Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндогенные этанол и ацетальдегид в организме якутского длиннохвостого суслика (Citellus undulatus jacutensis, Brandt, 1843) и их участие в эколого-физиологических механизмах зимней спячки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эндогенные этанол и ацетальдегид в организме якутского длиннохвостого суслика (Citellus undulatus jacutensis, Brandt, 1843) и их участие в эколого-физиологических механизмах зимней спячки"

АКАДЕМИЯ'НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Якутский институт биология

'На правах рукописи

Бизяева Ольга Николаевна

ЭЦЦРГЕННЫЕ ЭТАНОЛ И АЦЕТАЛЬДЕГИД В ОРГАНИЗМЕ ЯКУТСКОГО ДЛИНШХЮСТОГО СУСЛИКА

(Citellue undulatus jacutепзis,Brandt,1843 ) И ИХ УЧАСТИЕ В ЭШЖГО-ФИЗИОЛОППЕСКИХ МЕХАШЗМАХ ЗИМНЕЙ СПЯЧКИ

( 03. 00.13. - физиология человека и животных )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1990

Работа выполнена в лабораториях экологической физиологии животных и экологической биохимии Якутского института биологии СО АН СССР

Научные руководители: Заслуженый деятель науки РСФСР,

доктор биологических наук, профессор Н.Г.Соломонов

Кандидат химических наук Б.М.Кершенгольц

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор Н.К.Попова

доктор медицинских- наук, профессор И.И.Евнина

Ведущее. учреждение

Институт биофизики АН СССР (г.Пущино)

Защита состоится 1990г. в " " часов

на заседании специализированного совета К 0011401 по защите кандидатских диссертаций при Институте физиологии СО АМН СССР

Адрес: 630117 г.Новосибирск. ул.Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии СО АМН СССР

Автореферат разослан "Д2" 1990г.

Ученый секретарь специализированного совета к.б.н.

Г.М.Домахина

ОЩАЯ харлктшстш. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многочисленные исследования последних лет различных аспектов зимней спячки не только привели к пониманию целого ряда популяционных, физиологических и биохимических механизмов данного феномена, но и поставили новые задачи, среди которых можно выделить следупцие:

исследование причин спонтанных пробуждений в процессе спячки, на которые расходуется около 20% всех зимних энергозатрат организма;

изучение энергетических субстратов, обеспечивающих биоэнергетику в процессе зимней спячки и на самых ранних этапах пробуждения, когда поглощение кислорода еде очень мало и темпе-* ратура близка к нулю;

исследование роли дегидрогеназных систем в обеспечении стабильного, ко минимального по интенсивности метаболизма в условиях зимней спячки при снижении потребления кислорода.

Открытым остается вопрос о природе веществ непосредственно обратимо ингибирующих терминальное окисление и регулирующих го-меостаз при гипобиозе. Остаются неясными вопросы, касающиеся механизмов поддержания высокой иммунореактазности при гиберна-ции, а также природа эндогенных икмуносенсибияизаторов.

В нашей работе мы попытались получить новуа информацию необходимую для решения в той или иной степени поставленных проблем, исходя из изучения особенностей метаболизма эндогенных этанола и ацетальдегида в организма длиннохвостого суслика в различных физиологических состояниях животного и влияния этих экзогенных веществ на процесс зимней спячка.

Цель и задача исследования. Основная цель - исследование состояния системы этанол-ацбтальдегзд в организме зимоспящих животных и выяснение рола данных метаболитов в механизмах регуляции интенсивности метаболизма и степени иммунореактивностя организма при различных физиологических состояниях животных. Для достижения этой цэяи были поставлены следующие задачи:

I. изучение содержания эндогенных этанола и ацетальдегида в организма якутского длиннохвостого суслика при различных физиологических состояниях яиаотного;

2. исследование каталитических и шизико-хиуических свойств ферментной системы, метаболазирующей эндогенные атанон и ацет-альдегид, как молекулярного инструмента рехуляции соотношения уровней данных метаболитов в различных физиологических состояниях организма суслика;

3. изучение иммунологического гомеостаза организма суслика в различных физиологических состояниях животного и роль ацет-альдегида в рефляции реактивности данной системы;

4. исследование влияния экзогенного этанола, как возможного катаболическмо субстрата и метаболита, стабилизирующего неспецифическую адаптивную реакцию организма и акзогенаопгацет-альдегида, как вероятного регулятора интенсивности терминального окисления и модулятора активности "гипометаболических факторов спячки" на физиологические параметры спячки.

Научная новизна работы заключается в том, что в ней впервые показана роль эндогенных этанола и ацетальдегида в механизмах рефляции и стабилизации гомеостаза при гибернации и в активном физиологическом состоянии суслика.

Установлена сезонная асинхронная динамика уровней эцдо-генных этанола и ацетальдегида а крови якутского длиннохвостого суслика.

Показано, что динамика уровней эндогенных этанола и ацетальдегида обусловлена изменениями каталитических и физико-химических свойств основных дегидрогеназ печени суслика.

