Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Основные факторы, управляющие кальциевыми каналами L-типа в кардиоцитах гомойотермных и пойкилотермных животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Основные факторы, управляющие кальциевыми каналами L-типа в кардиоцитах гомойотермных и пойкилотермных животных"

^ \ На правах рукописи

т/^слиь шо

Гриченко Алексей Станиславович

Основные факторы, управляющие кальциевыми каналами Ь-типа в кардиоцитах гомоиотермных и пойкилотермных животных

03.00.02 Биофшшса

• Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Пушимо — 1У!Н>

Работа выполнена в группе регуляции ионных каналов Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

кандидат физико-математических наук

Ю.М. Кокоз

кандидат физико-математических наук

Н.И. Маркевич

доктор физико-математических наук

B.В. Смолянииов доктор биологических наук

C. С Колесников

Московский Государственный Университет, Биологи ческий факультет, кафедра физиологии человека и животных, г. Москва

Защита диссертации состоится " 2 & " «^¿л^уя-* 2000 г. в часов 3** минут на заседании Диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142292, г. Пущино Московской области, проспект Науки, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН. Автореферат разослан " ¿Ь " £ -^^¿Г/зи. 1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

5 6(9 ■« 0

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Актуальность темы исследования

Потенциалзависимые Са2+-каналы L-типа играют ключевую роль в регуляции частоты и силы сердечных сокращений, генерации потенциалов действия, выбросе нейротрансмиттеров, модуляции нейронной активности. Активность этих каналов управляется большим количеством физико-химических факторов различной природы. Наличие сложной системы регуляции каналов L-типа приводит к тому, что эффект даже хорошо изученных соединений оказывается иногда непредсказуемым, зависящим от внешних условий (температура, рН, потенциал на мембране, частота стимуляции и др.). Например, изменение поддерживаемого на мембране потенциала сильно влияет на подавление токов ацетилхолином и их активацию изопротеренолом и BAY К 8644; внутриклеточный кальций в низких концентрациях действует как активатор каналов L-типа, но блокирует их при повышении концентрации. Из приведенных примеров видно, что для адекватной интерпретации свойств того или иного регулятора кальциевого тока необходимо учитывать множество факторов, влияющих на активность каналов. В большинстве случаев эта задача может быть решена детальным анализом действия соединения в . различных условиях как индивидуально, так и совместно с другими регуляторами. Однако, в настоящее время имеется очень мало данных о механизмах подобного взаимодействия. Настоящая работа является новым шагом в этом направлении и посвящена комплексному рассмотрению влияния двух, на наш взгляд, наиболее важных факторов, определяющих активность каналов L-типа в кардиоцитах теплокровных: фосфорилирования и мембранного потенциала.

Цель работы

Целью работы является выяснение роли поддерживаемого потенциала при действии соединений, влияющих на систему фосфорилирования Са2+-каналов L-типа, а также построение на основе полученных экспериментальных результатов модели регуляции Са2+-тока в кардиоцитах, объясняющей ряд парадоксальных свойств этого тока. Кроме того, в качестве одного из факторов, влияющих на кальциевый транспорт в кардиоцитах, рассматривалось состояние гибернации. В связи с этим была поставлена вторая задача: в рамках разработанной модели объяснить особенности регуляции кальциевого тока в клетках гибернантов.

Научная новизна полученных результатов

Впервые обнаружено, что активация цАМФ-зависимого фосфорилирования может приводить не только к росту интегрального Са2+-тока, но и к его подавлению. Направление действия активаторов фосфорилирования зависит от поддерживаемого на мембране потенциала. Обнаруженный эффект может быть объяснен наличием у Са2+-канала Ь-типа, по крайней мере, двух независимых центров фосфорилирования и трех активных состояний с различными свойствами. В кардиоцитах гибернирующих животных зависимость направления действия изопротеренола от поддерживаемого потенциала отсутствует, что в рамках предложенной модели объясняется блокадой фосфорилирования одного из центров. Этот результат является первым шагом к пониманию механизмов гибернации, до сих пор остававшихся нераскрытыми. Он позволяет объяснить и многие из известных ранее изменений, происходящих в системе кальциевого транспорта при входе в спячку: понижение амплитуды тока, уменьшение активирующего эффекта изопротеренола, повышение активности аденилатциклазы.

Теоретическая и практическая ценность работы

Показано, что активация фосфорилирования Са2+-каналов Ь-типа изопротеренолом может приводить не только к росту, но и к подавлению медленного входящего тока. Предложена модель канала, объясняющая обнаруженные парадоксальные свойства каналов. Впервые выдвинута гипотеза, объясняющая различия между системами регуляции кальциевого транспорта в кардиоцитах активных и спящих животных. Кроме того, полученные в работе результаты уточняют существующие представления о механизме действия регуляторов Са2+-транспорта, в том числе используемых в кардиологии и нейрологии, что позволяет использовать их при диагностике и лечении ряда сердечных нарушений, связанных с деполяризацией клеток участков миокарда (сердечная недостаточность, инфаркт миокарда).

