Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции сократительной функции предсердий мыши при активации Бета-2-адренорецепторов

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции сократительной функции предсердий мыши при активации Бета-2-адренорецепторов"

На правах рукописи

005049442 ^

Одношивкина Юлия Геннадьевна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ПРЕДСЕРДИЙ МЫШИ ПРИ АКТИВАЦИИ БЕТА-2- АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 ФЕВ ?013

Казань-2013

005049442

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Зефиров Андрей Львович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Аникина Татьяна Андреевна

доктор медицинских наук, профессор Пятин Василий Федорович

Ведущая организация - Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН

со

Защита состоится «19» февраля 2013 г. в « ^ » часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.28 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Левобулачная, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» www.ksu.ru

Автореферат разослан «\8 » 2013 г

Ученый секретарь

диссертационного совета ____✓ ¿?

д.м.н., профессор Зефиров Т.Л.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальпость исследования

Исследование регуляции сократимости миокарда является актуальным направлением в физиологии сердца. Один из основных механизмов, контролирующих сердечную деятельность, связан с воздействием катехоламинов (адреналина и норадреналина) на р-адренорецепторы кардиомиоцитов [Д.В. Абрамочкин, Г.С. Сухова, JI.B. Розенштраух, 2006; Кошелев В.Б., 2010; Buxton B.F., et al., 1987]. На основании структурных особенностей и разной чувствительности к фармакологическим агентам адренорецепторы разделяют на аь а2, и pi, р2, рз подтипы. В сердце человека доминируют Pi и р2 подтипы, а их соотношение в предсердиях и желудочках составляет 70:30 % и 80:20 %, соответственно [Buxton B.F. et al., 1987].

Молекулярные исследования р2-адренорецепторов

обнаружили их крайне интересные свойства. Активация р2-адренорецешоров кардиомиоцитов снижает негативные эффекты гипоксии, воспаления и активных форм кислорода [McGraw D.W., Liggett S.B., 2005]. Было показано существование нескольких активных состояний (конформаций) р2-адренорецептора, в которых рецептор с разной эффективностью связывается с сигнальными молекулами и, следовательно, способен запускать различные варианты клеточных ответов [Bokoch M. P., et al., 2010; Jozwiak K., et al., 2010; Rosenbaum D. M., et al., 2011]. При этом разные агонисты переводят р2-адренорецепторы в специфичные активные конформации, поэтому от типа агониста зависит клеточный ответ (этот феномен называют «функциональной селективностью» агонистов). Также в зависимости от дозы агониста р2-адренорецепторы могут «нанимать» для передачи сигнала внутрь клетки различные сигнальные каскады и/или с разной эффективностью связываться с эффекторными молекулами [Sun Y., et al., 2007]. Как и все адренорецепторы, р2-подтип принадлежит к суперсемейству сопряженных с G-белками рецепторов. При этом р2-адренорецепторы взаимодействуют с разными G-протеинами: Gs-белком, стимулирующим каскад аденилатциклаза - цАМФ -протеинкиназа А, и Gi-белком, который угнетает аденилатциклазу и активирует путь фосфоинозитол-3-киназа - протеинкиназа В [Swift S.M. et al., 2007; Liu R. Et al., 2009].

Механизмы действия р2-адренорецепторов малоизучены и затрагивают, по разным данным, систему аденилатциклазы, потенциал-зависимые Са-каналы L-типа, рианодиновые рецепторы и другие сигнальные молекулы [Cherezov V. et al., 2007; Haase H., 2007; Zhou P.

й а1., 2009]. Таким образом, р2-адренергическая регуляция сердца остается недостаточно изученной, и ее детальное исследование может внести существенный вклад в разработку новых кардиопротекторных и кардиомодулирующих препаратов.

Цель и задачи исследования:

Целью исследования являлось выявление эффектов и механизмов действия агониста Рг-адренорецепторов (фенотерола) на сократимость, Са2+-сигналы и продукцию оксида азота в изолированных предсердиях мыши.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать вклад р2-адренорецепторов в реакцию предсердий на норадреналин.

2. Определить эффект разных доз агониста (фенотерола) на силу сокращения изолированных предсердий мыши.

3. Выявить влияние низких (5 мкМ) и высоких (50 мкМ) доз фенотерола на динамику Са2+ - сигналов и продукции оксида азота.

4. Выявить роль аденилатциклазы и протеинкиназы А в эффектах активации (32 - адренорецепторов.

5. Выявить роль Ж)-синтазы в эффектах активации р2— адренорецепторов.

6. Определить влияние длительности активации р2-адренорецепторов на силу сокращения изолированных предсердий мыши.

7. Исследовать изменение сократимости, Са2+-сигналов и продукции оксида азота при кратковременной активации р2-адренорецегггоров.

Положения, выносимые на защиту:

1. Активация Рг-адренорецепторов селективным агонистом (фенотеролом) увеличивает силу сокращения предсердий. Динамика положительной инотропной реакции определяется концентрацией и длительностью аппликации агониста.

2. Механизм эффектов активации р2 - адренорецепторов связан с изменением. активности двух каскадов (аденилатциклазный и N0-синтазный), разнонаправлено регулирующих силу сокращения.

Научная новизна

В работе впервые произведен подробный анализ влияния разных доз агониста и отличающихся по длительности аппликаций на функционирование предсердий. Был выявлен медленно-

развивающийся (через 15-20 мин после аппликации) положительный инотропный эффект агониста (32-алренорецепторов фенотерола, в концентрации 5 мкМ. Тогда как фенотерол в высокой концентрации (50 мкМ) вызывал быструю положительную инотропную реакцию предсердий. При этом оба эффекта исчезали на фоне селективного ингибирования р2-адренорецепторов и зависели от увеличения внутриклеточного систолического уровня Са2+ и изменения продукции оксида азота. В ходе выполнения исследования была предложена и подтверждена гипотеза о том, что фенотерол запускает внутриклеточные сигнальные каскады (аденилатциклаза протеинкиназа А - Са-каналы Ь-типа и МО-синтаза), которые определяют специфику разносторонней регуляции силы сокращения. Также нами были получены приоритетные данные об увеличении амплитуды сокращений предсердий, проявляющемся только после завершения кратковременной фармакологической стимуляции р2-адренорецепторов. Этот эффект сопровождался увеличением внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и снижением продукции оксида азота.

Научно-практическая ценность

Полученные данные имеют теоретический характер, дополняя современные представления о механизмах регуляции деятельности сердца, и имеют прикладные аспекты, связанные с обоснованием применения агонистов р2-адренорецепторов при лечении сердечной недостаточности и с разработкой методов помпового (периодичного) введения р2-адреномиметиков, при которых агонист действует кратковременно. То есть имеют практическое значение при разработке средств фармакологической коррекции сердечной деятельности. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 12-04-31032-мол-а, 11-04-00422-а).

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях и съездах: на XV, XVI, и XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010, 2011, 2012); международном симпозиуме «Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (Пущино, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносова» (Москва, 2011); второй конференции молодых ученых и студентов "Экспериментальная и прикладная физиология" (Москва, 2011), V всероссийской с международным участием школе-конференции «Физиология кровообращения» (Москва, 2012), на заседании ФО им. И.П. Павлова (Казань, 2012), на заседании кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета (2012).

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых журналах (из списка ВАК). Материалы диссертации неоднократно доложены на ежегодных научных конференциях в Казанском государственном медицинском университете. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация объемом 120 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 256 источников, из них 11 -отечественных и 245 - иностранных авторов. Диссертация содержит 20 рисунков и 1 таблицу.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на препаратах изолированных предсердий белых мышей. Все эксперименты выполнены при постоянной наружной перфузии препарата раствором Кребса для теплокровных животных следующего состава (мМоль/л): NaCl — .144,0; КС1 — 5,0; MgC12 - 1,0; СаС12 - 2,0; NaH2P04 — 1,0; NaHC03

—2,4; С6Н1206 — 11,0. Все эксперименты проведены при температуре 20°С, pH поддерживался на постоянном уровне 1.2-1 А.

В экспериментах применяли следующие фармакологические препараты:(±)-фенотерол - селективный агонист ß2 - адренорецепторов, в концентрациях 1-300 мкМ ; ICI-118.551- селективный блокатор ß2 -адренорецепторов, в концентрации 0,1 мкМ; Rp-Adenosine 3',5'-cyclic monophosphorothioatetriethyl ammonium salthydrate (Rp-cAMPS) -блокатор протеинкиназы А, в концентрациях 5 и 20 мкМ; Nm-Nitro-L-arginine methylesterhydrochloride (L-NAME) -блокатор NO-синтазы, в концентрации 100 мкМ; cisN-(2-phenylcyclopentyl) azacyclotridecl-en-amine hydrochloride (MDL-1233OA) -ингибитор аденилатцшшазы, в концентрациях 3-20 мкМ; Все использованные вещества фирмы «SIGMA» (США).

Тензометрия. Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro у мыши изучали на изолированных предсердиях. Эксперименты по определению сократимости миокарда проводились на установке PowerLab (AD Instruments, Австралия), датчиком силы MLT 050/D (AD Instruments, Австралия). Препарат помещали вертикально в резервуар объемом 20 мл, рабочий раствор при комнатной температуре. Верхний конец препарата прикреплялся к датчику напряжения через металлическую планку, нижний конец к фиксирующему блоку. Препарат стимулировался электрическим стимулом через 2 платиновых электрода (с помощью стимулятора ЭСЛ-2 (Россия) с частотой стимулов 0,1 Гц амплитудой сигнала 40 мВ, продолжительность стимула 5 мс. Запись кривой регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения "Chart 5.3". Сигналы обрабатывали с помощью программы Chart или Elf (автор А.В.Захаров), силу сокращения определяли в граммах. Оценивали силу сокращения. Статистический анализ проводили с помощью стандартных методов, достоверность различий определяли с помощью параметрического t-критерия Стьюдента (Лакин, 1984).

Флуоресцентная микроскопия. Флуоресценцию наблюдали с помощью микроскопов OLYMPUS сХ41 (со сменными монохроматическими источниками возбуждающего света) и OLYMPUS ВХ51 (оснащенного конфокальной системой DSu) с использованием объективов LMPlanFI 20*/0.40 и uPlanSApo 60x/1.20W. Изображения регистрировали быстродействующими CCD-видеокамерами фирмы OLYMPUS, черно-белой F-View II и цветной DP71. Для обработки изображений применяли программы Се11лА, се11лР и ImagePro. Интенсивность свечения оценивали в относительных единицах (отн.ед.), соответствующих значению яркости в пикселях.

