Регуляция потенциал-зависимого Ca2+ тока L-типа поддерживаемым потенциалом и модуляторами фосфорилирования по тирозину

Пименов, Олег Ювенальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция потенциал-зависимого Ca2+ тока L-типа поддерживаемым потенциалом и модуляторами фосфорилирования по тирозину
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция потенциал-зависимого Ca2+ тока L-типа поддерживаемым потенциалом и модуляторами фосфорилирования по тирозину"

На правах рукописи

Пименов Олег Ювенальевич

003053824

РЕГУЛЯЦИЯ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМОГО Са2+ ТОКА Ь-ТИПА ПОДДЕРЖИВАЕМЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ И МОДУЛЯТОРАМИ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ПО ТИРОЗИНУ.

Специальность «Биофизика» 03.00,02.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2007

003053824

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, Россия.

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук Кокоз Ю.М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Колесников С.С.

кандидат физико-математических наук Алиев P.P.

Ведущая организация: кафедра биохимии МГУ, г. Москва

Защита состоится 21.03.07 в 1330 на заседании диссертационного совета Д002.093.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу:

142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу:

142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН. Автореферат разослан 19.02.2007г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Высоко-пороговые потенциал-зависимые Са2+ каналы L-типа играют ключевую роль в регуляции сокращения гладких и сердечных клеток, нейро-эндокринной секреции и во многих других жизненно важных процессов в организме. Они регулируются факторами различной природы. Медленная регуляция, в основном, связана с химическими модификациями. Быстрая регуляция определяется потенциал- и Са2+-зависимыми конформационными переходами внутри канала. Са2+ ток L-типа можно разделить на следующие компоненты: потенциал-зависимую активацию, Са2+-зависимую инактивацию (CDI), потенциал-зависимую инактивацию (VDI) и остаточный ток. Молекулярные и кинетические механизмы регуляции компонент тока потенциалом и внутриклеточной концентрацией Са2+до сих пор полностью не изучены. В последнее десятилетие прогресс достигнут в понимании молекулярных механизмов CDI. Определены последовательности на С-концевом участке (остатки 1520-1732) а 1-субъединицы, названные областью Са2+-инактвации (CI). Несмотря на достижения в локализации сайтов, ответственных за CDI, и в определении молекулярных механизмов CDI, существует всего одно сообщение, использующее последние экспериментальные данные по молекулярным механизмам, в котором предпринята попытка количественно проанализировать последовательность переходов каналов из одного состояния в другое.

Одной из проблем интерпретации экспериментальных данных является то, что кинетика CDI сильно зависит не только от конформационных перестроек канала, но и от изменения внутриклеточной концентрации Са2+ около мембраны, сильно варьирующей около открытых и закрытых каналов. Для того чтобы объяснить зависимость кинетики CDI от концентрации Са2+, определяемой от локальных и удалённых источников, при анализе CDI следует учитывать высокую вариабельность распределения внутриклеточного Са2+ вдоль всей внутренней поверхности мембраны. Наиболее популярными моделями CDI Са2+ каналов L-типа, учитывающих изменения концентрации Са2+ около мембраны, являются «shell» и

«доменная» модели. «5Ье11»-модель предполагает, что инактивация запускается Са2+, который равномерным тонким слоем распределён вдоль внутренней поверхности мембраны. Напротив, «доменная» модель предполагает, что переход в инактивированное состояние возникает только тогда, когда аллостерический центр открытого канала связывает Са2+. Обе модели имеют ряд недостатков, которые обсуждались в литературных источниках. «БЬеНл-модель не способна объяснить С01, наблюдаемую в экспериментах на одиночных каналах, а «доменная» модель не учитывает роль концентрации Са2+ около закрытых каналов. В свете сказанного, создание общей кинетической модели С01, способной объяснить всё разнообразие экспериментальных данных по кинетике интегральных токов и воротных токов одиночных каналов, является актуальной и важной задачей.

В настоящее время большое внимание уделяется регуляции Са2+ токов Ь-типа серин/треониновыми киназами (РКА, РКС), в то же время, мало изученной остаётся система регуляции Са2+ токов тирозиновыми киназами (ТРК). В последние годы показано, что активация ТРК может регулировать транспортные системы, модулировать К+ токи, фосфорилировать Р-адренорецепторы, хотя основное действие ТРК направлено на регуляцию метаболических и пролиферативных реакций в клетке. Однако, появляется всё больше данных о модуляции агонистами рецепторных ТРК (инсулин и факторы роста) кальциевого гомеостаза. Литературных данных о действии инсулина на Са2+ токи очень мало. Показано, что инсулин активирует Са2+ токи, и рост тока при аппликации инсулина связан с активацией сАМР-зависимого фосфорилирования. Косвенно, на изменения Са2+ гомеостаза указывают и исследования действия инсулина на сократимость сердечной мышцы. На трабекулах предсердия лягушки впервые показан двухфазный эффект действия инсулина на потенциала действия (ПД) и Са2+ токи Ь-типа. Исследования действия инсулина на сократимость клеток миокарда теплокровных животных показали положительный инотропный эффект только в кардиоцитах животных с индуцированным стрептозотоцином диабетом; в кардиоцитах здоровых животных инсулин не оказывал никакого эффекта. Из приведенных литературных данных ясно,

что в настоящее время эффекты и механизмы действия активаторов тирозин-зависимого фосфорилирования на Са2+ токи однозначно не определены. Цели и задачи исследования:

Целью данной работы являлось исследование регуляции потенциал-зависимого Са2+ тока L-типа поддерживаемым потенциалом и модуляторами фосфорилирования по тирозину. Поставлены следующие задачи:

1. Подробное исследование дуального эффекта действия агонистов Са2+ тока L-типа в зависимости от поддерживаемого потенциала.

2. Построение кинетической модели Са2+ транспорта через каналы L-типа, способной воспроизвести наблюдаемый в эксперименте дуальный эффект действия агонистов.

3. Определение роли модуляторов тирозин-зависимого фосфорилирования в регуляции Са2+ тока.

Научная новизна работы и полученные результаты.

Изучен эффект зависимости действия агонистов Са2+ тока L-типа от поддерживаемого потенциала (Vh). В кардиоцитах крыс и активных сусликов при стандартных Vh (от -50 до -40 mV) изопротеренол и BAY К8644 увеличивают Са2+ токи; при Vh от -35 до -25 mV оба агониста вызывают подавление Са2+ тока. В кардиоцитах гибернирующих сусликов дуальный эффект изопротеренола отсутствует, но восстанавливается добавкой BAY К8644.

Построена модель регуляции Са2+ тока, способная не только воспроизвести наблюдаемый в эксперименте дуальный эффект действия агонистов Са2+ каналов изопротеренола и BAY К8644, но и оценить степень участия каждой моды в формировании интегрального Са2+ тока при изменении поддерживаемого потенциала или предъявлении химического стимула.

Обнаружен двухфазный эффект в действии инсулина на базальный Са2+ ток L-типа в кардиоцитах крыс: вначале наблюдается незначительная по амплитуде и длительности (3-5 мин.) фаза активации токов, а затем — длительная фаза подавления Са2+ токов (15-20 мин.). Инсулин практически не влияет на

активированные изопротеренолом токи, но. его ингибирующий эффект увеличивается в несколько раз по сравнению с контролем на модифицированных BAY К8644 токах. Действие синтетических модуляторов тирозин-зависимого фосфорилирования генистейна и ортованадата натрия меняют амплитудные характеристики базального и активированного изопротеренолом и BAY К8644 Са2. Научно-практическая ценность.

Полученные результаты расширяют наши знания о механизмах регуляции Са2+ тока в кардиоцитах нормотермных и зимоспящих животных. Построенная модель может использоваться как для интерпретации уже имеющихся экспериментальных данных, так и для планирования дальнейших экспериментов. Результаты по действию регуляторов тирозин-зависимого фосфорилирования могут использоваться в экспериментальной и практической медицине при анализе и лечении заболеваний, связанных с нарушением сердечной активности и диабета. Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001г.) и на заседании секции «Биологическая подвижность» учёного совета 19 декабря 2006 г. Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в 7 печатных работах, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах. Структура и объём диссертации.

Диссертационная работа изложена на_ страницах с использованием__

рисунков и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит_ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изолированные кардиоциты были получены из сердец крыс линии Sprague Dawley и сусликов в активном и гибернирующем состоянии по методу описанному ранее (Alekseev et al., 1994). Регистрация токов проводилась от кардиоцитов через 23 часа после выделения при комнатной температуре 20-22°С методом «whole cell patch-clamp» в конфигурации «perforated patch». Кончики электродов из мягкого молибденового стекла оплавляли на микрокузнице, сопротивление полученных электродов составляло 1 -5 МП.

Омывающий раствор содержал (в mM, рН=7,25): NaCl - 80; СаСЬ - 2; MgS04 - 5; КН2Р04 - 1,2; CsCl - 10; ТЕА*С1 - 20; Glu - 20; HEPES - 10. Раствор для заполнения стеклянных электродов содержал (в mM, pH=7,25):CsCl - 130; MgS04 -5; HEPES - 10. К+ токи блокировали добавкой ТЕА*С1 в камерный раствор и заменой ионов калия цезием (CsCl). Для перфорации мембран использовали антибиотик амфоторицин В (150 ng/mL).

В экспериментах использовали изопротеренол, BAY К8644, амфоторицин В, циклогексимид, инсулин, ЭГТА, таурин, HEPES, DMEM, генистейн, ортованадат натрия производства фирмы Sigma (USA).

В работе приводятся либо оригинальные записи токов нескольких однотипных экспериментов (не менее 5), либо данные, усреднённые по не менее 7 экспериментам.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Дуальная зависимость Са2+ тока ¿-типа от поддерживаемого потенциала в кардиоцитах нормотермных и зимоспяших животных.

На рис. 1 представлены токовые трассы при аппликации изопротеренола и ВАУ К8644 при поддерживаемых потенциалах, равных -50 и -30 тУ. Видно, что при

а о б

40 140 240 время, мс

Т -0,1

ж о -0,2

>5 -0,3

ш о -0,4

-0,5

-0,6

-40

-20 0 20 мембранный потенциал, мВ

40 140 240 время, мс

I -0,1 о -0,2

>5 -0,3 3

й -0.4

-0,5 -0,6

-20 0 20 40 60 80 мембранный потенциал, мВ

Рис.1 Зависимость действия изопротеренола от поддерживаемого потенциала V), в кардиоцитах крыс, а, в — оригинальные записи токов при Уь=-50 мВ и Уь=-30 мВ, соответственно, пунктириая линия - токи в контроле, сплошная линия - токи в присутствии изопротеренола. б, г — вольтамперные характеристики при соответствующих Уь- (о - контроль, ■ - изопротеренол)

V), равном -50 тУ оба агониста Са2+ токов приводят к мощной активации базального Са2+ тока (рис. 1а, 2а). Сдвиг поддерживаемого потенциала в сторону положительных

mV эти соединения активируют, а при Vh = -30 - блокируют С а' токи, Ситуация изменяется, когда суслики переходят в состояние зимней спячки. На рис. 3 приведены гистограммы, отражающие изменения С а1' токов под действием изопротеренола и BAY К8644 в кардиоцитах гибернирующих сусликов для различных значений Vh. Из приведенных

600%

поддерживаемый потенциал, мВ

Рис.3 Зависимость действия изопротеренола и BAY К8644 от поддерживаемого потенциала в кардиоцитах г ибер пирующего суслика при Vh равном -50, -30 и -10 чВ, Ордината — изменение тока в процентах. Белый столбик - контроль, серый - изопротеренол, чёрный - совместное действие изопротеренола и BAY К8644.