■ Устансиено, что эвдогенный ацетальдегид является сенсибилизатором реактивности иммунной системы в период зимней спячки. '

Научно-теоретическая значимость результатов работы заключается в разработке с помощью экзогенных этанола и ацетальдегида способов углубления гипобиоза у яегибернируюеих вйвотных, а также в выявлении механизма защиты организма от токсического действия высоких концентраций ацетальдегида с помощь» образования оснований Шиффа со свободными аминокислотами, особенно при низких температурах. Установленные особенности функционирования системы э тан о л-ацэ тальдегида в организме зимосдящих раскрывают новые стороны механизма адаптации и могут быть использованы для оценки физиологических возможностей организма в экстремальных условиях. Данные о сезонной динамике система этавол-ацетальдегид и иммунной системы у сусликов дополняют сведения со экологической физиологии человекаи кавотвых.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных конференциях Якутского института биологии СО АН СССР (1987, 1988, 1989, 1930), на УП Республиканской научно-практической конференции колодвх ученых (Якутск, 1988), на УП Всесоюзном совещании по грызунам (Нальчик,1988), на Ш Всесойзной школе-семинаре "Механизмы зимней спячки млекопитающих" (ПущиноДЭбб), на научно-практических конференциях Якутского госуниверсигета (Якутск,1989,1990), на заседании отдела зоологии Якутского ¡института биологии (1969), на У съезде Всесоюзного териологического общества (Москва, 1930), в Институте биохимии им.А.Н.Баха (Москва,1990), а танке з Институте физиологии СОАМН СССР (Новосибирск,1990).

Публикации. - По катериалам диссертации опубликовано 8 работ и принято к печати 5 работ. •

Структура и объем диссертации. Рукопись диссертации состоит из введения, пяти глав, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 107 отечественных и 119 иностранных источника,-Общий объем работы 141 страница, в том числе 12 таблиц и 33 рисунка,

СОДЕРШИЕ ДИССЕРТАЦИЙ

Во »ведении характеризуются цели и задачи исследования, обоснованы его актуальность и научно-теоретическое значение,

В литературном обзоре по проблема "Биоэнергетические аспекты зимней спячки" сделан анализ известных материалов по некоторым проблемам: биоэнергетические субстраты, механизмы регуляции биоэнергетических процессов у зимоспящих, метаболизм эндогенных этанола и ацетальдегида у незимоспящих животных, позволивших выделить ряд менее изученных вопросов,.исследования по которым и составили задачи настоящей работы.

Материалы, и ыето,ш исследования Исследования проводились на якутских длиннохвостых сусликах ( Citèllus .). В период исследований сусликов отлавливали способом выливания из нор в окрвстрстях города Якутска. Для исследований в период зимней спячки животных отлавливали в первой половине сентября. 'До, середины октября зверьков содержали в индивидуальных клейках при комнатной температуре и естественной продолкктельйости светового дня. В конце октября киеот-

пых переводили для спячки б специальное помещение, где температурные условия были близки к естественным на горизонтах расположения гнездовых камер сусликов. Во все сезоны животные получали обильное количество пищи. Забор крови проводили в момент декапитацав животных, печеночные пробы - сразу после декапитации..Периферическую кровь брали из хвоста. Под состоянием глубокой спячки понималось состояние сопровождающееся снижением температуры тела суслика до'0+4°С.

Инъекпии экзогенного этанола производили внутрибршин-но. Вводили 1,5 мл 11% раствора этанола. Внутрибршинно сусликам вводили 2 мл физиологического раствора, содержащего 0,45 мМ раствор адетальдегида, либо 0,45 мМ р-р ацетальде-гида и 1,43 мМ р-р аминокислот.Модификацию аминокислот ацет-альдегидом проводили в течение 60 минут при различных температурах (+3°С и +£4°С). Для выяснения вопроса об отношении животных к этанолу быкл использован распространенный метод количественной оценки потребления жидкостей в условиях свободного выбора (Буров и др.,1985). Для кинетических исследований очистку ферментов иечени проводили колоночным способом с использованием Сефадекса (»-100. Активность алкоголь-дегвдрогеназы в реакции окисления этанола (АДГ^) и восстановления адетальдегида (¿Щ^.альдегиддегидрогеназы (АдьДГ). определяли по начальной скорости образовалия НАШ или его расходования при дегидрогеиазном окислении этанола или адетальдегида, регистрируемой по увеличению оптической плотности или ее уменьшению при длине волны 340 нм на двух-лучевом регистрирующем спектрофотометре "Зкуго*^' (Япония). Для получения кинетических'параметров (Констант Михаэлиса АДГ и АльДГ во НАД, этанолу, НАДЯ, ацетальдегиду) измеряли зависимость начальной скорости от концентрации одного из субстратов (коферментов) при насыщающих концентрациях кофер-мента (субстрата) при различных рН среды и в области температур от +2°С до +40°С. Использовали метод двффереацировки йзо-форм АльДГ на две группы (с большим я меньшим сродством к ацетальдегиду) кинетическим методом (Кершенгольц, Серкина, 1981). Гетерогенность АДГ печени изучали путем электрофоре-ткческого разделения в крахмальном геле, используя модифицированную методику, описанную в работе ( 7викд.гг\оЬо «Ь ¿1, 1960). Для определения концентрации АДГ был использован метод