Апробация работы и публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы, 2 готовятся к публикации. Материалы диссертации были представлены на 2 научных конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 88 страницах машинописного текста и содержит 3 таблицы и 23 рисунка. Список литературы содержит 175 наименований. Работа состоит из введения,

обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Первые два раздела обзора литературы посвящены существующей классификации кальциевых каналов и структуре потенциал-зависимых каналов. В третьем разделе рассматриваются характеристики, используемые при описании свойств потенциал-зависимых каналов (вольт-амперные характеристики, переменные активации и инактивации и т. п.). В четвертом разделе рассматриваются основные механизмы рецептор-зависимой регуляции кальциевых каналов. Влияние фосфорилирования на активность каналов более подробно обсуждается в пятом разделе. Отдельный раздел посвящен изменениям, происходящим в системе кальциевого транспорта во время зимней спячки. В заключительном разделе обсуждаются достоинства и недостатки метода перфорированного пэтч-клямпа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Метод выделения кардиоцитов

Изолированные кардиоциты были получены из сердец якутских сусликов (citellus undulatus) и крыс Wistar. Суслики были отловлены в конце лета 1994 г. и в конце лета 1996 г. в Якутии и помещены в условия, близкие к естественным. Эксперименты на спящих животных проводились с декабря по март месяц. Температура тела сусликов составляла 6-7.5°С в состоянии гибернации и 37°С— спонтанно пробужденных.

Для получения клеток был модифицирован метод Bendukidze с соавторами (Bendukidze et al., 1985), основанный на использовании проназы в качестве протеолитического фермента. Внесенные в эту методику изменения позволили в значительной степени унифицировать выделение кардиомиоцитов из сердец животных разных видов (Alekseev et al., 1994).

Контроль качества кардиомиоцитов

Для контроля качества кардиомиоцитов были привлечены методы электронной и световой микроскопии, регистрации внутриклеточной концентрации ионов Са2+ с использованием флуоресцентного зонда QUIN 2-АМ, а также измерения потенциалов покоя и действия полученных клеток. По всем измеряемым параметрам в изолированных кардиоцитах существенных отличий от клеток in vivo не обнаружено.

Метод перфорированного пэтча

При работе методом перфорированного patch-clamp использовались растворы следующего состава:

1. (камерный) — 80 мМ NaCl, 20 мМ ТЕА-С1, 10 мМ CsCl, 1.2 мМ КН2Р04, 5 мМ MgCl2, 2 мМ СаС12, 20 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, рН 7.3.

2. (пипеточный) —130 мМ CsCl, 5 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, рН 7.3.

Раствор для заполнения пипеток приготовлялся на основе раствора 2 (замена ионов К+ на Cs+ использовалась для блокирования калиевых токов). Концентрация амфотерицина в пииеточном растворе составляла 160-170 мкг/мл для мембран кардиоцитов крысы и 200-500

Са2+-природа регистрируемого тока доказывается тем, что Са2+ и Na+ компоненты тока разделены по поддерживаемому потенциалу. О Са2+-природе этого тока свидетельствует и его чувствительность к дигидропиридинам (Alekseev et al., 1994).

Все эксперименты проводились при комнатной температуре (20-22°С). Токи регистрировались при помощи усилителя (СКБ "Биоприбор") и записывались на ЭВМ пакетом программ "BioQuest", разработанным Алексеевым А.Е. и Кокозом Ю.М. Математическая обработка результатов

Статистическая обработка полученных данных затрудняется большим разбросом характеристик клеток и величин эффектов регуляторов кальциевого тока. По этой причине исследовалось, в первую очередь, направление воздействия тех или иных факторов. Достоверность результатов оценивалась на основании их повторяемости в различных экспериментах. Количество проведенных экспериментов приводится в подписях к рисункам.

Для определения кинетических и вольт-амперных характеристик токов использовалась аппроксимация экспериментальных данных известными функциями. За основу был взят метод, предложенный Алексеевым с соавторами (Alekseev et al., 1996). Основными изменениями метода были (1) использование не предельных (1 или 0) значений переменных активации и инактивации в начальный момент времени и (2) аппроксимация не отдельных токовых трасс, а их семейств, полученных при снятии вольт-амперных характеристик. Расчеты производились на ЭВМ класса 486 или Pentium при помощи программы DBSolve, разработанной Горяниным.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Потенциалзависимость действия изопротеренола на Са -токи Ь-типа

Изопротеренол (ко) является одним из самых известных агонистов Р-адренорецепторов, активатором цАМФ-зависимого фосфорилирования и, соответственно, Са2+-тока Ь-типа. До сих пор считалось, что увеличение амплитуды тока является единственно возможным ответом Са2+-каналов на цАМФ-зависимое фосфорилирование. Однако, оказалось, что сдвиг поддерживаемого потенциала в сторону деполяризации приводит к смене знака эффекта на противоположный: при Уь = -30 мВ изопротеренол не увеличивает, а уменьшает амплитуду тока (рис. 1). Данный эффект наблюдается во всем диапазоне

использовавшихся тестовых потенциалов.

Рис. 1 Действие изопротеренола на Са:*-гоки кардиоцитов крысы.

а) — токовые трассы в контроле и под действием Ьо при У|, = -50 мВ;

б) — токовые трассы при V,. = -30 мВ. (N=12)

0 1 1

00 -

-0 1 -

X -0 2-

о -0 3 -

-0 4 -

-0 5 -

-Об-1

0 1 -

— 00 -

1 <

*t-Контроль -0 1 -

-0 2 -

ц=— |s°

-г—,—,— -0 3 -

О 100 200 300 Время, мс - а)

100 200 300 Время, мс 6)

Поскольку известно, что Iso сдвигает кривые активации и инактивации Са"+-тока в сторону отрицательных потенциалов (McDonald et al., 1994), логично предположить, что смена знака его действия связана с усилением инактивации при деполяризующих поддерживаемых потенциалах. Для проверки этого предположения была проведена серия экспериментов с использованием двухимпульсной стимуляции. Результаты этой серии показаны на рис. 2. Для исключения влияния активационных составляющих производилось нормирование на максимальную амплитуду тока. На приведенном рисунке хорошо виден сдвиг переменной медленной инактивации влево.