данных следует, "¡то под действием изопротеренола н сердечных клетках гибернирующих животных Са1' токи возрастают в отличие от кардиоиитов активных животных. Т.е. у гибернирующих животных из оп роте рек о л способен лишь увеличивать Са2* ток при изменении V(1 В то же время, действие BAY К 8644 качественно не отличается от его эффектов на кардиоцитах активных животных: при Vh = -50мВ токи увеличиваются, а при Vh >-ЗОмВ - уменьшаются. Совместное действие этих соединений приводит к падению тока при больших значениях поддерживаемого потенциала (Vh=40MB). Подчеркнем, что действие BAY К8644

значений приводит к инверсии эффекта действия обоих веществ (рис. 1в, 2в). На графиках вольтамперных характеристик видно, что оба соединения подавляют токи при Уь=-30 мВ во всём диапазоне значений мембранного потенциала (рис. 16,г; 26,г). Полученные результаты показывают, что в зависимости от состояния Са2+ канала (величины V),) действие одного и того же соединения приводит к противоположным результатам.

0,1

< х

-0,1 - (г 1 -0,2

-0,3 !// * о -0,4

-0,5 / 1-

1 >S -0,6

-0,7 1

-0,9 : а о -0,8

-1,1 1 ' s с -1

-1,3 -1.2

-1,5 --60

40 140 240 время, мс

-20 0 20 40 60 мембранный потенциал, мВ

40 140 240 время, мс

-40 -20 0 20 40 60 мембранный потенциал, мВ

Рис.2 Зависимость действия BAY К8644 от поддерживаемого потенциала Vh в кардиоцитах крыс, а, в — оригинальные записи токов при Vh=-50 мВ и Vh=-30 мВ, соответственно, пунктирная линия - токи в контроле, сплошная линия - токи в присутствии изопротеренола. б, г — вольтамперные характеристики при соответствующих Vh. (о -контроль, ■ - изопротеренол)

Действие этих же соединений в зависимости от УЬ на кардиоцитах активных сусликов не отличается от их действия на кардиоцитах крысы: при УЬ равном -50

не связано с процессами (де)фосфорилирования и зависимость его эффекта от Vh сохраняется и в кардиоцитах гибернирующих животных.

Таким образом, понятие агонист Са2+ тока является условным, так как при разных Vh могут приводить к инверсии вызываемого ими эффекта. Кроме того, из результатов этой работы ясно, что механизмы регуляции Са2+ каналов L-типа в кардиоцитах крыс и зимоспящих сусликов в активном состоянии сходны. В то же время, у гибернирующих животных регуляция Са2+ тока принципиально отличается: дуального эффекта в этих клетках не наблюдается при действии изопротеренола, но эффект восстанавливается при аппликации BAY К8644.

Поскольку зависимость Са2+ тока от Vh имеет вполне реальное практическое значение (например, при инфаркте миокарда в зоне разрыва мышцы, вытекающий К+ может деполяризовать участок миокарда), было важно разобраться в механизмах этого эффекта. Мы решили проверить, воспроизводится ли этот эффект в классе феноменологических моделей типа Ходжкиаа-Хаксли, описывающих Са2+ ток.

Ранее было показано, что наиболее приемлемым описанием Са2+ тока в моделях этого класса является представление интегрального Са2+ тока в виде (Alekseev, Kokoz, et al 1996):

Ic^ScAV-V^d'fJr (1)

d = (d„-d)lr, (2)

A = (/*»-/*)/»> (3)

Л-=(/;.-//)/V №

где gCa - максимальная проводимость по Ca2+; V и VCa - мембранный и реверсивный кальциевый потенциал, соответственно; d, fsvi fr - переменные активации, медленной и быстрой инактивации Са2+ канала; /s„ и - установившиеся значения соответствующих переменных; rd, гд. и ту- постоянные времени тех же переменных.

В условиях фиксации потенциала с учётом Vh ток описывается:

где 1 = ^ .Г; т- 2, и/-' = 1 и = 2. Индекс Ь у переменных /,.. и /,,. относится к значениям этих переменных при Уь.

Поиск кинетических характеристик Са2+-тока Ь-типа производился

минимизацией функции х1 = ¡пюЛ<))2 на временном отрезке от 0 до

л-1

300 мс. Зависимость амплитуды тока от УЬ в присутствии изопротеренола определялось в два этапа. На первом этапе глобальной аппроксимацией определяли кривые зависимости переменных с!,о, , и т^, тя, г 1Т от мембранного потенциала (V), не изменяя УЬ. Затем, в уравнении (5) переменные с1к, и принимали значения /,„, при V равном УЬ. Анализ показал, что эта модель

не воспроизводит эффект влияния Уь у нормотермных животных и гибернантов. Кинетическая модель регуляции С а2 к канала.

Модель включает в себя 4 состояния канала (моды), внутримодальные переходы в которых зависят от потенциала, а межмодальные переходы потенциал-

11 21 12

с,

с-

Рис. 4 Схема внутримодальных переходов внутри моды Мх.

Состояния С1, С2 - закрытые, О - открытое и И и 12 - инактивированные состояния. Потенциал-зависимыми на этой схеме являются стадии С] о С2 и (|<=> 12. г!, 2.2 -переносимый инактивационный и активационный воротные заряды.

независимы и учитывают зависимость от ионов Са2+. Схема переходов внутри одной моды представлена на рис. 4.

Кинетическая схема межмодальных переключений представлена на рис.5 . На этой схеме Ма -базальная активная мода, М|,-промежуточная мода между базальной модой и модой МСа>, MF- фликеринг мода, переход в которую происходит после Са2-зависимой инактивации канала. Casch и Casrr> обозначены концентрации Са2+ внутри клетки вблизи устьев, соответственно, открытых и закрытых каналов. Мы исходим из предположения, что существуют 4 моды, из которых Мв и MF, активны, а моды, Мса и Mi,- неактивны. Необходимость введения промежуточной неактивной моды Mi возникла в результате предварительного анализа межмодальных переключений только с тремя модами Мв, МСа и MF.

г 2+ í^a sch

Мв ■Mi

4 r

MCa

Рис. 5 Схема межмодальных переходов. Са2^ — концентрация кальция у устьев открытых каналов; Са2тзт — примембранная концентрация кальция (у устьев закрытых каналов).

Потенциал-зависимые переключения в пределах любой одной моды будем называть внутримодальными, а переходы между модами - межмодальными

переключениями. На Са24 канале идентифицированы два аллостерических центра Са2+ с различной константой диссоциации Кд, отвечающих за Са2+-зависимую инактивацию. Причем, связывание Са2+ с аллостерическими центрами происходит в строгой последовательности. Сначала в моде Мв Са2+ связывается только с центром, имеющим низкое сродство (Кд -10"4 - 10"3М). В результате происходит переход из базальной моды Мв в промежуточную М|. И только затем, в моде Мь второй ион Са2+ связывается с центром, имеющим высокое сродство к Са2* (Кл ~10"7 - 10"бМ). В этом случае канал из моды Mi переходит в Мса. Если же второй ион Са2+ не связывается со вторым аллостерическим центром, то канал из моды Mj может спонтанно перейти в моду MF. Таким образом, состояние Мв - свободно от Са2+, Mi и Мр - состояния со связанным Са2+ в аллостерическом центре с низким сродством, Мса - состояние, у которого оба аллостерических центра связаны с Са2+. Предполагается, что в неактивных модах МСа и М, состояние канала, условно названное О, является закрытым. Отсутствие открытого состояния в моде М, связано с предположением, что переход из моды М| в МСа регулируется только внутриклеточным Са2+, находящимся около закрытых каналов, то есть примембранным Са2+ (Casr71), концентрация которого не очень высока (до нескольких мкМ) и оп буфером.

Микродоменное распределение концентрации Са2+ (с) в зависимости от расстояния от канала г описывается уравнением:

4 izFDr

где ^-концентрация Са2+ в объеме цитоплазмы, i-амплитуда тока по одиночному каналу, F -константа Фарадея, D -коэффициент диффузии Са2+ в цитоплазме, Я-эффективная длина забуферевания Са2+.

Эффективная длина забуферевания вычисляется следующим образом:

Я и [D2 КК„В)]"2 (6)

мкМ) и определяется интегральным Са2+ током через мембрану и Са2+-связывающим

где коп- константа ассоциации Са + с буфером; В- концентрация мобильного Са2+ буфера. Уравнение (6) получено в приближении, что относительные изменения концентрации буфера, свободного и связанного с Са2+, малы по сравнению с изменениями свободного Са2+.

Используя уравнение микродоменного распределения, легко оценить макродоменное распределение Са около закрытого канала за счет латеральной диффузии Са2+ от всех соседних открытых каналов, проинтегрировав это уравнение по г. Если обозначить эту концентрацию как с<т, то выражение для нее имеет следующий вид:

cm=c„ + XoipJ2FD (7)

где а это число функционально активных каналов на 1 мкм2 поверхности мембраны, рс- вероятность нахождения канала в открытом состоянии. Данное соотношение адекватно в случае равномерного распределением каналов вдоль поверхности мембраны. Если каналы входят в состав удаленных друг от друга кластеров, "hot spots", что характерно для Са2+ каналов L-типа в кардиоцитах, то радиус кластера R меньше X и для csm справедливо другое уравнение:

с„, = с„ + О - ехр(-Л / Х))Ыра /2FD (8)

Ниже приведены формулы рассчёта тока по одиночному каналу и рассчёт интегрального тока:

HPc,F(F/RT)2VCa^eXp(-2VF/RT)-Ca- (9)

с' exp(-2VF/RT)-l

ICa=ivSp0 (10)

Во всех последующих расчетах использовались следующие значения фиксированных параметров: Са0Ы=2мМ; г=1нм; D=0.6 мкм2/мс. Значения остальных параметров X, Cain, а и значения констант скоростей различных переключений канала вычислялись путем глобальной минимизации отклонений между экспериментальными и теоретическими данными. Для вычисления параметров модели была использована процедура глобального фитинга (минимизации

отклонений экспериментальных и модельных результатов одновременно для различных тестовых потенциалов Ут).

На рис.6 представлены результаты моделирования дуального эффекта в действии изопротеренола в зависимости от УЬ. Значение V), учитывается при вычислении начального стационарного состояния. В модели некоторые константы скоростей зависят от потенциала и, соответственно, стационарные состояния зависят от потенциала. Поэтому, начальное стационарное состояние (состояние покоя), которое вычисляется как установившееся состояние при интегрировании полной системы диференциальных уровнений при бесконечно больших значениях времени, так же зависит от потенциала. В работе принято, что значения потенциалов, при которых вычисляется начальное стационарное состояние, являются значениями Уь.

Хорошую подгонку экспериментальных результатов в контроле удалось получить предположив, что существует всего одна популяция каналов.