титрования активных центров фермента гидрокспмеркурибензоа-том (НШЗ), основанный на высоком сродстве ртутьсодеряащих ингибиторов к ЗН-группам актового центра фермента (Рогохан, Кериенгодьц и др.,198Ь). Концентрацию этанола определяли хроматографичесхим и энзимологическим метода!/:!! (Крраенгольц, Серкина,1981). Для оиределния содержания в крови я печени эндогенного ацетальдегида использовали энзимологвческий метод с применением.очищенного препарата АДГ из зерен пшеницы. Эндогенные атанол и ацетальдегкд предварительно отгоняли из крови методом парофазного концентрирования при 80°С и 56°С,соответстзенно, в течение 60 кинут. Кроме того концентрации ацетальдегзда расчитывали теоретически по формуле, приведенной в работе (Керкенгольц и др. ,1981"). Подсчет лейкоцитов в периферической крови проводили по стандартной методике в счетной камере ГоряеЕа. Лейкоцитарную формулу крови подсчитывали в мазках окраиешшх по методу Ромаковс-кого-Гимзн (на 300-500 клеток). Дифференциацию на Т-, В-и 0-лимфоцита проводила по методу, в основу которого положена способность клеток образовывать комплексы (розетки) с эритроцитами барана (Петров,1986). Результаты работа обработаны методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдеята,

РЕЗУЛЬТАТЫ КСОДОВАШ'Й

Метаболизм эндогенных этанола и адетальдегида в организме

якутского суслика при различных физиологических состояниях животного. ■ :

Установлено, что у длиннохвостого суслика уровни эндогенных этанола к адетальдегида, определенные экспериментально, а 4-6 раз различаются в зависимости от физиологического состояния тавотного. В состоянии зимней спячки (декабрь-фев-ражь) концентрация этанола в крови составляет 0,4-0,6 а адетальдегида более 20 ккМ. В активном состояния (июнь-июль) уровень эндогенного этанола возрастает до 2,8-3,2 кМ, а адетальдегида падает до 4,5-5,5 мкМ (рис.1а). Причем ; во всех физиологических состояниях абсолютные уровни этих метаболитов были существенно вкие, чем у негибернлрутетх зивотных, а соотношение ацетальдегад/этаяол увеличивалось в период зимней спячки по сравнению с'активным летним более, чем в 25 раз.

of. £Г

i

¿ -

r»

Q<

I

ra

o,

o

t* -A

O

а я

o Hi"

P.1 Ci CS

а, к о о

S Bis

se :í ts

а а гк

« ц œ

H о

I- tí

s o>J

W í-4

а »АО QttfO

К о о, о =

¡4 я

ri ï-ï

Я О Я

S ях

Si cj rt

$ и ^ Л .

ч -о <3 и н

а

4

е> 'Û

5

■ с у

0 Ci

a.

g

га

и

1 л

I-, о . » с;

« л tí сг о я) - ö

•X t* f

tí <а а> вй й

О g CÎ

'гп з: й rí «»es

г S ><■ 0)

Q> Ci S3 с> KidTlCt

О о «о о и Чи

t I 05 s

Jl«

«Г й> «

О о

«

Й

к w

i Û

а ш

к о

s о

«S

а»!) -»сз о гз НЙЖЙВЗ <9 <и

оо«ноЗ ЙЧ OOOOW Я! S QiV.ei я о

I I НО 3 Й0

« >оА -oí •• I л •

MOJES • Qr-ч у К

о со с* s a tí :•« Кй ts ooi н к й о а о ч Й ь*

Я»1;ЯС18ЯО SOÏBH во О.С5 ООвЙ" Ч И У f Ж Зн S i«

(iynj къгие]

Ч

Мы предполокили, что сезонные'изменения уровней зндоген-ах этанола и ацетальдегпда, их соотношения зависят от концентрами и кинетических параметров ДДГ и АльДГ и в связи с этхм зучили свойства этих ферментов в различные периода етзни усликов. Во время зимней спячки концентрация АДГ состав-яет около 1,8 нмоль/г печени, а в активный период содер-ание фермента возрастает всего в 1,3-1,5 раза (2,6нмоль/г ечени). Следовательно в различных физиологических состояниях имоспящих онтогенетические изменения по отношению к АДГ дут, вероятно, по путл синтеза новых форм фермента с оп-имальныыи для низких температур каталитическими свойства;«;, не простого изменения интенсивности биосинтеза.

Мы расчитали ккатАДГ на I субъедицицу и УмаксАлзгДГ ри различных физиологических состояниях суслика с уче-ом истинной температуры тела и рН внутренней среды (табл.1).

Таблица I.