Рис. 2 Инактивационные кривые Са *-токов 1,-типа в кардиоцитах крысы в коп [роле и под действием изопротеренола. По оси X отложена величина инактивирующего стимула. Кривые нормированы по максимальной амплитуде тока. Символами • и в обозначены кривые в контроле и под действием 1во соответственно. (Ы = 4)

S 1 о -| 0 8

I 06

§■ 04

I 02 -

х

00

-50 -40 -30 -20 -10 0 Потенциал, мВ

Обращение действия изопротеренола ацетилхолином

Поскольку оказалось, что активация цАМФ-зависимого фосфорилирования может приводить не только к росту, но и уменьшению амплитуды тока (рис. 1), можно предположить, что сдвиг равновесия данной реакции в сторону дефосфорилирования приведет к

полностью противоположному результату, для проверки этого предположения было исследовано совместное действие ацетилхолина (который, как считалось ранее, ингибирует цАМФ-зависимое фосфорилирование) и изопротеренола на Са2+-токи Ь-типа.

Однако, в наших экспериментах действие АСЬ на фоне 1бо приводит к уменьшению амплитуды тока независимо от Уь. Кроме того, в большинстве случаев не удается получить полного обращения эффекта 150 ацетилхолином и при нормальных Уь — практически всегда наблюдается остаточное увеличение тока по сравнению с базальным уровнем даже при насыщающих концентрациях блокатора (рис. 3). Это говорит о том, что механизм подавления тока ацетилхолином связан не только с подавлением активности протеинкиназы А. Скорее всего, существует другой, независимый от цАМФ-зависимого фосфорилирования путь блокады Са2+-тока, который преобладает при поддерживаемых потенциалах выше -30 мВ. То, что эффекты изопротеренола и ацетилхолина не являются строго противоположными,

подтверждается и анализом изменений кинетических

характеристик токов под действием этих регуляторов.

Рис. 3 Подавление эффекта изопротеренола (1 мкМ) ацетилхолином (10 мкМ). Токовые трассы сняты при УЬ = -50 мВ и V = 0 мВ. (N=12)

00 -

-02 -

-0 4 -

< I -0.6 -

о t- -0.8 -

-1.0 -

-1.2 -

-1.4 -

, . I

<

-Контроль

Ufa-l»o*ACh

/<=-ISO

100 200 Время, мс

Независимость механизмов регуляции Са -токов изопротеренолом и BAY К 8644

Дигидропиридиновый агонист Са2+-токов BAY К 8644 (BAY) является сильным активатором Са2+-каналов. Одно из интересных свойств ДГП-агонистов— смена знака эффекта на отрицательный при деполяризации мембраны (Hadley and Lederer, 1992). При относительно отрицательных поддерживаемых потенциалах (Vh = -50 мВ) BAY существенно увеличивает амплитуду тока; при потенциалах выше -30 мВ происходит ее уменьшение. Таким образом, по крайней мере, качественно, эффекты BAY и Iso совпадают. Однако, механизмы, лежащие в основе их действия, различны.

Эффекты насыщающих концентраций Iso и BAY практически аддитивны независимо от последовательности аппликации веществ, что было бы невозможно в случае их действия по одному механизму. Кроме того, эффект Iso не проявляется в присутствии Н8 (ингибитора протеинкиназы А) или ацетилхолина (активатора протеинфосфатазы 2А), которые не оказывают влияния на эффект BAY. Пример активации тока

о

ДГП-агонистом в условиях блокады РКА показан на рис. 4. Таким

образом, действие BAY, в отличие от Iso, не связано с цАМФ-зависимым фосфорилированием.

Рис. 4 Действие BAY К 8644 на Са -токи кардиоцитов крысы в присутствии блокатора РКА Н8. Показаны токовые трассы в контроле, под действием Н8, изопротеренола и BAY К 8644. Vh = -50 мВ, V = 0 мВ. (N = 7)

0 1 -00 --0 1 -I < I -0.2 - S -0 3 -^ -0 4 - Н8*Ко

/Контроль Щ— не

-0 5 - Ls-He»l«o»BAY К 8М4

-0 6 -I

100 200 Время, мс

О

Особенности регуляции кальциевого тока у гибернирующих животных

Хорошо известно, что регуляция Са2+-токов у гибернантов тесно связана с состоянием спячки: изменяются амплитуда тока, форма потенциала действия, активность регуляторных ферментов и т. д. Как показали проведенные нами эксперименты, изменения систем

кальциевого транспорта, происходящие при входе в спячку, отражаются и на регуляции токов

изопротеренолом и

BAY К £644.

Рис. 5 Действие изопротеренола и BAY К 8644 на Са5*-токи кардиоцитов спящих сусликов при различных поддерживаемых

потенциалах: изменение амплитуды тока относительно контроля. Величина тестового потенциала во всех случаях 0 мВ. (N = 4)

В кардиоцитах активных сусликов, как и в клетках негибернантов, наблюдается зависимость знака эффекта Iso и BAY от поддерживаемого потенциала. Однако, в экспериментах на кардиоцитах спящих сусликов Iso активировал Са2+-ток L-типа независимо от поддерживаемого потенциала (вплоть до -10 мВ), хотя ээфект BAY существенно не изменился (рис. 5). Ниже будет показано, что отсутствие двойственного эффекта Iso тесно связано с другими изменениями характеристик тока (такими как сильное уменьшение его амплитуды) во время гибернации. Сейчас стоит только подчеркнуть, что эти изменения носят качественный характер, и не могут быть объяснены простым уменьшением числа активных каналов или их проводимости.