Измерение внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Изменения концентрации Са2+ определяли с помощью красителя Fluo-4, который позволяет точно измерять концентрации Са + в диапазоне от 1 мкМ до 1 мМ. Fluo-4 слабо флуоресцирует в отсутствие однако при связывании с ионами Са2+ флуоресценция Fluo-4 увеличивается более чем в 100 раз [Harkins A.B.,etal., 1993]. Препарат изолированного предсердия выдерживали в растворе, содержащем 1 мкМ Fluo-4-AM, в течение 20 мин при комнатной температуре, и перфузировали физиологическим раствором, не содержащим краситель, в течение 30 мин. Далее регистрировали флуоресценцию в пучке кардиомиоцитов. Флуоресценцию красителя возбуждали короткими (около 1 с) вспышками света с длиной волны 480 нм, а свечение регистрировали с использованием эмиссионного светофильтра, пропускающего свет с длиной волны более 515 нм. В ходе циклов сокращения-расслабления препарата наблюдались периодические изменения свечения Са2+-сенсора в виде вспышек («Са2+ - сигналов»). Для оценки амплитуды Са2+ - сигналов из значения максимальной флуоресценции (в период систолы) вычитали минимальную величину флуоресценции в период диастолы.

Измерение концентрации оксида азота (NO). Продукцию оксида азота детектировали при помощи маркера DAF-FM-диацетата (Molecular Probes, США), который возбуждали светом длиной волны А. = 495 нм, а при регистрации флуоресценции применяли эмиссионный фильтр, пропускающий свет с длиной волны более 515 нм. DAF-FM практически не флуоресцирует до вступления в реакцию с N0, но при взаимодействии с N0 его флуоресценция возрастает более чем в 160 раз [Woo A.Y.,et al.,2009]. DAF-FM растворяли в DMSO и хранили в замороженном виде в защищенном от света месте. Препарат изолированного предсердия выдерживали в растворе с 2 мкМ DAF-FM-диацетатом в течение 30 мин. Далее препарат перфузировали физиологическим раствором, не содержащим краситель, в течение 20 мин (время, за которое заканчивается реакция деацетилирования маркера) [Kojima H., etal., 1999], после чего регистрировали флуоресценцию в пучке кардиомиоцитов. Статистический анализ проводили при помощи программы OriginPro. Результаты измерений представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (п — число независимых опытов). Достоверность различий определяли с помощью критериев Стьюдента и ANOVA.

Эксперименты выполнены совместно с А.М. Петровым (доц. каф. норм, физиологии КГМУ, кб.н.)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование вклада р2-адренорецептороп в реакцию предсердий на норадреналпн. Добавление 10 мкМ норадреналина на три минуты приводило к увеличению силы сокращения изолированного предсердия мыши до 182±5 % (п=6, р<0.05), после смены раствора на физиологический амплитуда сокращений сохранялась на повышенном уровне: к 15 минуте достигала 178±6 % (п=6, р<0.05). На фоне селективного блокатора (32 - адренорецепторов (0.1 мкМ 1С1-118.551) под влиянием норадреналина сила сокращений возрастала в меньшей степени и составила 170±5 % (п=6, р<0.05) к 5 минуте эксперимента, а после смены раствора амплитуда сокращений снизилась до 100±7 % (п=6, р<0.05) к 10 минуте и до 80±7 % (п=6, р<0.05) к 20 минуте (рис. 1 А). Аппликация 10 мкМ норадреналина в течение 20 минут также вызывает положительную инотропную реакцию предсердий, сила сокращений достигает 200±7 % (п=6, р<0.05) и сохраняется на этом уровне при смене раствора на физиологический. На фоне же селективного блокатора р2 -адренорецепторов (0.1 мкМ 1С1-118.551) положительная инотропная реакция предсердий значительно снижается и достигает 150±6 % (п=6, р<0.05) к 10 минуте эксперимента, а после смены раствора на физиологический амплитуда сокращений снижается до 70±5 % к 40 минуте (п=6, р<0.05) (рис. 1 Б).Таким образом, увеличение силы сокращений предсердий при действии норадреналина (10 мкМ) частично определяется активацией р2- адренорецепторов.

д г- Норадреналин,

мин min

Рис. 1. Влияние норадреналииа на силу сокращения изолированных предсердий.

На рисунке показана амплитуда сокращений предсердий под действием норадреналина, в контроле (кружки) 3 мин (А), 20 мин (Б) и на фоне селективного блокатора [Ь -адренорецепторов (0.1 мкМ ICI-118.551) (треугольники) (А, Б). Аппликация норадреналина и ICI-118.551 обозначены стрелками. Вклад Ргадренорецепторов в положительную инотропную реакцию предсердий на норадреналин показан штриховкой.

Влияние агониста р2 - адренорецепторов — фенотерола на сократимость изолированных предсердий мыши. Добавление фенотерола в концентрации от 1 до 300 мкМ вызывало существенное увеличение силы сокращения (рис. 2 А, Б). Аппликация 1 и 5 мкМ фенотерола повышала силу сокращений до 134± 4 % (п =5, р<0.01) и 145 ± 5 % (п=5, р< 0.01) относительно контрольного значения соответственно. Под действием фенотерола (25 и 50 мкМ) сила сокращений еще более возрастала — до 160± 5 % (п=6, р<0.01) и 176 ± 6 % (п=8, р<0.01). Однако в концентрации 300 мкМ фенотерол повышал амплитуду сокращений только до 143 ±6% (n=5, р<0.01) (рис. 2 В). На фоне селективного блокатора р2-адренорецепторов (0.1 мкМ ICI -118.551) положительный инотропный эффект фенотерола в концентрации 5 и 50 мкМ не проявлялся (данные не приведены).

Результаты экспериментов указывают на то, что скорость проявления положительного инотропного эффекта фенотерола изменяется в зависимости от его концентрации: чем выше концентрация, тем раньше наблюдается увеличение силы сокращений, и тем оно более выражено (рис. 2 А, Б). Интересно отметить, что активация р2-адренорецепторов низкими концентрациями селективного агониста фенотерола вызывает медленно развивающуюся положительную инотропную реакцию, регистрирующуюся через 20—25 мин. В дальнейшем использовались две концентрации фенотерола: 5 мкМ, при которой наблюдался медленно развивающийся эффект, и 50

Рис. 2. Влияние фенотерола на силу сокращения изолированных предсердий.

А — максимальная амплитуда сокращений (Р тах); Б — время от начала аппликации фенотерола до момента, когда амплитуда сокращения достигала 50% от максимальной (Т50). В - Изменение силы сокращения предсердий под действием 5, 50 и 300 мкМ фенотерола (кружки, квадраты и треугольники соответственно

Влияние агонпста |?2 - адренорецепторов — фенотерола на Са2+-сигналы и продукцию оксида азота. Динамика изменений внутриклеточной концентрации ионов кальция, запускающих сокращения кардиомиоцитов, существенно меняется под воздействием фенотерола (рис. 3 А). Низкая концентрация фенотерола (5 мкМ) ведет к постепенному увеличению амплитуды Са2+-сигналов. К 10 мин аппликации р2 - агониста амплитуда Са2+ - сигналов достигала 152 ± 5 % (п=7, р<0.01) от исходных значений. После 15 мин аппликации агониста амплитуда Са2+-сигналов несколько снижалась, а через 20 мин стабилизировалась на повышенном уровне - около 130-140 %. Через 5 мин после замены наружного раствора раствором без фенотерола величина Са2+ - сигналов составляла 134 ± 4 % (п=7, р<0.01). Амплитуда Са2+ - сигналов возвращалась к исходному уровню примерно через 60-70 мин. Аппликация фенотерола в высокой концентрации (50 мкМ) вызывала повышение амплитуды Са2+-сигналов до 122 ± 5 % (п=7, р<0.05) уже через 30 с, а к 3 мин амплитуда достигала максимального значения - 155 ± 5 % (п=7, р< 0.01). Через 8 мин аппликации величина Са2+ - сигналов начинала стекаться, и к 20 мин от начала действия фенотерола составляла 111 ± 4 % (п=7, р<0.05). Восстановление исходной величины Са2+ - сигналов происходило через 50-60 мин после начала перфузии препарата раствором без фенотерола.

Под влиянием фенотерола флуоресценция маркера DAF-FM (показатель продукции NO) в кардиомиоцитах предсердий достоверно возрастала (рис. 3 Б). Фенотерол в низких дозах запускал постепенное увеличение продукции оксида азота, а к 20 мин аппликации фенотерола интенсивность флуоресценции увеличивалась до 104± 1 % (п=6, р<0.05). После удаления фенотерола из наружного раствора флуоресценция быстро снижалась до 95 ± 1 % (п =6, р <0.05) от исходного уровня и в течение 10 мин возвращалась к исходному уровню. Под действием высокой дозы фенотерола в первые 5 мин аппликации наблюдалось снижение интенсивности флуоресценции DAF-FM (к 5 мин интенсивность флуоресценции составляла 96±1 %) (п=6, р<0.05). После 8 мин аппликации фенотерола интенсивность флуоресценции начинала возрастать и достигала 104 ± 1 % (п=6, р<0.05) через 20 мин. После перфузии препарата раствором, не содержащим фенотерол, интенсивность флуоресценции превышала контрольный уровень в течение 10-15 мин и составляла 104—108 % (п=6, р<0.05) от исходной величины.

Таким образом, предполагается, что динамика и выраженность положительного инотропного эффекта при фармакологической

стимуляции р2-адренорецепторов определяются скоростью увеличения амплитуды Са2+- сигналов и изменением продукции оксида азота.

фвжзгерол

10 20 30

Время (мин)

Рис.3. Влияние агониста рг - адренорецепторов - фенотсрола на Са2+ -снгпалы (А) и продукцию оксида азота (Б).

На рисунке показана динамика флуоресценции Са2+- индикатора Р1ио-4и маркера ОАР-РМ (показателя продукции оксида азота), предварительно загруженных в кардиомиоциты, под воздействие 5 и 50 мкМ фенотерола (светлые и черные квадраты и треугольники, соответственно). Светлыми кружками, соединенными пунктирной линией, показано изменение амплитуды Са2+ - сигналов в отсутствие фенотерола (контроль). Аппликация фенотерола обозначена чертой.

Эффекты блокирования аденилатциклазы и протеннкиназы А на силу сокращений, амплитуду Са2+ - сигналов, изменение продукции оксида азота при активации ß2 -адренорецепторов. Блокирование аденилатциклазы (MDL) достоверно изменяло инотропное действие фенотерола. На фоне MDL в концентрации 20 мкМ фенотерол оказывал слабый отрицательный инотропный эффект - амплитуда сокращений снижалась до 83±2 % (п=5, р<0.05) (рис.4А). Аналогичным эффектом обладал специфичный ингибитор протеннкиназы А (Rp-cAMPS). В концентрации 20 мкМ он инвертировал действие агониста ß2 — адренорецепторов (амплитуда сокращений уменьшалась до 79±4 % (п=5, р<0.05) (рис.4А).

При ингибировании аденилатциклазы 10 мкМ MDL амплитуда Са2+ - сигналов снижалась до неопределяемого уровня, что указывает на высокую фоновую активность аденилатциклазной системы, которая стимулирует активность Са2+ - каналов плазматической мембраны и мембраны саркоплазматического ретикулума. На фоне более низких концентраций MDL (3 мкМ) изменения амплитуда Са2+ - сигналов под действием фенотерола были менее выражены (рис.4 Б.). Так, к 3-й и 10-й минутам действия фенотерола амплитуда Са2+ - сигналов возрастала только до 118±3 % (п=6, р<0.05) и 129±4 % (р<0.05)

соответственно. В дальнейшем амплитуда Са2+ - сигналов начинала уменьшаться, составляя к 20-й минуте 122±4 % (р<0.05), а к 40-й минуте величина Са2+- сигналов достоверно не отличалась от контрольной (рис.4Б).