Получить хорошее соответствие экспериментальных и теоретических результатов в кардиоцитах крысы под действием изопротеренола в рамках модели с одним типом каналов не удалось. Для того чтобы подогнать экспериментальные данные в присутствии изопротеренола пришлось предположить, что популяция Са2+ каналов состоит из двух подпопуляций: одной базальной и другой — фосфорилированной. При этом, все параметры моды в базальном состоянии были приняты такими же, как в контроле, за исключением плотности каналов (сг, таблица, рис.6). Параметры моды в фосфорилированном состоянии были вычислены с помощью фитинга (таблица, рис.6). Дуальный эффект изопротеренола в модели и эксперименте (активация или угнетение) Са2+ токов в зависимости от УЬ удалось воспроизвести теоретически с использованием значений параметров, полученных в результате фитинга при УЬ= -50мВ и УЬ= -20мВ.

V„=-50 мВ

-10 90 190 290 время, мс

Vh=-30 мВ

о 3

5 -о,б о

с "0,8 J

-1 i -........- - -.......

-10 90 190 290 время, мс

Параметры Контроль Изопротеренол

тип 1 Тип 1 Тип 2

К (мВ) 9.54 9.54 12

al (мс"') 0.15 0.15 0.46

VI (мВ) 13.2 13.2 3.6

Ик0,С2 2.6 2.6 0.99

"kciji 10° 10"s 0.005

кс2,12 0.0053 0.0053 0.0028

'к|,С2 2.6 2.6 0.99

'kci.il 10° 10"5 0.005

'кс2,!2 0.0053 0.0053 0.028

Cakl,C2 2.6 2.6 0.99

Lakc,,„ 0.00014 0.00014 0.01

V 0.17 0.17 0.56

Ir.Ca 0.17 0.17 0.53

'Ca.I 0.0017 0.0017 0.0053

U2, ll, Ca 0.17 0.17 0.53

L2lca,l 0.0017 0.0017 0.0053

'll.Ca 0.17 0.17 0.53

'ica.I 0.0017 0.0017 0.0053

Km (mkM) 2 2 4.5

Cam (mkM) 0.05 0.05 0.05

x (mkm) 0.54 0.54 0.54

a (mkm"2) 9 5.5 15.9

Рис. 6 Токовые трассы — воспроизведение дуального эффекта действия изопротеренола. Таблица — некоторых значение констант типа 2, отличающиеся от аналогичных в базальном типе I.

Аппроксимация экспериментальных данных, полученных на кардиоцитах активных (летних) сусликах.

Ранее нами было показано, что изопротеренол и BAY К 8644 оказывают сходное по характеру действие на Са2+ ток в кардиоцитах крыс и летних сусликов. Результаты фитинга показывают, что даже базальные Са2+ токи активного суслика в контроле не удается описать с помощью модели с одной популяцией каналов. Для хорошего описания необходимо, как минимум, использовать предположение о двух различных популяциях каналов.

Аппроксимация экспериментальных данных, полученных на кардиоцитах гибеуниуующих сусликах.

Оказалось, что в контроле и под действием изопротеренола популяции каналов отличаются между собой по количественным значениям ряда параметров. Прежде всего, это отличие состоит в плотности активных каналов (в контроле их меньше), в сдвиге активационной кривой (VI) под действием изопротеренола в сторону отрицательных значений потенциала и в большей чувствительности к Са2+ аллостерических центров под действием изопротеренола.

Действие модуляторов тирозин-зависимого фосфорилирования на Са2+ ток L-типа.

Как уже отмечалось ранее, регуляция Са2+ тока во многом определяется потенциалом, внутриклеточной концентрацией Са2+ и фосфорилированием. Мы предположили, что модуляторы фосфорилирования по тирозину могут участвовать в регуляции потенциал-зависимого Са2+ тока. В связи с этим было проведено исследование действия эндогенного активатора фосфорилирования по тирозину — инсулина и синтетических модуляторов фосфорилирования по тирозину — генистейна и ортованадата натрия. Действие инсулина на базальный Со2* ток.

На рис.7 представлено действие инсулина в концентрациях от 10"9М до 10"7М на базальные Са2+ токи в изолированных кардиоцитах крыс. В течение первых 4 минут инсулин активирует токи (~14%), а затем в течение примерно 10 минут

наблюдается подавление Са2+ токов (-21%) ниже базального уровня. Подавление

о 2+

Са токов при аппликации инсулина дозозависимо.

время, мс

0,2

С 0

е-0,2

"-0,4

5 -0,6

1-0, Е

: -1 -1,2

о контроль в [1П5]=10 нМ

о 11пз]=1 нМ ♦ [¡П8]=100 нМ

19 29 39 время, мин

о котроль е [д!и]=0 мМ » [1пэ]=1 мкМ 0,1

£ -0,1

0 -0,3 '5 -0,5

1 -о.'

* -0,9 с:

-1,1

сшх^,

9 19

время, мин

Рис. 7 Двухфазный эффект действия инсулина на базальный Са2+ ток — оригинальные токовые трассы (слево) и в зависимости пиковых токов от времени (а). Сохранение двухфазного эффекта в условиях острой гипогликемии (б) [С1и]=0 мМ.

Двухфазный эффект инсулина может быть связан с активацией, как минимум, двух систем регуляции Са2' токов. Фаза роста токов, предположительно, вызвана активацией в белков. Это предположение следует из того известного факта, что автофосфорилированный инсулиновый рецептор может связывать и активировать белки. В свою очередь, С5 может напрямую активировать Са2+ канал, минуя сАМР-зависимое фосфорилирование.

Фаза подавления токов связана с активацией пока неизвестного каскада регуляции Са2+ токов на более позднем этапе развития инсулинового сигнала.

Действие инсулина в условиях острой гипогликемии.

Одной из причин подавление Са2+ тока инсулином (вторая фаза действия инсулина) может быть изменение концентрации глюкозы в примембранном слое. Активация инсулинового рецептора приводит к транслокации глюкозного транспортёра GLUT4 в плазматическую мембрану и активации транспорта глюкозы в клетку. Известно, что осмотическая активность высоких концентраций глюкозы может приводить к активации ряда сигнальных систем (MAP, IP3K, рецепторы растяжения (stretch receptors)), кроме того - к гликозилированию мембранных белков, что может модулировать Са2+ ток. Нами было проведено исследование действия инсулина в условиях острой гипогликемии — концентрация глюкозы во внешней среде равна 0 тМ (рис.7б). Как и ожидалось, при смене стандартного омывающего раствора ([glu]=20 mM) на безглюкозный ([glu]=0 тМ) в конечном счёте наблюдалось сильное падение Са2+ токов (подавление -50%,). Однако и в условиях отсутствия глюкозы во внешней среде мы наблюдали сохранение обеих фаз действия инсулина на Са2+ токи. Действие инсулина на фоне циклогексимида.

Другой возможный механизм подавления Са2+ токов инсулином может быть связан с процессом интернализации активированного комплекса инсулин+рецептор (IR), с образованием нового внутриклеточного интермедиата, сдвигающего равновесие процессов фосфорилирования/дефосфорилирования в сторону дефосфорилирования Са2+ канала Для исследования участия процесса интернализации как собственно инсулинового рецептора, так и p-адренорецепторов, мы исследовали действие инсулина на кардиоцитах, предварительно проинкубированных (в течении 1-3 часов) с блокатором интернализации рецепторов и синтеза белка циклогексимидом (5*10'SM). Оказалось, что двухфазный эффект действия инсулина на Са2+ токи сохраняется и в этих условиях.

Действие инсулина на токи. индуцированные изопротеренолом и ВА YK8644.

0 контроль • [glu]=0 мМ ■ [iso]=0.1 мк! а о контроль • [glu]=0 мМ ■ [Ьау]=1 мкН 5

1 tins]=1 мкМ О отмыв Д [l„sl=1 мкМ О отмыв

время, мин вРемя' нин

Рис. 8 Действие инсулина на Са2+ токи, активированные изопротеренолом (а) и BAY К8644 (б).

Аппликация изопротеренола или BAY К 8644 приводила к сильному (почти двукратному) росту токов.. Видно, что при аппликации инсулина на фоне действия изопротеренола практически полностью подавляются обе фазы действия инсулина. При аппликации инсулина на фоне действия BAY К 8644 (10'6М) отчётливо видно, что фаза активации таюке практически отсутствует. Однако фаза подавления Са2+ тока возрастает более чем в два раза.

Так как наблюдаемые эффекты инсулина могут быть и не связанны с активацией фосфорилирования по тирозину, мы исследовали действие известного блокатора ТК генистейна и блокатора TP ортованадата натрия на потенциал-зависимый Са2+ ток.

Действие ортованадата натрия на базальные и индуцированные Са2* токи. Ортованадат натрия (Na3V04), блокатор тирозинфосфатаз, в концентрациях 1-3 шМ на потенциал-зависимый Са2+ ток в изолированных кардиоцитах крыс не влиял. Так как сам Na3V04 не влиял на базальные Са2+ токи, было исследовано его действие в сочетании с инсулином. Эксперименты проводились в условиях гипогликемии. Предполагалось, что блокирование тирозинфосфатаз должно было усилить ингибирующий эффект инсулина на Са2+ токи. Однако инсулин на фоне действия Na3V04 не блокировал Са2+ токи, хотя фаза активации сохранялась. Полученный результат свидетельствует, что Na3V04 обладает собственным действием на Са2+

токи. В присутствии BAY К8644 (1 цМ) Na3V04 (ImM) не оказал никакого модулирующего воздействия (рис.9а). В то же время, на фоне изопротеренола (0.1 рМ, рис.9б) Na3V04 (1 mM) подавлял токи на 25-30%.

о контроль ■ [¡SO]=0.1 МКМ 4 рП5]=1 МКМ О ОТМЫВ а о контроль ■ [bay]-1 мкМ * [1пз]=1 мкМ О ОТМЫВ fl

■1 9 19 29 39 49 -1 9 19 29 39 49

время, мин время, мин

Рис. 9 Действие ортованадата натрия (Иа3У04) на активированный изопротеренолом (а) и ВАУ К8644 (б) Са2+ ток.

Действие генистейна на базальные и индуцированные Са*+ токи. Блокатор тирозинкиназ генистейн в концентрациях от 10 до 50 цМ дозозависимо подавляет потенциал-зависимыи Са2+ ток. В связи с сильным блокирующим эффектом генистейна исследование влияния генистейна на эффекты инсулина не проводилось. На рис.10 видно, что генистейн (50 цМ) незначительно увеличивает токи, вызванные изопротеренолом (1 рМ). При обратной последовательности подачи этих модуляторов изопротеренол активировал подавленные генистейном токи также сильно, как и базальные (~2.5-3 раза). Однако, токи не устанавливались на новом уровне, и наблюдалось их подавление на ~50% от максимальных значений. В процессе отмыва апплицированных веществ приводил к падению Са2+ токов почти до значений, наблюдаемых в присутствии генистейна. Генистейн полностью подавлял активированные ВАУ К8644 (1 рМ) Са2+ токи. При обратной последовательности подачи веществ ВАУ К8644 вызывал активацию Са2+ токов, подавленных генистейном. Но сравнительно с его действием на базальные токи, активация была меньше. Достигнув максимальных значений, активированные Са2+ токи при воздействии ВАУ К8644 не устанавливались на новом уровне, а плавно

подавлялись. Отмыв обоих агентов приводил к. активации токов, выше значений, наблюдаемых в контроле.