Сезонные изменения кинетических параметров АДГ и АльДТ печени суслика

остолние (мин*1) (мкмоль/мин на 1г печени)

пячка 181 86,6^4,0 210,7^15,6 0,05*0,004 С,03±0,003

:сдготов. , . . ,

: пробуяд. 53 144,8±12,2 1055,6±Ш,3 0,49*0,005 0,16*0,012

1ЫХ0Д КЗ

¡печки 96 122,7*10,6 591,2-48,6 0,03^0,003 0,02±0,002 ктивный , ,

¡етний пер.25В 48,6*5,1 993,2±9£,7 0,12*0,005 0,10*0,004

Изменение активности ферментов может быть обусловлено ие-¡енением степени сродства их к соответствующим субстратам (кофакторам) . Были определены величины элективных констант Ми-:аэлиса АДГ и АльДГ з различных физиологических состояних :услика (таб.2).

С учетом того, что условия протекания реакции (температура, рН) неравнозначны,, то ш исследовали температурную и рН зависимости данных Констант.

Таблица 2.

Величины эффективных констант Михаэлиса АДГ и АльДГ (мкМ) печен к суслика по субстратам и .койерментьм с учетом- • " истинной темпе сатуры тела животного

Физиолог. К АДГ К.,АльДГт К-ДльДГтт

состояние со по по - по • "по . .по

этанолу ацетальд НАД НАДИ алт>Д| альд^ .

Зимняя , спячка 603*60 383*38 38*4 13,3-1,2 3,6*0,4 323*33

Подгот.к проСунд. 426*45 362*35 _ _ 5,л±0,5 250*26

Выход из . спячки юаэчоо 400-40 33*3 14,2-1,5 7,0*0,7 200*20

Актйвный период 1667±150 186*20 57*6 22,2*2,2 8,8*0,8 105*11

В летний период скорость оборота одной субъединицы АДГ с ацетальдегидом-- поч?к в 10 раз Еше чем зимой. Степень связывания АДГ с ацетальдегидом-в летний период в 184 раза выше чем с этанолом. Б зимний же период, наоборот, возрастает почти в 50 раз скорость связывания АДГ с этанолом. Такие сезонные изменения величины скорости оборота одной субъеди-ниш АДГ (скорости связывания второго порядка) обуславливает в период зимней спячки увеличение уровня эндогенного ацетальдегвда и уменьшение содержания этанола в крови длин- • нохвостого суслика. Летом же, наоборот, происходит смещение равновесия системы этансл-ацетальдегид в сторону образования этанола.

Экспериментальные и расчетные данные по концентрации ацетальдегида в крови сусликов в летний период практически совпадают (рис.1а). В зимний ге период экспериментальные данные по уровню ацетальдегида на 30-45$ нике расчетных.

Наиболее вероятным механизмом выявленных'сезонных изменений свойств ферментов кокет быть изменение изеферментного спектра. С целью проверки этой гипотезы мы изучили полиморфизм АДГ в различные сезоны. Было обнаружено, что-фермент представлен пятью изоформами. В зависимости от физиологического состояния животного наблюдаются как количественные, так и качественные изменения состава фермента (рис.2). Так, три изофорш АДГ2_щ сбнаруашаются в печени а течение всего года. У сшщего суслика практически отсутствует АДГу, доля его увеличивается в весенний к летний периоды. В печени кавотикх,

- & -

Содержание дДГ-Ш

м

£

IX

I

XI

д.

1

I

1ц

I

1 г

%

1

Щ

ж

II

УП

подготовка к спгчкс 1'лусокаг ащ/.н?" спячкь о^хсд из спрчк'л

т - э - адгп' а -адгш. ¡пз- т -

Рис. 2. Сезонная динамика содержания различных изоформ алкогольдегидрогеказы печеш суслика.

яктиенъ.'»* летний период

вышедших из состояния зимней спячки и у активных доля АДГ^у невелика (около А%). Но она увеличивается в процессе подготовки к спячке (август) до 10,. У спящего суслика АДГ1у уже преобладает, составляя до 8С$ от содержания всех изоформ.

Сравнение сезонной динамики содержания эндогенного этанола в крови суслика и изменение уровней »того метаболита при спонтанных пробуздениях ( о ростом температуры тела) . указывает на близость этих процессов: в крови активного животного уровень эндогенного этанола всегда выше, чем при гибернацаи. Однако при спонтанных .пробуждениях рост концентрации этанола в 2-2,5 раза менее выражен (рис.16).

Соответствующие изменения содержания ацетальдегида в крови суслика резко отличаются: если в сезонном аспекте активное состояние животного характеризуется снижением уровня эндогенного ацетальдегида в 5-6 раз по сравнению с зимней ссячкой, то при спонтанных пробуждениях уровни ацетальдегида в этих двух различных физиологических состояниях мало ОТЛИЧИМЫ.

Эффекта введения зкзогвнныхп этанола и ацетальдагела на Физиологические к иммунологические параметры .

Повышенна уровня эндогенного этанола в крови при пробуждениях/животных мы попытались связать с увеличением потребности организма в нем в весенний и летний периода. Наибольшее количество потребляемого сусликами Ю^-ното раствора этанола отмечается в весенний период. В этот период, связанный с выходом животных из спячки^ регистрируется очень нестабильный уровень эндогенного эталона в крови (рисЛе). При наличии экзогенного этанола организм легко вовлекает его в обменные процессы.