На фоне ингибитора аденилатциклазы 3 мкМ MDL фенотерол оказывал более существенный эффект на продукцию оксида азота (N0). В этих условиях через 10 и 20 мин действия фенотерола флуоресценция DAF-FM возрастала до 110±1 % (п=7, р<0.05) и 122±1 % (р<0.05) соответственно. К 40-й мин свечение DAF-FM составляло 107±1 % (р<0.05) (рис. 4 В).

Представленные данные, свидетельствуют о том, что блокирование внутриклеточного сигнального каскада аденилатциклаза — протеинкиназа А приводит к угнетению положительного инотропного эффекта активации р2-адренорецепторов, за счет уменьшения Са2+ - сигналов и увеличения продукции оксида азота.

Рис.4. Роль аденилатциклазы и протеинкиназы А в эффектах активации Рз - адренорецепторов.

А-действие фенотерола (5 мкМ) на динамику амплитуды сокращения предсердий мыши в контроле (светлые кружки), на фоне блокирования аденилатциклазы (20 мкМ MDL, светлые квадраты), протеинкиназы А (20 мкМ Rp-cAMPS, светлые реугольники). Б - влияние фенотерола (5 мкМ) на динамику амплитуды Са1+ - сигналов в контроле (светлые квадраты) и при ингибировании аденилатциклазы (3 мкМ MDL, темные квадраты). В- динамика свечения DAF-FM (показателя уровня оксида азота в кардиомиоцитах) при фармакологической стимуляции р2 - адренорецепторов в контроле (светлые треугольники) и на фоне ингибирования аденилатциклазы (3 мкМ MDL, темные треугольники). Аппликация фенотерола указана стрелкой.

Эффекты блокирования NO - синтазы на силу сокращений, амплитуду Са2+ - сигналов, измепеппе продукции оксида азота при активации ß2 — адренорецепторов. Блокирование NO — синтазы с помощью 100 мкМ L-NAME увеличивало амплитуду сокращений предсердий до 114±3 % (п=6, р<0.05), что указывает на наличие тонической продукции NO, угнетающей силу сокращения. На фоне L-NAME эффект фенотерола развивался существенно быстрее (рис. 5 А). Уже к 10-й минуте аппликации фенотерола происходило увеличение

амплитуды сокращений до 115±3 % (п=6, р<0.05), а к 20 - 25-й мин до 130-140 %. Впоследствии амплитуда сокращений медленно снижалась.

На фоне действия Ь-ЫАМЕ (100 мкМ) существенно изменялась динамика амплитуды Са2+ - сигналов (рис. 5 Б). Аппликация фенотерола вызывала более значительное увеличение амплитуды Са2+ - сигналов, чем в контроле: спустя Змин после добавления фенотерола величина Са2+ - сигналов увеличивалась до 126±2 % (п=6, р<0.05), а к 20-й мин достигала максимума - 162±4 % (р<0.01) (рис. 5 Б). Затем амплитуда Са2+- сигналов стабилизировалась на повышенном уровне 150-160 %.

В условиях блокирования N0 - синтазы (100 мкМ Ь-ЫАМЕ) аппликация фенотерола не приводила к увеличению свечения, наоборот, к 15 - 20-й мин флуоресценция маркера ОАТ-БМ уменьшалась до 91-92 % (п=5, р<0.05) от исходного уровня (до момента добавления агониста). В последующем флуоресценция ОАР-БМ не изменялась, сохранялась на сниженном уровне (рис 5 В).

Следовательно, блокирование N0 — синтазы и продукции оксида азота вызывает ускорение развития положительного инотропного эффекта активации р2 — адренорецепторов с увеличением амплитуды Са2+ - сигналов.

Рвс.5. Роль N0 - синтазы в реализации эффектов активации р2 -адренорецепторов.

А - действие фенотерола (5 мкМ) на динамику амплитуды сокращения предсердий мыши в контроле (светлые кружки), на фоне блокирования N0 - сшпазы (100 мкМ Ь-МАМЕ, темные кружки). Б - динамика амплитуды Са2+ - сигналов в ответ на аппликацию 5 мкМ фенотерола в контроле (светлые квадраты) и при ингибировании N0 - синтазы (100 мкМ Ь-ЫАМЕ, темные квадраты). В - изменение свечения маркера БАГ-ИМ ( показателя продукции оксида) при активации р2 — адренорецепторов в контроле (светлые треугольники) и на фоне ингибирования N0 - синтазы (100 мкМ Ь-ЫАМЕ, темные треугольники). Аппликация фенотерола указана стрелкой.

Зависимость эффектов агониста р2 — адренорецепторов -фенотерола от длительности его аппликации. Аппликация фенотерола (5 мкМ) приводила к увеличению амплитуды сокращений

предсердий. В течение 1мин-й аппликации фенотерола достоверных изменений силы сокращения не наблюдалось. Однако после удаления агониста амплитуда возрастала до 116±4 % (п=7, р<0,01) в течение 10 мин. Если фенотерол добавлялся в раствор на 3 и 10 мин, то положительный инотропный эффект наблюдался также только после удаления фенотерола из раствора. Причем в обоих случаях амплитуда сокращений повышалась до 140-141 %. Интересно отметить, что при 3 мин аппликации эффект достигал указанного значения через 12 мин после «отмывки» фенотерола, а при 10 мин аппликации - через 6 мин. При добавлении же агониста на 20 мин, эффект достигал 145±4 % (п=6, р<0,01) через 5мин после аппликации. Длительное 40 мин воздействие фенотерола, вызывает медленно развивающееся увеличение силы сокращения. Оно начинается через 15-20 мин после добавления агониста в наружный раствор: к 25 мин амплитуда сокращений возрастала до 109± 4 % (п=8, р<0.05), а к 40 мин - до 140±4 % (р <0.01) от исходного значения (рис. 6).

Таким образом, время аппликации фенотерола определяло динамику и выраженность положительной инотропной реакции. Для исследования механизмов отставленной инотропной реакции под действием фенотерола мы анализировали кратковременную 1 мин и 3 мин активацию р2-адренорецепторов. Положительные инотропные эффекты фенотерола не регистрировались на фоне селективного блокатора р2-адренорецепторов 0.1 мкМ1С1-118.551 (рис. 7А).

Рпс.6. Зависимости силы сокращений предсердий от длительности аппликации агониста р2 — адренорецепторов — фенотерола.

Динамика изменения амплитуды сокращений предсердий мыши под действием фенотерола (5 мкМ) при аппликации на 1 мин (кружки), 3 мин (треугольники), 10 мин (квадраты), 20 мин (ромбы), 40 мин (пятиугольники). Длительность аппликации фенотерола указана стрелкой.

Изменение амплитуды Са2+-сигналов, динамики продукции оксида азота в кардиомиоцитах при кратковременной активации р2 —адренорецепт ров. Активация р2 - адренорецепторов существенно изменяла уровень систолического цитозольного Са2+, запускающий сокращения кардиомиоцитов и во многом определяющий их силу (рис. 7 Б). При 1 мин аппликации фенотерола величина Са2+ - сигналов возрастала до 112±3 % (п=5, р<0.05) к концу аппликации, на протяжении последующих 4 мин амплитуда сигналов продолжала увеличиваться, достигая 125±2 % (п=5, р<0.05), а затем в течение 25-30 мин возвращалась до исходного уровня. В случае 3-х мин аппликации эффект агониста был существенно ярче выражен и длительнее. К 3 мин величина Са2+ - сигналов достигала 140±3 % (п=6, р<0.05) , а через 13 мин после удаления агониста - 190±3 % (п=6, р<0.05). Восстановление исходных значений наблюдалось к 50-60 мин.

На фоне действия фенотерола продукция N0 в кардиомиоцитах предсердий возрастала (рис. 7 В). Короткая 1 мин аппликация вела к достоверному увеличению флуоресценции БАБ-РМ до 102±0.3 % (п=6, р<0.05). Однако после завершения аппликации флуоресценция быстро снижалась (через 5 мин до — 99±0,4 %) (п=6, р<0.05). При добавлении фенотерола на 3 мин флуоресценция увеличивалась к 3 мин до 104±0.4 % (п=6, р<0.05), а после быстро снижалась: через 5 мин - до 93±0.7 % (п=6, р<0.05).

Рис.7. Эффекты кратковременной активации рг -адренорецепторов на изменение силы сокращений, амплитуды Са1+ - сигналов, динамики продукции оксида азота в кардиомиоцитах.

А - Динамика силы сокращений при аппликации фенотерола на 1 мин (белые кружки) или 3 мин (белые ромбы). Тонкие кривые показывают влияния 1 мин (темные кружки) и 3 мин (темные ромбы) аппликаций фенотерола на фоне блокирования (?2 -адренорецепторов с помощью 0,1 мкМ 1С1-118.551.Б - Изменение амплитуды Са2+ -сигналов при аппликации фенотеролана 1 мин (белые квадраты) или 3 мин (темные квадраты). В - изменение флуоресценции ОАБ-РМ (показатель продукции оксида азота)в предсердии мыши при аппликации фенотерола. на 1 мин (белые треугольники) или 3 мин (темные треугольники). Стрелками отмечены 1 мин и 3 мин аппликации фенотерола.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предполагаемый механизм влияния активации р2-адренорецепторов на медленно развивающуюся положительную реакцию предсердий мыши.

р2-адренорецепторы, Са2+"каналы L-типа, а также сигнальные молекулы, аденилатциклаза и эндотелиальная NO-синтаза, избирательно локализуются в углублениях мембраны, обогащенных холестерином [Pike et al., 2006; Петров A.M. и др., 2013]. Агонист стимулирует р2-адренорецепторы, которые усиливают работу аденилатциклазы и эндотелиальной NO-синтазы. Аденилатциклаза синтезирует продукцию молекул вторичного посредника цАМФ, которые активируют протеинкиназуА. (рис. 8). Протеинкиназа А, действуя на Са2+"каналы L-типа, увеличивает поступление Са2+ в цитоплазму клетки из внеклеточной среды. Помимо этого, протеинкиназа А может влиять на Са2+~освобождающие каналы саркоплазматического ретикулума, облегчая выходСа2+ из внутриклеточного депо. Повышение внутриклеточного уровня Са2+ ведет к увеличению силы сокращений. Активация эндотелиальной NO-синтазы приводит к увеличению продукции оксида азота, который ограничивает работу Са2+"каналов L-типа и угнетает силу сокращения. Таким образом, при активации р2-адренорецепгоров запускаются каскады, разнонаправленно регулирующие силу сокращения, которые в течение первых минут действия агониста уравновешивают друг друга (левая панель), впоследствии продукция NO снижается и аденилатциклазный путь увеличивает амплитуду сокращений (правая панель). Предположили, что мишенями действия являются Са-каналы и рианадиновые рецепторы.

