Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции сократимости миокарда в модели болезни Альцгеймера

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции сократимости миокарда в модели болезни Альцгеймера"

На правах рукописи

Леушина Алина Владимировна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИМОСТИ МИОКАРДА В МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

19 ФЕВ 2015

005559313

Казан ь-2015

005559313

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Мухамедьяров Марат Александрович -

кандидат медицинских наук, доцент

Научный консультант: Зефиров Андрей Львович - доктор

медицинских наук, член-корреспондент РАН, профессор

Официальные оппоненты:

Тарасова Ольга Сергеевна - доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета ФГОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова» (г. Москва)

Маслюков Петр Михайлович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Ярославль)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина» (г. Москва).

Защита состоится 31 марта 2015 года в 12:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.28 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Левобулачная, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» www.kpfu.ru

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук,

профессор

УСег^Л Т.А. Аникина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Болезнь Алъцгеймера — это нейродегенеративное заболевание, проявляющееся прогрессирующим снижением когнитивных функций. В основе патогенеза болезни Альцгеймера лежит избыточная продукция и накопление ß-амилоидного пептида (рАП). ßAIT полимеризуется с образованием длинных нерастворимых фибрилл, которые являются ключевым компонентом амилоидных (сенильных) бляшек, формирующихся в мозге у пациентов с болезнью Альцгеймера, а также у трансгенных мышей с генетической моделью болезни Альцгеймера (Crouch P.J. et al., 2008, Querfurth H.W., 2010, LaFerla F.M., 2010). В последние годы появились сведения о взаимосвязи деменции альцгеймеровского типа с сердечно-сосудистой патологией. Выявлена связь между болезнью Альцгеймера и сердечно-сосудистыми нарушениями, такими как фибрилляция предсердий, тромбозы, гипертонии, гипотонии, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, низкий сердечный индекс, и клапанная патология (Stampfer M.J., 2006, van Oijen М. et al., 2007, Luchsinger J.A., 2008, de la Torre J.C., 2012). Известно, что у пожилых людей перфузия головного мозга снижается, а заболевания сердечно-сосудистой системы вызывают дополнительное снижение мозгового кровотока, что увеличивает вероятность развития болезни Альцгеймера. Данные также свидетельствуют о том, что постоянная гипоперфузия мозга может вызывать синтез амилоидного белка, который рано или поздно приведет к нейродегенератавным поражениям, связанных с образованием ß-амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков (Barker R. et al., 2014, Miklossy J., 2003).

Как известно, сердечная деятельность находится под контролем автономной нервной системы (т.е. симпатической и парасимпатической), которая действует через адренорецепторы (Абрамочкин Д.В., 2006) и мускариновые рецепторы (М-ХР) (Абрамочкин Д.В. и др., 2006, Ноздрачев А.Д., 1983). Функции сердца могут регулироваться такими факторами, как старение и болезнь (Brodde O.E. et al., 1999). Исследования показали, что нормальное старение снижает мозговой ток крови примерно на 20% в возрасте 60 лет, по сравнению с 20-летним возрастом (Leenders K.L. et al., 1990), так что любая дополнительная нагрузка, снижающая перфузию головного мозга может привести к повреждению или гибели уязвимых нейронов (De La Torre J.C. et al., 2012).

При болезни Альцгеймера в различных областях головного мозга наблюдается снижение уровня р2-адренорецепторов (Parameshwaran К. et al., 2008), а также происходит гибель холинергических нейронов и уменьшение количества холинорецепторов (Репу Е. К. et al., 1981, Coyle J.R. et al., 1983).

В 9-месячном возрасте у трансгенных мышей (APP/PS1 - трансгенные мыши, в геном которых встроены мутантные гены человека белка предшественника амилоида и пресеншшна 1) обнаруживается высокий уровень отложений ß-амилоидного пептида в мозге (Taniuchi N., et al., 2007). Учитывая,

что гены пресенилина 1 также экспрессируются в сердце, можно полагать, что мутации этих генов при болезни Альцгеймера влияют на работу сердца (Иака^та М., 2004). Однако вопрос о том, что именно нарушается в работе сердца остается открытым.

Несмотря на большое количество экспериментальных данных, механизмы взаимосвязи между болезнью Альцгеймера и сердечно-сосудистой патологией неясны. Поэтому изучение рецепторных механизмов холино- и адренергической регуляции сократимости миокарда может внести существенный вклад в понимание патогенеза болезни Альцгеймера и взаимосвязи механизмов альцгеймеровской нейродегенерации и сердечнососудистых нарушений.

Цель и задачи исследования: Целью исследования явилось изучение механизмов регуляции сократимости миокарда в модели болезни Альцгеймера на животных. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать амплитудно-временные параметры сократительных ответов миокарда желудочков в моделях болезни Альцгеймера на животных.

2. Провести верификацию генетической модели болезни Альцгеймера путем оценки морфологических изменений, наличия Р-амилоидных отложений в ткани мозга и миокарда, выявления поведенческих нарушений.

3. Исследовать эффекты разных концентраций норадреналина и карбахолина на силу сокращения изолированных предсердий и желудочков трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера.

4. Изучить рецепторные механизмы холинергической регуляции сократимости миокарда у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера.

5. Исследовать рецепторные механизмы адренергической регуляции сократимости миокарда трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера.

6. Исследовать иммуноэкспрессию Р-адренорецепторов в миокарде трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера.

7. Исследовать иммуноэкспрессию М-холинорецепторов в миокарде трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера.

Положения, выносимые на защиту:

1. У трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера наблюдается выраженное нарушение процессов холинергической регуляции сократимости миокарда желудочков, проявляющееся в положительной инотропной реакции миокарда на карбахолин и связанное с повышением экспрессии Мг холинорецепторов в миокарде.

2. У трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера происходит нарушение процессов адренергической регуляции сократимости миокарда желудочков, что проявляется в отрицательной инотропной реакции миокарда

на норадреналин и связано со снижением экспрессии и изменением физиологической активности ß-адренорецепторов.

3. При сравнении двух моделей болезни Альцгеймера (ß-амилоидной и генетической) было установлено, что для исследования дисфункции миокарда при данной патологии наиболее адекватной является генетическая модель болезни Альцгеймера на трансгенных мышах, экспрессирующнх химерный мышиный/человеческий белок предшественник амилоида и мутантный человеческий пресенилин-1 в возрасте 8-10 месяцев.