В серии экспериментов, проведенных осенью и весной па изучению влглнвя внутрибршинного введения экзогеяного этанола на температуру теласусликабыли получены различные эффекты (рис.3 ). Весной экзогенный этанол не вызывает практически гипотермаческого и гипсмет$бодического эффекта. Введение этанола буерам в осенний период вызывает в первые 60 канут сниженяе температурк тела в средней на 0,В°С, наблюдается также и снижение двигательной активности.

Эффекты введения сусликам этанола осенью (I), весной (2),

ацетальдегида осенью (3),на температуру тела аивотних. (4) - контроль - введение физ.р-ра.

?

*

о *

£ (г о If

2

1.0

•3

'6 и и

у

а

3

х $

I - пеи-гпрофгмп !•*'■• -1. • лимфоцг/пн

1

о

Рло. л. ных а в

1

Í

о »

€ fc

О

If

о»

ч к

« 0,5

'К

о

и

¡I

й *

8

I

Т- Аим*Г*ОЧЪТЫ

{ | - O-^VAfpo»¡ЧТЫ

Абсолхтлое количество■найтрофиков, лим$овдтоп и различ-cyCnonj'.'tíui!^ ликфоиатоа и крозя спящих сусликов (С„, п=5) крова сусликов после ■ введения оснований i¡¡r4»¿a (Ст, п-5>.

В экспериментах по экзогенному введению ацетальдсгида были проверены предположения о его способности: во-первых, снижать температуру тела, во-вторых, повышать биологическую активность "гипометаболических факторов спячки" (предположительно пептидной природы); и в третьих, выступать в роли сенсибилизатора иммунной системы.

Бри введении в осенний период пяти сусликам экзогенного адетальдегида в первые 60 минут отмечается снинение температуры тела в среднем на 1,0°С, кроме того, отмечается понижение двигательной активности, вялость, сонливость (рис.3 ). С целью увеличения'эффективности действия адетальдегида и снижения его токсического аффекта мы разработала метод введения экзогенного ацетальдегида в организм суслика путем инъекции его з связанном с аминокислотами состоянии в виде оснований Шиффа. Данные комплексы оказались наиболее стабильными при низких температурах (менее +5+6сС). При введении внутрибршинно гйбернирувдим сус-кам оснований Шиффа (модкффахация аминокислот ацет-аяьдегвдом при +3°С) не происходило пробувдепия животных. Наооборот, отмечалось усиление гипомзтаболкческого эффекта - температура тела спящих сусликов снизилась дополнительно на 1,4-1,5°С.

В этой хе серия экспериментов мы проследили влияние экзогенного ацетальдегида на шдлунореактявность организма суслика (рас.4), При введении в организм оснований Шиффа, (при условии, что модификация аминокислот ецетальдегвдом проводилась при низких температурах) в крови не отмечается повышения уровня лейкоцитов к лимфоцитов, однако, изменяет--ся их популяциокная структура. По сравнению с контролем уровень Т-ликфоцитов практически не изменяется, но увеличивается абсолютное количество В-лимфоцитов, вероятно, за счет снижения уровня 0-клеток. По-видимому, ацетальдегид, кодифицируя белки или кпкие-то другие комплексоны, выступает в роли сенсибилизатора аутоантителобразовааия (В-лимфоцитов). ^ . '

В следуюцей серии экспериментов мы изучили влияние модификации экзогенные ацетальдегидом "гипометаболичзского фактора спячки" СГФС"), выделенного из иозга северного оленя

- 12 - и-

(фракция от I до 10 КД), на его гипобиотическую активность. "ТФС" вводится белым мышам весом 25-35 г в дозе I мг/г. Модификация ацетаяьдвгидоы проводилась в такой концентрации, чтобы уровень последнего а крови тестовых мышей быд соизмерим с уровнем эндогенного ацетальдегвда в крови гибернируяцвго суслика - около 30-50 мкМ, Результаты приведены яа рисунке 5. Введение модифицированного ацетальдёгидом ТФС" через 3040 минут выбывает снавение температуры тела животных на (4,7±1,4)°С. При этом шаи находятся в-угнетенном, заторможенном состоянии в отличие от контрольных животных. Через 360 минут происходит нормализация температуры тела животных и их двигательной активности. С целью выяснения первичности воздействия ТФС" или ацетальдегида, ш видоизменили постановку эксперимента: компоненты вводились с некоторым интервалом и с различной очередностью. Более эффективным по продолжительности и величине гипотерми- ■ ческого зф$екта является введение "ГФС" через 30 мьнут после введения ацетальдегида: на 70-80 минуте отмечается понижение температуры на (г.Т^.б^С. При введении ацетальдегида после ТФС" отмечается снижение температуры тела двакда о максимумом через 210-230 минут примерно на 1,7°С. И в этих случаях эффект обратим, то есть физиологичен.

Поскольку эндогенный ацетальдегид, выполняя;, .по-види- ' мому, определенные физиологические функции, тем не менее в высоких концентрациях является для организма токсичным соединением , 1978) то, следовательно, в организме долиш, вероятно, существовать какие-то механизмы защиты. И поэтому особый интерес представляют вопросы, связанные с характером сезонных корреляций мевду уровне;.! эндогенного ацетальдегида в крови и иммунореактивностью организма суслика, а также зависимостью между этими параметрами при спонтанных пробувдениях животных в зимний период.