В предсердиях р2-адренорецепторы частично опосредуют положительную инотропную реакцию вызванную норадреналином. Активация р2-адренорецепторов селективным агонистом (фенотеролом) также увеличивает силу сокращения предсердий. Причем динамика положительной инотропной реакции определяется концентрацией и длительностью аппликации агониста. Механизм эффектов активации р2 — адренорецепторов связан с изменением активности двух каскадов (аденилатциклазный и NO-синтазный), разнонаправленно регулирующих силу сокращения.

сокращения

Сила сокращения

к

агонист

Рис.8. Предполагаемый механизм влияния активации р2-адренорецепторов на медленно развивающуюся положительную реакцию предсердий мыши.

На схеме обозначены: (Вг-адренорецепторы (р2-АР),Са2+"каналы Ь-типа (ЦСа)), аденилатциклаза (АЦ), эндотелиальная ЫО-синтаза (еЫ08), протеинкиназа А (ПК-А), саркоплазматический ретикулум (СПР), оксид азота (N0).

ВЫВОДЫ

1. Увеличение силы сокращений предсердий при действии норадреналина (ЮмкМ) частично определяется активацией |32 -адренорецепторов.

2. Положительный инотропный эффект селективного агониста р2 - адренорецепторов изменяется в зависимости от его концентрации: чем выше концентрация фенотерола, тем раньше наблюдается увеличение силы сокращений, и тем более оно выражено.

3. Фармакологическая стимуляция р2- адр еноре це птор о в вызывает увеличение амплитуды Са2+- сигналов и изменяет продукцию оксида азота.

4. Блокирование внутриклеточного сигнального каскада аденилатциклаза — протеинкиназа А приводит к угнетению положительного инотропного эффекта активации р2-адренорецепторов, за счет уменьшения Са2+-сигналов и увеличения продукции оксида азота.

5. Блокирование N0 — синтазы и продукции оксида азота вызывает ускорение развития положительного инотропного эффекта активации р2- адренорецепторов, что сопоставимо с увеличением амплитуды Са2+ - сигналов.

6. Время аппликации феиотерола определяет динамику и выраженность положительной инотропной реакции.

7. При относительно кратковременной (минуты) стимуляции р2-адренорецепторов возникает отставленный (наблюдающийся после удаления агониста из окружающей среды) инотропный эффект. После удаления агониста происходит снижение продукции оксида азота при сохранении повышенной амплитуды Са2+"сигналов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Одношнвкина Ю. Г., Петров А. М., Зефиров A. JI. Влияние активации р2-адренорецепторов в предсердиях мыши на силу сокращения, Са-сигналы и продукцию оксида азота // Acta Naturae.-2011.-Т.З, № 1.- С. 85-94

2. OdnoshivkinaYu.G., Petrov A.M., Zefirov A.L. The effects of p2-adrenoreceptor activation on the contractility, Ca-signals and nitrix oxide production in the mouse atria // Acta Naturae.-2011,- V.3, №2,- P. 103-112

3. Одношивкина Ю.Г., Петров A.M., Зефиров A.JI. Механизм опосредуемой р2-адренорецепторами медленно развивающейся положительной инотропной реакции предсердий мыши // Российский физиологический журнал им. Сеченова. 2011. -Т. 97, № 11.- С.1223-1236

4. Одношивкнна Ю.Г.. Петров A.M., Зефиров А. Л. Механиз м ы отставленной инотропной реакции предсердий мыши на активацию р2-адренорецепторов//Доклады Академии Наук.- 2012.- Т. 446, № 6.- С. 1-3

5. Odnoshivkina U.G., Petrov A.M., Zefirov A.L. Mechanisms of delayed inotropic response of mouse atria to activation of P2-adrenoreceptors// Doklady Biological Sciecenes. 2012.-V. 446, N. 6, P. 700-702

6. Одношивкина Ю.Г., Петров A. M. Реализация эффектов р2-агониста на инотропную функцию изолированных предсердий мыши // XV Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине». Казань,- 2010,- С. 290

7. Одношнвкина Ю.Г., Петров A. M .Механизм функционирования р2-адренорецепторов в сердце // XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносова». Москва -2010.-С.275.

8. Odnoshivkina U.G., Zemskova S.N., Petrov A.M. Lipid raft in beta2-adrenoreceptor signaling in mice atrial// Symposium Biological Motility: from fundamental achievements to nanotechnologes. Pushchino. 2010.-P.195-196.

9. Одношивкина Ю.Г., Петров А. М. Аденилатциклаза и NO-синтаза в реализации эффектов агониста р2-адренорецепторов // XXI Съезд Физиологического Общества им. И.П. Павлова. Калуга.- 2010.-С. 449

10. Одношивкина Ю.Г., Петров А. М. Роль Са-каналов L-типа в опосредованной р2-адренорецепторами регуляции сократимости изолированных предсердий мыши// XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносова-2011». Москва. -2011,- С.242-243

11. Одношивкина Ю.Г., Петров А. М. Динамика положительной инотропной реакции, кальция и оксида азота при фармакологической активации р2-адренорецепторов// XVI Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине». Казань,-2011,-С. 132

12. Сычев В.И., Пигалева М.С., Одношивкина Ю.Г., Петров A.M.. Эффекты активации бета2-адренорецепторов в предсердиях мыши на продукцию оксида азота// 85-ая Всероссийская студенческая научная конференция. Казань,- 2011,- С. 354

13. Одношивкина Ю.Г., Петров А. М. Дозозависимые эффекты агониста р2-адренорецепторов на сократимость, Са-сигналы и продукцию оксида азота в предсердиях мыши// Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Молодежь -медицине будущего». Одесса.- 2011.- С. 58-59

14. Одношивкина Ю.Г., Петров А. М. «Отставленная» положительная инотропная реакция при активации р2-адренорецепторов изолированных предсердий мыши// XV Международная Пущин екая школа-конференция молодых ученых. Пущино.- 2011.- С. 162-163

15. Одношивкина Ю.Г., Петров А. М. ЦАМФ и NO-зависимый положительный инотропный эффект агониста бета-2-адренорецепторов (фенотерола)// Сборник статей «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». Пущино,- 2011.- Т.1, С. 297-301

16. Одношивкина Ю.Г., Петров A.M. Зависимость эффектов агониста бета-2-адренорецепторов фенотерола от длительности его аппликации. // Международная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Молодежь. Наука. Будущее: технологии и проекты». Казань,- 2011 .-С. 144-147

17. Одношивкина Ю.Г., Петров A.M. Зависимость инотропной реакции предсердий от длительности активации бета-2-адренорецепторов. // Вторая конференция молодых ученых и

студентов "Экспериментальная и прикладная физиология". Москва,-2011.- С.23-25.

18. Одпошивкина Ю.Г., Петров А. М. Инотропный эффект, проявляющийся после аппликации агониста рг-адренорецепторов // V Всероссийская с международным участием школа-конференция «Физиология кровообращения». Москва.- 2012.- С. 119-120

Выражаю искреннюю благодарность к.б.н, доценту кафедры нормальной физиологии КГМУ Петрову Алексею Михайловичу за оказанное содействие при выполнении данного исследования.

Подписано в печать 16.01.2013. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. U. Тираж 100. Заказ № 1601/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Одношивкина, Юлия Геннадьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ

1.1- Адренорецепторы. Их роль и разнообразие

1.1.1. агадренорецепторы

1.1.2. а2-адренорецепторы

1.1.3. (3-адренорецепторы

1.1.4. Физическое взаимодействие подтипов адренорецепторов: гомодимеризация и гетеродимеризация

1.2. Особенность р2-адренорецепторов: структура, полиморфизм

1.3. Фармакология р2-адренорецепторов

1.3.1. Активация р2-адренорецепторов, агонисты

1.3.1.1. Селективный агонист р2-адренорецепторов - фенотерол

1.3.2. Десенситизация р2-адренорецепторов

1.4; Внутриклеточные сигнальные каскады, сопряженные с р2-адренергическои регуляцией

1.4.1. Взаимодействие р2-адренорецепторов с СБ-белком.

1.4.2. Взаимодействие р2-адренорецепторов с С1-белком.

1.4.3. Эффекты Р-адренорецепторов в ремоделировании сердца

1.4.4. Эндогенная активация Р-адренорецепторов

1.5. Роль холестерина в функционировании р2-адренорецепторов

2. ОБЪЕКТ ИМЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Организация и метод исследования

2.2.1. Тензометрия

2.2.2. Флуоресцентная микроскопия

2.2.2.1. Измерение внутриклеточной концентрации ионов Са г | I • I . . I III Л и • I I ¡5:1 : 1 : ! ' '

2.2.2.2.

Измерение концентрации оксида азота (N0)

Растворы и фармакологические вещества

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование вклада р2-адрепорецепторов в реакцию предсердий на норадреналин

Выявление эффектов селективного агониста р2-адренорецепторов - фенотерола

3.2.1.

Влияние агониста 02 - адренорецепторов - фенотерола на сократимость изолированных предсердий мыши

Влияние агониста р2- адренорецепторов - фенотерола на Са сигналы

3.2.3.

Влияние агониста р2 - адренорецепторов - фенотерола на продукцию оксида азота

Исследование механизмов медленно развивающейся положительной инотропной реакции предсердий на фенотерол

3.3.1.

Роль аденилатциклазы и протеинкиназы А в эффектах активации р2- адренорецепторов

3.3.1.1.

Эффекты блокирования аденилатциклазы и протеинкиназы А на силу сокращений при активации р2 - адренорецепторов

3.3.1.

Эффекты блокирования аденилатциклазы и протеинкиназы А на амплитуду Са - сигналов при активации р2-адренорецепторов

3.3.1.3.

Эффекты блокирования аденилатциклазы и протеинкиназы А на изменение продукции оксида азота при активации р2 -адр енорецепторов

3.3.2.

Роль N0 - синтазы в реализации эффектов активации р2-адренорецепторов - *

3.3.2.1.

Эффекты блокирования N0 - синтазы на силу сокращений при активации р2- адренорецепторов

3.3.2.2. Эффекты блокирования N0 - синтазы на амплитуду Са2+ -сигналов при активации р2- адренорецепторов

3.3.2.3. Эффекты блокирования N0 - синтазы на изменение продукции оксида азота при активации р2 — адренорецепторов

3.4. Выявление зависимости эффектов агониста р2-адренорецепторов - фенотерола от длительности его аппликации

3.5. Исследования механизмов отставленной инотропной реакции предсердий на активацию р2- адренорецепторов

3.5.1. Изменение силы сокращений предсердий при кратковременной активации р2- адренорецепторов

3.5.2. Изменение амплитуды Са2+ - сигналов при кратковременной активации р2 - адренорецепторов

3.5.3. Изменение продукции оксида азота при кратковременной активации р2- адренорецепторов

4. ' ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Вклад р2-адренорецепторов в реакцию предсердий на норадреналин

4.2. Эффекты селективного агониста р2 - адренорецепторов -фенотерола

4.3. Механизмы медленно развивающейся положительной инотропной реакции предсердий на фенотерол

4.3.1. Р2-Адренорецепторы и аденилатциклазная сигнальная система.