° 500 Н

I

а 300 -

о

3 200 е-

= 100 <

р 1

р i F

г & w 1— v: 1' 1 %

-50 -30 -10

Поддерживаемый потенциал. мВ

I I Контроль

\//А Изопротеренол

ГОУЧ Изопротеренол + BAY К 8644

Двухцептровая модель фосфорилирования Са2+-канала

Рис. 6 Схема фосфорилирования Са -канала Ь-типа. С0, СА, Сх и Сдх — четыре возможных состояния канала. Кх1, КА1, Кх2, КА2 — скорости фосфорилирования канала по центрам А и X. Кх-1, Кд-1, Кх-2, КА-2 — скорости дефосфорилирования канала.

Для анализа результатов, описанных выше, была использована модель Са2+-канала Ь-типа, предполагающая наличие у него двух независимых центров фосфорилирования (рис. 6). За основу данной модели была взята модель, предложенная ранее НаЛгеИ с соавторами (НайгеН й а1., 1995). Согласно модели НайгеИ, кальциевый канал Ь-типа имеет два центра фосфорилирования: центр А, фосфорилируемый хорошо известной протеинкиназой А (РКА) и дефосфорилируемый протеинфосфатазой РР2А (\Viechen е1 а1., 1995) и центр X, за фосфорилирование которого отвечает пока неидентифицированная протеинкиназа РКХ (НаПгеН й а1., 1995), а за дефосфорилирование — протеинфосфатаза РР1 (\Viechen е1 а!., 1995).

Согласно модели, канал может находится в одном из четырех состояний: дефосфорилированы оба центра (1); фосфорилирован один из центров А (2) или X (3); фосфорилированы оба центра (4). Первое из этих состояний является неактивным. Фосфорилирование любого из центров переводит канал в функционально активное состояние, то есть делает его чувствительным к деполяризации. Таким образом, суммарный ток через клеточную мембрану может быть представлен как сумма трех токов, протекающих через каналы в трех активных состояниях:

1са =1аСа+1хСх+1ахСах (1)

где 1А, 1х, 1ах — удельные токи (под удельным током здесь и далее будет пониматься величина суммарного тока в условиях, когда все каналы находятся в данном состоянии), з. Сд, Сх, Сах — доли квнштов в

соответствующих состояниях. Слагаемое, соответствующее дефосфорилированному состоянию, опущено, поскольку данное состояние является неактивным (10 = 0).

Каждая из компонент тока обладает собственными кинетическими и амплитудными характеристиками. Изменение равновесия реакций фосфорилирования центров А и X приводит к перераспределению каналов между тремя активными и одним неактивным состояниями. При этом будет наблюдаться изменение характеристик суммарного Са2+-тока.

Суммарный ток, протекающий через мембрану, несложно выразить через доли каналов в каждом состоянии и константы равновесия реакций фосфорилирования центров А и X. При этом кооперативность фосфорилирования для простоты может быть взята равной 1:

1ДКЛ +1„К„

1Са

т _ ' xXxvX 1 АХ A X пч

1 + КА+Кх+КАКх

Анализ действия изопротеренола и BAY К 8644

Двухцентровая модель фосфорилирования канала была использована для объяснения зависимости направления изопротеренола и BAY К 8644 от поддерживаемого потенциала. Анализ выражения 2 показвает, что производная суммарного тока по константам равновесия реакций фосфорилирования КА и Кх может быть как положительной (рост тока в ответ на активацию фосфорилирования), так и отрицательной (падение тока) в зависимости от параметров системы. Подавление тока изопротеренолом должно наблюдаться при соблюдении условий:

Кх>т ^ и 1х>1ах (3)

АХ АХ

Из неравенств (3) ключевым является второе. Действительно, активация РКА должна приводить к увеличению доли каналов, фосфорилированных по центру А, то есть к росту СА и САХ. Первый путь не влияет на долю каналов в состоянии Сх, которая определяет базальный уровень тока; переход С0 => СА может лишь увеличивать его амплитуду за счет увеличения числа активных каналов. Остается предположить, что подавление тока вызвано переходом Сх => САХ. Это возможно только в том случае, если удельный ток через каналы в состоянии САХ меньше, чем в состоянии Сх. Таким образом, смена знака эффекта изопротеренола при деполяризации мембраны связана с переходом каналов в дважды фосфорилированное состояние, обладающее при данном потенциале меньшей проводимостью.

Подобным рассуждения могли бы быть справедливы и в случае BAY К 8644, если предположить, что действие этого регулятора связано с активацией РКХ или блокадой РРХ. Условия подавления тока в этом случае должны описываться неравенствами:

Кд> Iх и 1А>1дх- (4)

Однако, совместный анализ неравенств 3 и 4 показывает, что (1) одновременное выполнение всех этих условий накладывает слишком жесткие ограничения на область допустимых значений параметров системы и (2) равновесие, по крайней мере, на одной из ветвей схемы 6 должно быть смещено в сторону фосфорилирования, то есть доля дефосфорилированных каналов Со < 0.25, в то время как из приводимых в литературе данных следует, что число функционально неактивных каналов в контроле превышает 50% (Yue et al., 1990). Приходится допустить, что BAY, помимо сдвига равновесия реакции фосфорилирования центра X, способен непосредственно влиять на конформационный переход канала в активное состояние. На возможность прямого действия BAY указывают также данные о наличии быстрой фазы (сотни миллисекунд) в активации им Са2+-тока, что не согласуется с медленным (порядка секунд) действием фосфорилирования (Hartzell et al., 1991).

