

8. Brustovetsky N.N., Egorova M.V., Gnutov D.Yu., Mokhova E.N., Skulaohev T.P. (1993) Cyolosporin A supression of uncoupling in liver mitochondria of ground squirrel during arousal from hibernation. FEBS Letters 315, 233-236.

9. Brustovetsky N.N., Egorova M.V., Iljasova E.N., Bakeeva I.E.

(1993) Relationship between structure and funotion of liver mitoohondria from hibernating and aotive ground. BquirrelB, Citellus undulatus. Conp. Biochem. Physiol. 106B, 125-130.

10. BrustovetBky N.N., Egorova M.V., Gnutov D.Yu. (1993) The mechanism of oaloium-dependent activation of oxidative activity of liver mitoohondria of hibernating gophers, Citellus undulatus. Comp. Biochem. Physiol, (in press).

1534.

2.11.93 г. 3aK.5839P. Тир. ГОР экз. Уч.-изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПШ РАН