4.3.2. РгАдренорецепторы и Ж)-синтазная сигнальная система

4.4. Механизмы отставленной инотропной реакции предсердий мыши на активацию р2-адренорецепторов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регуляции сократительной функции предсердий мыши при активации Бета-2-адренорецепторов"

Актуальность исследования

Исследование внутрисердечной регуляции сократимости миокарда является актуальным направлением в физиологии сердца. Один из основных механизмов, контролирующих сердечную деятельность, связан с воздействием катехоламинов (адреналина и норадреналина) на Р-адренорецепторы кардиомиоцитов [Д.В. Абрамочкин, Г.С. Сухова, JI.B. Розенштраух, 2006; Кошелев В.Б., 2007; Buxton B.F., et al., 1987]. На основании структурных особенностей и разной чувствительности к фармакологическим агентам адренорецепторы разделяют на аь а2, и рь р2, Рз подтипы. В сердце человека доминируют pi и р2 подтипы, а их соотношение в предсердиях и желудочках составляет 70:30 % и 80:20 %, соответственно [Buxton B.F. et al., 1987].

Молекулярные-исследования р2-адренорецепторов обнаружили их крайне интересные свойства. Активация р2-адренорецепторов кардиомиоцитов снижает негативные эффекты гипоксии, воспаления и активных форм кислорода [McGraw D.W., Liggett S.B., 2005]. Было показано существование, нескольких активных состояний (конформаций) р2-адренорецептора, в которых рецептор с разной эффективностью связывается с сигнальными молекулами и, следовательно, способен запускать различные варианты клеточных ответов [Bokoch M. P., et al., 2010; Jozwiak K., et al., 2010; Rosenbaum D. M., et al., 2011]. При этом разные агонисты переводят р2-адренорецепторы в специфичные активные конформации, поэтому от типа агониста зависит клеточный ответ (этот феномен называют «функциональной селективностью» агонистов). Также в зависимости от дозы агониста р2-адренорецепторы могут «нанимать» для передачи сигнала внутрь клетки различные сигнальные каскады и/или с разной эффективностью связываться' с>!эффекторными молекулами [Sun Y., etal., 2007]. Как и все адренорецепторы, р2-подтип принадлежит к суперсемейству сопряженных с G-белками рецепторов. При этом р2-адренорецепторы взаимодействуют с разными G-протеинами: Gs-белком, стимулирующим каскад аденилатциклаза - цАМФ - протеинкиназа А, и Gi-белком, который угнетает аденилатциклазу и активирует путь фосфоинозитол-3-киназа - протеинкиназа В [Swift S.M. etal., 2007; Liu R. etal., 2009].

Механизмы действия р2-адренорецепторов малоизучены и затрагивают, по разным данным, систему аденилатциклазы, потенциал-зависимые Са-каналы L-типа, рианодиновые рецепторы и другие сигнальные молекулы [Cherezov V. et al., 2007; Haase H., 2007; Zhou P. et al.,-2009]. Таким образом, Рг-адренергическая регуляция сердца остается недостаточно изученной, и ее детальное исследование может внести существенный вклад в разработку новых кардиопротекторных и кардиомодулирующих препаратов.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось выявление эффектов и механизмов действия агониста р2-адренорецепторов (фенотерола) на сократимость, Са -сигналы и продукцию оксида азота в изолированных предсердиях мыши. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать вклад р2-адренорецепторов в реакцию предсердий на норадреналин.

2. Определить эффект разных доз агониста (фенотерола) на силу сокращения изолированных предсердий мыши.

3. Выявить влияние низких (5 мкМ) и высоких (50 мкМ) доз фенотерола на динамику Са2+ - сигналов и продукции оксида азота.

4. Выявить роль аденилатциклазы и протеинкиназы А в эффектах активации р2- адренорецепторов.

5. Выявить роль N0 - синтазы в эффектах активации р2 -адренорецепторов.

6. Определить влияние длительности активации р2 - адренорецепторов на силу сокращения изолированных предсердий мыши.

2+

7. Исследовать изменение сократимости, Са - сигналов и продукции оксида азота при кратковременной активации (32 - адренорецепторов.

Положения, выносимые на защиту •, ; ¡л ; I ; I>г,

1. Активация р2 - адренорецепторов селективным агонистом (фенотеролом) увеличивает силу сокращения предсердий. Динамика положительной инотропной реакции определяется концентрацией и длительностью аппликации агониста.

2. Механизм' эффектов - активации р2 - адренорецепторов связан с изменением активности двух каскадов (аденилатциклазный и N0-синтазный), разнонаправлено регулирующих силу сокращения.

Научная новизна

В работе впервые произведен подробный анализ влияния разных доз агониста и отличающихся по длительности аппликаций на функционирование предсердии. Был выявлен медленно-развивающиися (через 15-20 мин после аппликации) положительный инотропный эффект агониста р2-адренорецепторов фенотерола, в концентрации 5 мкМ. Тогда как фенотерол в высокой концентрации (50 мкМ) вызывал быструю положительную инотропную реакцию предсердий. При этом оба эффекта исчезали на фоне селективного ингибирования р2-адренорецепторов и зависели от увеличения внутриклеточного систолического уровня Са2+ и изменения продукции оксида азота. В ходе выполнения исследования была предложена и подтверждена гипотеза о том, что феотерол запускает внутриклеточные сигнальные каскады (аденилатциклаза - протеинкиназа А -Са-каналы Ь-типа) и ЫО-синтаза, которые определяют специфику разносторонней регуляции силы сокращения. Также нами были получены приоритетные данные об увеличении амплитуды сокращений предсердий, проявляющемся только после завершения кратковременной фармакологической стимуляции р2-адренорецепторов. Этот эффект сопровождался увеличением внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и снижением продукции оксида азота. ! .'¡к. м ¡¡1) (ги^р;;;.';^,.:. :

Научно-практическая ценность

Полученные данные имеют теоретический характер, дополняя современные представления о механизмах регуляции деятельности сердца, и: имеют прикладные аспекты, связанные с обоснованием применения агонистов р2-адренорецепторов при лечении сердечной недостаточности и с разработкой методов помпового (периодичного) введения р2-, адреномиметиков, при которых агонист действует кратковременно. То есть имеют практическое значение при разработке средств фармакологической коррекции сердечной деятельности. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов ■ и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на'" кафедре- нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 12-04-31032-мол-а, 11-04-00422-а).

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных данных подтверждалась использованием достаточного объема экспериментальных исследований, постановкой и решением поставленных задач, статистической обработкой полученных результатов.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях и съездах: на XV, XVI, и XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010, 2011, 2012); международном симпозиуме «Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (Пущино, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносова» (Москва, 2011); второй конференции молодых ученых и студентов "Экспериментальная и прикладная физиология" (Москва, 2011), V всероссийской с международным участием школе-конференции «Физиология кровообращения» (Москва, 2012), на заседании ВФО им. И.П. Павлова (2012), на заседании ВФО им. И.П. Павлова (Казань, 2012), на заседании • кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета (2012).

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых журналах (из списка ВАК). Материалы диссертации неоднократно доложены на ежегодных научных конференциях в Казанском государственном медицинском университете. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 120 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 256 источников, из них 11- отечественных и 245-иностранных авторов. Диссертация содержит 20 рисунков и 1 таблицу.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Одношивкина, Юлия Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Увеличение силы сокращений предсердий при действии норадреналина (10 мкМ) частично определяется активацией р2 -адренорецепторов.

2. Положительный инотропный эффект селективного агониста р2 -адренорецепторов изменяется в зависимости от его концентрации: чем выше концентрация фенотерола, тем раньше наблюдается увеличение силы сокращений, и тем более оно выражено.

3. Фармакологическая стимуляция р2-адренорецепторов вызывает увеличение амплитуды Са2+ - сигналов и изменяет продукцию оксида азота.

4. Блокирование внутриклеточного сигнального каскада аденилатциклаза - протеинкиназа А приводит к угнетению положительного инотропного'эффекта активации р2 - адренорецепторов, за счет уменьшения Са2+ - сигналов и увеличения продукции оксида азота. 5. Блокирование N0 - синтазы и продукции оксида азота вызывает ускорение развития положительного инотропного эффекта активации р2 -адренорецепторов, что сопоставимо с увеличением амплитуды Са2+ -сигналов.

6. Время аппликации фенотерола определяет динамику и выраженность положительной инотропной реакции.

7. При относительно кратковременной (минуты) стимуляции р2 -адренорецепторов > возникает отставленный (наблюдающийся после удаления агониста из окружающей среды) инотропный эффект. После удаления агониста происходит снижение продукции оксида азота при сохранении повышенной амплитуды Са2+"сигналов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Одношивкина, Юлия Геннадьевна, Казань

1. Абрамочкин Д.В. Особенности регуляции сердечной деятельности у некоторых млекопитающих / Д.В. Абрамочкин, Г.С. Сухова, JI.B. Розенштраух // Кардиология. -2006. -Т. 45, № 6.- С. 50-53.

2. Зефиров A.JI. Ионные каналы возбудимой клетки (структура, функция, патология) / A.JI. Зефиров, Г.Ф. Ситдикова // Казань: Арт-кафе. -2010.- 271С.

3. Кошелев В.Б. Математическое моделирование гемодинамики сердечно-сосудистой системы с учетом влияния нейрорегуляции / В. Б. Кошелев, С. И. Мухин, Т. В. Соколова, Н. В. Соснин, А. П. Фаворский // Математическое моделирование.-2007.- Т. 19, № 3.- С. 15-28.

4. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // Москва: Наука.- 1984.351С.

5. Ноздрачев А. Д. Физиология вегетативной системы/ А. Д. Ноздрачев // Ленинград:Медицина.- 1983. -296 С.

6. Нигматуллина P.P. Клеточно-молекулярные механизмы функционирования и регуляции сердца/ P.P. Нигматуллина, С.Н. Земскова, А.Л. Зефиров, A.B. Смирнов // Казань:- 2004.- 100 С.

7. Розенштраух Л.В. Современный курс классической физиологии (избранные лекции) с приложением на компакт-диске. Быстрые и медленныепотенциалы действия в кардиомиоцитах. Автоматия сердца / JI.B. Розенштраух // ГЭОТАР-Медиа. 2007.-384 С.

8. Сухова Г.С. Изменения последовательности активации в синоатриальном узле кролика при адренергических воздействиях / Г.С. Сухова, А.В. Розенштраух, B.C. Кузьмин, Д.В. Абрамочкин // Кардиология. -2009.- Т.49, № 6.- С.50—52.

9. Уразаев А.Х., Зефиров A.JI. // Успехи физиологических наук. 1999. Т. 30. № 1.С. 54—72.

10. Aass Н. Noradrenaline evokes an a-adrenoceptor-mediated inotropic effect in human ventricular myocardium / H. Aass, T. Skomedal, J.B. Osnes, N.B. Fjeld, G. Klingen, A. Langslet, J. Svennevig, G. Semb //Acta. Pharmacol. Toxicol. -1986.-V 58.-P. 88-90.

11. Agarwal S.R.,Effects of cholesterol depletion on compartmentalizedcAMP responses in adult cardiac myocytes/ S.R.Agarwal, D.A.MacDougall, R.Tyser // J. Mol. Cell Cardiol. 2011. V. 50. № 3. P. 500-509.