С.целью получения ответа на поставленные вопросы было проведено исследование морфологической и иммунологической структуры белой крови якутского суслика при различных физиологических состояниях TSKBOTEHX.

Изменение ноpctgлогической к иумуиологячвекой структура

белой крови у eveлика е зявисимости от ого йизиодоги-

ческого состояния (в сезотюм аспскте_т при спомташшх

Несмотря на значительную лейкопению зикой, абсолютное количество лимфоцитов в крови сусликов уменьшается всего на Ч-1С%. В период зимней спячки доля яимфоцитоэ увеличивается с 29 до 63^, содерзание зе нейтрсфилов в этот период, напротив,.снижается с 57 до 2Э£'. Максикаль-ßoe содернание лимфоцитов, превышающее их абсолютный уровень в активном состоянии а 1,7-1,8 раза, наблвдалось пра выходе животных из спячка и при подготовка к ней. Даясз:ки проследила сезонпу» динамику поаудяциоапой структура лкь-фоцитов крозк сусликов* Многообразие функций лимфоцитов показывает целесообразность'их срочной иобилиэацки у суслкка в период зк:/.ней спячки и расселение по органам и тканям для обеспечения подготовки орга-нвзка к ответу на лвбоё нарушение. -

В период зкйней спячки уровень Т-лимфоцитов на 30$ вшеi чем йетом, Абсолютное количество 3-лимфоцитов шк-скиалшо в период выхода шзотннх из спячки (ряс.6).

Изучена также динамика изменений морфологической в иммунологической структура белой крови суслика при : спрятанных пробуздеакях зивотных. При повышении температуры тела от 0+4°С до 35+37°С sa очень короткий период (2-4 часа) общее количество лейкоцитов крови возрастает почта с 3 pasä. Ш.рта'лияюь/отап-ах^оройзпдаа»«'.: претерпевает некоторое пзвеяение в морфологический состав лейкоцитоз. На этааз ясшшеаия температуры тела суслика до +7*6°С а крови отмечается быстрый рост содержания лш^оцетоэ (отяоеатеиыша и абсолютный). Рост атотидет га счет .аояаззйая отнобательного содеркакия нейтрофалов. Вероятно, на первые этапах пробуждения, зоз- : растает роль дпинфоцитов, Пра всследЬваЕШ допулядеонвой структуры лзшфсцатсзаыяснняось, что погызение температуры тела до +7+S°C сопровождается ростом абсолютного количества как: Т-, так н В-лемфоцатоа (рис.7). На последнем этапе пробуадевгй прЬдЬяЕается повшенае абсолютного .'■'. количества» таг я." относЕтевьноа^^ доли Т-иам^цятов. ' Увелачеаав дояа В-тф>цитов в крови на первых этапах врсбутдеаия проваходат, вероятно, sa счет 0-клеток.

1

ч

1200

0

Ч <000

1

£ £00

О

V) <£ 600

о

« ■а 400

а

*

й 2С0

о

Х'Ъимн&л. с од. ;

¿-поЪгот^аЪ п. 3 - Оф (/^

2 3

^■щио'юшгесуов

<5

сое рюлниа

Рис.6. Динамика абсолвтного количества Т-,В- и 0-лимфо-цитов в крови длиннохвостого суслика в зависимости от физиологического состояния кавстных,

к »

■ к

о

•I «

т к

%0

•2

г о,5 л

и 16 ао г* ла дг 5 е. т'с

Рес. 7. Динамика абсолютного количества Т-,В- и 0-лимфо-цатов в кровь суслика при сповтанных пробувдвниях.

• Возмошо, увеличение уровня В-лимфоцитов в этот период (до +7+6°С) мокет быть связано с ростом концентрации в крова свободного эндогенного ацетальдегяда - эндогенного сенсибилизатора аутоиммунных процессов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результат! свидетельствует- о функциональной значимости системы зядогейпах метаболитов этанол-ацетальде-гкд в формировании специфического гсчеостаза в организме ЗИИ0СПЯ1ДПХ животных как в активном состоянии, так и, особенно, при гибераация. Механизмом регуляция соотношения этих метаболитов (смещение равновесия в.сторону образования ацетальдегида при снижении температуры тела и в сторону этанола в активном состоянии) является изменение активности а фазико-хикйчесхюс свойств АДГ и АлтДГ. Последнее обусловлено .изменениями иэоферментного спектра активных форм данных.ферментов, наличием изеформ специфических для зимней спячки и для активного состояния.

В период зимней спячки до 4.0% эндогенного ацетальдегяда» веооятно, находится г связанном состоянии. В период подготовки к спячке а крови сусликов отмечено повышение уровня альбуминов и некоторых аминокислот (¡а частности, алзчина), которна способны образовывать о ацзтальдег.ч дом нетоксичные ..комплексы типа оснований Шиф$а.