: *онтрот\ь ■ tfso]=0.1 МкМ 4 lgsfl«50 МКМ 1 отмыв а

I -0,5 • i

S -1'5

3 -2 J а

о -2,5

■

-1 4 9 14 13 24 29 34 время, МИН

о контроль • [bayj=1 мхМ * tgstl=E0 мкМ о ошыв q

I- -0,5 >"

>х .1 л а

S -1.S -

s С

•2

14 19 24 29 34 время, МИН

о контроль a [gst]»50 мкМ ■ [iso]=0.1 мкМ о отмыв ^

0 -1

У* .1,5

1 -2

•3

9 14 19 24 29 34 39 Время, мин

о контроль л tgstj*50 мкМ ■ [Ьэу]-1 мкМ о ОТМЫВ р 0

X -0,6 уе**"*

I -1

1 О

Z -2

-2,5

14 19 24 29 34 39 время, МИН

Рис. 10 Действие генистейна на активированный изопротеренолом (а) и BAY К8644 (в) Са + ток. Действие этих же активаторов на фоне действия генистейна: (б) — изопротеренол и (г) — BAY К8644, соответственно.

выводы

1. Изучен эффект зависимости действия агонистов Са2+ тока L-типа от поддерживаемого потенциала (Vh). В кардиоцитах крыс и активных сусликов при стандартных Vh (от -50 до -40 mV) изопротеренол и BAY К8644 увеличивают Са2+ токи; при Vh от -35 до -25 raV оба агониста вызывают подавление Са2+ тока. В кардиоцитах гибернирующих сусликов дуальный эффект изопротеренола отсутствует, но восстанавливается добавкой BAY К8644.

2. Построена физико-химическая модель регуляции Са2+ тока L-типа, воспроизводящая зависимость действия кальциевых агонистов от поддерживаемого потенциала. Кроме того, модель объясняет ряд трудно интерпретируемых полученных ранее экспериментальных фактов и обладает предсказательной силой.

3. Показано, что модуляторы тирозин-зависимого фосфорилирования (инсулин, ортованадат натрия и генистейн) влияют на амплитуду и кинетические характеристики Са2+ тока L-типа. Показано, что инсулин обладает двухфазным действием на Са2+ ток.

4. Полученные в диссертации результаты показывают, что понятие агонисты и антагонисты Са2+ транспорта условно. Эффект соединений зависит от состояния канала и ряда факторов, изменяющих это состояние: от поддерживаемого потенциала, уровня фосфорилирования каналов, порядка действия модуляторов.

Работа поддержана грантами: РФФИ 04-04-48658, мас00-04-06346, «7 конкурс -экспертиза» 2004г.

Автор благодарен Маркевичу Н.И за постоянное внимание к работе и большую помощь в её выполнении.

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Внутри- и межмодальные переходы в Са2+ канале L-типа.

Таблица А.1. Детальная схема и уравнения для внутри- и межмодальных переходов.

Внутримодальные переходы

Простые переходы Уравнения скоростей переходов

Мода В

вс,«вс2 Vi = Bkci,c2 ' ВС, - BkC2,ci ' BC2

иС2овО V2 = Bkc2,o'BC2-Bko,c2'B0

вС,ов1, ,, _ в, . ür Вь Ит V3 - Kci.n Ci - Kh.ci и

вС2о% V4 = kC2j2 • C2 - k|2,c2 ' h

В1.«ВЬ ,, _ в, ; в, в. в, Vj- K|1,I2 Jl - KI2.II h

Мода I

'с,«'с2 V6 = 'kCi.c2 • 'C| - 'kc2,ci • 'C2

'С2«'0 V7 = lkC2,o-lC2-'ko,C2-'0

'C.o'l, V8= 'kci.ii ■ 'c, - 'kn.ci • 'li

'C2o'l2 V9 = lkc2,i2'lC2-'kl2.c:-'b

'I,»'!, VI0= 'kn,12' 111 - 'kl2,n • 'l2

Мода F

fC1OkC2 Vil =tkci,c2' 'C, - Fkc2,CI ' hC2

FC2orO v,2 = l'kc2.o-hC2-hko.c2-hO

Мода Ca

Са|С1оСа1С2 _Lali L'al r* Lai. Lai*-. Vl3 - KC1.C2' Ll - KC2.C1 <~2

^'■сго^'о vu - kC2io L2 - k0,c2 U

Ca,CloCalIl ,, _Ua [ 1 l'al.-. tali. Cal, V15 - KCI.II - K,I ci ii

CalC2oCa,12 ,, — Cali, Cali^ Cali, Calj V|6- KC2.I2 Ci - KI2.C2 '2

CalIl«CalI2 ,, _ Cal. .Cal, L'ai, .Cal, Vl7_ Кц.12 11" K[2.ll 12

Ca2ac;Ca2c2 V|g — КС1.С2 Li - KC2.CI >-2

Са2с2<^Са20 v,9 = l'aikC2,o-La2C2-Ca-íko.c2-l-a-íO

Ca2c,0Ca2n V2o = ca"kci.n ■ '"""Ci - ^kn.ci ■ La"Ii

Ca2C2oCa2j2 _ L'a2i LaLaji, Ca2, V21 - KC2.I2 ' L2- K¡2,C2 ' h

Ca2[loCa2[2 V22- K\1.12 И" Kl2,Il П

Межмодальные Са2+-зависимые переходы

Простые переходы Уравнения соростей переходов

BCi+CaSm<=>'Ci „ _С J, ап ci, . v23 _ 'вл ' ~ 'из

BC2+Casmo'C2 v24= L7Ib,i ' вСг ' Casm - t¿li b ' 'Сг

^O+Ca^cho'b v25= u1b,i • вО • Casch - °li,b ' 'b

1C,+Casm»CalC, V26 = U'll.Cal •'Cl • Casm - Lllcal,l ' La'Cl

'C2+Casm<s.CalC2 v27= 11,Cal ' C2'Casm- lcal.1 ' C2

'b+Casra»CalI3 V2S - 'JI|,Cal • 'ij ' Casm - Ulcal,I • CalI3

Са-независимые межмодальные переходы

Простые переходы Уравнения соростей переходов

'Ci <» FC, ., — Cli lr Cil F/-> V29 - 11.F Ll - iF.f ' Li

1С2 о fC2 V30 = H l,F ■ 'C2 - L''l F,l ' * C2

■ь »Fo V3,=Ul,.F-'0-UlF,rfO

CalC| о Ca2Ci ,, _l'l, .Cal r cil CaV v32 _ ICa!,Ca2 - 'Ca2,Cal

CalC2oLa2C2 „ U2i La 1 f vil La le v33 ~ ICal,Ca2 ' <~2 - >Ca2,CaI' L2

CalI3«ta2I, V34- ICal,Ca2 <-)- Ica2.cal U

Константы скоростей внутримодальных переходов внутри моды Мх (X = В, I, F, Са) обозначены символами хк, а константы скоротсей межмодальных переходов обозначены Y/, где Y = С|, Сг, 0,1з. В модели предполагается, что: ясс1 = 'а\ = ' а\ = "он

ваг = 'аг = Раг = С°СС2

skc*.,o= 'ксхо 'ко.п = 'ht.vi

г7;,у = Г!//.А "h-.i = "lh.1

Для простоты принято, что межмодальные переходы в инактивированных состояниях (Ь и У очень медленные и, поэтому, в этой работе не учитываются.

Кроме того, ограничения, наложенные на другие константы скоростей переходов, представляют замкнутые циклы:

hkci,o •' 71. г • 'h.a•' h>,ci'''h ,i ■ "h.i■•• 'knj

xkn,ci-"kx i,, where X = B,I,Cat,Ca2

ПРИЛОЖЕНИЕ В

Дифференциальные уравнения, описывающие меж- и

внутримодальные переходы Ь-типа кальциевых токов, интегральные Са2+ токи и Са2+ токи одиночных каналов:

л л л

"М

л л л ¿1

ИМ.,

л а л а

¿('"'С,)

с1(с°'Сг) -'- = Г 27- Ун - У и - У и - Кзз

«2+т -У,-Уз-У2з

-У1-Уг~У*-Уи

= Уз-Уъ

= Уа-У,

= Уг-Ук

-У6-У*~У26-У29

= Уб-Ут-У<>-У»-Ух>

У9-У10 = У7-У28-Уз, = У*>-У,1

= У,,-у 12 + У 30

У26-У11-У,1-УЭ2

с1[с"1г) Л '

431.

£Л

а <Й

'("'О

-1 = У 21 + К22

У,6 + Уп

Уп + Уи-У34

Уп-Уч-Уго

■■ У 33 + У ¡Я — У19 — У 21

= У 20-У 22

СТ'Яч • рп

+ Са,„-Са™ •£>

<Й

Л Л2

где вероятность открывания

ехр

Са,а, - Са,т +•

, (г = 1 гая)

Ток через одиночный канал:

_ С

/ „ ч Со«»1*ехр--

Я'Т

ехр -

Интегральный Са ток: Ьа =/,о1,5,,р», где Б — площадь поверхности мембраны.

с/г

= Уч-Уг

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Кокоз Ю.М., Гриченко А.С., Корыстова А.Ф., Ланкина Д.А., Пименов О.Ю., Маркевич Н.И. Регуляция Са2+-каналов L-типа в кардиоцитах зимоспящих животных.// Биол. Мембраны 2000; 17(2):217-222.

2. Kokoz YuM, Grichenko AS, Korystova AF, Lankina DA, Pimenov OYu, Markevich N1. The regulation of L-type Ca2+ currents in cardiac myocytes of hibernating animals.// Membr Cell Biol. 2000;14(2):277-84.

3. Markevich N.I., Pimenov O.Y., Kokoz Y.M. Analysis of the modal hypothesis of Ca2+-dependent inactivation of L-type Ca2+ channels.// Biophysical Chemestry, 2005, 117:173-190

4. Пименов О.Ю., Грушин K.C., Корыстова А.Ф., Кокоз Ю.М. Эффект инсулина и регуляция потенциал-зависимого Са2+ тока L-типа в изолированных кардиоцитах крыс модуляторами тирозин-зависимого фосфорилирования.// Биологические мембраны, 2006, т.23, №2, стр.161-170

Тезисы докладов

1. Корыстова А.Ф., Пименов О.Ю., Грушин К.С., Кокоз Ю.М. Регуляция инсулином Са2+ токов L-типа в изолированных кардиоцитах крыс.// Тр. Конф. «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям», Пущино, 2002, с. 84.

2. Корыстова А.Ф., Пименов О.Ю., Грушин К.С., Кокоз Ю.М. Регуляция Са2+ тока L-типа модуляторами тирозинового фосфорилирования в изолированных кардиоцитах гибернирующего суслика.// Тр. Конф. «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям», Пущино, 2002, с. 84.

3. Пименов О.Ю., Корыстова А.Ф., Грушин К.С., Маркевич Н.И., Кокоз Ю.М. Действие инсулина и регуляторов тирозинзависимого фосфорилирования на Са2+ токи L-типа в кардиоцитах нормотермных и зимоспящих животных.// Сборник статей «Горизонты биофизики. От теории к практике.», Пущино, 2002, с. 130-136.

Припято к исполнению 19/02/2007 Исполнено 20/02/2007

Заказ № 119 Тираж: 75 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пименов, Олег Ювенальевич

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 ТипыСа каналов и их классификация.

2.2 Структура потенциал-зависимых Со2* каналов.