12. Balligand J. eNOS activation by physical forces: from short-term regulation of contraction to chronic remodeling of cardiovascular tissues / J. • Balligand, L. Feron, O. Dess // C. Physiol. Rev.- 2009.- V 89, № 2. P. 481—534.

13. Barak L. S. The beta2-adrenergic re-ceptor interacts with the Na+/H+-exchanger regulatory factor to control Na+/H+ exchange / L. S.Barak, S. Shenolikar, E. J. Weinman, S.Grinstein, R. J. Lefkowitz // Nature.- 1998.- V 392, № ,6676, P.626—630.

14. Bastiani M.Caveolae at a glance / M. Bastiani, R.G. Parton // J. of Cell Sei. -2010.- V. 123., P. 3831-3836.

15. Berkowitz D.E. Distribution of ß3-adrenoceptor mRNA in human tissues/ D.E. Berkowitz, N.A. Nardone, R.M. Smiley, D.T. Price, D.K. Kreutter, R.T. Fremeau, D.A. Schwinn // Eur. J. Pharmacol. -1995.- V 289.-P. 223-228.

16. Bernstein D. Differential cardioprotective/cardiotoxic effects mediated by b-adrenergic receptor subtypes / D. Bernstein, G. Fajardo, M. Zhao, T. Urashima, J. Powers, G. Berry // Am. J. Physiol.- 2005.- V 289. P. 2441- 2449.

17. Best J.M. Different subcellular populations of L-type Ca2+ channels exhibit unique regulation and functional roles in cardiomyocytes / J. M. Best, T.J. Kamp // J. Mol. Cell. Cardiol. -2012. -V. 52. .- № 2. -P. 376-387.

18. Böhm M. a -Adrenoceptors and a-adrenoceptor-mediated positive inotropic effects iini failing human myocardium / M. Böhm, F. Diet, F. Geiler, B. Kemkes, E. Erdmann // J. Cardiovasc. Pharmacol: 1988- V.12.- P. 357-364.

19. Bohm M. Increase of Gi a in human hearts with dilated but not ischemic cardiomyopathy/ M. Bohm, P. Gierschik, K.H. Jakobs, B. Pieske, P. Schnabel, M Ungerer, E. Erdmann // Circulation.- 1990.- V. 82.- P. 1249 1265.

20. Bokoch M. P. Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor/M. P. Bokoch, Y. Zou, S. G. Rasmussen, C. W. Liu, R. Nygaard, D. M. Rosenbaum // Nature.- 2010.- V .463.-P. 108-112.

21. Bossuyt J. Expression and phosphorylation of the Na-pump regulatory subunit phospholemman in heart failure/ J. Bossuyt, X. Ai, J.R. Moorman, S.M Pogwizd, D.M.Bers // Circ. Res.- 2005-. V. 97.-P. 558- 565.

22. Bremner P. Partial and full (3 -receptor agonism—a clinical study of inhaled albuterol and fenoterol / P. Bremner, R. Siebers, J. Crane, R. Beasley, C. Burgess//Chest.-1996.-. V. 109.-.P. 957-962.

23. Bristow M.R: Changes in myocardial and vascular receptors in heart , failure./M.R. Bristow // J. Am. Coll. Cardiol. -1993- V. 22.-P. 61-71.

24. Bristow M.R. p-Adrenergic pathways in nonfailing and failing human ventricular myocardium. / M.R. Bristow, R.E. Hershberger, J.D. Port, E.M. Gilbert,

25. A. Sandoval,1 R^Rasniussen, A:Ev Cates, A.M. Feldman // Circulation.- 1990-. V.82 P. 12-25.

26. Bristow M.R. Alpha-1 adrenergic receptors in the nonfailing and failing human heart./ M.R. Bristow, W. Minobe, R. Rasmussen, R.E. Hershberger,

27. B.B. Hoffinan // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1988-. V .247.- P. 1039-1045.

28. Brodde O-E. Coexistence of pi- and p2-adrenoceptors in human right atrium. / O-E. Brodde, K. Karad, H-R. Zerkowski, N. Rohm, J.C. Reidemeister // Circ. Res.- 1983- V.53.-P. 752-758.

29. Brodde O-E. Signal transduction mechanisms controlling cardiac contractility and their alterations in chronic heart failure. / O-E. Brodde, K. Karad, H-R. Zerkowski7/Cardiovasc. Res.- 1995-. V. 30.- P. 570-584.

30. Brodde O-E. Human cardiac P-adrenoceptors: both pi- and P2-adrenoceptors are functionally coupled to theadenylate cyclase in right atrium. / O-E. Brodde, N. O'Hara, H-R. Zerkowski, N. Rohm // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1984,-V: 6:-P. 1184-1191.

31. Brodde O-E. P- and a-adrenoceptor agonists and -antagonists in chronicheart failure./O-E. Brodde // Bas. Res. Cardiol.- 1990.-V 85.-P. 57-66.

32. Brodde O-E. pi and p2-adrenoceptors in the human heart: properties, function, and alterations in chronic heart failure. / O-E. Brodde // Pharmacol. Rev. , -1991. - V 43 :-P. '203-242.: •:

33. Brodde O-E. Receptor systems in the non-failing human heart/ O-E. Brodde, A. Broede, A. Daul, K. Kunde//Bas. Res. Cardiol. -1992. -87- P. 1-14.

34. Brodde O-E, Michel M.C. Adrenergic and muscarinic receptors in thehuman heart. / O-E. Brodde, M.C. Michel // Pharmacol .Rev.- 1999.- V .51.- P. 651-689.

35. Brückner R. a-Adrenoceptor-mediated positive inotropic effect of phenylephrine in isolatedhuman ventricular myocardium/ R. Brückner, W. Meyer, A. Mügge, W. Schmitz // Eur. J. Pharmaco. -1984. -V. 1 99.- P. 345-347.

36. Buxton B. F. Characterization and autoradiog-raphic localization of beta-adrenoceptor subtypes in human cardiac tissues./ B. F. Buxton, C. R. Jones, P. Molenaar, R. J. Summers // Br. J. Pharmacol. -1987- V.92. P.299—310.

37. Carbo N. Comparative effects of ß2-adrenergic agonists on muscle waste associated with tumour growth. / N. Carbo, J. Lopez-Soriano, T. Tarrago, O. Gonzalez, M. Llovera, F.J. Lopez-Soriano, J.M. Argiles // Cancer. Lett. 1997.-V .115. P. 113-118.

38. Communal C. Noradrenaline stimulates apoptosis in adult rat ventricular myocytes by activation of b-adrenergic pathway. / C. Communal, K. Singh, D.R. Pimentel, W.S. Colucci // Circulation. -1998. V . 98. P.1329 - 1334.

39. DiPilato L. M., Zhang J. FRETting mice shed light on cardiac adrenergic signaling. Circ.Res. 2006.- V.99 .- № 10.- P. 1021—1023.

40. Dubuis E. Evidence for multiple Src binding sites on the ale L-type Ca2+ channel and their roles in activity regulation/ E. Dubuis, N. Rockliffe, M. Hussain, M. Boyett, D. Wray, D. Gawler // Cardiovasc. Res. 2006. - V. 69. - P. 391-401.

41. Eason M.G. Human a2-adrenergic receptor subtype distribution: widespread and subtype-selective expression of a2C10, a2C4, and a2C2 mRNA in multiple tissues. / M.G. Eason, S.B. Liggett // Mol. Pharmacol. -1993. V. 44. P. 70-75.

42. Emery P.W. Chronic effects of p2-adrenergic agonists on body composition and protein synthesis in the rat./ P.W. Emery, N.J. Rothwell, M.J. Stock, P.D.Winter. // Biosci. Rep. 1984. - V. 4. P. 83-91.

43. Engelhardt S., Hein L., Wiesmann F., Lohse M.J. Progressive hypertrophy and heart failure in b 1-adrenergic receptor transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1999. V. 96. P. 7059 - 7064.

44. Fabiato A. Calcium and cardiac excitation-contraction coupling. / A. Fabiato, F. Fabiato // Annu. Rev. Physiol. -1979. V. 41. - P. 473- 484.

45. Faure C. Quantification of a 1-adrenoceptor subtypes in human tissues by competitive RT-PCR analysis / C. Faure, C.Gouhier, S.Z. Langer, D. Graham // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995 -. V. 213. - P. 935-943.

46. Fujita A. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique/ A. Fujita, J. Cheng, K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009. V. 106. - № 23. - P. 9256-9261.

47. Fulton D. Src kinase activates endothelial nitric-oxide synthase by phosphorylating Tyr-83 / D. Fulton, J. E. Church, L. Ruan, C. Li, S. G. Sood, B. E. Kemp, I. G. Jennings, R. C. Venema // J. Biol. Chem. -2005.- V.280.- № 43. P. 35943—35952:*1 ^ —•

48. Garrett R.P. Body composition of lambs receiving 30 or 60 days of exercise training and (or) fenoterol treatment / R.P. Garrett, K.B. Britain, J.W. Savell, J.W. Edwards, S.B. Smith //Meat. Sci. 1999.- V.52.- P. 235-246.

49. Gauthier C. p3-Adrenoceptors in the cardiovascular system. / C. Gauthier, D. Langin, J-L. Balligand // Trends. Pharmacol. Sci. -2000.- V. 21. -P. 426-431.

50. Gauthier C. Functional (33-adrenoceptor in the human heart. / C. Gauthier, G. Tavernier, F. Charpentier, D. Langin, H. Le Marec // J. Clin. Invest.- 1996. V.98. - P. 556-562.

51. Gazzerro E. Caveolinopathies: from the biology of caveolin-3 to human diseases/ E. Gazzerro, F. Sotgia, C. Bruno, M. P. Lisanti, C. Minetti // Eur. J. Hum. Genet. 2010. - V. 18.- № 2. - P.137-145.

52. Gu X.H. Regulation of b-adrenoceptors in a rat model of heart failure: Effects of perindopril>/vX.H. Gu,-A.R. Kompa, R.J. Summers // J. Cardiovasc. Pharmacol. -1998. V. 32. P. 66- 74.

53. Haase H. Ahnak, a new player in beta-adrenergic regulation of the cardiac L-type Ca2+channel / H.Haase // Cardiovasc. Res. 2007. - V.73. -№ 1. P. 19—25. .

54. Haft' J.I. Cardiovascular injury induced by sympathetic catecholamines. / J.I. Haft //Prog. Cardiovasc. Dis. 1974.- V. 17.- P. 73 - 86.

55. Hague C. Cell surface expression of a lD-adrenergic receptors is controlled by heterodimerization with alB-adrenergic receptors. / C. Hague, M.A. Uberti, Z. Chen, R.A. Hall, K.P. Minneman // J. Biol. Chem. -2004.- V. 279. P. 15541-15549.

56. Hall LP. P2~Adrenoceptor polymorphisms: are they clinically important? / LP. Hall // Thorax. -1996. V. 51.- P. 351-353.

57. Harding S.E. Lack of evidence for 3-adrenoceptor modulation of contractile function in human ventricular myocytes. / S.E. Harding // Circulation. -1997.- V. 96.-P. 1-53.