При спонтанных пробуждении сусликов можно предположить наличие следующей гипотетической схемы функционирования в организме системы з^аяол-адетальдегад. В состоянии глубокой гибвряадяи асетальдеггщ вероятно, является одним из ингибиторов катаболизма. Часть его депонируется в виде комплексов с белками -С.основанея Шиф1а), часть в виде этанола. Последний,. з свою очередь, может выполнять наряду с липидвми и аминокислотами функция катаболического низкотемпературного субстрата, в определенной степени поддерживающего в концентрации 0,5 иМ скорость биоэнергетических реакций на стабильном минимальном уровне. При пробуждении

• этанол продолжает использоваться э рола эффективного яата-болического сырья, его значение в процесса разогревания

тела возрастает, содержание повышается в 2-3 раза за счет восстановления ацеталздегида. В интервале температур от +2°С до +16°С экспериментально определяемая концентрация эндогенного ацетальдегида, достигая бОмкМ, превышает расчетный уроаень б 2,2 раза (при +8°С). Это указывает на то, что на первых этапах разогрева тела появляется еще одни дополнительный мощный источник■свободного ацетальдегида,который затем быстро превраь^ется в этанол (или ацетат). Мы предположили, что этими источниками являются основания . Шкф|а, образовавшиеся в процессе спячки при температуре тела животного 0+4°С и расаадавдеся на самих ранних этапах спонтанного пробуждения при температуре тела более ч-5+6°С. При пробуждении уровень свободного эндогенного ацетальдегида не с в и хается, тем самым достигается высокая степень готовности организма к последующему быстрому они-, жению уровня обмена веществ, происходящему на несколько часов. При окончательном пробуждении весной уровень ацетальдегида снижается в 5-6 раз. Таким образом, динамика уровня аце .'альдегида при спонтанных пробуждениях, вероятно, имеет функциональное значение: с одной стороны, ускоряет процессы разогрева тела, а с другой стороны, сохраняет высокую гибернационную готовность организма животного.

Различные ответные реакции организма сусликов осенью и весной вслед за введением экзогенного этанола можно, по-видимому, объяснить различиями состояния дегидрогеназаой системы в эти сезоны. Весной сродство АДГ к этанолу понимается и это обуславливает использование экзогенного этанола в качестве энергетического субстрата. Осенью изменения состояния дегидрогеназной системы направлены в сторону быстрого окисления этанола до ацетаадегида-Е накопления последнех'о. Это, вероятно, и-приводит к снижения температуры тела в первые 60 минут после инъекции раствора этанола.

В экспериментах с экзогенным введением ацетальдегида изучены взаимоотношения повышенных концентраций ацетальдегида. и иммунологического гомеостаза при гибернации. Установлено, что ацетальдегид является сенсибилизатором иммунной

- 1Ь -

систем!, в перзуи очередь гукорального иммунитета (В-лимфоциты) „

Высокий уровень Т-лмфзцитов зимой, вероятно, связан с наработкой этих клеток осенью з организме и длительным (более 200 дней) периодом их яизнедеятеявности. Кезначилыю.з снижение уровня В~ликфоцитсз в период зимней спячки по сравнению с актсвным летним периодом (учитывая малое время их низни - 14-25 дней) позволяет предположить их интенсивное образование или л периода; спонтанных пробуждений, или даке прп околонулешх температурах тела бо время спячка.Вероятно, В-лимфоцата ареобретают особую значимость'при гнбернация и э период выхода из спячкв. Связано это с необходимостью поддержания высокой степени готовности защитной система на случай развития ипфвкционвого или азггоа?лмуниах процессов з организме спягдзго- и, следовательно, незащищенного от внешних а внутренних воздействий суслика.

Можно также отметить, что по-видш-тому, образование оснований 1иф$а между ацатальдегидом и болкамя или свободжш .•аминокислотами, стабильных при низких температурах тела кийотного, является механизмом защиты организм--1, суслика от токсического действия избытка свободного эндогенного ацот-.альдегида. Вероятно< также, что ацетальдбгяд, кодифицируя опредояеанне беяхошз структуры, переводит их а -ранг антигенов} сеисйбализкруи иммунную систему, участвует з обеспечения высокой шмунорег:г:я2ности организма гибернярукщего суоика,

. Пояагана важяая фззаологэтескаа • роль ааетальдегида а концентрацачх £0-50 мкМ а механизмах формирования гкпобио-тяческого соотсяяая, а .»засгноста, как ацеталиррацего агента ТйС", та:: Еак шдафаяация "ГФС" гцетальдегидон приводила к ■ увеяачеккв гхйгкх-з. сяиз-экая теивературя'тела тестсшх ¡яшей с 1,0°С до (4/7±1,4)°С,

Дояученгпз результат позволяет предположить сле^успуй схему, отрашску» тапотахичесоте участие ацеталвдегкда в формироваяза состояния гипобпозг.

/

Сенсибилизация иммунной системы

Увеличение {а ц е та л ьд е г

.Модификация опиоиднкх и других регу-ляторных пептидов и аминов,включая "ГФС"

Сохранение высокого уровня :-),;-мунореантивкос-тя в спячке

Ингибирование МАО

I

Увеличение [серотонкна)

Торможение окизления янтарной кислоты I

Ч

1

\

Ингибноованве переноса электронов от НАДД на флаво-протеид

Ингибироваяиз сухцинатдегидро-гепазы и образования ФАДН .