Научная новизна исследования

В исследовании впервые были обнаружены нарушения сократимости миокарда у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера. Был произведен подробный анализ влияния разных концентраций агониста ß-адренорецепторов норадреналина на предсердия и желудочки в трех группах мышей. Был выявлен отрицательный инотропный эффект миокарда желудочков у трансгенных мышей в ответ на агонисты ß-адренорецепторов, что может объясняться изменением взаимосвязи р2-адренорецепторов с различными внутриклеточными сигнальными каскадами.

При исследовании влияния разных концентраций агониста М-холинорецепторов было установлено, что карбахолин оказывает положительный инотропный эффект на миокард желудочков трансгенных мышей, в то время как у мышей дикого типа такого же возраста и мышей дикого типа 3-4 месяцев наблюдается отрицательная реакция. На фоне действия селективного ингибитора Mi-холинорецепторов (галамин) положительная реакция карбахолина на желудочки трансгенных мышей снижалась, а на фоне селективного ингибитора Мгхолинорецепторов (пирензепин) она исчезала. В ходе выполнения исследования была предложена и подтверждена гипотеза о том, что при аппликации карбахолина происходит активация Мг холинорецепторов, которых у трансгенных мышей увеличенное количество в миокарде желудочков, что подтверждается иммуногистохимическим исследованием.

Научно-практическая значимость исследования

Полученные данные имеют теоретический характер, дополняя современные представления о механизмах регуляции функций сердца в модели нейропатологии. Полученные нами результаты значительно расширяют современные представления о патогенезе болезни Альцгеймера и ее сердечнососудистых проявлениях. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, кардиологов, неврологов, психиатров. Полученные данные используются при чтении лекций по клинической физиологии на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 10-04-00883, №12-04-31502-мол-а, грант Президента РФ № НШ-4670.2012.4, № НШ-5250.2010.4, грант концерна Carl Zeiss.

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при непосредственном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях и съездах: на XVI и XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2011, 2012); 7-ом и 8-ом Международном Междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Крым, Украина, 2011, 2012); Пятой Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2012); 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых: «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013); 88-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2014); XII международная научная школа-конференция "Адаптация растущего организма" (Казань, 2014).

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 23 печатных работы, в том числе 4 публикации в рецензируемых журналах (из списка ВАК). Материалы диссертации неоднократно доложены на ежегодных научных конференциях в Казанском государственном медицинском университете. Полученные данные внедрены в учебный процесс на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета и в Институте фундаментальной медицины и биологии КФУ.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация объемом 127 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 284 источников, из них 8 - отечественных и 276 -иностранных авторов. Диссертация содержит 24 рисунка и 1 таблицу.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования

Эксперименты проводились на полосках миокарда предсердий и желудочков мышей и крыс. Для исследования были взяты две модели болезни Альцгеймера - 1) бета-амилоидная модель и 2) трансгенные мыши. В качестве модели болезни Альцгеймера использовались трансгенные мыши генотипа В6СЗ-Т§(АРР695)85БЬо Tg(PSENI)85Dbo, экспрессирующие химерный мышиный/человеческий белок, предшественник амилоида и мутантный

человеческий пресенилин-1. Обе мутации связываются с развитием ранних форм болезни Альцгеймера. В мозге мышей, начиная с 6-7 месячного возраста, обнаруживаются отложения ß-амилоидного пептида — один из основных признаков болезни. Линия приобретена в The Jackson laboratory (США) и содержится в питомнике лабораторных животных «Пущино» (г. Пущино, Московская область). Эксперименты проводились в трех группах мышей -трансгенные мыши с моделью болезни Альцгеймера 8-10 месячного возраста [далее как APP/PS1 (8-10)], а также мыши дикого типа 3-4 месячного возраста [далее как дикий тип (3-4)] и мыши дикого типа 8-10 месячного возрастов [далее как дикий тип (8-10)]. Бета-амилоидная модель - производилась аппликация ß-амилоидного пептида (фрагмент 25-35, обладающий нейротоксическими и нейротрофическими эффектами) в концентрации — в перфузионный раствор.

Все эксперименты выполнены при постоянной наружной перфузии препарата раствором Кребса для теплокровных животных следующего состава (мМоль/л): NaCl - 125; KCl - 2.5; СаС12 -2; NaH2P04 - 1; MgCl2 - 1; глюкоза -11. Данный раствор насыщался кислородом. pH растворов поддерживался на уровне 7.35—7.40, температура 22 °С.

Поведенческие тесты. Для регистрации сократительных ответов миокарда нам нужны были трансгенные мыши с моделью болезни Альцгеймера на клинической стадии заболевания, а чтобы убедиться в наличии этой стадии мы проводили поведенческие тесты. Были сформированы 2 экспериментальные группы: мыши дикого типа (8-10) (п=15) и APP/PS1 (8-10) мыши (п=15).

Т-образный лабиринт. Для исследования пространственной памяти мышей был использован Т-образный лабиринт («Открытая Наука», Москва). В ходе эксперимента мыши были ограничены в потреблении пищи. В ходе обучения каждый день мыши проходили по 6 пар тренировочных испытаний. В первом (принудительном) испытании один из рукавов лабиринта был закрыт, и мышь шла в открытый (где находилась пища). Во втором (свободном) испытании оба рукава были открыты, но пища находилась в противоположном, то есть ранее закрытом рукаве. Когда два испытания даются с коротким временным промежутком, во второй раз животное склонно выбрать рукав, не посещенный ранее, что свидетельствует о памяти первого выбора. Этот феномен называется «спонтанной альтернацией» (Deacon et al., 2006).

Оценка морфологического состояния и наличия ß-амилондных отложений в головном мозге и миокарде мышей. Из препаратов миокарда левого желудочка и головного мозга (в качестве контроля) мышей дикого типа (8-10) и APP/PS1 (8-10) мышей готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином для общей оценки состояния органа. Качественную оценку ß-амилоидных отложений проводили путем окраски срезов флуоресцентным красителем тиофлавин S (возбуждение 430 нм, эмиссия >455 нм) по стандартной методике (Elghetany et al., 1988). Препараты визуализировали на микроскопе Olympus BX51WI. Для оценки флуоресценции тиофлавина S использовали УФ-фильтр.

Миография. Регистрацию сократительных ответов миокарда проводили при помощи стандартной миографической методики в изометрическом режиме на 4-х канальной установке PowerLab (AD Instruments, Австралия), с датчиком силы MLT 050/D (AD Instruments, Австралия). Препараты миокарда размером в несколько миллиметров погружали в экспериментальную ванночку объемом 20 мл, заполненную стандартным перфузионным раствором Кребса для теплокровных животных. Сократительные ответы ткани вызывали путем стимуляции электрическими импульсами силой 10 В, длительностью 5 мс, с частотой б имп/мин, при помощи серебряных электродов. В процессе эксперимента осуществляли аэрацию раствора в ванночке и поддерживали pH на уровне 7.2-7.4. После погружения препарата в ванночку следовал период приработки длительностью 60 минут, в ходе которого мышечным волокнам постепенно придавалось оптимальное напряжение. Запись кривой регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения "Chart 5.5". В каждом сократительном ответе анализировали амплитуду, время укорочения и время расслабления. Сигналы обрабатывали с помощью программы Chart или Elf (автор A.B. Захаров), силу сокращения определяли в миллиньютонах.

Иммуногистохимия*. Проводили иммунофлуоресцентное окрашивание правого и левого предсердия, правого желудочка APP/PS1 (8-10) мышей, а также мышей дикого типа (3-4) и мышей дикого типа (8-10). Фиксация препаратов осуществлялась в расправленном состоянии в 2%-ом растворе формальдегида в течение 1 часа. Для идентификации антигена препараты инкубировали с первичными антителами к ßr или р2-адренорецепторам (поликлональные кроличьи антитела к Р1/р2-адренорецепторам, Abeam, Великобритания, 1:200), к Мг или М2-холинорецепторам (поликлональные кроличьи антитела к Ml /М2-холинорецепторам, alomone labs, Израиль, 1:100) в течение ночи при 4°С. Промывали в фосфатно-солевом буфере и затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями Alexa 555 (Invitrogen, США, 1:100) в течение 2 часов при комнатной температуре. Для визуализации ядер клеток препараты дополнительно окрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре раствором 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорида (краситель DAPI, Sigma, США, 1:50000). Окрашенные срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, изучение и оцифровку изображений проводили при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 510-Meta (Carl Zeiss). Для всех иммуногистохимических реакций выполняли отрицательные контроли с исключением из инкубационной среды первичных или вторичных антител путём их замены на 5% сыворотку осла и 1% сыворотку быка. Анализ проводился в полях зрения размером 41x41 мкм при увеличении

*

Эксперименты по шшуногистохимии выполнены совместно с Л. Ф. Нуруллиным (,к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биофизики синоптических процессов КИББ КНЦРАН)

хбЗ. Обработка изображения производилась в программе Adobe Photoshop CS6. Для каждого поля зрения вычислялось количество светящихся точек (пятен), средняя площадь точек (мкм2) и общая площадь точек (мкм2). Для каждой экспериментальной серии проводились усреднения по 8-10-ти полям зрения.

Статистическая обработка. Статистический анализ проводили при помощи программы Origin 9. Результаты измерений представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (п - число независимых опытов). Достоверность различий определяли с помощью t - критерия Стьюдента (Лакин, 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Верификация модели болезни Альцгеймера на животных

Исследование пространственной памяти в Т-образном лабиринте. Мышам дикого типа (8-10) для достижения критерия обученности в среднем было необходимо 10 дней (на 10-ый день обучилось 42,5% мышей, на 14-й день - 72,5%) (Рисунок 1). APP/PS1 (8-10) мыши обучались достоверно дольше в сравнении с мышами дикого типа (8-10) - за 13,3±0,3 дней. При этом процентное количество обучившихся APP/PS1 (8-10) мышей было достоверно ниже в сравнении с мышами дикого типа (8-10): на 10-ый день обучилось 12%, на 14-ый день 15,2 %.

Таким образом, нами было выявлено нарушение пространственной памяти у APP/PS1 (8-10) мышей, выражающееся в увеличении времени обучения и уменьшении количества обучившихся в сравнении с мышами дикого типа (8-10).

Оценка морфологического состояния и наличия ß-амилоидных отложений в головном мозге и миокарде мышей. Было установлено, что морфологическая картина головного мозга APP/PS1 (8-10) мышей соответствует патологии Альцгеймеровского типа, о чем свидетельствует атрофия ткани мозга, проявляющаяся расширением желудочков, а также наличие амилоидных бляшек (Рисунок не представлен). При окраске тиофлавином S в гиппокампе и коре головного мозга APP/PS1 (8-10) мышей выявлены множественные светящиеся пятна неправильной округло-звездчатой формы - амилоидные бляшки (Рисунок 2А). При этом в срезах мозга мышей дикого типа (8-10) и (3-4) амилоидные бляшки отсутствовали. Таким образом, при анализе срезов сердца мышей дикого типа (8-10) обнаружено, что строма миокарда находится в состоянии отека без воспалительной инфильтрации. Кардиомиоциты с выраженной поперечной исчерченностью, четкими ядрами, сосуды умеренно малокровны. Морфологическая картина срезов препаратов APP/PS1 (8-10) мышей в целом сходна, однако в отдельных сосудах миокарда отмечались скопления мелкозернистых базофильных масс. При окраске срезов миокарда на тиофлавин S амилоидные бляшки не выявлялись ни в одной группе мышей (Рисунок 2Б).

Таким образом, с применением морфологических и поведенческих методов исследования у 8-10 месячных трансгенных мышей с моделью болезни

День эксперимента

Рисунок 1 - Динамика обучаемости в Т-образном лабиринте. На рисунке показано количество обучившихся мышей за 14 дней. Мыши дикого типа (8-10) -черные квадраты, АРР/Р81 (8-10) мыши - белые квадраты.

Альцгеймера были обнаружены выраженные нарушения пространственной памяти и повышение тревожности, наличие отложений Р-амилоидного пептида в гиппокампе и коре головного мозга, а также их отсутствие в миокарде, что свидетельствует об адекватности выбранной модели и возраста мышей для изучения симптомной стадии болезни Альцгеймера.

Мыши дикого типа АРР/РБ1 мыши

Амплитудно-временные параметры сократительных ответов миокарда мышей с моделью болезни Альцгеймера. В контрольных условиях после приработки сила сокращения желудочков у мышей дикого типа (3-4) составила 0,66±0,12мН (п=15) (Рисунок ЗА). У мышей дикого типа (8-10) и АРР/Р81 (8-10) мышей сила сокращения желудочков оказалась достоверно ниже и составила 0,3±0,05мН (п=12, р<0,05) и 0,39±0,012мН (п=12, р<0,05), соответственно. Достоверных отличий во временных параметрах сокращения в сравнении с мышами дикого типа (3-4) выявлено не было (Рисунок не представлен).

Сила сокращения предсердий в группах мышей достоверно не отличалась (п=15) (Рисунок ЗБ). Временные параметры сокращения предсердий мышей дикого типа (8-10) и АРР/Р81 (8-10) мышей достоверно не отличались от мышей дикого типа (3-4) (Рисунок не представлен).

Таким образом, нами обнаружено снижение амплитуды сокращений миокарда желудочков у АРР/Р81 (8-10) мышей по сравнению с мышами дикого типа (3-4) и мышами дикого типа (8-10). Это может объясняться тем, что у

Рисунок 2 - Картины флуоресценции красителя

тиофлавин 8. На микрофотографиях А показаны срезы гиппокампа (увеличение 10х), Б - срезы миокарда желудочка (увеличение 60х) мышей дикого типа (8-10) (слева) и АРР/Р81 (8-10) мышей (справа).

трансгенных мышей происходит нарушение гомеостаза внутриклеточного Са + (Davidson,1994; Macmanus,2000; Price,1998). Возможно, за счет механизмов, связанных со снижением выхода внутриклеточного Са2+ из саркоплазматического ретикулума, изменением экспрессии кальциевых регуляторных белков (Са2+-АТФаз саркоплазматического ретикулума и натрий-кальциевого насоса). Также, возможно, происходит изменение чувствительности миофиламентов (актина и миозина) к ионам Са2+ (Turdi, 2009).

Б 1,00,9-

! ■ Нп

■ Ш: m

Рисунок 3 — Амплитудные параметры сократительных ответов миокарда мыши с моделью болезни Альцгеймера. А - желудочки, Б - предсердия. Серые столбики - мыши дикого типа (3-4), черные столбики - мыши дикого типа (8-Ю) и белые столбики - АРР/Р81 (8-10).

Влияние р-амилоидного пептида на амплитудные и временные параметры сокращения миокарда желудочков мышей дикого типа (3-4).

Аппликация Р-амилоидного пептида ( 10~6М) вызывала увеличение силы сокращения желудочков мышей дикого типа (3-4) относительно контрольных значений. В контроле она составила 2,7±0,7 мН (п=24, р>0.05) (Рисунок 4А).

При регистрации временных параметров сокращения миокарда было установлено, что аппликация РАП вызывает достоверное уменьшение фазы расслабления (п=24, р<0.05) (Рисунок не представлен) и увеличение скорости расслабления миокарда желудочков (Рисунок ЗБ). Скорость расслабления увеличивалась на протяжении всего эксперимента и к 120 минуте составила 2,13±0,27 г/с (п=24, р<0.05).

Таким образом, нами было обнаружено, что РАП уменьшает фазу расслабления и увеличивает скорость расслабления (т.е оказывает люзитропный эффект) миокарда желудочков у мышей дикого типа (3-4). Увеличение скорости расслабления миокарда желудочков, возможно, может происходить за счет усиленной работы кальциевых насосов. В литературе есть данные о том, что у АРР / PS1 мышей происходит снижение эндогенного ингибитора Са2+- АТФазы саркоплазматического ретикулума (фосфоламбан) (Turdi et al., 2009). Возможно, это снижение может вызвать изменение гомеостаза внутриклеточного Са2+ и повлиять на сократительную функцию кардиомиоцитов (Bers, 2002). Исходя из этих данных, можно сделать

предположение, что при аппликации р-амилоидного пептида на миокард желудочков мышей, полученный нами положительный люзитропньгй эффект возникает за счет разрушения (или изменение экспрессии) эндогенного ингибитора Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума (фосфоламбана).

Влияние норадреналина на амплитудные и временные параметры сократимости миокарда желудочков мышей дикого типа (3-4).

Норадреналин в концентрации 10"6М оказывает положительный инотропный эффект на миокард желудочков мышей дикого типа (3-4) (Рисунок 4В). Сила сокращения к 20 минуте составила 17,1 ±2 мН (п=9). На фоне действия (3-амилоидного пептида не наблюдалось достоверного инотропного эффекта норадреналина (п=9, р>0,05) (Рисунок 4В).

В контрольных условиях аппликация норадреналина приводила к уменьшению фазы расслабления (п=9, р<0.05) (Рисунок не представлен) и к увеличению скорости расслабления миокарда желудочков мышей дикого типа (3-4) до 1,47±0,3 г/с (п=9, р>0.05) (Рисунок 4Г).

На фоне РАП норадреналин не изменял фазу укорочения и расслабления миокарда желудочков (Рисунок не представлен). Также не было выявлено достоверных изменений скорости расслабления желудочков. До подачи норадреналина скорость расслабления составила 1,47±0,3 г/с, после подачи - 2, 13±0,56 г/с (п=9, р>0.05) (Рисунок 4Г).

ш'

го

&

£2,0-

кй

то _

.!" т

° о.о -ЬйШяЗ---.

г

3.0-,

Б а о.5

На фоне норадреналина (НА)

На фоне р-амилоидного пептида Рисунок 4 - Влияние Р-амилоидного пептида (А,Б) и норадреналина (В,Г) на силу сокращения и скорость расслабления миокарда желудочков мышей дикого типа (3-4).

Так как ранее мы установили, что р-амилоидный пептид сам по себе оказывает положительный люзитропный эффект можно предположить, что норадреналин и /3-амилоидный пептид увеличивают скорость расслабления миокарда желудочков по сходному механизму. Таким образом, Р-амилоидный пептид (25-35) оказывает выраженное влияние на сократимость миокарда и

процессы регуляции сократительной активности. Выявленные нами нарушения под действием Р-амилоидного пептида могут играть роль в повышенном риске и повышенной встречаемости сердечно-сосудистой патологии у пациентов с болезнью Альцгеймера и другими р-амилоидосвязанными заболеваниями.

Холинергическая регуляция сократительной активности миокарда мышей с моделью болезни Альцгеймера. Карбахолин (стойкий аналог ацетилхолина) вызывал дозозависимое уменьшение силы сокращения предсердий во всех группах мышей (п=5) (Рисунок 5А). При действии карбахолина на желудочки дозозависимое снижение силы сокращения наблюдается у мышей дикого типа (3-4) и мышей дикого типа (8-10) (Рисунок 5Б). У АРР/Р51 (8-10) мышей наблюдается положительный инотропный эффект карбахолина; в частности, при концентрации 10_6М амплитуда сокращении увеличилась на 32,9±8,7% от исходной величины (п=8; р<0.05).

Таким образом, эффект карбахолина на сократимость миокарда желудочков в генетической модели болезни Альцгеймера видоизменяется. Возможно, это связано с изменением соотношения холинорецепторов в миокарде желудочков. Можно предположить, что позитивный инотропный эффект в этом случае обусловлен возрастанием функционального значения подтипов М-ХР, реализующих положительный инотропный эффект, к которым относятся Мь М3, М5.

А Б

Рисунок 5 - Влияние различных концентраций карбахолина на силу сокращения миокарда мыши.

А - предсердия, Б - желудочки. Серые столбики - мыши дикого типа (3-4), черные столбики - мыши дикого типа (8-10), белые столбики - АРР/Р81 (8-10) мыши.

Влияние карбахолина (10"5М) на сократимость миокарда мыши на фоне действия М-холиноблокаторов. Карбахолин в концентрации 10"5М оказывал уменьшение силы сокращения предсердий как у мышей дикого типа (3-4) (п=15), так и у АРР/РБ! (8-10) мышей (п=15) (Рисунок 6А). На фоне

блокатора Мгхолинорецепторов пирензепина (10'5М) эффект карбахолина снижался, а на фоне блокатора М2-холинорецепторов галамина (10"5М) -практически исчезал у мышей дикого типа (3-4) и у АРР/Р81 (8-10) мышей (Рисунок 6А).

В желудочках аппликация карбахолина у АРР/Р81 (8-10) мышей приводила к увеличению силы сокращения на 38,1±11,6% (п=10), у мышей дикого типа к снижению на 27,4±7,4% (п=14, р<0,05), а у мышей дикого типа (8-10) не наблюдалось выраженного инотропного эффекта (п=14, р<0,05) (Рисунок 6Б).

На фоне пирензепина положительный инотропный эффект карбахолина на желудочки АРР/Р81 (8-10) мышей снимался (п=4), а у мышей дикого типа (8-10) наблюдался отрицательный инотропный эффект (п=8) (Рисунок 6Б).

У мышей дикого типа (3-4) на фоне галамина отрицательный инотропный эффект снимался (п=6), и это свидетельствует о том, что М2-холинорецепторы опосредуют отрицательную инотропную реакцию. У мышей дикого типа (8-10) и АРР/Р81 (8-10) мышей при блокировании галамином карбахолин вызывал увеличение силы сокращения желудочков на 24,7±3,8% (п=5, р<0,05) и 20,7±7,5% (п=4, р<0,05) (Рисунок 6Б).

На фоне действия блокатора 4-ОАМР карбахолин вызывал незначительное увеличение силы сокращения желудочков у мышей дикого типа (3-4) на 7,2±2,8% (п=8), а у мышей дикого типа (8-10) и АРР/Р81 (8-10) мышей наблюдалось уменьшение силы сокращения на 13,2±7,5% (п=6, р<0,05) и 16,6±7,2% (п=8, р<0,05), соответственно (Рисунок 6Б).

А Б

Рисунок 6 - Влияние карбахолина (10"5М) на сократимость миокарда мыши на фоне действия М-холиноблокаторов.

А - предсердия, Б - желудочки. Серые столбики - мыши дикого типа (3-4), черные столбики - мыши дикого типа (8-10), белые столбики - АРР/Р81 (8-10) мыши. Карбахолин (КХ) - стойкий аналог ацетилхолина, пирензепин (10"5М) -блокатор Мгхолинорецепторов, галамин (10~5М) — блокатор Мгхолинорецепторов, 4-ВАМР (10"5М) - блокатор М3-холинорецепторов.

Таким образом, у АРР/Р81 мышей наблюдается нарушение холинергической регуляции инотропной функции миокарда. В частности, наблюдается положительный инотропный эффект карбахолина на желудочки. Применение блокаторов Мг и М3-холинорецепторов устраняло данный феномен, что свидетельствует о повышении функциональной роли данных рецепторов в регуляции сократимости миокарда АРР/Р51 (8-10) мышей.

Норадренергическая регуляция сократительной активности миокарда мышей с моделью болезни Альцгеймера. Аппликация норадреналина (10"6М - 10"4М) вызывала дозозависимое увеличение амплитуды сокращений желудочков мышей дикого типа (3-4) - при концентрации 10"4М на 84±27% от исходной величины (п=8). Примечательно, что у АРР/РБ! (8-10) мышей норадреналин в концентрациях 10"5М и 10~4М вызывал отрицательный инотропный эффект, снижая силу сокращения на 15,4±7,3% и 24,3±11,1% от исходных значений, соответственно (п=10) (Рисунок 7Б). У мышей дикого типа (8-10) аппликация 10"5М и Ю^М норадреналина вызывала положительную и отрицательную инотропную реакцию, соответственно (п=8) (Рисунок 7Б). В отношении предсердий норадреналин вызывал увеличение силы сокращения миокарда у мышей дикого типа (3-4) в концентрациях Ю^-Ю^М, при этом при концентрации норадреналина 10"5М амплитуда сокращений возрастала на 43,4±5,5% от исходных значений (п=8). Достоверных отличий в эффектах норадреналина на силу сокращений предсердий между разными экспериментальными группами мышей не наблюдалось (Рисунок 7А). Таким образом, ключевым наблюдением в данной серии экспериментов было выявление различий в реакции миокарда желудочков на аппликацию норадреналина (10"5М): у трансгенных мышей наблюдался, в отличие от мышей дикого типа (3-4), отрицательный инотропный эффект.

А К

Рисунок 7 - Влияние различных концентраций норадреналина на силу сокращения миокарда мыши. А - предсердия, Б - желудочки. Серые столбики -мыши дикого типа (3-4), черные столбики - мыши дикого типа (8-10), белые столбики - АРР/Р81 (8-10) мыши.

Влияние агонистов р-адренорецепторов на силу сокращения миокарда мыши. Применение специфических агонистов различных р-АР показало, что выявленная отрицательная инотропная реакция желудочков на норадреналин у АРР/Р81 (8-10) мышей обеспечивается активацией р2-АР: аппликация специфического агониста р2-АР фенотерола (10"5М) вызывала идентичные изменения сократимости миокарда желудочков (п=8) (Рисунок 8Б). Аппликация ргагониста добутамина вызывала выраженный положительный инотропный эффект предсердий (Рисунок 8А) и желудочков мышей дикого типа (3-4) (п=9), а р3-агонист каразолол не вызывал достоверных изменений амплитуды сокращений миокарда как предсердий, так и желудочков во всех группах мышей (п=8) (Рисунок 8А,Б).

Таким образом, использование селективных агонистов р-АР свидетельствует прежде всего об изменении роли р2-АР в модуляции силы сокращений предсердий и желудочков миокарда АРР/Р81 (8-10) мышей и мышей дикого гипа (8-10). Можно сделать вывод о том, что снижение величины положительного инотропного эффекта норадреналина на сократимость предсердий мышей дикого типа (8-10) и АРР/Р81 (8-10) мышей обусловлено, главным образом, снижением функциональной роли р2-АР. Кроме того, нами были выявлены нетипичные реакции миокарда желудочков АРР/Р81 (8-10) мышей на селективные агонисты Р-адренорецепторов. В частности, фенотерол, активатор р2-адренорецепторов, вызывал отрицательную инотропную реакцию желудочков, а добутамин вызывал отрицательный инотропный эффект на препаратах предсердий. Эти феномены могут быть объяснены модификацией внутриклеточных сигнальных каскадов, реализующих эффекты р2-адренорецепторов в сердце трансгенных мышей.

А

^ 100

аГ 1 80

во

40 20 0

-20 -40

¿1

ш

Рисунок 8 - Влияние агонистов Р-адренорецепторов на силу сокращения миокарда мыши.

А - предсердия, Б - желудочки. Серые столбики - мыши дикого типа (3-4), черные столбики - мыши дикого типа (8-10), белые столбики - АРР/Р81 (8-10) мыши. Добутамин (10"5М) - агонист р,-адренорецепторов, норадреналин (10" — неселективный агонист Р-адренорецепторов, фенотерол (10 5М) - агонист р2 -адренорецепторов, каразолол (10"5М) - агонист Р3-адренорецепторов.

Экспрессия М-холинорецепторов в миокарде трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера. На препаратах желудочков иммунопозитивное флуоресцентное окрашивание на наличие М,-холинорецепторов более выражено проявилось у АРР/Р81 (8-10) мышей -209,2±47,7 (п=12) светящихся точек по сравнению с препаратами мышей дикого типа (8-10) и (3-4) - 80,2±16,03 (п=12, р<0.05) и 78,4±12,8 (п=12, р<0.05) светящихся точек, соответственно (Рисунок 9А). На препаратах предсердий достоверных отличий между группами мышей обнаружено не было (Рисунок 9А).

На препаратах желудочков выявлялось иммунопозитивное флуоресцентное окрашивание на наличие М2-холинорецепторов. В частности, на препаратах АРР/Р81 (8-10) мышей в поле зрения выявлялось 120,9±11,1 светящихся точек (п=22), что в значительной степени больше по сравнению с препаратами мышей дикого типа (3-4) - 43,4±7,3 светящихся пятен (п=10, р<0.05) и с препаратами мышей дикого типа (8-10) - 91,2±18 светящихся точек (п=12, р<0.05) (Рисунок 9Б). На препаратах предсердий достоверных отличий между группами мышей обнаружено не было (Рисунок 9Б).

Можно сделать вывод о том, что в желудочках мышей дикого типа (8-10), и особенно - АРР/Р81 (8-10) мышей наблюдается увеличение экспрессии Мг и М2-холинорецепторов. Наиболее выраженное увеличение (более чем в 3 раза) было выявлено в миокарде желудочков АРР/Р81 (8-10) мышей в сравнении с миокардом мышей дикого типа (3-4). Эти результаты коррелируют с данными, полученными при изучении сократимости миокарда. Отрицательный инотропный эффект карбахолина на препаратах желудочков АРР/Р81 (8-10), очевидно, объясняется высокой экспрессией в них Мгхолинорецепторов, активация которых снижает силу сокращений кардиомиоцитов.

Предсердия

Желудочки

Предсердия

Желудочки

М1-холинорецепторы

М2-холинореценторы

Рисунок 9 - Экспрессия М,- и М2-холинорецепторов в миокарде мышей. Серые столбики - АРР/Р81 (8-10), черные столбики - мыши дикого типа (3-4), белые столбики - мыши дикого типа (8-10).

Экспрессия р-адренорецепторов в миокарде трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера. На препаратах правых желудочков выявлялось иммунопознтивное флуоресцентное окрашивание на наличие рг адренорецепторов. В частности, на препаратах мышей дикого типа (3-4) в поле зрения выявлялось 100,6±10,8 светящихся пятен (п=16), что в значительной степени больше по сравнению с препаратами АРР/Р81 (8-10) мышей - 61,5±9,9 светящихся точек (п=12, р<0.05) (Рисунок 10А). Выявленное количество светящихся точек у мышей дикого типа (8-10) достоверно не отличалось от значений других групп мышей - 89±18,7 (п=9, р>0.05). На препаратах предсердий достоверных отличий между группами мышей обнаружено не было (Рисунок 10 А).

На препаратах правых желудочков выявлялось иммунопознтивное флуоресцентное окрашивание на наличие р2-адренорецепторов. У АРР/РБ1 (810) мышей в поле зрения наблюдалось 66,8±7,4 светящихся пятен (п=16), что значительно меньше в сравнении с препаратами мышей дикого типа (3-4) и дикого типа (8-10) - 190,1±19,6 (п=14, р<0.05) и 169±27,2 светящихся точек (п=11, р<0.05) (Рисунок 10Б). На препаратах предсердий в поле зрения препаратов АРР/Р81 (8-10) мышей выявлялось 101,8±11,2 светящихся точек (п=28), что в значительно степени меньше по сравнению с мышами дикого типа (8-10) -160,9±16,9 (п=22, р<0.05) (Рисунок 10Б).

При исследовании иммуноэкспрессии Р-адренорецепторов было выявлено, что в желудочках АРР/РБ1 (8-10) мышей происходит выраженное снижение количества рг и р2-адренорецепторов. Такие изменения, вероятно, обуславливают гораздо менее выраженный инотропный эффект или его отсутствие под воздействием норадреналина.

г!;

Предсердия

Желудочки

Предсердия

Желудочки

Р1-адренорецепторы

р2-адренорецеиторы

Рисунок 10 - Экспрессия р,-и р2-адренорецепторов в миокарде мышей. Серые столбики - АРР/Р51 (8-10), черные столбики - мыши дикого типа (3-4), белые столбики - мыши дикого типа (8-10).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе было проведено фундаментальное исследование механизмов сократимости миокарда в модели болезни Альцгеймера. Эксперименты были проведены на двух моделях данной патологии - ß-амилоидной (при аппликации ß-амилоидного пептида) и генетической (трансгенные мыши, экспрессирующие мутантные белок предшественник амилоида и пресенилин-1). Проведение поведенческих тестов и флуоресцентное исследование на наличие ß-амилоидных отложений позволило считать применение трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера в возрасте 8-10 месяцев (на симптомной стадии) наиболее адекватной моделью для изучения нарушений сократимости миокарда при данной патологии.

Далее, было установлено, что у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера наблюдается выраженное нарушение процессов холинергической регуляции сократимости миокарда желудочков, проявляющееся в положительной инотропной реакции миокарда на карбахолин и связанное с повышением экспрессии М,-холинорсцепторов в миокарде. Кроме того, у трансгенных мышей происходит нарушение процессов адренергической регуляции сократимости миокарда желудочков, что проявляется в отрицательной инотропной реакции миокарда на норадреналин и связано со снижением экспрессии и изменением физиологической активности ß-адренорецепторов.

Таким образом, нами было установлено, что при болезни Альцгеймера наблюдается выраженное нарушение адренергических и холинергических механизмов регуляции сократимости миокарда. Данный феномен является специфическим для Альцгеймеровской нейропатологии, поскольку у мышей дикого типа такого же возраста таких нарушений не наблюдается. Полученные данные раскрывают новый, ранее неучтенный аспект патогенеза болезни Альцгеймера и способствуют пониманию взаимосвязи между механизмами нейродегенерации и сердечно-сосудистой патологии.

ВЫВОДЫ

1. С применением морфологических и поведенческих методов исследования у 8-10 месячных трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера генотипа B6C3-Tg(APP695) 85DboTg(PSENI)85Dbo (APP/PS1) были обнаружены выраженные нарушения пространственной памяти и повышение тревожности, наличие отложений ß-амилоидного пептида в гиппокампе и коре головного мозга, а также их отсутствие в миокарде, что свидетельствует об адекватности выбранной модели и возраста мышей для изучения симптомной стадии болезни Альцгеймера.

2. Установлено, что амплитудно-временные параметры электрически вызванных сократительных ответов миокарда желудочков и предсердий

трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера достоверно не отличаются от таковых у мышей дикого типа того же возраста. В р-амилоидной модели болезни Альцгеймера при аппликации 10"6М Р-амилоидного пептида (25-35) выявлено уменьшение длительности фазы расслабления и увеличение скорости расслабления миокарда.

3. У мышей дикого типа (8-10) в ответ на аппликацию карбахолина наблюдается дозозависимое снижение амплитуды сокращений миокарда желудочков, в то время как у трансгенных мышей отмечается положительный инотропный эффект карбахолина; в частности, при концентрации Ю^М она увеличилась на 32,9±8,7% от исходной величины. Норадреналин вызывал дозозависимое увеличение силы сокращения предсердий у мышей всех групп. Аппликация норадреналина в желудочках трансгенных мышей и мышей дикого типа (8-10) приводила к снижению амплитуды сокращения, и в концентрации Ю^М она снизилась на 24±11,1% и 32±11%, соответственно.

4. На фоне действия блокаторов М1-ХР пиренезепина и М2-ХР галамина отрицательный эффект карбахолина на препаратах предсердий всех групп мышей снижается. Положительный инотропный эффект карбахолина на желудочки трансгенных мышей снижается на фоне действия галамина, а у мышей дикого типа (8-10) он наоборот появляется. На фоне действия пирензепина положительная инотропная реакция у трансгенных мышей совсем исчезает, в то время как у мышей дикого типа (8-10) наблюдается отрицательный инотропный эффект. На фоне 4-ОАМР - наблюдается отрицательный инотропный эффект в обеих группах мышей.

5. При аппликации фенотерола (агонист Рг-адренорецепторов) на препараты предсердий наблюдалось увеличение силы сокращения во всех группах мышей. При воздействии фенотерола на желудочки миокарда мышей дикого типа (8-10) наблюдалось увеличение амплитуды сокращений, тогда как у трансгенных мышей — снижение. Добутамин (агонист Ргадренорецепторов) вызывал снижение амплитуды сокращений предсердий, а в желудочках у мышей дикого типа (8-10) и у трансгенных мышей наблюдалась положительная инотропная реакция. Каразолол (агонист Рз-адернорецепторов) не вызывал достоверных изменений амплитуды сокращений предсердий и желудочков всех групп мышей.

6. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов миокарда показало изменение в экспрессии рецепторов. В частности, у трансгенных мышей в миокарде желудочков увеличилось количество Мр и М2-холинорецепторов по сравнению с мышами дикого типа (3-4) и мышами дикого типа (8-10). В миокарде предсердий трех групп мышей изменений в экспрессии Мг и М2-холинорецепторов обнаружено не было.

7. При исследовании иммуноэкспрессии р-адренорецепторов было обнаружено уменьшение количества рг и р2-адренорецепторов в миокарде желудочков у трансгенных мышей. Выявлено достоверное снижение

количества Рг-адренорецепторов в миокарде желудочков у трансгенных мышей в сравнении с мышами дикого типа (8-10).

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Леушина, A.B. Клеточные и рецепторные механизмы нарушения сократимости миокарда и аорты в модели болезни Альцгеймера I A.B. Леушина, Р.Ф. Гайфуллнна, А.Л. Зефиров и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2012. - Т.7. - № 3. - С.98-100,

- (перечень ВАК), автора - 0,2 пл.

2. Леушина, A.B. Адренергические механизмы регуляции сократимости миокарда в генетической модели болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, Л.Ф. Нуруллин, Е.О. Петухова и др. // Казанский медицинский журнал. -2015. - Т.96. - №1. - С. 50-55, - (перечень ВАК), автора - 0,4 пл.

3. Семина, И.И. Динамика развития поведенческих нарушений у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера / И.И. Семина, А.З. Байчурина, Е.А. Макарова, A.B. Леушина и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. — Т.158. - №11. — С. 568-571, - (перечень ВАК), автора - 0,3 пл.

4. Mukhamedyarov, М.А. Extraneuronal toxicity of Alzheimer's ß-amyloid peptide: comparative study on vertebrate skeletal muscles / M.A. Mukhamedyarov, A.Y. Teplov, A.V. Leushina et al. // Muscle & Nerve. -2011. - V.43, №6. - P.872-877, - (перечень ВАК), автора - 0,4 пл.

5. Мухамедьяров, М.А. Нарушение функций периферических возбудимых структур в модели болезни Альцгеймера / М.А. Мухамедьяров, П.Н. Григорьев, Э.Р. Юсупова, A.B. Леушина и др. // Тезисы докладов XXI Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва-Калуга, 2010.

- С. 426.

6. Леушина, A.B. Влияние бета-амилоидного пептида на сократительную функцию брюшной аорты крыс / A.B. Леушина, Э.Р. Юсупова, Б.А. Хайдаров // Материалы 84-ой Всероссийской студенческой научной конференции. Казань, 2010. - С.381.

7. Хайдаров, Б.А. Влияние бета-амилоидного пептида на синаптическую передачу в нервно-мышечном соединении мыши / Б.А. Хайдаров, Э.Р. Юсупова, A.B. Леушина // Материалы 84-ой Всероссийской студенческой научной конференции. Казань, 2010. — С. 364.

8. Мухамедьяров, М.А. Клеточно-молекулярные механизмы нарушений электрогенеза скелетных мышечных волокон мыши под действием бета-амилоидного пептида / М.А. Мухамедьяров, Э.Р. Юсупова, A.B. Леушина и др. // Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине». Казань, 2010. - С. 286.

9. Мухамедьяров, М.А. Вненейрональная токсичность бета-амилоидного пептида: эффекты на сократительную активность сосудов крыс / М.А. Мухамедьяров, A.B. Леушина, Э.Р. Юсупова, и др. // Материалы X Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиологические механизмы адаптации растущего организма», Казань: ТГПТУ, 2010.-С. 125-126.

Ю.Юсупова, Э.Р. Фармакологические пути коррекции токсического эффекта бета-амилоидного пептида при помощи фосфорсодержащих препаратов «капах» и «фосфабензид» / Э.Р. Юсупова, A.B. Леушина, Б.А. Хайдаров и др. // III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород, 2010. - С. 159-160.

11. Леушина, A.B. Бета-адренергическая регуляция сократительной функции миокарда в генетической модели болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Материалы XVI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине». Казань, 2011. - С.129.

12. Леушина, A.B. Нарушение бета-адренергической регуляции инотропной функции миокарда в генетической модели болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Тезисы докладов XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва, 2011.-С. 18-19.

13. Леушина, A.B. Оценка сократительной функции миокарда у трансгенных мышей с генетической моделью болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Материалы 7-го Международного Междисциплинарного Конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак (Крым, Украина), 2011.-С. 263.

14. Мухамедьяров, М.А. Адренергическая и холинергическая регуляция сократительной активности миокарда у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера / МА. Мухамедьяров, A.B. Леушина, А.Л. Зефиров // Материалы III СЪЕЗДА ФИЗИОЛОГОВ СНГ. Ялта, Украина, 2011. - С.71.

15. Леушина, A.B. Холинергическая регуляция сократительной функции миокарда у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Молодежь. Наука. Будущее: технологии и проекты». Казань, 2011. - С.518-519.

16. Леушина, A.B. Нарушение бета-адренергической регуляции инотропной функции миокарда в генетической модели болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Материалы 15-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых: «Биология — наука XXI века». Пущино, 2011. - С. 164-165.

17. Леушина, A.B. Участие различных подтипов М-холинорецепторов в регуляции сократительной функции миокарда у трансгенных мышей с

моделью болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Материалы 8-го Международного Междисциплинарного Конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак (Крым, Украина), 2012. -С.248-249.

18. Леушина, A.B. Нарушение механизмов регуляции сократимости миокарда в модели болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, Л.Р. Нуриева, Д.Ф. Халиуллина // Материалы XVIII Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященная 155-летию со дня рождения Л.О.Даркшевича. Казань, 2013. - С. 347.

19. Леушина, A.B. Холинергическая регуляция сократительной функции миокарда у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Материалы Пятой Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. Москва, 2012. - С. 518-519

20. Леушина, A.B. Участие различных подтипов М-холинорецепторов в регуляции сократительной функции миокарда у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Материалы XVII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине». Казань, 2012. -С. 107.

21. Леушина, A.B. Роль адрено- и холинорецепторов в регуляции инотропной функции миокарда в модели болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, М.А. Мухамедьяров // Материалы 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых: «Биология - наука XXI века». Пущино, 2013. - С.431-432.

22. Леушина, A.B. Исследование иммуноэкспрессии различных подтипов М-холинорецепторов и бета-адренорецепторов в миокарде трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, Л.Ф. Нуруллин, М.А. Мухамедьяров // Материалы 88-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых. Казань, 2014. - С. 412.

23. Леушина, A.B. Рецепторные механизмы холино- и адренергической регуляции сократимости миокарда в модели болезни Альцгеймера / A.B. Леушина, Л.Ф. Нуруллин, М.А. Мухамедьяров и др. // Материалы XII международной научной школы-конференции "Адаптация растущего организма" Казань, 2014. - С.64-65.

Подписано в печать 05.02.2015. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,3. Тираж 100. Заказ № 0602/3. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Весгфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ru