Тем не менее, гипотезу о связи BAY с фосфорилированием центра X отвергать нельзя, поскольку анализ спонтанного падения Са2+-токов (rundown) показывает, что данное соединение оказывает стабилизирующее воздействие на активность Са2+-каналов, наблюдаемое только в присутствии фосфорилирующих ферментов (Armstrong and Eckert, 1987). По мнению авторов, это является доказательством ингибирования фосфатаз Са2+-каналов.

Таким образом, приходится предположить наличие двух путей активации Са2+-токов дигидропиридиновым агонистом BAY К 8644: быстрый, связанный с прямым влиянием на конформационные переходы канала, и медленный, осуществляемый через ингибирование РР1. Возможно, именно изменение конформации канала делает центр X более или менее доступным для протеинкиназ и протеинфосфатаз. Следует отметить, что двухфазность действия характерна и для дигидропиридиновых антагонистов (нифедипин), механизм угнетения тока которыми пока также остается неясным (Hadley and Lederer, 1995).

Кинетические характеристики Са2*-токов L-типа в кардиоцитах крыс

Кинетические характеристики Са2+-тока представляют собой зависимости активации и инактивации этого тока от потенциала и часто несут больше информации об изменениях, происходящих под

воздействием тех или иных факторов, чем простое сравнение амплитуд токов в различных условиях. Поведение Са2+-токов L-типа описывается одной активационной (d) и двумя инактивационными (быстрой— fF и медленной — fs) компонентами. При исследовании связи фосфорилирования и потенциала особенно интересным оказалось поведение медленной инактивации каналов.

На рис. 7 показано изменение переменной медленной инактивации fs в кардиоцитах крыс под действием изопротеренола и BAY К 8644. Оба регулятора существенно усиливают инактивацию при потенциалах выше -30 мВ, увеличивая крутизну кривой. Кроме этого наблюдается незначительный рост активационной составляющей и проводимости по кальцию, что не может быть причиной падения токов. Таким образом, подавление токов изопротеренолом и BAY К 8644 при поддерживаемых потенциалах выше -30 мВ может происходить за счет усиления в этих условиях медленной инактивации токов. Этот важный вывод можно сформулировать иначе: деполяризация мембраны до Vh > -30 мВ приводит к тому, что часть каналов инактивируется, теряя способность открываться в ответ на стимул. Под действием Iso и BAY доля инактивированных деполяризацией каналов оказывается существенно

больше, чем в контроле, благодаря чему и наблюдается уменьшение амплитуды тока.

Рис. 7 Изменение переменной медленной инактивации Са2+-тока L-типа кардиоцитов крысы под действием изопротеренола. и .20 о 20 40 60 BAY К 8644. • — контроль; ■ — изопротеренол;

Тестовый потенциал. мВ " — изопротеренол + BAY К 8644. (N = 6)

При анализе двухцентровой модели было показано, что угнетение тока Iso и BAY связано с переходом каналов в дваяеды фосфорилированное состояние. Следовательно, именно состояние С ах должно обладать более выраженной инактивационной составляющей при высоких поддерживаемых потенциалах, чем состояния СА и Сх-

На основании анализа кинетических характеристик можно сделать еще одно важное заключение: изопротеренол и BAY смещают их в одном направлении, а значит, переводят каналы в одно и то же состояние, а именно, в состояние САх- При этом действие BAY должно быть, по крайней мере косвенно, связано с усилением фосфорилирования центра X.

Анализ изменений, происходящих е кардиоцитах гибернирующих животных во время цикла спячка-бодрствование

Изменения кинетических характеристик Са2+-токов изопротеренолом и BAY в кардиоцитах активных сусликов аналогичны изменениям, происходящим в кардиоцитах крыс: оба регулятора увеличивают крутизну кривой fs(V), что приводит к усилению медленной инактивации при потенциалах выше -35 мВ. Ситуация резко меняется при входе животных в спячку. Как было описано выше, в кардиоцитах гибернирующих животных подавление тока изопротеренолом при поддерживаемых потенциалах выше -30 мВ отсутствует. В рамках двухцентровой модели это означает, что каналы не переходят в состояние САх- Тем не, менее, активация токов изопротеренолом сохраняется, то есть фосфорилирование центра А возможно. Остается предположить, что в данных условиях невозможно или сильно затруднено фосфорилирование центра X. Причиной этого является, скорее всего, ингибирование протеинкиназы X, а не сильная активация соответствующей протеинфосфатазы. Таким образом, из четырех возможных переходов, показанных на схеме б, реализуется только переход С0 о СА- Сдвиг равновесия этой реакции вправо под действием изопротеренола может привести только к росту тока.