2.3 Рецептор-зависимая регуляция Са2+ токов L-muna.

2.4 Фосфорилирование по тирозину.

3 Материалы и методы

3.1.1 Выделение клеток.

3.1.2 Метод перфорированного патча.

4 Результаты и обсуждения

4.1.1 Дуальный эффект изопротеренола и BAYК8644 на

Са2+ токи нормотермных животных.

4.1.2 Действие изопротеренола и BAYК8644 на

-токи кардиоцитах активных и гибернирующих сусликов.

4.1.3 Кинетические параметры Са2+ тока. 34 4.2 Кинетическая модель регуляции Са2+ канала.

4.2.1 Основные допущения о свойствах Са2* каналов, положенные в основу кинетической модели регуляции Са2+ токов L - типа.

4.2.2 Аппроксимация экспериментальных данных, полученных на кардиоцитах крысы.

4.2.3 Аппроксимация экспериментальных данных, полученных на кардиоцитах активных (летних) сусликах.

4.2.4 Аппроксимация экспериментальных данных, полученных на кардиоцитах гибернирующих (зимних) сусликах.

4.3.1 Действие инсулина на базальный Са2+ ток.

4.3.2 Действие инсулина в условиях острой гипогликемии.

4.3.3 Действие инсулина на фоне циклогексимида.

4.3.4 Действие инсулина на токи, индуцированные изопротеренолом UBAYK8644.

4.3.5 Действие ортованадата натрия на базальные и индуцированные Са2+ токи.

4.3.6 Действие генистейна на базальные и индуцированные

Са токи.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция потенциал-зависимого Ca2+ тока L-типа поддерживаемым потенциалом и модуляторами фосфорилирования по тирозину"

•у i

Потенциал-зависимые Ca -токи L-типа играют ключевую роль в регуляции частоты и силы сердечных сокращений, формировании потенциалов действия, выбросе нейротрансмиттеров, регуляции активности нейронов [McDonald et al., 1994; Hartzell et al., 1992]. Они регулируются факторами различной природы. Медленная регуляция, в основном, связана с химическими модификациями. Быстрая регуляция определяется потенциал- и Са2+-зависимыми конформационными переходами внутри канала. Са2+ ток L-типа можно разделить на следующие компоненты: потенциал-зависимую активацию, Са2+-зависимую инактивацию (CDI), потенциал-зависимую инактивацию и остаточный ток. Молекулярные и кинетические механизмы регуляции компонент тока потенциалом и внутриклеточной концентрацией Са2+ до сих пор полностью не изучены. В последнее десятилетие определены последовательности на С-концевом участке (остатки 15201732) al-субъединицы, названные областью Са2+-инактивацией (CI). Связь фосфорилирования каналов с их амплитудными и кинетическими характеристиками до конца не выяснена, хотя известно, что активность канала управляется по крайней мере двумя центрами фосфорилирования, которые фосфорилируются различными протеинкиназами и дефосфорилируются различными протеинфосфатазами [Мае Donald et al1994; Hartzell et al.,1995; Ono and Fozzard, 1993]. При этом считается, что эффект фосфорилирования зависит от типа центра: фосфорилирование одного центра преимущественно переводит каналы из неактивного состояния в функционально активное, а фосфорилирование второго — к увеличению вероятности пребывания в открытом состоянии функционально активного канала [Tsien et al.,1986; Wiechen et al., 1995].

Одной из проблем интерпретации экспериментальных данных является то, что кинетика CDI зависит не только от конформационных перестроек канала, но и от изменения внутриклеточной концентрации л I

Са около мембраны, сильно варьирующей около открытых и закрытых каналов. Для того чтобы объяснить зависимость кинетики CDI от концентрации Са2+, определяемой от локальных и удалённых источников, при анализе CDI следует учитывать высокую вариабельность распределения внутриклеточного Са2+ вдоль всей внутренней поверхности мембраны. Наиболее популярными моделями CDI Са2+ каналов L-типа, учитывающих изменения концентрации Са2+ около мембраны, являются «shell» и «доменная» модели. «Shell»-модель предполагает, что инактивация запускается Са2+, который равномерным тонким слоем распределён вдоль внутренней поверхности мембраны. Напротив, «доменная» модель предполагает, что переход в инактивированное состояние возникает только тогда, когда аллостерический центр открытого канала связывает Са2+. «Shell»-модель не способна объяснить CDI, наблюдаемую в экспериментах на одиночных каналах, а «доменная» модель не учитывает роль концентрации Са2+ около закрытых каналов.

В последние годы показано, что активация тирозинкиназ может регулировать транспортные системы [Russell R.R. et al., 1999], модулировать К+ токи [Bowlby M.R. et al., 1997], фосфорилировать Р-адренорецепторы [Baltensperger К. et al., 1996], хотя основное действие ТРК направлено на регуляцию метаболических и пролиферативных реакций в клетке. Однако, сейчас появляется всё больше данных о модуляции агонистами рецепторных тирозиновых киназ (инсулин и факторы роста) кальциевого гомеостаза. Проследить всю цепочку от активации инсулинового рецептора до модификации свойств кальциевого канала довольно сложно, так как модуляция Са2+ токов инсулином может происходить на разных этапах развития инсулинового сигнала, а литературных данных о действии инсулина на Са2+ токи очень мало [Aulbach F. et al., 1999; Maier S. et al., 1999].

Наличие многочисленных регуляторных связей у Са2+ каналов L-типа приводит к тому, что результат действия даже хорошо известных соединений часто непредсказуем и зависит от условий эксперимента. Поскольку зависимость Са2+ тока от поддерживаемого потенциала имеет вполне реальное практическое значение (например, при инфаркте миокарда в зоне разрыва мышцы, вытекающий К+ может деполяризовать участок миокарда), было важно разобраться в механизмах этого эффекта. С этой целью нами были проанализированы имеющиеся модели регуляции Са2+ тока. Было показано, что стандартные описания регуляции Са2+ тока не способны адекватно описать наблюдаемый феномен. В связи с этим, возникла необходимость создания модели, воспроизводящей дуальный эффект действия агонистов. Из анализа наших экспериментов следовало, что в реализации дуального эффекта необходимы , по крайней мере, две киназы. Одна из них известная - РКА, другая - не идентифицирована. Сравнительно недавно стали появлятся данные об участии тирозин-киназ в регуляции потенциал-зависимого Са2+ тока. Именно поэтому в данной работе особое внимание уделяется тирозин-зависимому фосфорилированию.

Таким образом, задачами данного исследования являются:

1. Подробное исследование дуального эффекта действия агонистов Са2+ токов L-типа в зависимости от поддерживаемого потенциала.

3. Определение роли модуляторов тирозин-зависимого фосфорилирования в регуляции Са тока.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Типы Са2+-каналов и их классификация.

Первая значительная попытка классифицировать Са2+ каналы была предпринята в 1985 году Nowycky с соавторами [Nowycky et al., 1985]. Основываясь на изучении свойств Са токов в клетках спинного нервного узла цыплёнка, они разделили Са2+ токи на три типа: Т-тип с низким порогом активации (Transient), а токи с высоким порогом активации обозначили как L- и N-типа (Long lasting и Neither). Данное разделение основано как на электрофизиологических, так и на фармакологических свойствах каналов. Ток L-типа чувствителен к дигидропиридинам, N-типа - к со-конотоксину (co-CgTx), а Т-типа оказался нечувствительным к обоим агентам.

В основу классификации рецепторуправляемых Са каналов положены механизмы их активации: непосредственно через G-белки, либо регуляция опосредована вторичными мессенджерами. Существует также субпопуляция этих каналов, активируемых физическими факторами (на пример, механо-чувствительные).

Л I

Имеющаяся на данное время классификация Са каналов представлена в таблице 1, составленная на основе данных Meldolesi и Pozzan [Meldolesi and Pozzan, 1987], Anwyl [Anwyl et al., 1991],Tang [Tang et al., 1993], Martin-Moutot [Martin-Moutot et al., 1996]. Данная классификация, как и предложенная Nowycky, не всегда позволяет достаточно точно охарактеризовать объект исследования. Имеются данные о том, что некоторые из типов каналов можно разделить на несколько подтипов с различными свойствами в зависимости от ткани,

Таблица 1. Классификация Са2+ каналов.

Вид | Свойства Функции и место нахождения

Потенциалзависимые Са/+ каналы

L-тип Активируется при высоких потенциалах (пик активации положительнее -10 raV), проводимость одиночного канала 25 пСм, характеризуется замедленной инактивацией или отсутствием таковой, блокируется дигидропиридиновыми антагонистами. Сопряжение возбуждение/сокращение в мышечных клетках, возбуждение/секреция в эндокринных клетках и некоторых нейронах.

Т-тип Активируется при низких потенциалах (пик активации от -70 до -50 mV), характерное время инактивации х = 5-50 мс, блокируется низким [Na+]o и часто октанолом. Вносит вклад в пейсмейкерную активность и повторяющиеся разряды в сердце и нейроне.

N-тип Активируются при высоких потенциалах (аналогично L-типу), проводимость одиночного канала около 13 пСм, умеренная скорость инактивации с т = 50-80 мс, нечувствителен к дигидропиридинам и блокируется ю-конотоксином. Идентифицирован в большинстве нейронов, управляет выбросом нейротрансмиттеров.

Р-тип Активируется при умеренно высоких потенциалах, нечувствителен к дигидропиридинам, блокируется co-Aga-токсином паука Agelenopsis aperta. Клетки Пуркенье. В некоторых нейронах опосредует выброс трансмиттеров и высокопороговые спайки.

R-тип Блокаторы не известны. Быстро инактивируется (~20мс)

Рецептор-управляемые Са2+-каналы

НМДА-зависимые Активируются связыванием лиганда, потенциал-чувствителен. Опосредует вход Са^+ в нейронах в ответ на связывание трансмиттера и деполяризацию мембраны.

АТР-зависимые Ативируется связыванием лиганда, потенциал-нечувствителен. Обеспечивает вход катионов и Са для активации гладкой мышцы.

Управляемые вторичными мессенджерами Са2+ каналы

Активируемые Са2+ или 1Р3 Связывают активацию лигандом с секрецией или экспрессией гена. Нейтрофилы, лимфоциты, тромбоциты

Механо-чувствительные Са2+ каналы

Механически активируемые или инактивируемые Связывают механическую активность с Са2+-зависимой ферментативной активностью. Различные мышечные клетки. в мембране которых эти каналы присутствуют. Так Са ток L-типа зависит от активности протеинкиназы С в гладкомышечных клетках [Obejero-Paz et al., 1998], в то время как в кардиомиоцитах эта зависимость отсутствует [Hartzell et al., 1995].

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Пименов, Олег Ювенальевич

ВЫВОДЫ

1. Изучен эффект зависимости действия агонистов Са2+ токов L-типа от поддерживаемого потенциала (Vh). В кардиацитах крыс и активных сусликов при стандартных Vh (от -50 до -40 мВ) изопротеренол и BAY К8644 увеличивают Са2+ токи; при Vh от -35 до -25 мВ оба агониста вызывают подавление Са2+ тока. В кардиоцитах гибернирующих сусликов дуальный эффект иопротеренола отстутствует, но восстанавливается добавкой BAY К8644. ji

2. Построена физико-химическая модель регуляции Са тока L-типа, воспроизводящая зависимость действия Са2+ агонистов от поддерживаемого потенциала. Кроме того, модель объясняет ряд трудно интерпретируемых полученных ранее экспериментальных фактов и обладает предсказательной силой.