58. Harding S.E. Mechanisms of p-adrenoceptor desensitisation in the failing human heart. ;/ SiE. Harding, L.A. Brown, D.G. Wynne, C.H. Davies, P.A. Poole-Wilson // Cardiovasc. Res. -1994.- V. 28. P. 1451-1460.

59. Harkins A. B. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo—3./ A. B. Harkins, N. Kurebayashi, S. M. Baylor// Biophysic. J. 1993.- V. 65. - № 2. -P. 865—881.

60. Ianoul A. Imaging nanometer domains of beta-adrenergic receptor complexes on the surface of cardiac myocytes/ Ianoul A., Grant D.D., Rouleau Y. et al. //Nat. Chem, Biol. -2005. -V. 1. -№ 4.- P. 196-202.

61. Iijima T. Modification by manganese ions and verapamil of the responses of the atrioventricular node to norepinephrine / Iijima T., Taira N. // Eur. J. Pharmacol. -1989. -V. 163. P. 357- 360.

62. Ind P.W. Salbutamol enantiomers: early clinical evidence in humans. / Ind P.W. // Thorax. -1997.- V. 52.- P. 839-840.

63. Iwai-Kanai E. a and b-adrenergic pathways differentially regulate cell type-specific apoptosis in rat cardiac myocytes. / Iwai-Kanai E., Hasegawa K., Araki M., Kakita T., Morimoto T., Sasayama S. // Circulation.- 1999.- V.100. P. 305-3!11. " ' ^ .:.

64. Jakob H. Adrenoceptor-mediated changes of action potential and force of contraction in human isolated ventricular heart muscle. / Jakob H., Nawrath H., Rupp J. // Br. J. Pharmacol. -1988.- V. 94. P. 584-590.

65. Johnson M. Mechanisms of action of (32-adrenoceptor agonists. / M. Johnson // Paediatr Respir Rev.- 2001-. V. 2.-№ 1. P. 57-62.

66. Johnson M. The p-adrenoceptor./ M. Johnson // Am J Respir Crit Care Med. 1998.- V. 158.- P. 146-153.iii pci irat ncurL c. 1''.' .

67. Johnson M. The pharmacology of salmeterol./ Johnson M., P.R. Butchers, R.A. Coleman, A.T. Nials, P. Strong, M.J. Summer et al. // Life. Sci., -1993-. V. 52.-P. 2131-2147.

68. Jordan, B.A. Oligomerization of opioid receptors with b 2-adrenergic receptors: a role in trafficking and mitogen-activated protein kinase activation. / Jordan, B.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001.- V. 98.- P. 343-348.

69. Kaumann A.J. Modulation of human cardiac functionthrough 4 adrenoceptor populations. / Kaumann A.J., Molenaar P. // Naunyn-Schmiedeberg's. Arch. Pharmacol.- 1997. V.355.- P. 667-681.

70. Kojima H. Fluorescent Indicators for Imaging Nitric Oxide Production / Kojima H, urano Y, Kikuchi K, Higuchi t, Hirata Y, nagano t. // Angew. chem. Int. ed. engl. -1999.-V. 38,-P. 3209-3212.

71. Kozera L. Caveolae act as membrane reserves which limit mechanosensitive I channel activation during swelling in the rat ventricular myocyte/ Kozera L, White E, Calaghan S. // PLoS. One. -2009.- V. 4. № 12. -P.8312-8362.

72. Kuschel M. Protein-mediated functional compartmentalization of cardiac P2-adrenergic signaling. / Kuschel M, Zhou Y-Y, Cheng H, Zhang S.J, Chen Y, Lakatta E.G., Kuschel M. et al. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 220484-22052. -^ k I i'!>. • .

73. Liggett S.B. Early and Delayed Consequences of (32-Adrenergic Receptor Overexpression in Mouse Hearts.Critical. Role. For Expression. Level. /Liggett S.B.// Am. J. respir. crit. care Med. -2000. -V. 161. P. 197-201.

74. Liu G. Assembly of a Ca2+-dependent BK channel signaling complex by binding to 2 adrenergic receptor/ Liu G., Shi J., Yang L., cao L., Park S.M., cui J., Marx S.O. // eMBO J. -2004. -V. 23. -P. 2196-2205.

75. Liu V. W. Cardiovascular roles of nitric oxide: a review of insights from nitric oxide synthase gene disrupted mice./ Liu V. W., Huang P. L. // Cardiovasc. Res. -2008.--VJ7 (1>~P. 19—29.

76. Lynch G.S. Role of beta-adrenoceptor signaling in skeletal muscle: implications for muscle wasting and disease./ Lynch G.S., Ryall J.G. // Physiol, rev.- 2008. -V. 88. -P. 729-767.

77. Lynch GS. Novel therapies for sarcopenia: ameliorating age-related changes in skeletal muscle. / GS. Lynch // Expert. Opin. Thera. Patents. -2002.-V. 12. P. 11-27.

78. Lynch G.S. Therapies for improving muscle function in neuromuscular disorders./ G.S. Lynch // Exerc. Sport. Sc. Rev. -2001.- V. 29. P. 141148.

79. Lynch G.S. p2-Agonists. In: Performance Enhancing Substances in Sport and Exercise, edited by Bahrke MS and Yesalis CE. Champaign, IL: Human Kinetics.- 2002.- P. 47-64.

80. Johnson M. Molecular mechanisms of p2-adrenergic receptor function, response, and regulation. / M. Johnson. // Journal, of Allergy and Clinical Immunology. -2006- V.l 17.- P.18-24.

81. Mann D.L. Adrenergic effects on the biology of the adult mammalian cardiocyte. / Mann D.L., Kent R.L., Parsons B., Cooper G. // Circulation. -1992-. V.85:'P.790^804J'V C . '

82. McGraw D. W. Molecular mechanisms of beta2-adrenergic receptor functi-on and regulation./ McGraw D. W., Liggett S. B. // Proc. Am. Thorac. Soc. -2005.- V.2 (4). P. 292—296.

83. Meissner G. Ryanodine receptors/Ca+2 release channels and their regulation by endogenous effectors. / Meissner G. // Annu. Rev. Physiol.- 1994.-V. 56. MP. 485^508: H i • !'.1

84. Moensa An L. Beta 3-adrenoreceptor regulation of nitric oxide in the cardiovascular system. / Moensa An L., Ronghua Yang,, Vabren L. Watts, Lili A. Barouch, // Journal of Molecular and Cellular Cardiology. -2010. -V. 48. -P. 10881095.

85. Moore N.G. Anabolic effects of the (32-adrenoceptor agonist salmeterol are dependent on route of administration. / Moore N.G., Pegg G.G., and Sillence M.N. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 1994. V.267.- P. 475- 484.

86. Morris D.P. The alphala-adrenergic receptor occupies membrane raftswith its G protéin effectors but internalizes via clathrin-coated pits/ Morris D.P., Lei B., Wu Y.X. et al. // J. Biol. Chem.- 2008.- V. 283. № 5. -P. 2973-2985.

87. Motomura S., Zerkowski H-R., Daul A., Brodde O-E. On the physiologic role of beta-2 adrenoceptors in the human heart: in vitro and in vivo studies./ Motomura S., Zerkowski H-R., Daul A., Brodde O-E. // Am. Heart. J. -1990. V. 19.-P. 608-619.

88. Mugge A. Effects of the ^-adrenoceptor agonists fenoterol and salbutamol on force of contraction in isolated human ventricular myocardium./ Mugge A., Posselt D., Reimer U., and Scholz. H. // Klin Wochenschr. 1985.-V.63.-P.'26-31y< -V-iuiY.

89. Mugge A. Effects of the beta2-adrenoceptor agonists fenoterol and salbutamol on force of contraction in isolated human ventricular myocardium/ Miigge A., Posselt D., reimer u., Schmitz W., Scholz H. // J. Mol. Med. -1985. -V. 63. -P. 26-31.

90. Muriel O. Phosphorylated filamin A regulates actin-linked caveolae dynamics/ Muriel O., Echarri A., Hellriegel C. et al. // J. Cell Sci. -2011.- V. 124. № 16.-P. 2763-2776.

91. Odnoshivkina Yu.G. The effects of p2-adrenoreceptor activation on the contractility, Ca-signals and nitrix oxide production in the mouse atria/ Yu.G. Odnoshivkina; A'.M/Petrov, A.L. Zefirov // Acta Naturae, 2011, V.3, №2. P. 103112.

92. Onaran H.O.Subunits of guanine nucleotide-binding proteins and regulation of spontaneous receptor activity: thermodynamic model for the interaction between receptors and guanine nucleotide-binding protein subunits. /

93. Onaran H.O., Costa T., Rodbard D. // Mol Pharmacol. -1993.- V.43.- P. 245-256.

94. Pak M.D. Anom-alous behavior of CGP 12177 A on pi-adrenergic receptors. / Pak M.D., Fishman P.H. // J Rec Signal Transduct Res .-1996.- V.16. -P. 1-23. .

95. Park P.S-H. Diversifying the repertoire of G protein-coupled receptors through oligomerization. / Park P.S-H. and Palczewski, K. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -2005.- V.102. P. 8793-8794.

96. Parker JiD. Effects of beta-adrenergic stimulation with dobutamine on isovolumic relaxation in the normal and failing human left ventricle. / Parker J.D.,1.ndzberg J.S, Bittl J.A, Mirsky I, Collucci W.S. // Circulation.- 1991.- V.84. -P.1040 1048.

97. Patterson A.J. Protecting the myocardium: a role for the b 2-adrenergic receptor in the heart. / Patterson, A.J. et al. // Crit. Care Med. -2004 32, P. 1041-1048.

98. Pavoine C. p2-adrenergic signaling in human heart: shift from the cyclic AMP to the arachidonic acid pathway. / Pavoine C. et al. // Mol. Pharmacol, 64 (2003), pp. 1117-1125.

99. Peleg G. Single-molecule spectroscopy of the be-ta(2) adrenergic receptor: observation of conformational substates in a membrane protein. / Peleg

100. G, Ghanouni P, Kobilka B. K, Zare R. N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. 98 (15): 8469—8474. rr :. -:

101. Perala M. Presynaptic imidazoline receptors and a2-adrenoceptors in the human heart: discrimination by clonidine andmoxonidine./ Perala M, Hirvonen

102. H, Kalimo H, Ala-Uotila S, Regan JW, Akerman KEO, Likungu J, Molderings GJ, Gothert M. • //••Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol (1996) 354: 689-692.

103. Ray K.P. Phosphorylation of the inhibitory subunit of troponin and its effect on the calcium'dependence of cardiac myofibril adenosine triphosphatase./ Ray KP, England PJ. // FEBS Lett. 1976. V. 70. P. 11-16.

104. Reishaus E. Mutations in the gene encoding for the p2-adrenergic receptor in normal and asthmatic subjects. / Reishaus E, Innis M, Maclntyre N, Liggett SB. // Am J Respir Cell Mol Biol. 1993. V. 8.- P. 334-339.

105. Reuter H. Calcium channel modulation by neurotransmitters, enzymes and drugs./ReuterH. // Nature 1983. 301:569 574.

106. Ringdahl N. Onset and duration of action of single doses of formoterol inhaled via Turbuhaler in mild to moderate asthma. / Ringdahl N., Derom E, Pauwels R. //Eur Respir J. 1995;8(suppl):68S.