Приведенные соображения полностью подтверждаются анализом кинетических характеристик токов в кардиоцитах якутских сусликов citellus undulatus в активном и гибернирующем состояниях. Изменения характеристик токов в кардиоцитах активных животных, происходящие под действием Iso, аналогичны наблюдаемым в кардиоцитах крыс (повышение gCa, усиление активации при всех потенциалах, более выраженная инактивация при потенциалах выше -30 мВ). В случае же спящих животных усиление как активации, гак и инактивации проявляется в меньшей степени (рис. 8). Кроме того, практически не изменяется крутизна кривой fs, то есть отсутствует сильная зависимость инактивационной переменной от потенциала, наблюдавшаяся в

Тестовый потенциал. мВ

кардиоцитах крыс и активных животных. На основании этих данных можно утверждать, что под действием Iso не происходит заметного перераспределения каналов между функционально активными состояниями.

-40 -20 0 20 40

Тестовый потенциал. мВ „ ..

Рис. X Изменение переменной медленной инактивации

• Контроль 2*

щ Iso <-а "тока спящего суслика под действием

a iso+BAY изопротеренола и BAY К 8644. (N = 4)

Из рис. 8 следует также, что в присутствии BAY К 8644 двойное фосфорилирование имеет место — крутизна кривой медленной

инактивации резко увеличивается и ее форма становится' близкой к наблюдаемой у активных животных. Это также подтверждает предположение о блокаде фосфорилирования центра X у спящих животных. Действительно, если BAY сильно ингибирует РР1, то даже при слабой активности РКХ будет наблюдаться фосфорилирование центра X. Как следствие этого становится возможным и переход каналов в состояние Сдх, сопровождаемый угнетением тока при поддерживаемых потенциалах выше -30 мВ.

Таким образом, одним из основных отличий регуляции Са2+-транспорта в кардиоцитах гибернирующих животных во время спячки является отсутствие фосфорилирования центра X и недоступность двух активных состояний канала из трех возможных.

Полученный результат позволяет объяснить и многие из известных ранее фактов, связанных с модификацией Са2+-транспорта у гибернантов: поннженнне амплитуда токов вызвано отсутствием каналов в состоянии Сх, через которые протекает основная часть тока у активных животных; повышенная активность аденилатциклазы связана с необходимостью скомпенсировать блокаду Са2+-транспорта за счет каналов в состоянии СА. Под действием насыщающих концентраций изопротеренола число канатов в этом состоянии может сравняться или незначительно превысить число каналов в состоянии Сх у негнбернантов в контроле. Следовательно, амплитуда тога, вызванного изопротеренолом не должна заметно отличаться от амплитуды базальных токов активных животных.

ВЫВОДЫ

1. Поведение Са2+-каналов L-типа в кардиоцитах негибернантов и гибернантов хорошо описывается моделью с двумя независимыми центрами фосфорилирования. Один из центров фосфорилируется известной протеинкиназой А, а второй — пока неидентифицированной протеинкиназой X. Наиболее существенное отличие рассматриваемой модели от предлагавшихся ранее — наличие трех, а не двух функционально активных состояний канала (фосфорилированные по каждому из центров и двум центрам одновременно).

2. Вопреки общепринятому мнению, активация цАМФ-зависимого фосфорилирования Са2+-канала L-типа может приводить не только к росту амплитуды интегрального Са2+-тока, но и к ее уменьшению при поддерживаемых потенциалах выше -30 мВ. Этот эффект, как и описанный ранее аналогичный эффект ДГП-агониста BAY К 8644, объясняется в рамках предложенной двухцентровой модели более выраженной инактивацией дважды фосфорилированного канала при высоких поддерживаемых потенциалах. При этом предполагается, что BAY К 8644, по крайней мере косвенно, активирует фосфорилирование центра X.

3. У негибернирующих животных и гибернантов в активный период уровень базального тока определяется количеством каналов, фосфорилированных по центру X. Вклад остальных состояний каналов в интегральный ток пренебрежимо мал. Изменения Са2+-транспорта в кардиоцитах гибернирующих сусликов при входе в спячку связаны с блокадой фосфорилирования центра X и, как следствие этого, невозможностью перехода каналов в два из трех активных состояний. Зависимость направления действия изопротеренола от поддерживаемого потенциала при этом отсутствует. Блокада центра X снимается ДГП-агонистом BAY К 8644.

4. Действие агониста М-холинорецепторов ацетилхолина не является полностью противоположным действию изопротеренола, а затрагивает также механизмы, не связанные с цАМФ-зависимым фосфорилированием. По этой причине ацетилхолин не обладает двойственным эффектом, то есть не активирует Са2+-ток при высоких поддерживаемых потенциалах.

Научные публикации но теме диссертации

1. Kokoz, Yu.M, A.S. Grichenko, A.F. Korystova, D.A. Lankina, N.I. Markevich. 1999. Effect of Isoproterenol on the L-type Ca2+ current in cardiac cells from rats and hibernating ground squirrels. Bioscience Reports, 19:17-25.

2. Markevich, N.I., A.F. Korystova, A.S. Grichenko, D.A. Lankina, Yu.M. Kokoz. 1999. The regulation of L-type Ca2+ currents in cardiac myocytes of active and hibernating animals. Biophys. J, 76:A341

3. Маркевич, Н.И., А.Ф. Корыстова, A.C. Гричеако, ДА. Панкина, Ю.М. Кокоз. 2000. Регуляция Са2+-токов L-типа в кардиоцитах крысы. Биол. мембраны 17/1:88-101

4. Кокоз, Ю.М., А.С. Гриченко, А.Ф. Корыстова, ДА. .Панкина, Н.И. Маркевич. 2000. Регуляция Са2+-каналов L-типа в кардиоцитах зимоспящих животных. Биол. мембраны, 17/2 (в печати)

5. Маркевич, Н.И., А.С. Гриченко, А.Ф. Корыстова, ДА. .Панкина, Ю.М. Кокоз. Кинетические механизмы регуляции Са2+-каналов L-типа в кардиоцитах животных. II съезд биофизиков России. 23-27 августа 1999, г. Пущино. Тезисы докладов, том II, с. 538-539.

Цитируемая литература

Alekseev, А.Е., Korystova, A.F., Mavlyutova, D.A., Kokoz, Y.M. Potential-dependent Ca2+ currents in isolated heart cells of hibernators. Biochem MolBiolInt, 1994, 33(2):365-375.

Alekseev, A.E., Markevich, N.I., Korystova, A.F., Terzic, A., Kokoz, Y.M. Comparative analysis of the kinetic characteristics of L-type calcium channels in cardiac cells of hibernators. BiophysJ, 1996, 70(2):786-797.

Armstrong, D., Eckert, R Voltage-activated calcium channels that must be phosphorylated to respond to membrane depolarization. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(8):2518-2522.

Bendukidze, Z., Isenberg, G., Klockner, U. Ca-tolerant guinea-pig ventricular myocytes as isolated by pronase in the presence of 250 microM free calcium. Basic Res Cardiol, 1985, 80 Suppl 1:13-17.

Hadley, R.W., Lederer, W.J. Comparison of the effects of BAY К 8644 on cardiac Ca2+ current and Ca2+ channel gating current. Am J Physiol, 1992, 262(2 Pt 2):H472-H477.

Hadley, R.W., Lederer, W.J. Nifedipine inhibits movement of cardiac calcium channels through late, but not early, gating transitions. Am J Physiol, 1995, 269(5 Pt 2):H1784-H1790.

Hartzell, H.C., Hirayama, Y., Petit-Jacques, J. Effects of protein phosphatase and kinase inhibitors on the cardiac L- type Ca current suggest two sites are phosphorylated by protein kinase A and another protein kinase. J Gen Physiol, 1995, 106(3):393-414.

Hartzell, H.C., Merv, P.F., Fischmeister, R, Szabo, G. Sympathetic regulation of cardiac calcium current is due exclusively to cAMP-dependent phosphorylation. Nature, 1991, 351(6327):573-576.

McDonald, T.F., Pelzer, S., Trautwcin, W., Pelzer, D.J. Regulation and modulation of calcium channels in cardiac, skeletal, and smooth muscle cells. Physiol Rev, 1994, 74(2):365-507.

Wiechen, K, Yue, D.T., Herzig, S. Two distinct functional effects of protein phosphatase inhibitors on guinea-pig cardiac L-type Ca2+ channels. J Physiol (Lond), 1995, 484 (Pt 3):583-592.

Yue, D.T., Herzig, S., Marban, E. Beta-adrenergic stimulation of calcium channels occurs by potentiation of high-activity gating modes. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(2):753-757.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Гриченко, Алексей Станиславович

1 Введение.

2 Обзор литературы.

2.1 Типы Са2+-каналов и их классификация.

2.2 Структура потенциалзависимых Са2+-каналов.

2.3 Электрические и кинетические характеристики кальциевых токов.

2.4 Рецепторзависимая регуляция кальциевых токов L-типа.

2.5 Роль фосфорилирования в регуляции кальциевого тока L-типа.

2.6 Зимняя спячка — адаптация организма к экстремальным условиям

2.7 Метод перфорированного пэтча.

2.7.1 Свойства перфорирующих соединений.

2.7.2 Особенности заполнения пипеток.

2.7.3 Преимущества методики перфорируемого пэтча.

2.7.4 Ограничения методики перфорированного пэтча.

3 Материалы и методы исследования.

3.1 Метод выделения кардиоцитов.

3.2 Контроль качества кардиомиоцитов.

3.2.1 Морфологический контроль.

3.2.2 Толерантность кардиомиоцитов к ионам Са2+.

3.2.3 Контроль потенциала покоя и потенциала действия.

3.3 Метод перфорированного пэтча.

3.3.1 Растворы.

3.3.2 Приготовление и заполнение пипеток.

3.3.3 Регистрация токов.

3.3.4 Выделение Са2+-компоненты входящего тока у крыс и сусликов.

3.4 Математическая обработка результатов.

3.4.1 Статистический анализ.

3.4.2 Методы аппроксимации данных.

4 цАМФ-зависимая и цАМФ-независимая регуляция Са2+-токов.

4.1 Потенциалзависимость действия изопротеренола на Са2+-токи L-типа

4.2 Обращение действия изопротеренола ацетилхолином: за и против.

4.3 Независимость механизмов регуляции Са2+-токов изопротеренолом и BAY К 8644.

4.4 Особенности регуляции кальциевого тока у гибернирующих животных

Двухцентровая модель фосфорилирования Са2+-канала.

5.1 Описание модели.

5.2 Анализ действия изопротеренола с использованием двухцентровой модели Са2+-канала.

5.3 Попытка анализа двойственного действия BAY К 8644.

5.4 Кинетические характеристики Са2+-тока L-типа в кардиоцитах крыс.

5.5 Анализ изменений, происходящих в кардиоцитах гибернирующих животных во время цикла спячка-бодрствование.

Выводы.

Список основных сокращений и обозначений

ACh ацетилхолин

BAY BAY К

Iso изопротеренол

РКА протеинкиназа А

РКХ протеинкиназа X

РР1 протеинфосфатаза

РР2А протеинфосфатаза 2А

АТФ аденозин-5'-трифосфат

АЦ аденилатциклаза

ГДФ гуанозин-5-дифосфат

ГТФ гуанозин-5'-трифосфат

ДГП дигидропиридины цАМФ циклический аденозин-5-монофосфат

Са2+]0 внеклеточная концентрация Са2+

Ca2+]i внутриклеточная концентрация Са2+

V потенциал, тестовый потенциал

V], поддерживаемый потенциал d, f переменные активации и инактивации Са2+-тока gca максимальная Са2+ проводимость

Vc;i, Vrev потенциал реверсии Са2+-тока

Со, Сд, Сх, Сах состояния Са -канала и доля каналов в соответствующем состоянии

Кд, Кх константы равновесия реакций фосфорилирования центров А и X lea интегральный Са2+-ток

Ia, Ix, 1ах удельные токи через каналы в соответствующем состоянии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Основные факторы, управляющие кальциевыми каналами L-типа в кардиоцитах гомойотермных и пойкилотермных животных"

Потенциалзависимые Ca -каналы L-типа играют ключевую роль в регуляции частоты и силы сердечных сокращений, генерации потенциалов действия, выбросе нейротрансмиттеров, модуляции нейронной активности (McDonald et al., 1994). В свою очередь, активность этих каналов регулируется большим количеством физико-химических факторов различной природы. К важнейшим из этих факторов можно отнести фосорилирование канала1. В частности, эффект многих гормонов и нейротрансмиттеров связан с изменением активности протеинфосфатаз и протеинкиназ, увеличением или уменьшением количества фосфорилированных каналов и, как следствие, ростом или падением кальциевого тока, протекающего через данные каналы, за счет изменения вероятности открывания одиночного канала или числа активных каналов. Например, увеличение токов L-типа агонистами ß-адренорецепторов опосредуется ростом активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (Hartzell et al., 1991), а подавление тех же токов агонистами М-холинорецепторов — активацией соответствующей протеинфосфатазы (Herzig et al., 1995). Наличие сложной системы регуляции каналов L-типа приводит к тому, что действие даже хорошо изученных соединений оказывается иногда непредсказуемым, зависящим от различных внешних факторов (температура, pH, потенциал на мембране, частота стимуляции и т.п.). Так изменение поддерживаемого на мембране потенциала (Vh) сильно влияет на подавление токов ацетилхолином (McMorn et al., 1996) и их активацию изопротеренолом (Tiaho et al., 1991). Дигидропиридиновый агонист BAY К 8644 при деполяризации мембраны превращается из мощного активатора тока в блокатор (Hadley and Lederer, 1992). Внутриклеточный кальций в низких концентрациях действует как активатор каналов L-типа, но блокирует их при повышении концентрации (Hirano and Hiraoka, 1994). Подобная зависимость направления эффекта от концентрации наблюдается и в случае ингибиторов фосфатаз в гладкомышечных клетках (Obara and Yabu, 1993). Приведенные примеры показывают, что для адекватной интерпретации свойств того или иного регулятора кальциевого тока необходимо учитывать множество факторов, влияющих на активность каналов. В большинстве случаев эта задача решается детальным анализом действия того или иного

1 Под фосфорилированием канала здесь и далее подразумевается фосфорилирование не только белков, непосредственно образующих канал, но и, возможно, различных структур, тесно связанных с каналом и влияющих на его свойства. соединения в различных условиях как самостоятельно, так и совместно с другими регуляторами.

Многообразие путей регуляции Са2+-токов L-типа определяется, в основном, двумя свойствами канала. Прежде всего, канал может находиться в одной из нескольких стабильных (с временами жизни порядка секунд) конформаций с различной быстрой (миллисекундной) кинетикой открываний и закрываний (т.н. моды канала) (Hess et al., 1984). Обычно рассматривают одну неактивную моду (0) и две активных (1 и 2). Некоторые авторы вводят в рассмотрение дополнительную активную моду la (Yue et al., 1990). Скорости перехода канала между различными модами зависят от различных внешних факторов, таких как потенциал, внутриклеточная концентрация кальция, влияние регуляторных соединений и т.п. Наличие нескольких активных мод означает, что популяция каналов в мембране неоднородна и может быть разделена на несколько групп, включающих каналы, находящиеся в одном состоянии. При этом токи, протекающие через различные группы каналов, обладают разными амплитудными и кинетическими характеристиками. Следует учитывать, что измеряемый экспериментально суммарный Са2+-ток L-типа является суммой токов, протекающих через каналы каждой группы, что часто затрудняет интерпретацию результатов экспериментов.

Второе важное свойство каналов L-типа — наличие нескольких центров фосфорилирования (McDonald et al., 1994). Для каналов в кардиоцитах известно, по крайней мере, два различных центра, фосфорилирование которых влияет на характеристики тока. Принято считать, что фосфорилирование одного из этих центров переводит канал из неактивного состояния в активное (чувствительное к изменениям потенциала), а фосфорилирование второго центра увеличивает вероятность нахождения канала в открытом состоянии.

Целью данной работы стали исследование системы фосфорилирования канала L-типа и влияния на нее мембранного потенциала, разработка и анализ модели, объясняющей ряд парадоксальных свойств канала, а также выявление и анализ изменений в системе фосфорилирования канала, происходящих при входе в состояние гибернации.

2 Обзор литературы