3. Показано, что иодуляторы тирозин-зависимого фосфорилирования (инсулин, ортованадат натрия и генистейн) влияют на амплитуду и кинетические характеристики Са тока L-типа. Показано, что инсулин обладает двухфазным действием на Са ток.

4. Полученные в диссертации результаты позволяют предположить, что понятие агонисты и антагонисты Са2+ транспорта условно. Эффект соединений зависит от состояния канала и ряда факторов, изменяющих это состояние: от поддерживаемого потенциала, уровня фосфорилирования каналов, порядка действия модуляторов.

Работа поддержана грантами: РФФИ 04-04-48658, мас00-04-06346, «7 крнкурс-экспертиза» 2004.

Атор благодарен Маркевичу Н.И. за постоянное внимание к работе и большую помощь в её выполнении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пименов, Олег Ювенальевич, Пущино

1. Маркевич Н.И., Корыстова А.Ф., Гриченко А.С., Панкина Д.А., Кокоз Ю.М. Регуляция Са2+-токов L-типа в кардиоцитах крысы. Биологические мембраны, 2000, т. 17, No. 1, стр.: 88-101.

2. Накипова О.В., Кокоз Ю.М., Фрейдин А.А., Сафронова В.Г., Лазарев А.В. Влияние инсулина на кальциевый ток миокарда лягушки.// Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1987. № 4. С. 492-498.

3. Накипова О.В., Кокоз Ю.М., Лазарев А.В., Фрейдин А.А., Крупенин В.А. Модификация циклогексимидов эффектов инсулина на транспорт кальция сарколеммой миокарда.// Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1988. № 3. С. 420-427.

4. Akiyama Т., Ishida J., Nakagawa S., Ogawara H., Watanabe S., Itoh N., Shibuya M., Fukami Y. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine specific protein kinases. J. Biol. Chem. 1987. V. 262. № 12. P. 5592-5595.

5. Alekseev A.E., Korystova A.F., Mavlyutova D.A., Kokoz Yu.M. Potential-dependent Ca2+-current in isolated heart cells of hibernators.// Biochemistry and Molecular biology International. 1994. V. 33. № 2. P. 365-376.

6. Alekseev A.E., Markevich N.I., Korystova A.F., Terzic A., Kokoz Y.M.// Biophys J, 1996, V. 70, P: 786-797.

7. Alkon D.L, Naito S. Long-term synergistic regulation of ionic channels by C-kinase and Ca2+/CaM-type II kinase.Adv Exp Med Biol, 1987,221: 275-290.

8. Alvarez J.L., Vassort G. Properties of the low threshold Ca current in single frog atrial cardiomyocytes. A comparison with high threshold Ca current. J. Gen. Physiol., 1992, V. 100(3), P.: 519-545.

9. Anwyl R. Modulation of vertebrate neuronal calcium channels by transmitters. Brain Res. Rev., 1991, V. 16(3), P.: 265-281.

10. Armstrong D., Eckert R. Voltage-activated calcium channels that must be phosphorylated to respond to membrane depolarization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84: 2518—2522.

11. Aulbach F., Simm A., Maier S., Langenfeld H., Walter U., Kersting U., Kirstein M. Insulin stimulates the L-type Ca2+ current in rat cardiac myocytes.// Cardiovsc. Res. 1999. V. 42. P. 113-120.

12. Balke C.W., Rose W.C., Marban E., Wier W.G. Macroscopic and unitary properties of physiological ion flux through T-type Ca2+-channels in quinea-pig heart cells. J Physiol (Lond), 1992,456: 247-265.

13. Baltensperger K., Karoor V., Paul H., Ruoho A., Czech M.P., Malbon C.C. The beta-adrenergic receptor is a substrate for the insulin receptor tyrosine kinase. J. Biol. Chem. 1996. V. 271. №2. P. 10611064.

14. Beam K.G., Knudson C.M. Calcium currents in embryonic and neonatal mammalian skeletal muscle. J Gen Physiol, 1988,91(6): 781-798.

15. Bean B.P. Nitrendipine block of cardiac calcium channels: high-affinity binding to the unactivated state. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, V. 81(20), P.: 6388-6392.

16. Bean B.P. Two kinds of calcium channels in canine atrial cells. Differences in kinetics, selectivity, and pharmacology. J Gen Physiol, 1985, 86(1): 1-30.

17. Bean B.P., Sturek M., Puga A., Hermsmeyer K. Calcium channels in muscle cells isolated from rat mesenteric arteries: modulation by dihydropyridine drugs. Circ. Res., 1986, V. 59(2), P.: 229-235.

18. Belardinelli L., Giles W.R., West A. Ionic mechanisms of adenosine actions in pacemaker cells from rabbit heart. J Physiol (Lond), 1988,405: 615-633.

19. Belevych A., Nulton-Persson A., Sims K., Harvey R.D. Role of tyrosine kinase activity in a-adrenergic inhibition of the p-adrenergically regulated L-type Ca2+ current in guinea-pig ventricular myocytes.//J. of Physiol. 2001. V. 537. № 3. P. 779-792.

20. Bezanilla F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol. Rev., 2000, V. 80, P.: 555-592.

21. Bezanilla F. Voltage sensor movements. J. Gen. Physiol., 2002, V. 120, P.: 465-473.

22. Birnbaumer L., Campbell K.P., Catterall W.A., Harpold M.M., Hofmann F., Home W.A., Могу Y., Schwartz A., Snutch T.P., Tanabe T. The naiming of voltage-gated calsium channels. Neuron, 1994, 13(3): 505-506.

23. Boixel С., Tessier S., Pansard Y., Lang-Zadunski L., Mercadier J.-J., Hatem S.N. Tyrosine kinase and protein kinese С regulate L-type Ca2+ current cooperatively in human atrial myocytes.//Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000. V. 278. P. H670-H676.

24. Bockaert J., Hamburger V., Rouot B. GTP binding proteins: a key role in cellular communications. Biochimie, 1987,69(4): 329-338.

25. Bourne H.R., Sanders D.A., McCormick F. The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell funktion. Nature, 1990,348(6297): 125-132.

26. Bourinet E., Mangoni M.E., Nargeot J. Dissecting the functional role of different isoforms of the L-type Ca2+ channel. J Clin Invest., 2004, V. 113(10), P.: 1382-1384.

27. Bowlby M.R., Fadool D.A., Holmes T.C., Levitan I.B. Modulation of the Kvl.3 potassium channel by receptor tyrosine kinases.// J. Gen. Physiol. 1997. V. 110. № 5. P. 601-610.

28. Brandt D.R., Ross E.M. Catecholamine-stimulated GTPase cycle. Multiple sites of regulation by beta-adrenergic receptors and Mg2+ studied in reconstituted receptors-Gs vesicles. J Biol Chem, 1986,261(4): 1656-1664.

29. Brette F., Calaghan S.C., Lapin S., White E., Colyer J., Guennec J.-Y.L. Biphasic effects of hyposmotic challenge on excitation-contraction coupling in rat ventricular myocytes.// Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000. V. 279. P. H1963-H1971.

30. Brown A.M., Lux A.D., Wilson D.L. Activation and inactivation of single channels in snail neurons. J. Gen. Physiol., 1984, V. 83, P.: 751-769.

31. Brown A.M., Kunze D.L., Yatani A. Dual effects of dihydropyridines on whole cell and unitary calcium currents in single ventricular cells of quinea-pig. J. Physiol.(London)., 1986, V. 379, P.: 495-514.

32. Brown A.M. Membrane-delimited cell signaling complexes: direct ion channel regulation by G proteins. JMembr Biol, 1993, 131(2): 93-104.

33. Brum G., Osterreider W., Trautwein W. Beta-adrenergic increase in the calcium conductance of cardiac myocytes studied with the patch clamp. Pflugers Arch, 1984, 401(2): 111-118.

34. Cadena D.L., Gill G.N. Receptor tyrosine kinases. FASEB J., 1992, V. 6, P.: 23322337.

35. Campbell D.L., Giles W.R., Shibata E.F. Ion transfer characteristics of the calcium currents in bull-frog atrial myocytes. J Physiol (bond), 1988,403: 239-266.

36. Catterall W.A. Functional subunit structure of voltage-gated calcium channels. Science, 1991,253(5027): 1499-1500.

37. CavalieA., Ochi R., Pelzer D., Trautwein W. Elementary currents through Ca channels in Guinea pig myocytes. PJlugers Arch., 1983, V. 398, P.: 284-297.

38. Cavalie A., Pelzer D., Trautwein W. Fast and slow gaiting behaviour of single calcium channels in cardiac cells. Relation to action and inactivation of calcium-channel current. Pflugers Archiv., 1986, V. 406, P.: 241-258.

39. Cerbai E., Klockner U., Isenberg G. Ca-antagonistic effects of adenosine in guinea-pig atrial cells. Am. J. Physiol., 1988, V. 255 (4 Pt 2), P.: H872-H8878.

40. Ciang C.E., Chen S.A., Chang M.S., Lin C.I., Luk H.N. Genistein directly inhibits L-type calcium currents but potentiates cAMP-dependent chloride currents in cardiomyocytes.// Biochem. And Biophys. Research Communications. 1996. V. 223. P. 598-603.

41. Dutta K., Podolin D.A., Davidson M.B., Davidoff A.J. Cardiomyocyte dysfunction in sucrose-fed rats is associated with insulin resistance. Diabetes., 2001, V. 50(5), P.: 1186-92.

42. Findlay I. b-Adrenergic and muscarinic agonists modulate inactivation of L-type Ca2+ channel currents in guinea pig ventricular myocytes.// Journal of Physiology. 2002. V. 545. № 2. P. 375-388.

43. Fischmeister, R., Hartzell, H.C. Mechanism of action of acetylcholine on calcium current in single cells from frog ventricle. J Physiol (bond), 1986, 376:183-202.

44. Fischmeister, R., Shrier, A. Interactive effects of isoprenaline, forskolin and acetylcholine on Ca2+ current in frog ventricular myocytes. J Physiol (Lond), 1989,417:213-239.

45. Fleming, J.W., Strawbridge, R.A., Watanabe, A.M. Muscarinic receptor regulation of cardiac adenylate cyclase activity. JMol Cell Cardiol, 1987,19(1):47-61.

46. Frace, A.M., Mery, P.F., Fischmeister, R., Hartzell, H.C. Rate-limiting steps in the beta-adrenergic stimulation of cardiac calcium current. J Gen Physiol, 1993,101(3):337-353.

47. Hadley R.W., Lederer W.J. Comparison of the effects of BAY К 8644 on cardiac Ca current and Ca channel gating current. Am. J. Physiol., 1992,262: H472-H477.

48. Hagemann D., Kuschel M., Kuramochi Т., Zhu W., Cheng H., Xiao R.P. Frequency-encoding Thr17 phospholamban phosphorylation is independent of Ser16 phosphorylation in cardiac myocytes.// J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 29. P. 22532-22536.

49. Hagiwara, N., Irisawa, H., Kameyama, M. Contribution of two types of calcium currents to the pacemaker potentials of rabbit sino-atrial node cells. J Physiol (Lond), 1988, 395:233253.