107. Rochais F. A specific pattern of phosphodiesterases controls the cAMP signals generated by different Gs-coupled receptors in adult rat ventricular myocytes / Rochais F., Abi-Gerges A., Horner K. et al. // Circ. Res. 2006. V. 98. №8. P. 1081-1088.

108. Rougeti C.l,-Beta3-adrenoceptor is the predominant beta-adrenoceptor subtype in human myometrium and its expression is up-regulated in pregnancy. /

109. Rouget C., M. Bardou, M. Breuiller-Fouche, C. Loustalot, H. Qi, E. Naline et al. // J. Clin. Endocrinol Metab, 90 (2005), pp. 1644-1650.

110. Rump L.C. Dopaminergic and a-adrenergic control of neurotransmission in human right atrium. / Rump L.C., Riera-Knorrenschild G., Schwertfege.r E, Bohmann C, Spillner G,Schollmeyer P. // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1995b. 26: 462-470.

111. Rump L.C. a2C-Adrenoceptor-modulated release of noradrenaline in human right atrium. / Rump LC, Bohmann C, Schaible U, Schöllhorn J, Limberger N. // Br J Pharmacol (1995a)l 16: 2617-2624.

112. Seddon M. Cardiomyocytes as effectors of nitric oxide signaling/ Seddon M., Shah A.M., casadei B. //cardiovasc. res. 2007. V. 75. P. 315326.

113. Sengupta P. Lipid rafts, fluid/fluid phase separation, and their relevance to plasma membrane structure and function/ Sengupta P., Baird B., Holowka D. '■'//■ Semin. Cell Dev. Biol. 2007. V. 18. № 5. P. 583-590.

114. Shcherbakova O.G. Organization of beta-adrenoceptor signaling compartments by sympathetic innervation of cardiac myocytes/ Shcherbakova O.G., Hurt C.M., Xiang Y. et al. // J. Cell Biol. 2007. V. 176. № 4. P. 521-533.

115. Shizukuda Y. Subtype specific roles of b -adrenergic receptors in apoptosis of adult rat ventricular myocytes. / Shizukuda, Y. and Buttrick, P.M. // J. Mol. Cell. Cardiol. (2002) 34, 823-831.

116. Sillence M.N. Effects of clenbuterol on growth in underfed cattle. / Sillence M.N., Matthews ML, Badran TW, and Pegg GG. // Aust J Agric Res 2000.51:401-406.

117. Sillence M.N.Ligand binding properties of putative ß3-adrenoceptors compared in brown adipose tissue and in skeletal muscle membranes. / Sillence M.N., Moore N.G., Pegg GG, and Lindsay DB. // Br J Pharmacol 1993. 109: 1157-1163." "

118. Simons K. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights/ Simons K.,GerlMJ. //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. V. 11. № 10. P. 688-699.

119. Simpson P. NA-stimulated hypertrophy of cultured rat myocardial cells is an a -adrenergic response./ Simpson P. // J Clin Invest (1983) 72: 732738:' !''-:>nnac.»l 344: 4-iv ; : v- )1

120. Skomedal T. Demonstration of alpha adrenoceptor-mediated inotropic effect of nor-epinephrine in human atria. / Skomedal T., Aass H., Osnes J-B, Fjeld NB, Klingen G, Langslet A, Semb G. // J Pharma-col Exp Ther (1985) 233: 441446. .

121. Solaro R.J. Phosphoiylation of troponin I and the inotropic effect of adrenaline in the perfused rabbit heart./ Solaro R.J., Moir A.J., Perry S.V. // Nature. 1976; 262: 615-617.

122. Stiles G.L. Human cardiac beta-adrenergic receptors: subtype heterogeneity-delineated by direct radioligand binding. / Stiles G.L., Taylor S, Lefkowitz RJ. // Life Sei (1983) 33: 467-473.

123. Strosberg A.D. Structure and function of the ß3-adrenergic receptor./ Strosberg A.D. // Annu Rev Pharmacol Toxicol (1997) 37: 421-450.

124. Sun Y. Dosage-dependent switch from G protein-coupled to G protein-independent signaling by a GPCR. / Sun Y., Huang J., Xiang Y., Bastepe M., Juppner H., Kobilka B. K., Zhang J. J.// EMBO J. 2007.26 (1) : 53—64.

125. Suzuki S. Effects of mechanism of fenoterol on fatigued canine diaphragm./ Suzuki S, Numata H, Sano F, Yoshiike Y, Miyashita A, and Okubo T.

126. Am Rev Respir Dis 137: 1048-1054.

127. Suzuki S. Brain-derived neurotrophic factor regulates cholesterol metabolism for synapse development / Suzuki S., Kiyosue K., Hazama S. et al. // J. Neurosci. 2007. V. 27. № 24. P. 6417-6427.

128. SwaminathvG.' Sequential Binding of Agonists to the 02 Adrenoceptor / Swaminath G., Xiang Y., Lee t.W., Steenhuis J., Parnot c., Kobilka B.K. // J. Biol. chem. 2004. V. 279. P. 686-691.

129. Swift S. M. Pleiotropic beta-agonist-pro-moted receptor conformations and signals independent of intrinsic activity. / Swift S. M., Schwarb M. R., Mihlbachler K. A:; Liggett S. B. // Am. J. Respir. Cell.Mol. Biol. 2007.36 (2).: 236—243.

130. Tada M. Phosphorylation of a 22,000-Dalton component of the cardiac sarcoplasmic reticulum by adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase./ Tada M., Kirchberger M.A., Katz AM. // J Biol Chem. 1975;250:2640-2647.

131. Vatner S.F. Regulation of large coronary arteries./ Vatner S.F, Young M.A. // circ. res. 1986. V. 59. P. 579-596.

132. Wang G. Nitric oxide regulates endocytosis by S-nitrosylation of dynamin/ Wang G, Moniri n.H, Ozawa K, Stamler J.S, Daaka Y // Proc. natl. Acad. Sei. uSA. 2006. V. 103. P. 1295-1300.

133. Wenzel-Seifert K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors/ WenzelSeifert K, Seifert r. // Mol. Pharmacol. 2000. V. 58. 46. P. 954-966.

134. Woo A.Y. Stereochemistry of an Agonist Determines Coupling Preference of p2-Adrenoceptor to Different G Proteins in Cardiomyocytes/ Woo A.Y., Wang t.B., Zeng X., Zhu W./Mol. Pharmacol. 2009. V. 75. P. 158-165.

135. Xiang Y. Phosphodiesterase 4D is required for p2-adrenoceptor subtype-specific signaling in cardiac myocytes. / Xiang Y. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102 (2005), pp. 909-914.

136. Xiang Y. The PDZ-binding motif of the beta2-adrenoceptor is essential for physiologic signaling and trafficking in cardiac myocytes. / Xiang Y., KobilkaB. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003.100 (19) : 10776—1781

137. Xiang Y.K. Compartmentalization of beta-adrenergic signals in cardiomyocytes/ Xiang Y.K. // Circ. Res. 2011. V. 109. № 2. P. 231-244.

138. Xiao R.P. Subtype-specific p-adrenoceptor signaling pathways in the heart and their potential clinical implications. / Xiao R.P. Zhu W, Zheng M, Chakir K, Bond R, Lakatta E.G.// Trends Pharmacol. Sci., 25 (2004), pp. 358-365.

139. Xiao RP, Functional coupling of the b 2-adrenoceptor to a pertussis toxin-sensitive G protein in cardiac myocytes. / Xiao RP, Ji X, Lakatta EG. // Mol Pharmacol 1995.47:322-329.

140. Xiao R-P. Gi protein-mediated functional compartmen-talization of cardiac b2-adrenergic signaling. / Xiao R-P. // J Biol Chem 1999a.274:22048-22052.

141. Xiao R-P. Subtype-specific al- and P-adrenoceptor signaling in the heart / R-P Xiao, W. Zhuc, M. Zheng, Ch. Cao, Y. Zhang, E.G. Lakatta, Q. Han // TRENDS in Pharmacol. Sci. 2006 - V. 27. - N.6.- P. 330-337.

142. Xu Z. Exogenous nitric oxide generates ROS and induces cardioprotection: involvement of PKG, mitochondrial KATP channels, and ERK/ Xu Z.,-Ji-X.,.BoyseniP.G:u/AAm. J. Physiol. Heart, circ. Physiol. 2004. V. 286. P. 1433-1440.

143. Xu J. Heterodimerization of a2A- and b 1-adrenergic receptors./ Xu, J. // J.Biol. Chem.-2003- V. 278.-P. 10770-10777.

144. Yan Y. Bidirectional regulation of Ca2+sparks by mitochondriaderived reactive "oxygen species in cardiac myocytes. / Yan Y., Liu J., Wei C., Li K., Xie W., Wang Y., Cheng H. // Cardiovasc. Res. 2008. V.77. P.432—441.

145. Zaugg M. b-adrenergic receptor subtypes differentially affect apoptosis in adult rat ventricular myocytes. / Zaugg M, Xu W, Lucchinetti E, Shafiq SA, JamalLNZ, Siddiqui.MA. // Circulation.- 2000. V. 102. - P. 344 -350.

146. Zhang R. Cardiac troponin I phosphorylation increases the rate of cardiac muscle relaxation./ Zhang R., Zhao J., Mandveno A., Potter J.D. // Circ Res. 1995.-V. 76.-P. 1028-1035.

147. Zhou Y.Y. Spontaneous b2-Adrenergic Signaling Fails To Modulate L-Type Ca2+ Current in Mouse Ventricular Myocytes./ Zhou Y.Y., cheng H., Song L.S., Wang D., Lakatta e.G., Xiao r.P. // Mol. Pharmacol. 1999. V. 56. P. 485-493.

148. Zhu W. The enigma of b 2-adrenergic receptor Gi signaling in the heart: The good, the bad, and the ugly./ Zhu W., Zeng X., Zheng M., Xiao R. P. // Circ; Res. 2005. V. 97 (6). P. 507—509.

149. Zhu W.Z. Heterodimerization of b 1-and b 2-adrenergic receptor subtypes optimizes b -adrenergic modulation of cardiac contractility. / Zhu W.Z. // Circ. Res. 2005;. V-OJ-iP,'244-251.

150. Zhu W.Z. Dual ■ modulation of cell survival and cell death by b 2-adrenergic signaling in adult mouse cardiac myocytes. / Zhu W.Z. Zheng M., Koch W.J., Lefkowitz r.J., Kobilka B.K. // Proc. Natl. Aca d. Sci. U. S. A. 2001. V.98. P. 1607-1612.

151. Zierhut W. Significance of myocardial a and p-adrenoceptors in catecholamine-induced cardiac hypertrophy. / Zierhut W., Zimmer H-G. // Circ. Res. 1989. V.65. P.1417-1425.

152. Zou Y. Both Gs and Gi proteins are critically involved in isoproterenol-induced cardiomyocyte hypertrophy./ Zou Y., Komuro I., Yamazaki T., Kudoh S., Uozumi H., Kadowaki T., Yazaki Y.// J. Biol. Chem. 1999b. V.274. P.9760- 9770.