/ / /

ПОНЖШИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ТЕША СУСЛИКА

ВЫВОДЫ

СШЗЛДЯЬ у

Результаты проведенного исследования погволят^ледувде . вывода:

I, Установлена сезонная динамика уровней эндогенных этанола в ацетальдегида в крови ¡якутского длиннохвостого суслика. Наибольшая скорость подъема концентрации этанола и снижения уровня ацетальдегида приходится на период пробуждения (апрель). Во всех физиологических состояниях животного абсолютные уровни дашшх метаболитов были существенно выше, чем у негибернирущих лабораторных «плотных и человека. '

2 Выявлены изменения каталитических и физико-хшдаческих свойств основных дегидрогеиаз печени суслика, метаболизи-руидих эндогенные этанол и адетальдегид - алкогольдегидро-геназы (АДГ) и адьдегиддегидрогеиазк (АльДГ) при различных физиологических состояниях животных. Показано, что наблюдаемые изменения уровней эндогенных этанола и ацетальдегида обусловлены, в первую очередь, образованием а гепатоцнтах изоформ данных ферментов специфичных для зимней спячки (АДГ^у) или активного состояния (АДГу). Особенности физико-химических свойств АДГ-^у и "зимних" форм АльДГ обеспечивают интенсивное окисление этанола до ацетальдегида и замедление его дальнейшего окисления. Свойства АДГу и "летних" форм АлгДГ приводят к смещению равновесия в сторону этанола и

и дальнейшее превращение образующегося ацетальдегида.

3. Установлено, что при спонтанных пробуждениях аналогично сезонным изменениям увеличивается уровень эндогенного этанола крови, но в меньшей степени. При температуре тела суслика около 36°С содержание ацетальдегида немногим меньше его уровня при спячке.

4. Установлена сезонная динамика морфологической и иммунологической структуры белой крови длиннохвостого суслика. Максимальный лейкоцитоз развивается в переходных состояниях жизнедеятельности животных - вхождении в спячку а при выходе из нее. Отмечено изменение популяциояиой структуры лимфоцитов в зависимости от физиологического состояния сусликов. В период спячки отмечается относительно высокий уровень В-лимфоцитов.

5.Установлено явление явного предпочтения сусликами раст-. воров этанола весной при пробуждении (когда уровень эндоген-

- ного этанола растет). Прй этом инъекция этанола не вызывали •достоверного снижения температуры тела. Осенью, когда предпочтение животными растворов этанола вочезает, отмечен эффект снижения температуры тела животных пра инъекциях экзогенного этанола и особенно ацетальдегида. Причем суслики, которым вводили экзогенный ацетальдегид, достоверно раньше контрольных погружалась в спячку.

6. Показана важная физиологическая роль ацетальдегида в концентрациях- 30-50 мкМ в механизмах формирования гипобко-

' тического состояния, в частности, как ацетилирупдего агента "гипометаболических факторов спячки". Модификация ТФС" ацетальдегидом приводила к увеличению эффекта снижения темпе; ратуры тела тестовых шшей.

• Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Бизяева Q.H., Пшенников A.B., Васильев И.С. Суточная и сезонная динамика форменных элементов белой крови длиннохвостого суслика./ Грызуны. - Свердловск,I9&8.

- С.147-148.

2. Бизяева О.Н.,Рогозин З.В., Кершенгольц Б.М. Содержание эндогенного этанола а крови и печени длиннохвостого суслика //Грызуны. - Свердловск, 1988. - C.I4B

3. Биаяева О.Н. Некоторые результаты по изучение алко-гольдегидрогеназы и уровня эндогенного этанола в крови и печени длиннохвостого суслика. // Тезке« докладов УПРеспубл. конференции молодых ученых. - Якутск. - 1988. - С.29-30.

4. Бизяева О.Н., Соломонов Н.Г., Кершангольц Б,М. Состояние белой крови у длиннохвостого суслик«. // Сб. У съезда ВТО АН СССР. - Москва. - 1990. - С.163-164.

5. Бизяева О.Н. Состояние системы этанол-ацетальдегид и иммунореактивности организма длиннохвостого суслика при спонтанных пробуждениях животных. 14 Сб."Этанол и его метаболизм в высших организмах". - Якутск. -1990.- С.48-56.

6. Бизяева О.Н., Кершенгольц Б.М. Участие эндогенных этанола и ацэтальдегяда в формировании различных физиологических состояний организма длиннохвостого суслика. // Сб."Этанол и его

метаболизм в высших органивмах. - 1990. - С.59-80;

7.. Бизяева О.Н., Кершенгольц Б.М., Ахременко А.К. Влияние экзогенного ацетальдегида на некоторые физиологические и иммунологические параметре зимней спячки. //Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Механизмы зимней спячки",- Махачкала.- 1990.- С.27-28. V

в.Бизяева О.Н., Кершенгольц Б.М., Соломоноз Н.Г. Эедо- -генные этанол и ацетальдегид в механизмах зимней спячки длиннохвостого суслика. // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Механизмы зимней спячки". - Махачкала. - 1990.- С.29-30.