50. Hartzell, H.C. Regulation of cardiac ion channels by catecholamines, acetylcholine and second messenger systems. Prog Biophys Mol Biol, 1988, 52(3): 165-247.

51. Hartzell, H.C., Simmons, M.A. Comparison of effects of acetylcholine on calcium and potassium currents in frog atrium and ventricle. J Physiol (Lond), 1987,389:411-422.

52. Hartzell H.C., Mery P.-F., Fischmeister R., Szabo G. Sympathetic regulation of cardiac calcium current is due exclusively to cAMP-dependent phosphorylation. Nature, 1991, 351:573-576.

53. Hartzell H.C.,Duchatelle-Gourdon I. Structure and neural modulation of cardiac calcium channels. J. Cardiovascular Electrocardiology, 1992, 3: 567-578.

54. Herzig S., Meier A., Pfeiffer M., Neumann J. Stimulation of protein phosphatases as a mechanism of the muscarinic receptor-mediated inhibition of cardiac L-type calcium channels. Pflugers Archiv, 1995,429:531-538.

55. Herzog W., Weber K. Fractionation of brain microtubule-associated proteins. Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro. Eur. J. Biochem., 1978, V. 92, P.: 1-8.

56. Hescheler, J., Kameyama, M., Trautwein, W. On the mechanism of muscarinic inhibition of the cardiac Ca current. Pflugers Arch, 1986,407(2): 182-189.

57. Hess P., Lansman В., Tsien R.W. Different modes of Ca channel gating behavior favoured by dihydropyridine Ca agonists and antagonists. Nature, 1984, 311: 538- 544.

58. Hirano, Y., Fozzard, H.A., January, C.T. Characteristics of L- and T-type Ca2+ currents in canine cardiac Purkinje cells. Am J Physiol, 1989, 256(5 Pt 2):H1478-H1492.

59. Iacobellis G., Ribaudo M.C., Zappaterreno A., Vecci E., Tiberti C., Di Mario U., Leonetti F. Relationship of insulin sensitivity and left ventricular mass in uncomplicated obesity. ObesRes., 2003, V. 11(4), P.: 518-24.

60. Jmoto Y., Yatani A., Reeves J.P.,Codina J., Brown A.M., Birnbaumer L. Alpha-subunit of Gs directly activates cardiac calcium channels in lipid bilayers.// Am. J. Physiol. 1988. V. 255(4 Pt. 2). P. H722-H728.

61. Jo H., Byer S., McDonnald J.M. Insulin stimulates association of 41kDa G-protein (Gnvn) with insulin receptor.// Biochemical and Biophysical Research Communications. 1993. V. 196.№ l.P. 99-106.

62. Jo S.H., Leblais V., Wang P.H., Crow M.T., Xiao R.P. Phosphatidylinositol 3-kinase functionally compartmentalizes the concurrent G(s) signaling during beta2-adrenergic stimulation. // Circ. Res. 2002. V. 91. № 1. P. 46-53.

63. Josephson I., Sperelakis N. 5'-guanylimidodiphosphate stimulation of slow Ca2+ current in myocardial cells. J. Mol. Cell Cardiol, 1978, V. 10(12), P.: 1157-1166.

64. Gupta M.P., Makino N., Khatter K., Dhalla N.S. Stimulation of Na+-Ca2+ exchange in heart sarcolemma by insulin.// Life Sci. 1986. V. 39. № 12. P. 1077-1083.

65. Gupta M.P., Lee S.L., Dhalla N.S. Activation of heart sarcoplasmic reticulum Ca2+-stimulated adenosine triphosphatase by insulin.// J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989. V. 249. № 2. P. 623-630.

66. Gurney A.M., Nerbonne J.M., Lester H.A. Photoinduced removal of nifedipine reveals mechanisms of calcium antagonist action on single heart cells. J. Gen. Physiol., 1985, V. 86(3), P.: 353-379.

67. Kameyama, M., Hofmann, F., Trautwein, W. On the mechanism of beta-adrenergic regulation of the Ca channel in the guinea-pig heart. Pflugers Arch, 1985,405(3):285-293.

68. Kameyama, M., Hescheler, J., Hofmann, F., Trautwein, W. Modulation of Ca current during the phosphorylation cycle in the guinea pig heart. Pflugers Arch, 1986,407(2): 123128.

69. Kass, R.S., Arena, J.P. Influence of pHo on calcium channel block by amlodipine, a charged dihydropyridine compound. Implications for location of the dihydropyridine receptor. J Gen Physiol, 1989,93(6): 1109-1127.

70. Kato M, Kako KJ. Na+/Ca2+ exchange of isolated sarcolemmal membrane: effects of insulin, oxidants and insulin deficiency.// Mol. Cell Biochem. 1988. V. 83. № 1. P. 15-25.

71. Keef K.D., Hume J.R., Zhong J. Regulation of cardiac and smooth muscle Ca(2+) channels (Ca(V)1.2a,b) by protein kinases. Am J Physiol Cell Physiol., 2001, V. 281(6), P.: C1743-56.

72. Kokubun, S., Prod'hom, В., Becker, C., Porzig, H., Reuter, H. Studies on Ca channels in intact cardiac cells: voltage-dependent effects and cooperative interactions of dihydropyridine enantiomers. Mol Pharmacol, 1986, 30(6):571-584.

73. Kokubun, S., Reuter, H. Dihydropyridine derivatives prolong the open state of Ca channels in cultured cardiac cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81(15):4824-4827.

74. Kondo, N. Excitation-contraction coupling in myocardium of nonhibernating and hibernating chipmunks: effects of isoprenaline, a high calcium medium, and ryanodine. Circ Res, 1986,59(2):221-228.

75. Kotani S., Nishida E., Kumagai H., Sakai H. Calmodulin inhibits interaction of actin with MAP2 and Tau, two major microtubule-associated proteins. J. Biol. С hem., 1985, V. 260, P.: 10779-10783.

76. Kotturi M.F., Carlow D.A., Lee J,C., Ziltener HJ., Jefferies W,A. Identification and functional characterization of voltage-dependent calcium channels in T lymphocytes. J Biol Chem., 2003, V. 278(47), P.:46949-60.

77. Kuga, Т., Sadoshima, J., Tomoike, H., Kanaide, H., Akaike, N., Nakamura, M. Actions of Ca2+ antagonists on two types of Ca2+ channels in rat aorta smooth muscle cells in primary culture. Circ Res, 1990, 67(2):469-480.

78. Lacerda, A.E., Brown, A.M. Nonmodal gating of cardiac calcium channels as revealed by dihydropyridines. J Gen Physiol, 1989,93(6):1243-1273.

79. Lai, Y., Seagar, M.J., Takahashi, M., Catterall, W.A. Cyclic AMP-dependent phosphorylation of two size forms of alpha 1 subunits of L-type calcium channels in rat skeletal muscle cells. J Biol Chem, 1990,265(34):20839-20848.

80. Lee, K.S., Tsien, R.W. Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells. Nature, 1983, 302(5911):790-794.

81. Levi, R.C., Alloatti, G. Histamine modulates calcium current in guinea pig ventricular myocytes. J Pharmacol Exp Ther, 1988,246(1 ):377-383.

82. Li G.-R., Zhang M., Satin L.S., Baumgarten C.M. Biphasic effects of cell volume on excitation-contraction coupling in rabbit ventricular myocytes.// Am. J. Heart Circ. Physiol. 2002. V. 282. P. H1270-H1277.

83. Linden, J. Enhanced cAMP accumulation after termination of cholinergic action in the heart. FASEB J, 1987, 1(2):119-124.

84. McDonald T.F., Pelzer S., Trautwein W., Pelzer D. Regulation and modulation of calcium channels in cardiac, skeletal, and smooth muscle cell. Physiol. Rev., 1994, 74: 365-507.

85. McMorn S.O., Janvier N.C., Boyett M.R. The action of acetylcholine on the L-type Ca current is voltage dependent. J. Physiol., 1996,494. P: 113P.

86. Maier S., Aulbach F., Simm A., Lange V., Langenfeld H., Behre H., Kersting U., Walter U., Kirstein M. Stimulation of L-type Ca2+ current in human atrial myocytes by insulin.// Cardiovasc. Res. 1999. V. 44. № 2. P. 390-397.

87. Markevich N.I., Pimenov O.Yu., Kokoz Yu.M. Analysis of the modal hypothesis of Ca2+-dependent inactivation of L-type Ca2+ channels. Biophys. Chemistry, 2006, V.117, P.: 173-190.

88. Markwardt, F., Nilius, B. Modulation of calcium channel currents in guinea-pig single ventricular heart cells by the dihydropyridine Bay К 8644. J Physiol (bond), 1988, 399:559-575.

89. Martin-Moutot, N., Charvin, N., Leveque, C., Sato, K., Nishiki, Т., Kozaki, S., Takahashi, M., Seagar, M.J. Interaction of SNARE complexes with P/Q-type calcium channels in rat cerebellar synaptosomes. JBiolChem, 1996,271(12):6567-6570.

90. Meldolesi, J., Pozzan, T. Pathways of Ca2+ influx at the plasma membrane: voltage-, receptor-, and second messenger-operated channels. Exp Cell Res, 1987, 171(2):271-283.

91. Mikami, A., Imoto, K., Tanabe, Т., Niidome, Т., Mori, Y., Takeshima, H., Narumiya, S., Numa, S. Primary structure and functional expression of the cardiac dihydropyridine-sensitive calcium channel. Nature, 1989,340(6230):230-233.

92. Mitchell, M.R., Powell, Т., Terrar, D.A., Twist, V.W. Ryanodine prolongs Ca-currents while suppressing contraction in rat ventricular muscle cells. Br J Pharmacol, 1984, 81(1):13-15.

93. Mitra, R., Morad, M. Two types of calcium channels in guinea pig ventricular myocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83(14):5340-5344.

94. Nakajima, Т., Wu, S., Irisawa, H., Giles, W.R. Mechanism of acetylcholine-induced inhibition of Ca current in bullfrog atrial myocytes. J Gen Physiol, 1990, 96(4):865-885.

95. Nathanson, N.M. Molecular properties of the muscarinic acetylcholine receptor. Annu Rev Neurosci, 1987, 10:195-236.

96. Nilius, В., Hess, P., Lansman, J.B., Tsien, R.W. A novel type of cardiac calcium channel in ventricular cells. Nature, 1985,316(6027):443-446.

97. Nishimura J., Huang J.S., Deuel T.F. Platelet-derived growth factor stimulates tyrosine-specific protein kinase activity in Swiss mouse 3T3 cell membranes. Proc Natl Acad Sci USA., 1982, V. 79(14), P.: 4303-7.

98. Noda, M., Shimizu, S., Tanabe, Т., Takai, Т., Kayano, Т., Ikeda, Т., Takahashi, H., Nakayama, H., Kanaoka, Y., Minamino, N. Primary structure of Electrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence. Nature, 1984,312(5990): 121-127.

99. Nowycky, M.C., Fox, A.P., Tsien, R.W. Three types of neuronal calcium channel with different calcium agonist sensitivity. Nature, 1985,316(6027):440-443.

100. Obara K., Yabu H. Dual effect of phosphatase inhibitors on calcium channels in intestinal smooth muscle cells. Am. J. Physiol., 1993,264: C296-C301.

101. Obejero-Paz, C.A., Auslender, M., Scarpa, A. PKC activity modulates availability and long openings of L-type Ca2+ channels in A7r5 cells. Am J Physiol, 1998, 275(2 Pt 1):C535-C543.

102. Ochi, R., Kawashima, Y. Modulation of slow gating process of calcium channels by isoprenaline in guinea-pig ventricular cells. J Physiol (Loud), 1990,424:187-204.

103. Ogura Т., Shuba L.M., McDonald T.F. L-type Ca2+ current in guinea-pig ventricular myocytes treated with modulators of tyrosine phosphorilation.// Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 1999. V. 276. P. H1724-H1733.

104. Ono К., Fozzard H.A. Two phosphatase sites on the Ca channel affecting different kinetic functions. J. Physiol, 1993,470: 73-84.

105. Ouadid, H., Seguin, J., Richard, S., Chaptal, P.A., Nargeot, J. Properties and Modulation of Ca channels in adult human atrial cells. JMol Cell Cardiol, 1991,23(l):41-54.

106. Peterson B.Z., Catterall W.A. Calcium binding in the pore of L-type calcium channels modulates high affinity dihydropyridine binding.// The Journal of Biological Chemistry. 1995. V. 270. №31. P. 18201-18204.

107. Peterson B.Z., Lee J.S., Mulle J.G., Wang Y., Marita de Leon, Yue D.T. Critical determinants of Ca2+-dependent inactivation within an EF-hand motif of L-type Ca2+ channels.// Biophysical Journal. 2000. V. 78. P. 1906-1920.

108. Petit-Jacques, J., Bois, P., Bescond, J., Lenfant, J. Mechanism of muscarinic control of the high-threshold calcium current in rabbit sino-atrial node myocytes. Pflugers Arch, 1993, 423(l-2):21-27.

109. Pierce G.N., Ganguly P.K., Dzurba A., Dhalla N.S. Modification of the function of cardiac subcellular organelles by insulin. //Adv. Myocardiol. 1985. V. 6. P. 113-125.

110. Porzig H., Becker C. Potential-dependent allosteric modulation of 1,4-dihydropyridine binding by d-(cis)-diltiazem and (+/-)-verapamil in living cardiac cells. Mol Pharmacol, 1988,34(2): 172-179.

111. Ravingerova T„ Stetka R., Barancik M., Volkovova K., Pancza D., Ziegelhoffer A., Styk J. Response to ischemia and endogenous myocardial protection in the diabetic heart. Adv Exp Med Biol., 2001, V. 498, P.: 285-93.

112. Ren J., Walsh M.F., Hamaty M., Sowers J.R., Brown R.A. Augmentation of the inotropic response to insulin in diabetic rat hearts.// Life Sci. 1999. V. 65. № 4. P. 369-380.

113. Ren J., Sowers J.R. Reduced contractile response to insulin and IGF-1 in ventricular myocytes from genetically obese zucker rats. Am. J. Physiol., 2000, V. 279(4), P.: H1708-14.

114. Ren J., Bode A. M. Altered cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes from spontaneously diabetic BB rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol., 2000, V. 279(1), P.:H238-44.

115. Reuter H. The dependence of slow inward current in Purkinje fibres on the extracellular calcium-concentration. J Physiol (Lond), 1967,192(2):479-492.

116. Reuter H. Localization of beta adrenergic receptors, and effects of noradrenaline and cyclic nucleotides on action potentials, ionic currents and tension in mammalian cardiac muscle. J Physiol (Lond), 1974,242(2):429-451.

117. Reuter, H., Scholz, H. The regulation of the calcium conductance of cardiac muscle by adrenaline. J Physiol (Lond), 1977,264(l):49-62.

118. Rossing P., Breum L., Major-Pedersen A., Sato A., Winding H., Pietersen A., Kastrup J., Parving H.H. Prolonged QTc interval predicts mortality in patients with Type 1 diabetes mellitus. Diabet Med., 2001, V. 18(3), P.:199-205.

119. Russell R.R., Yin R., Caplan M.J., Ни X., Ren J., Shulman G.I., Sinusas A.J., Young L.H. Additive effects of hyperinsulinemia and ischemia on myocardial GLUT1 and GLUT4 translocation in vivo.// Circulation. 1999. V. 98. P. 2180-2186.

120. Salomone, S., Wibo, M., Morel, N., Godfraind, T. Binding sites for 1,4-dihydropyridine Ca(2+)-channel modulators in rat intestinal smooth muscle. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1991,344(6):698-705.

121. Sanguinetti, M.C., Kass, R.S. Voltage-dependent block of calcium channel current in the calf cardiac Purkinje fiber by dihydropyridine calcium channel antagonists. Circ Res, 1984, 55(3):336-348.

122. Sanquinetti M.C., Krafte D.S., Kass R.S. Voltage-dependent modulation of Ca channel current in heart cells by BAY K8644. J. Gen. Physiol., 1986, V. 88, P.: 369-392.

123. Schramm, M., Thomas, G., Towart, R., Franckowiak, G. Novel dihydropyridines with positive inotropic action through activation of Ca2+ channels. Nature, 1983, 303(5917):535-537.

124. Sims K., Chiu J., Harvey R.D. Tyrosine phosphatase inhibitors selectively antagonize P-adrenergic receptor-dependent regulation of cardiac ion channels.// Mol. Pharmacol. 2000. V. 58. №6. P. 1213-1221.

125. Singer, D., Biel, M., Lotan, I., Flockerzi, V., Hofmann, F., Dascal, N. The roles of the subunits in the function of the calcium channel. Science, 1991,253(5027): 1553-1557.

126. Shirokov R., Ferreira G., Yi J., Rios E. Inactivation of gating currents of L-type calcium channels. J. Gen. Physiol., 1998, V. 111, P.: 807-823.

127. Shuba, Y.M., Hesslinger, В., Trautwein, W., McDonald, T.F., Pelzer, D.J. Whole-cell calcium current in guinea-pig ventricular myocytes dialysed with guanine nucleotides. J Physiol (Lond), 1990,424:205-228.

128. Smogorzewski M., Galfayan V., Massry S.G. High glucose concentration causes a rise in Ca2+.i of cardiac myocytes.// Kidney Int. 1998. V. 53. № 5. P. 1237-1243.

129. Sperelakis N. Regulation of calcium slow channels of cardiac muscle by cyclic nucleotides and phosphorylation. J Mol Cell Cardiol, 1988, 20 Suppl 2:75-105.

130. Sternweis P.C., Pang I.H. The G protein-channel connection. Trends Neurosci, 1990, 13(4): 122-126.

131. Swarup G., Speeg K.V., Cohen J.S., Garbers D.L. Phosphotyrosyl-protein phosphatase of TCRC-2 cells. J. Biol. Chem. 1982. V. 257. № 13. P. 7298-7301.

132. Tanabe Т., Noda M., Furutani Y., Takai Т., Takahashi H., Tanaka K., Hirose Т., Inayama S., Numa S. Primary structure of beta subunit precursor of calf muscle acetylcholine receptor deduced from cDNA sequence. Eur J Biochem., 1984, V, 144(1), P.:l 1-7.

133. Tanabe Т., Beam K.G., Powell J.A., Numa S. Restoration of excitation-contraction coupling and slow calcium current in dysgenic muscle by dihydropyridine receptor complementary DNA. Nature, 1988, V. 336(6195), P.:134-9.

134. Tang, S., Yatani, A., Bahinski, A., Mori, Y., Schwartz, A. Molecular localization of regions in the L-type calcium channel critical for dihydropyridine action. Neuron, 1993, 11(6):1013-1021.

135. Takahashi, M., Seagar, M.J., Jones, J.F., Reber, B.F., Catterall, W.A. Subunit structure of dihydropyridine-sensitive calcium channels from skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987, 84(15):5478-5482.

136. Terada K., Nakao K., Okabe K., KitamuraK., Kuriyama H. Action of 1,4-dihydropyridine derivative, KW-3049, on the smooth muscle membrane of the rabbit mesenteric artery. Br. J. Pharmacol, 1987, V. 92(3), P.: 615-625.

137. Thomas, G., Chung, M., Cohen, C.J. A dihydropyridine (Bay к 8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circ Res, 1985,56(l):87-96.

138. Tsien R.W., Giles W.R., Greengard P. Cyclic AMP mediates the effects oa adrenaline on cardiac Purkinje fibres. Nat. New biol., 1972, V. 240(101), P.: 181-183.

139. Tsien R.W. Adrenaline-like effects of intracellular iontophoresis of cyclic AMP in cardiac Purkinje fibres. Nat. New Biol., 1973, V. 245(143), P.: 120-122.

140. Tsien R.W., Bean B.P., Hess P., Lansman J.B., Nilius В., Nowycky M.C. Mechanisms of Ca channels modulation by p-adrenergic agents and dihydropyridine Ca agonists. J. Mol. Cell Cardiol, 1986,18:691-710.

141. Uehara, A., Hume, J.R. Interactions of organic calcium channel antagonists with calcium channels in single frog atrial cells. J Gen Physiol, 1985, 85(5):621-647.

142. Ullrich A., Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell, 1990 V. 61(2), P.: 203-12.

143. Ushiro H., Cohen S. Identification of phosphotyrosine as a product of epidermal growth factor-activated protein kinase in A-431 cell membranes. J Biol Chem., 1980, V. 255(18), P.: 8363-5.

144. Vassort G., Rougier O., Sauviat M.P., Coraboeuf E., Gargouil Y.M. Effects of adrenaline n membrane inward currents during the cardiac action potential. Pflugers Arch., 1969, V. 309(1), P.: 70-81.

145. Wang Y.G., Lipsius S.L. Genistein elicits biphasic effects on L-type Ca2+ current in feline atrial myocytes.// Am. J. Physiol. 1998. V. 275. P. H204-H212.

146. Watanabe, A.M., Lindemann, J.P., Fleming, J.W. Mechanisms of muscarinic modulation of protein phosphorylation in intact ventricles. FedProc, 1984,43(11):2618-2623.

147. Wiechen, K., Yue, D.T., Herzig, S. Two distinct functional effects of protein phosphatase inhibitors on guinea-pig cardiac L-type Ca2+ channels. J Physiol (Lond), 1995, 484 ( Pt 3):583-592.

148. Worley, J.F., Quayle, J.M., Standen, N.B., Nelson, M.T. Regulation of single calcium channels in cerebral arteries by voltage, serotonin, and dihydropyridines. Am J Physiol, 1991,261(6 Pt 2):H1951-H1960.

149. Yatani A., Imoto Y., Codina J„ Reeves J.P., Brown A.M., Birnbaumer L. A G protein directly regulates mammalian cardiac calcium channels.// Science. 1987. V. 238. № 4831. P. 1288-1292.

150. Yokoshiki H., Sumii K., Sperelakis N. Inhibition of L-type calcium current in rat ventricular cells by the tyrosine kinase inhibitor, genistein and its inactive analog, daidzein.// J. Mol. Cell Cardiol. 1996. V. 28. P. 807-814.

151. Yue D.T., Herzig S., Marban E. p-adrenergic stimulation of calcium channels occurs by potentiation of high-activity gatings modes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 753— 757.

Информация о работе

Пименов, Олег Ювенальевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Регуляция потенциал-зависимого Ca2+ тока L-типа поддерживаемым потенциалом и модуляторами фосфорилирования по тирозину - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы