Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние Na+-Ca2+ обменной системы изолированного сердца крысы при его повреждениях и воздействии некоторых лекарственных веществ

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Состояние Na+-Ca2+ обменной системы изолированного сердца крысы при его повреждениях и воздействии некоторых лекарственных веществ"

На правах рукописи

Маслов Олег Владимирович

СОСТОЯНИЕ №+-Са ОБМЕННОЙ СИСТЕМЫ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА КРЫСЫ ПРИ ЕГО ПОВРЕЖДЕНИЯХ И ВОЗДЕЙСТВИИ НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальность 03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ДЕК 2010

Воронеж-2010

004616241

Работа выполнена в Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Алабовский Владимир Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Попова Татьяна Николаевна.

кандидат биологических наук Кирилова Екатерина Михайловна

Ведущая организация: Российский государственный медицинский

университет им. Н.И. Пирогова

Защита состоится 17 декабря 2010 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан » ноября 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук ,/ и М.Ю. Грабович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для осуществления постоянной и бесперебойной механической активности сердечной мышцы природа наделила ее несколькими дублирующими механизмами, каждый из которых обеспечивает проникновение в миоплазму определенного количества Ca \ вызывающего сокращение сердца. Среди них в последнее десятилетие особое внимание привлекает ученых так называемая система Na+-Ca2+ обмена. (Na+-Ca2+exchange 2005; J.P.Reevers, М. Condrescu, 2008). Пока она мало известна среди медиков-кардиологов и до сих пор не созданы лекарственные средства, способные напрямую регулировать этот процесс. Изучение Na+-Ca2+ обмена в настоящее время ограничивается простейшими объектами исследования - фрагментами сарколеммы, изолированными кардиомиоцитами или полосками миокарда. Данный научный экспериментальный подход дал большую информацию о строении транспортного переносчика, осуществляющего Na+-Ca2+ обмен, механизме его регуляции, участии в электромеханическом сопряжении сердца.

Сейчас, однако, назрела необходимость в осуществлении следующего этапа исследований - изучение этого важнейшего механизма в более сложных объектах, например, на целом сердце в условиях изолирования из организма, или изучение этого процесса на целом животном.

Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что исследования на данных объектах единичны. И они пока не отражают особенность работы и регуляции Na+-Ca2+ обменного механизма в целостном органе. Трудности выполнения подобных исследований обусловлены крайне незначительными изменениями внутриклеточной и внеклеточной концентрации Са2+, который транспортируется через мембрану сарколеммы в процессе Na+-Ca2+ обмена.

Поэтому для измерения этого процесса используются косвенные методики - измерение сопротивления мембраны, применение Са2+-селективных биолюминесцентных реагентов, а также микроэлектроды, вводимые внутрь клеток (S. Antolin, H.R. Matthews, 2007; A.C. MacDonald, S.E. Howlett, 2008).Подобные процедуры невозможно использовать на интактном сердце.

В этой связи возникла необходимость в разработке новой методики, позволяющей изучать натрий зависимые потоки ионов Са2+ через мембраны кар-диомиоцитов (Na+-Ca2+ обмен) в целом сердце. Овладение такой методикой дает широкий простор для изучения состояния Na+-Ca2+ обмена при различных заболеваниях сердца. А также появляется возможность исследования известных и новых лекарственных препаратов используемых в кардиологии.

Поскольку Na+-Ca2+ обмен сопровождается изменением потенциала на мембране сарколеммы, было важным определить связь этого обмена с возникновением электрической нестабильности сердца, завершающейся его аритмией.

Цель и задачи исследования: Цель диссертационной работы - изучить состояние Na+-Ca2+ обменной системы изолированного сердца крысы в норме и при патологиях, определить ее роль в возникновении фибрилляции миокарда, а также при воздействии некоторых лекарственных веществ.

В связи с целью были поставлены задачи исследования:

1. Разработка методики для исследования натрий-зависимого транспорта ионов кальция в изолированном сердце крысы.

2. Изучить особенности Ыа+-Са2+ обмена в изолированном сердце крысы. Оценить доли потоков ионов Ыа+, обеспечивающих -Н+ и №+-Са2+ обмены при снижении внеклеточного уровня

3. Определить роль Ыа+-Са2+ обмена в возникновении фибрилляции желудочков сердца.

4. Выявить участие митохондрий сердца в поглощении ими избыточно поступающего в сердце Са2+ через систему №+-Са2+ обмена. Оценить при этом их способность к окислительному фосфорилированию.

5. Установить влияние различных концентраций К+, рН, гипоксии, реперфу-зии после ишемии и пероксидного окисления липидов на Ыа+-Са2+ обмен в сердце крысы.

6. Изучить влияние некоторых кардиотропных лекарственных веществ на процесс Ыа+-Са2+ обмена в изолированном сердце крысы.

Научная новизна. Впервые №+-Са2+ обмен изучен путем непосредственного измерения динамики изменений концентрации Са2+ во внеклеточной среде в интактном изолированном сердце крысы. Рассчитаны ряд параметров в условиях нормы и при повторных инициациях этого процесса. Новизна метода подтверждена решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности, выдачей патента ((19)Ки<п)2400825<13)С1).

Зарегистрирована активация поглощения кислорода митохондриями, происходящая в момент аккумуляции ими избыточно поступающего в сердце ионов Са2+ через систему Ыа+-Са2+ обмена. При этом наблюдается необратимое нарушение процесса окислительного фосфорилирования.

Установлено, что фибрилляция желудочков возникает в момент наибольшей скорости поглощения Са2+ сердечной мышцей при Иа+-Са2+ обмене. Блокирование этого процесса предупреждает её возникновение.

Изучена особенность протекания Ка+-Са2+ обмена в целом сердце при гипоксии, реперфузии после ишемии, при активизации пероксидного окисления липидов, влиянии изменений рН. С помощью нового метода получен ответ о причине побочного негативного влияния некоторых лекарственных средств на сердечную деятельность. Получены новые данные о механизме действия верапамила и кофеина на обмен Са2+. Предложен новый тест для оценки селективности действия различных факторов и веществ на процесс №+-Са2+ обмена, протекающего в режиме реверсии.

Практическая значимость. Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко Минздравсоцразвития России и утверждена на заседании Ученого совета педиатрического факультета ВГМА (протокол №5 от 24.12.2006г.), номер Государственной регистрации 01.200.202014.

Новая экспериментальная методика позволяет напрямую измерять динамику поглощения изолированным сердцем крысы внеклеточного Са2+ при

стимулировании процесса Na+-Ca2+ обмена. Установлена взаимосвязь между интенсификацией Na+-Ca2+ обмена и возникновением фибрилляции желудочков сердца.

Полученные новые данные об особенностях протекания Na+-Ca2+ обмена в реверсном режиме при изменениях рН, гипоксии, реперфузии после ишемии, активировании пероксидного окисления липидов, могут быть использованы клиническими кафедрами для объяснения патогенеза развития осложнений в сердце при различных его заболеваниях.

Разработанная методика может служить в дальнейшем одним из способов исследования лекарственных веществ, обладающих побочными эффектами на сердце, наблюдаемых в клинической практике. Полученные в ходе настоящего исследования новые знания используются в лекциях и на практических занятиях по биохимии, нормальной физиологии, патофизиологии и фармакологии Воронежской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Результаты исследований, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на II Международной научной конференции молодых учёных-медиков (Курск, 2008); I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009); Российской конференции, посвященной 80 - летию со дня рождения Р.И. Лифшица (Челябинск, 2009); III Международной научной конференции молодых учёных - медиков (Воронеж, 2009); IV Международной научной конференции молодых учёных - медиков (Курск, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, и получен патент на изобретение №2400825.

На защиту выносятся следующие положения:

1. С помощью созданного изобретения, позволяющего регистрировать Na+-Ca2+ обмен, можно количественно изучать этот процесс на изолированном сердце крысы.

2. Активизация Na+-Ca2+ обмена в реверсном режиме сопровождается аккумуляцией избытка Са2+ митохондриями, в результате чего происходит нарушение в них процесса окислительного фосфорилирования.

3. При непродолжительной гипоксии, в отличие от ишемических факторов воздействия, наблюдается возрастание скорости накопления ионов Са + в сердце крысы через систему Na+-Ca2+ обмена.

4. Активизация процесса поступления Са2+ в сердце путем Na+-Ca2+ обмена (в реверсном режиме) сопровождается резкими нарушениями электрической активности сердца и возникновением фибрилляции его желудочков.

5. Побочные кардиодепрессивные свойства некоторых лекарственных средств (доксорубицин, верапамил, ноотропил, новатрон) могут быть обусловлены непосредственным влиянием их на Na+-Ca2+ обменник в сердце.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 4-х глав собственных результатов исследований, выводов, списка литературы. Иллюстративный материал включает 23 рисунка и 14 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлены современные представления о структуре и локализации Na+-Ca2+ обменника, его роли в электромеханическом сопряжении миокарда в норме и в условиях патологии.

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Основным объектом исследования была система Na+-Ca2+ обмена в изолированных сердцах белых крыс линии Wistar.

Создание экспериментальной модели. В работе использована перфузи-онная установка, которая была собрана на кафедре биохимии Воронежской медицинской академии им. H.H. Бурденко. Методика позволила на изолированном сердце крысы непрерывно регистрировать изменения концентрации ионов кальция, кислорода и другие компоненты в оттекающем от сердца перфузион-ном растворе.

Метод регистрации Na+-Ca2+ обмена в изолированном сердце крысы. Инициацию натрий-зависимого поглощения ионов кальция изолированным сердцем крысы осуществляли по общепринятой методике - путем снижения уровня ионов натрия в перфузионном растворе (В.В. Алабовский, 1981; G.A. Langer, 1976; W. Мете, 2001).

Концентрацию кальция в оттекающем от сердца перфузионном растворе непрерывно измеряли в течение всего периода опыта. С помощью перистальтического насоса перфузионный раствор смешивали с металлоиндикатором - ар-сеназо-III. Образовавшийся окрашенный продукт реакции между Са2+ и металлоиндикатором пропускали через проточную кварцевую микрокювету, помещенную в регистрационный блок спектрофотометра СФ-46. Показания спектрофотометра при длине волны 660 нм непрерывно записывали на самописце КСП-4, а полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы ANOVA.

Измерение скорости поглощения кислорода изолированным сердцем крысы и митохондриями миокарда. Интенсивность поглощения кислорода изолированным сердцем крысы определяли полярографическим методом. От-текаемый от сердца перфузионный раствор пропускали через термостатирован-

ную камеру со встроенным регистратором кислорода. Запись динамики поглощения кислорода осуществляли на регистрирующем потенциометре КСП-4.

Митохондрии получали методом дифференциального центрифугирования. Скорость дыхания измеряли в термостатированной кювете со встроенным в крышку стационарным платиновым электродом. Субстратом окисления служила глутаминовая кислота. Стимуляцию дыхания митохондрий вызывали добавками АДФ.

Методика регистрации электрической активности сердца. Электрическую активность изолированного сердца регистрировали с помощью биполярных серебряных электродов, которые вводились в толщу левого желудочка (М.Е. Райскина, 1970). Запись электрической активности производили на приборе «ЭЛКАР-2» при скорости движения ленты 25-50 мм/с, в зависимости от задач экспериментов.

Реагенты, используемые в работе. В работе использовались реактивы производства «Реахим» (Россия), «Лабтех» (Россия), «Sigma» (США). Применялись также лекарственные препараты как российского производства, так и зарубежного: кальция хлорид, эмоксипин, кофеин-бензоат-№, эфир диэтило-вый, пероксид водорода 30 (Россия), новатрон (Англия), кордарон (Франция), адрибластин (досорубицин) (Италия), гексаметиламилорид (НМА) (США). Все растворы готовили на бидистиллированой воде.

Статистическая обработка результатов. Обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ «Statgraphics». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Глава 3. ХАРАКТЕРИСТИКА НАТРИЙ - ЗАВИСИМОГО

ПРОТИВОТРАНСПОРТА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ИЗОЛИРОВАННОМ СЕРДЦЕ КРЫСЫ

ЗЛ. Динамика поглощения ионов Са2+ изолированным сердцем крысы при

повторных снижениях внеклеточной концентрации ионов натрия

Для изучения процесса поглощения Са2+ изолированным сердцем крысы инициировали Na+-Ca2+ обмен путём снижения внеклеточного уровня Na+. Активацию поглощения ионов кальция таким образом производили трижды на одном и том же перфузируемом сердце с 10-минутным интервалом между снижениями внеклеточной концентрации хлорида натрия. В качестве инициирующего раствора использовали гипонатриевый раствор, где хлорид натрия заменяли на хлорид аммония в той же концентрации. Опыты показали, что замена хлорида натрия в растворе на хлорид аммония при последующей перфузии, сопровождается интенсивным поглощением ионов кальция сердцем из перфузи-онного раствора (табл. 1).

Таблица 1

Показатели аккумуляции ионов Са2+ изолированным сердцем крысы при замене 140 ммоль/л ЫаС1 на 140 ммоль/л ЫН4С1

Показатели 1-я запись п= 10 2-я запись п= 10 3-я запись п= 10

время от начала опыта до максимального поглощения Са2+ (сек) 71 ±6 62 + 4 Р>0,2 70 + 4 р > 0,2

время от максимального уровня до конца замедления поглощения Са2+ (сек) 94 ± 15 120 ± 16 р > 0,2 110 ±84 р > 0,2

гл 2+ количество поглощенного Са за 5 мин. (нмоль/ г) 360 ±74 619 + 79 р < 0,05 731 ±89 р < 0,05

максимальная скорость поглощения Са2+ (нмоль/минт1) 94+17 215 + 27 р > 0,2 245 + 19 р < 0,05

средняя скорость поглощения Са2* в течение 5 мин (нмоль/минт1) 72+15 113 + 15 р < 0,05 154 +19 р < 0,05

При повторных заменах хлорида натрия на хлорид аммония интенсивность поглощения кальция изолированным сердцем с каждым разом значительно возрастала. Динамику этого процесса во времени демонстрирует рис. 1.

Рис. 1. Динамика поглощения ионов кальция изолированным сердцем крысы при замене хлорида натрия на хлорид аммония. Представлены результаты повторных 3-х записей

Обозначения: ♦ - запись -1; ■ - запись 2; А - запись 3.

Для инициирования натрий-зависимого поглощения Са2+ использовался также другой раствор, содержащий вместо хлорида натрия глюкозу. При этом количество поглощаемого Са2+ в течение 5 минут составила всего 15,1 нмоль/г"1, а максимальная скорость поглощения достигала 7,8 нмоль/минт"'. Необходимо отметить, что с каждой последующей заменой исходного раствора на гипонатриевый, интенсивность поглощения ионов Са2' снижалась.

По-видимому, сказывалось стимулирующее влияние глюкозы на активность Ыа+-К+-насоса клеток. Содержание внутриклеточного уменьшалось, в результате чего обмен внутриклеточного Иа+ на внеклеточный Са2+ ослаблялся. Учитывая этот нежелательный фактор, во всех после-

мин

дующих экспериментах, для стимуляции Ыа+-Са2+обмена мы использовали растворы, содержащие хлорид аммония.

3.2. Влияние ингибиторов Ма+-Са2+ обмена на процесс поглощения ионов кальция, индуцируемого снижением внеклеточной концентрации ионов натрия

Селективные ингибиторы №+-Са2+ обмена - хлорид марганца (1 ммоль/л) и хлорид никеля (0,5 ммоль/л) практически полностью прекращали аккумуляцию кальция сердцем при снижении внеклеточной концентрации ионов натрия (рис. 2).

время, мин

Рис. 2. Влияние ионов никеля и марганца на динамику поглощения кальция изолированным сердцем крысы при замене №С1 (140 ммоль/л) на ЫН4С1 (140 ммоль/л) Обозначения:

♦ - контроль;

о - №С12 (0,5 ммоль/л);

• - МпСЬ (1 ммоль/л)

Таким образом, полученные результаты показывают, что поглощение кальция изолированным сердцем крысы, при снижении концентрации ионов натрия в растворе обусловлена Ыа+-Са2+ обменом.

3.3. Влияние ингибитора №+-Н+ обмена на процесс поглощения ионов кальция при снижении трансмембранного градиента ионов натрия

Следует учитывать, что снижение внеклеточной концентрации натрия может одновременно стимулировать Ка+-Н+ обмен. В этой связи были проведены опыты с применением селективного ингибитора Ыа+-Н+ обмена - гексаметиламилорид (НМА), который добавляли в перфузионные среду в концентрации 1 мкмоль/л.

Эксперименты показали, что ослабление Ыа+-Н+ обмена сопровождается более интенсивным поглощением ионов кальция при замене хлорида натрия на хлорид аммония (табл. 2). Полученные результаты экспериментов свидетельствуют о том, что снижение трансмембранного градиента натрия вызывает активацию одновременно двух процессов - Ыа+-Са2+ и Ыа+ - Н+ обменов.

По-видимому, при селективном ингибировании №+-Н+ обмена доля внутриклеточного натрия, обменивающегося на ионы Са2+, возрастает. Расчеты показывают, что в данных условиях опытов доля натрия, обеспечивающая №+-Н+ обмен, составляет примерно 33%.

Таблица 2

Влияние гексаметиламилорида (НМА) на показатели поглощения ионов Са2+ изолированным сердцем крысы при замене хлорида натрия на хлорид аммония в перфузионном растворе

Показатели Контроль НМА

количество поглощенного Са2+ за 5 мин, (нмоль/ г) 360 + 74 538 ±42 р < 0,05

максимальная скорость поглощения Са2+ (нмоль/мин* г"1) 94+17 152 ± 10 р < 0,05

средняя скорость поглощения Са2+ в течение 5 мин, (нмоль/минт"1) 72+15 107 ±8 р > 0,2

3.4. Влияние рН на интенсивность реверсного №+-Са2+ обмена

Влияние рН на процесс Ка+-Са2+ обмена в изолированном органе -сердце никем не изучалось.

Наши исследования показали, что Ш+-Са2+ обмен при изменении рН во внеклеточной среде значительно ослаблялся и в более кислой (рН = 6,5), и в более щелочной среде (рН = 8,5) по сравнением с исходным рН = 7,4 (табл. 3).

Таблица 3

Влияние рН на процесс Ыа+-Са2+ обмена в сердце крысы

Показатели рН = 7,4 п= 10 рН = 6,5 п= 10 рН = 8,5 п= 10

количество поглощенного кальция за 5 мин, (нмоль/ г) 360 ± 74 36,3 ± 12,2 р < 0,01 82,2 ± 24,6 р < 0,05

максимальная скорость поглощения кальция, (нмоль/мин. г) 94 ±17 9 ±2,7 р < 0,01 25,6 ±5,0 р<0,01

средняя скорость поглощения кальция в течение 5 мин,, (нмоль/мин. г"1) 72 ± 15 6,5 ±2,3 р < 0,01 16,4 ±4,9 р < 0,01

По-видимому, для реализации №+-Са2+ обмена в белковой молекуле обменника необходимы ионизированные группы моноаминоди-карбоновых и диаминомонокарбоновых аминокислот.

3.5. Зависимость скорости №+-Са2+ обмена от внеклеточной концентрации ионов натрия в изолированном сердце крысы

Зависимость кальций - аккумулирующей способности сердца от содержания внеклеточного уровня ионов натрия начинала проявляться при снижении концентрации хлорида натрия от 62 до 2 ммоль/л и описывалась уравнением с величиной коэффициента Хилла а = 2,8, что указывает на положительную кинетическую кооперативность данного процесса.

В присутствии ингибитора Ыа+-Н+ обмена (НМА) скорость поглощения Са2+ повышалась в 1,6 раз (рис. 3).

скорость поглощения нмоль/мин-г1

О 30 60 90 120

концентрация NaCI ммоль/л

Рис. 3. Зависимость скорости поглощения Са2+ от внеклеточной концентрации Na+ в присутствие и отсутствии НМА

Интенсивность поглощения Са2+ при разных концентрациях натрия приобретала сигмоидную зависимость, что свидетельствует о возрастании степени положительной кооперативное™ к субстрату.

Полученные данные позволили дополнить представления о наличии аллостерической регуляции №+-Са2+ обмена внутриклеточной концентрацией Са2+ не только в изолированных клетках сердечной мышцы, но и в интактном сердце животного. Можно предположить, что поступление ионов кальция внутрь кардиомиоцитов через Ыа+-Са2+-обменник обусловлено главным образом снижением трансмембранного градиента ионов натрия и не является результатом повышения сродства транспортного сайта обменника к ионам кальция снаружи клетки в присутствии ионов замещающих ионы натрия.

3.6. Влияние внеклеточной концентрации ионов калия на процесс №а+-Са2+ обмена в сердце крыс

Учитывая, что при различных заболеваниях человека, а также патологиях сердца происходит снижение или увеличение в крови концентрации калия, было изучено влияние высокого (30 мМ) и сниженного уровня калия (1 мМ) на интенсивность поглощения Са2+ сердцем при Ыа+-Са2+ обмене. Обнаружено, что низкий уровень внеклеточного калия ослаблял

интенсивность поглощения Са2+ сердечной мышцей, а высокий напротив значительно усиливал скорость и максимальную способность сердца аккумулировать Са2+ из внеклеточной среды (рис 4, рис 5).

Рис. 4. Влияние снижения на активность Ыа+-Са2+ обмена в сердце крысы. 1,2,3 - я запись на одном сердце

Рис. 5. Влияние повышенной концентрации калия на активность Ыа+-Са2+ обмена в сердце крысы

Глава. 4. УЧАСТИЕ МИТОХОНДРИЙ В ПОДДЕРЖАНИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО УРОВНЯ Са2+ В СЕРДЦЕ ПРИ ИЗБЫТОЧНОМ

ПОСТУПЛЕНИИ ЕГО В КАРДИОМИОЦИТЫ, ВЫЗВАННЫМ РЕВЕРСИЕЙ Ыа+-Са2+ ОБМЕНА

4.1. Изменение скорости поглощения кислорода при натрий-зависимой аккумуляции Са2+ изолированным сердцем крысы

Остается неизвестен вклад того количества Са2+, который поступает в кардиомиоциты при реверсии №+-Са2+ обмена, в активизацию потребления митохондриями кислорода. Учитывая, что исследования последних лет, выполненные в этом направлении, проведены исключительно на изолированных кардиомиоцитах, представляет большой интерес изучение связи натрий-зависимой аккумуляции ионов кальция с дыхательной активностью митохондрий в целостном, интактном миокарде животного.

Проведенные исследования показали, что при замене хлорида натрия на хлорид аммония наблюдалась значительная активация интенсивности поглощения сердечной мышцей кислорода. Максимум активности происходил через 2,5 минуты от начала снижения концентрации натрия во внеклеточной среде. Сопоставление динамики поглощения сердцем ионов кальция с динамикой поглощения сердцем кислорода показывает, что наибольшая активность потребления кислорода происходит на 2 минуты позже того времени, когда наблюдается максимальный процесс аккумуляции

сердцем ионов кальция. В этой связи было предположено, что активация дыхания в митохондриях миокарда обусловлена, по крайней мере, двумя факторами - стимулированием сокращений миофибрилл, поступающим в кардиомиоциты кальцием и поглощением избытка кальция митохондриями.

4.2. Участие митохондрий в активном поглощении ионов Са2+ при его поступлении в сердце посредством №+-Са2+ обмена

С целью оценки вклада Са2+ -зависимого поглощения кислорода митохондриями в общий показатель поглощаемого кислорода сердцем, дальнейшие эксперименты выполнялись в условиях остановки сердечной активности. Прекращение сердечных сокращений осуществлялась высокой деполяризующей концентрацией ионов калия (30 мМ).

Проведенные опыты в этих условиях продемонстрировали различие между максимумами активности поглощения кальция и поглощением кислорода сердцами крыс. При этом поглощение кислорода продолжало активироваться спустя 1,5 минуты после прекращения процесса аккумуляции ионов Са2+ миокардом (рис. 6).

1 6

1 5 £

л 4

с о

е з

о 2

<

1

[.К] = 30 мМ

I

Рис. 6. Соотношение интен-сивностей поглощения ионов Са2+ и поглощения сердцем кислорода при снижении внеклеточной концентрации натрия (заменой ЫаС1 на N^0) в условиях ингибиро-вания сокращений сердца высокой внеклеточной концентрацией калия (30 мМ)

9 10 минуты

Обозначения: а. - динамика поглощения изолированным сердцем ионов кальция; ■ - динамика потребления изолированным сердцем кислорода.

По-видимому, несмотря на снижение скорости потока кальция в кардиомиоциты, митохондрии продолжали испытывать продолжительную стимуляцию, приводящую к усилению их дыхательной активности, обусловленной аккумуляцией митохондриями ионов кальция, поступившего в кардиомиоциты в избыточном количестве.

С целью решения этого вопроса, следующие эксперименты проводили в условиях селективного ингибирования Са2+ -транспортной системы митохондрий с помощью рутениевого красного. В присутствии ингибитора

максимум активности поглощения сердцем кислорода полностью совпал с максимумом аккумуляции Са2+, вызванным Ыа+-Са2+ обменом (рис. 7).

[К] * 30 мМ

минуты

Рис. 7. Влияние ингибитора транспорта кальция в митохондриях (рутениевого красного (1 мМ) на соотношение интенсив-ностей поглощения ионов Са2+ и поглощения сердцем кислорода при снижении внеклеточной концентрации натрия (заменой на ЫН4С1) в условиях ингибирования сокращений сердца высокой внеклеточной концентрацией калия (30 мМ)

Обозначения: ж - динамика поглощения изолированным сердцем ионов кальция; □ - влияние рутениевого красного на динамику интенсивности поглощения изолированным сердцем кислорода

Из этого наблюдения следует, что активация №+-Са2+ обмена, сопровождающаяся интенсивным поступлением Са2+ внутрь клеток миокарда влияет не только на миофибриллярный аппарат сердечной мышцы, а также и на способность митохондрий поглощать избыток ионов кальция.

4.3. Окислительное фосфорилирование в митохондриях сердца крыс при активации реверсного потока ионов Са2+, вызванной снижением внеклеточного уровня натрия

Результатом избыточного накопления митохондриями кальция во время Ыа+-Са2+ обмена может являться повреждение их структуры, что приводит к нарушению механизма окислительного фосфорилирования.

Известно, что интенсивное поглощение Са2+ митохондриями сопровождается разобщением дыхания и фосфорилирования, набуханием и разрушением органелл.

Исследования показали, что в митохондриях, полученных из сердца после его перфузии гипонатриевым раствором в течение 5 минут значительно нарушалась ответная реакция на добавки АДФ. В результате величина дыхательного контроля падала почти в 3 раза. Использование ингибитора аккумуляции Са2+ митохондриями - рутениевого красного ослабляло влияние гипонатриевой среды на скорость фосфорилирующего (Уз) дыхания митохондрий ( рис. 8).

Ч> vAfl<t> ДК

[^контроль ^ птонатриевая среда Ц гипонатриевая среда + рутениевый красный

Рис. 8. Влияние снижения внеклеточного уровня натрия на окислительное фосфорилирова-ние в митохондриях сердца крыс (Звездочкой помечены достоверно значимые результаты опытов)

Таким образом, полученные данные служат непосредственным подтверждением участия митохондрий в регуляции внутриклеточного уровня Са2+, накапливающегося в результате Ыа+-Са2+ обмена в сердце крыс.

Глава 5. НАТРИЙ-ЗАВИСИМОЕ ПОГЛОЩЕНИЕ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ИЗОЛИРОВАННОМ СЕРДЦЕ КРЫСЫ ПРИ ГИПОКСИИ И РЕПЕРФУЗИИ ПОСЛЕ ИШЕМИИ И СВЯЗЬ ЭТОГО ПРОЦЕССА С ВОЗНИКНОВЕНИЕМ АРИТМИИ СЕРДЦА

5.1. Влияние гипоксии и ишемии на ^+-Са2+ обмен в изолированном

сердце крысы

Гипоксию сердца создавали путем пропускания через него в течение 15 минут перфузионного раствора без насыщения его кислородом. При этом скорость натрий-зависимого поглощения Са2+ сердечной мышцей значительно повышалась. В условия ишемии после реперфузии поглощающая способность сердечной мышцы падала (табл. 4).

По-видимому, резкое ослабление скорости №+-Са2+ обмена в сердечной мышце при реперфузии после ишемии возникает в результате развития ацидоза, а также активации пероксидного окисления липидов.

5.2. Влияние активации ПОЛ на активность №+-Са2+ обменной системы

Предположение о важной роли пероксидного окисления липидов в повреждении кардиомиоцитов и нарушении Na-Ca2+ обмена при реперфузии после ишемии требовало подтверждения

В этой связи были проведены опыты, в которых активизацию пероксидного окисления вызывали с помощью добавок в перфузионные растворы пероксида водорода в концентрациях 50 и 150 мкмоль/л. При этом на-

блюдались существенные повреждения структуры миокарда, контролируемые нами с помощью маркера цитолиза - миоглобина.

Таблица 4

Параметры аккумуляции Са2+ изолированным сердцем крысы при гипоксии, реперфузии после 15 мин ишемии и при воздействии пероксида водорода в условиях снижения внеклеточной концентрации ионов натрия

Показатели Контроль п=10 Гипоксия п=10 Реперфузия после ишемии п=10 н2о2 50 мкмоль/л п=10 Н202 150 мкмоль/л п=10

количество по- 360 + 74 1334 44,2 193 63,9

глощенного + 25 ±7,8 ±35,5 ±6,8

кальция за 5 р< 0,001 р < 0,05 р < 0,05 р < 0,05

мин, (нмоль/ г)

максимальная 94+17 439 14,1 62 22,8

скорость погло- + 87 ±2,4 ±14,4 ±2,7

щения кальция, Р<0,2 р < 0,05 р < 0,05 р < 0,01

(нмоль/мин.г-1)

средняя ско- 72 ± 15 267 8,8 42,1 11,8

рость поглоще- + 50 ± 1.5 ±6,8 ±1,3

ния кальция в р < 0,05 р < 0,05 р < 0,05 р<0,01

течение 5 мин,

(нмоль/мин.г1)

Было установлено, что активность Na+-Ca2+обмена в условиях инициации в сердце пероксидного окисления липидов дозо-зависимо ослабляется (табл. 4). Таким образом, предположение о причине нарушения трансмембранных потоков ионов натрия и кальция при реперфузии после ишемии нашло свое подтверждение.

5.3. Состояние электрической активности сердца крыс при реверсии Na+-Ca2+ обмена и в условиях его ингибирования

Изменения в электролитном балансе вызывают опасные для жизни аритмии сердца. Полагают, что определенную роль в этих явлениях играет система Na+-Ca2+ обмена (D.M. Bers, 2002). Однако, непосредственных доказательств о взаимосвязи этой системы с возникновением аритмий в ин-тактном, работающем сердце нет.

Проведенные нами исследования показали, что замена хлорида натрия на смесь хлорида аммония с сахарозой вызывает возникновение фибрилляции желудочков сердца (рис. 9). Фибрилляция начиналась через 69 + 4 сек от момента начала перфузии гипонатриевым раствором. Ингибитор Na+-Ca2+ обмена - хлорид никеля в концентрации 0,5 ммоль/л предотвращал ее возникновение.

Важно отметить, что возникновение фибрилляции по времени (69 + 4 сек) совпадало с максимумом нарастания скорости поглощения Са2+ сердечной мышцей (71+6 сек). Совпадение периодов времени между максимальной скоростью поглощения ионов кальция и возникновением фибрилляции желудочков указывает на прямую взаимосвязь между ре-версным потоком ионов Са2+ и развитием электрической десинхронизации в изолированном сердце крысы.

1 С

г

Рис. 9. Блокирование ионами никеля возникновения фибрилляции желудочков сердца вызываемой снижением внеклеточной концентрации натрия. Запись производилась с поверхности левого желудочка биполярными металлическими электродами

Обозначения: 1- контроль, 2 - опыт;

А, В - исходное состояние;

Б - возникновение фибрилляции после замены хлорида натрия на хлорид аммония (в концентрации 10 мМ) с сахарозой (в концентрации 260 мМ);

Г - предупреждение фибрилляции желудочков сердца хлоридом никеля в концентрации 0,5 мМ/л

Глава 6. ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПРОЦЕСС Ыа-Са2+ ОБМЕНА В ИЗОЛИРОВАННОМ СЕРДЦЕ КРЫСЫ

6.1. Особенности №-Са2+ обмена в сердце крысы при воздействии некоторых лекарственных препаратов

Исследования, посвященные изучению влияния веществ на систему натрий-кальциевого обмена в целостном миокарде пока единичны. Это связано в основном с отсутствием модели, позволяющей регистрировать процесс накопления ионов Са2+ во время активирования натрий-кальциевого обмена непосредственно в работающем сердце. Создание модели, позволяющей регистрировать процесс Ыа'-Са2+ обмена в целом, ин-тактном сердце животного позволило нам провести подобные исследования.

В этой связи, целью дальнейшей работы явилось изучение влияния некоторых кадиотропных (прямо или косвенно влияющих на миокард) медицинских препаратов на процесс поглощения ионов Са2+, вызванного ре-

версией Ш+-Са2+ обмена. Выбор концентраций изучаемых веществ определялся данными полученными из литературных источников (У.\\'а1паЬе1 е1 а1., 2006).

Среди изученных веществ - верапамил значительно ослаблял поглощение Са2+ сердечной мышцей, снижая скорость его транспорта во время натрий-зависимого обмена. Учитывая важную роль Ыа-Са2+обмена в диа-столической деполяризации пейсмейкерных клеток, можно предположить, что его противоаритмические действие связано с ослаблением ионного деполяризующего реверсного потока Са2+.

Наибольшей токсичностью обладал доксорубицин. Известно, что блокируя митоз в опухолевых клетках, этот препарат вызывает тяжелые нарушения сердечной деятельности. Исследования показали, что в концентрации 4 мкМ/л доксорубицин практически на 90% ослабляет ответную реакцию миокарда на снижение натрия во внеклеточной среде.

В отличие от доксорубицина, менее токсичный противоопухолевый препарат - новатрон в концентрации 4 мкМ/л оказывал менее значимое ин-гибирующее влияние на процесс №-Са2+ обмена. При этом скорость поглощения Са2+ снижалась всего на 42%, а аккумулирующая способность сердца в течение 5 минут, достоверно не изменялась(табл. 5).

Таблица 5

Влияние некоторых лекарственных веществ на процесс №+-Са2' обмена в изолированном сердце крысы

Препарат Максимальная скорость поглощения Са2+ (нмоль/мин-г1) Количество поглощенного Са2+ за 5 минут (нмоль/г)

контроль п = 22 75,6 + 7,8 274 + 34

верапамил (10 мкмоль/л) п = 8 17,7 ±1,6 р< 0,001 66,2 ±6,3 р < 0,001

ноотропил (1 мкмоль/л) п = 5 17,6 ±2,2 р < 0,001 71,7+ 10 р<0,01

доксорубицин (4 мкмоль/л) п = 10 9 ±2,7 р< 0,001 36,3 ± 12,2 р < 0,001

новатрон (4 мкМ/л) п = 5 70 ±15,3 Р>0,5 250,4 ± 59,2 р>0,5

кофеин (1 мммоль/л) п = 10 162,4 ± 17,8 р < 0,05 613,7 ±69,8 р < 0,05

кордарон (10 мкмоль/л) п = 10 63 ± 12,2 Р>0,5 214 ± 35 р > 0,5

Стимулятор сердечно-сосудистой системы кофеин в концентрации 1 мМ/л увеличивал интенсивность поглощения кальция из перфузионного раствора. Полученные результаты находятся в соответствии с гипотезой, в которой предполагается, что усиление высвобождения Са2+ из саркоплаз-

матического ретикулума напрямую зависит от интенсивности реверсного направления Na+-Ca2+ обмена.

Проведенные нами исследования на изолированных сердцах крыс показали, что кордарон в концентрации 10 мкмоль/л не снижает аккумуляцию Са2+ при активировании Na+-Ca2+ обмена. Отсутствие эффекта можно объяснить свойством препарата влиять на ионообменник с внутренней стороны сарколеммы кардиомиоцитов.

6.2. Параметры селективности Na+-Ca2+ ионообменной системы изолированного сердца крысы к изменению внеклеточной концентрации натрия в различных условиях перфузии

При изучении процесса аккумуляции кальция изолированным сердцем крысы в момент реверсии Na+-Ca2+ обмена было установлено, что накопление кальция происходит в две фазы - периода высокой скорости (первая фаза) и периода замедления его поглощения (вторая фаза). Поскольку скорость начальной ответной реакции зависит от состояния селективности Na+-Ca2+ обменника к ионам натрия с внешней стороны кардиомиоцитов, было проведено исследование, позволившее оценить влияние различных условий перфузии, а также изученных лекарственных веществ на этот процесс.

Соответствующие расчеты позволили получить коэффициенты селективности Na+-Ca2+ обменной системы изолированного сердца крысы к внеклеточной концентрации натрия в условиях гипоксии, реперфузии после ишемии, воздействии пероксида водорода, изменений рН, разных концентраций внеклеточного калия, а также некоторых лекарственных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени все знания об электромеханическом сопряжении в сердце и участии ионов Са2+ в этом процессе получены исключительно на изолированных кардиомиоцитах При выполнении настоящего исследования был разработан способ изучения Na+-Ca2+ обмена на целом перфузируемом сердце. Этот метод позволил одновременно регистрировать в сердце электрическую и сократительную активность. Новая методика оформлена в виде патента на изобретение, на которое было получено авторское свидетельство.

Наличие Na'-Ca2^ обмена было доказано с помощью широко применяемого в научных исследованиях специфического ингибитора ионооб-менника - хлорида никеля (J. Kimura, 1987; Е.С. Altered, 2000; W. Meme, S. O'Neill, D. Eisner, 2001), который останавливал поглощение кальция сердцем крысы, при снижении внеклеточной концентрации натрия.

Скорость аккумуляции Са2+ и другие параметры Na+-Ca2+ обмена, в отличие от других научных работ, рассчитывается путем измерения коли-

чества Ca , поглощаемого всей мышечной массой изолированного сердца. Полученные расчетные данные отражают усредненную величину аккумулирующей способности всех отделов изолированного сердца. Принимая во внимание, что масса желудочков составляет около 70-80% всей массы сердца, можно считать, что именно эта доля сердечной мышцы является доминирующей в полученных нами результатах.

В ходе работы впервые обнаружено постепенное возрастание интенсивности аккумуляции ионов кальция изолированным сердцем при повторных заменах натрия на ионы аммония.

Предполагается, что во время первой замены хлорида натрия на хлорид аммония происходит накопление молекул аммиака внутри клеток. Обладая донорно-акцепторными свойствами, аммиак связывает протоны цитоплазмы. Включение раствора с прежней высокой концентрацией натрия вызывает выход аммиака из клеток, при этом протоны обмениваются на внеклеточный натрий через систему Na+-H+ обмена. В результате уровень натрия в этот момент внутри кардиомиоцитов увеличивается. При повторном удалении натрия из внеклеточной среды происходит более интенсивный выход его из кардиомиоцитов, сопряженный с более активным поглощением ионов кальция.

Следующей причиной постепенного нарастания аккумулирующей способности сердца является, возможно, активирование Na+ -Са2+ ионооб-менника увеличивающимся уровнем внутриклеточного Са2+. Подобная регулирующая способность внутриклеточного Са2+ подробно исследована в изолированных кардиомиоцитах (D. Levitsky et al., 1994; C.R. Weber et al.,2005.)

Усиление реверсного потока ионов кальция начинается только с двухкратного уменьшения внеклеточной концентрации натрия. Полученные данные свидетельствуют в пользу сложившегося мнения о том, что основным назначением Na+-Ca2+ обмена в состоянии покоя мышцы является удаление Са2+ из кардиомиоцитов. Обратный процесс, т. е поступление Са2+ в клетки (реверсия обмена) начинается только в тот момент, когда трансмембранная разность концентрации Na+ падает почти в два раза. Это соответствует равновесному состоянию, при котором потенциал покоя при деполяризации мембраны снижается ниже реверсного потенциала (30-40 мВ). На направление потока Са2+ при Na+-Ca2+ обмене существенное влияние оказывает исходное значение потенциала покоя в сарколемме миоцитов. При патологических состояниях сердца эта величина может значительно меняться. Полученные факты о способности низкой внеклеточной концентрации ионов калия ослаблять, а высокой - усиливать поглощение Са2+ в реверсном режиме Na+-Ca2+ обмена доказывает электрогенный характер противотранспорта ионов Na+ и Са2+ и влияние на скорость обмена величины мембранного потенциала клеток миокарда.

Учитывая, что в зоне ишемии наблюдается одновременно снижение трансмембранного градиента натрия и уменьшение величины мембранного потенциала, можно предположить о создании реальных условий для ревер-

сии Ыа+ -Са2+ обмена. В результате чего происходит неконтролируемый вход Са2+ в клетки ишемизированного миокарда. При этом процесс Ыа+-Са2+ обмена может быть реально существующей причиной перегрузки кальцием кадиомиоцитов, избыток которого, согласно нашим данным, аккумулируется митохондриями, сопровождается усилением поглощения ими кислорода.

Совершенно очевидно, что подобные процессы, протекающие в условиях нарастающего дефицита кислорода в зоне ишемии, являются усугубляющим фактором для миокарда в целом. При этом может усиливаться кислородный дефицит, и что ускоряет развитие некротических изменений в сердечной мышце.

Например, при гипоксии интенсивность поглощения Са2+ сердечной мышцей при реверсии №+-Са2+ обмена значительно возрастала. В отличие от контрольных опытов повторные замены хлорида натрия на хлорид аммония при гипоксии приводили к снижению скорости поглощения Са2+ изолированным сердцем крысы. По-видимому это происходит в результате повреждения ионтранспортных механизмов сарколеммы циклической перегрузкой сердца ионами кальция, и активизацией пероксидного окисления липидов.

Подтверждением этого предположения явились опыты с использованием модели ишемии - реперфузии. Как известно такое воздействие на миокард является более деструктивным. Как показали наши опыты активность №+-Са2+ обмена при этом резко снижается. Таким же ингибирую-щим воздействием обладал пероксид водорода, добавляемый в перфузион-ные растворы для активизации пероксидного окисления липидов. Таким образом, исходя из полученных данных, можно предположить о важной роли Иа^-Са2' обмена в возникновении гетерогенности повреждений мышцы сердца при ишемии. Очень часто появление такой неоднородности приводит к возникновению аритмий сердца (С. Аг^е1е\'кс11, 2007).

Особенностью полученных результатов исследования явилась возможность наблюдать изменения ионного транспорта Са2+ при №+-Са2+ обмене одновременно с состоянием электрической активности сердца. Совпадение периодов времени между максимальной скоростью поглощения ионов кальция и возникновением в 95 % случаев фибрилляции желудочков указывает на прямую взаимосвязь между реверсным потоком ионов Са2+ с развитием электрической десинхронизации в изолированном сердце крысы. Использование показателей селективности Ыа+-Са + ионообменной системы к изменению внеклеточной концентрации натрия дало возможность оценить состояние активности №+-Са2+ обменной системы при патологии, изменениях рН, разных концентрациях внеклеточного калия и воздействии на нее различных кардиотропных веществ. Необходимо подчеркнуть, что данный методический подход выполнен впервые и может-применяться только в опытах с использованием модели изолированного сердца животного.

выводы

1. Разработана методика регистрации натрий-зависимого поглощения ионов кальция изолированным сердцем крысы. Новизна нового метода подтверждена решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам о признании представленного изобретения с выдачей патента.

2. Снижение внеклеточного уровня Na+ сопровождается активацией поглощения кислорода изолированным сердцем крысы. Ослабление скорости поглощения сердцем кислорода ингибитором транспорта Са2+ в митохондриях указывает на их участие в аккумуляции избыточного Са2+, проникающего в миокард во время Na+-Ca2+ обмена. Это приводит к нарушению процесса окислительного фосфорилирования.

3. Показано, что внеклеточный уровень ионов калия оказывает существенное влияние на скорость поглощения Са2+ изолированным сердцем крысы при Na+-Ca2+ обмене. Результаты отражают электрогенный характер переноса ионов Са2+ и Na+ через сарколемму кардиомиоцитов, а также объясняют причину усиления реверсного пути поступления ионов Са2+ с помощью Na+-Ca2+ обменника в ишемизированном миокарде.

4. Выявлено значительное влияние на активность Na+-Ca2+ обменника в сердце крысы изменений pH (в пределах от 6,5 до 8,5), гипоксии, ре-перфузии после 15 минутной ишемии и активизации пероксидного окисления липидов.

5. Выявленно, что между активизацией поступления Са2+ в сердечные клетки через систему Na+ -Са2+ обменника и возникновением фибрилляции желудочков сердца существует непосредственная взаимосвязь.

6. Установлено, что некоторые кардиотропные лекарственные вещества (доксорубицин, верапамил, ноотропил) существенно изменяют активность Na+-Ca2+ обменника в интактном миокарде.

7. При использовании более сложного объекта исследования - изолированного сердца крысы, появилась возможность рассчитывать параметры селективности Na+-Ca2+ ионообменной системы к изменению внеклеточной концентрации натрия в условиях воздействия изучаемых кардиотроп-ных средств.

8. Установлено, что некоторые лекарственные препараты, обладающие существенным побочным действием на миокард, обладают свойством изменять взаимодействие натрий-кальциевого обменника с ионами натрия.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

*1. Маслов О.В. Активация интенсивности поглощения кислорода митохондриями сердца кальцием, проникающим в миокард посредством Na+-Ca2' обмена / О.В.Маслов, A.A. Винокуров, В.В. Алабовский // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. - 2010. - №1. - С. 94-99.

*2.Алабовский B.B. Влияние кардиотропных веществ на Na+-Ca2+ обмен в интактной сердечной мышце / В.В. Алабовский, A.A. Винокуров, О.В.Маслов // Вестник новых медицинских технологий. - 2010. - № 2. — С. 194.

3. Маслов О.В. Интенсивность поглощения сердцем кислорода при активации процесса Na+-Ca2+ обмена / О.В.Маслов, A.A. Винокуров, В.В. Алабовский // Материалы 4 Международной научной Конференции молодых учёных-медиков., 25-26 февраля 2010 г. - Курск, 2010. - Т. 2. - С. 264.

4. Алабовский В.В. Параметры селективности .Na+-Ca2+ обменной системы к изменению внеклеточной концентрации ионов натрия при гипоксии и ишемии сердца, а также при воздействии некоторых кардиотропных лекарственных препаратов / В.В. Алабовский, A.A. Винокуров, О.В.Маслов // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. -2010. -Т. 9, № 1.-С. 138-141.

5. Алабовский В.В. Натрий - зависимое поглощение ионов кальция в изолированном сердце крысы при гипоксии и ишемии и связь этого процесса возникновением аритмий сердца / В.В. Алабовский, A.A. Винокуров, О.В.Маслов // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. - 2009. -№2. - С. 83-89.

6. Маслов О.В. Натрий- кальциевый обмен в изолированном сердце крысы в условиях ингибирования натрий - протонного обмена / О.В.Маслов, В.В. Алабовский // Материалы 3 Всероссийской Конференции молодых ученых, организованной Воронежской государственной академией им. H.H. Бурденко и Курским государственным медицинским университетом, 20-21 февраля 2009 г. - Воронеж, 2009. -Т. 2. - С. 251- 253.

7. Маслов О.В. Регистрация Na+-Ca2+ обмена в сердце крысы / О.В.Маслов, A.A. Винокуров // Материалы III Всероссийской Конференции молодых ученых, организованной Воронежской государственной академией им. H.H. Бурденко и Курским государственным медицинским университетом, 20-21 февраля 2009 г. - Воронеж. 2009. -Т. 2. - С. 253- 255.

8. Маслов О.В. Оценка токсичности лекарственных препаратов с помощью измерения активности Na+-Ca2+ обмена в изолированном сердце крысы / О.В.Маслов, В.В. Алабовский, A.A. Винокуров // Вестник молодёжного инновационного центра. - 2009. - Вып. 2. — С. 75 78.

9. Алабовский В.В. Натрий - зависимое поглощение ионов кальция изолированным сердцем крысы / В.В. Алабовский, A.A. Винокуров, О.В.Маслов // Астраханский медицинский журнал. - 2008. - № 3. -С. 141-142.

10. Алабовский В.В. Значение Na+-Ca2+ обмена в возникновении электрической нестабильности сердца / В.В. Алабовский, A.A. Винокуров, О.В.Маслов // Журнал теоретической и практической медицины. - 2008. -Т. 6, №4.-С. 365 -372.

11. Трансмембранная разность концентраций ионов натрия, является главным регулятором поступления Са2+ внутрь клеток сердечной мышцы 1 В.В. Алабовский, A.A. Винокуров, О.В.Маслов, В. Н. Борисоглебская //

0 i V ■

Журнал теоретической и практической медицины. - 2009. - Т. 7, № 3. -С. 237-243.

12. Маслов О.В. Кардиотоксичность доксорубицина и новатрона обусловлена угнетением натрий- кальциевого обмена в сердечной мышце / О.В.Маслов, В.В. Алабовский, A.A. Винокуров // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: рос. Конф., посвященная 80- летаю со дня рождения Р.И. Лифшица, 5-8 октября 2009 г. - Челябинск, 2009.-С. 141.

13. Маслов О.В. Интенсивность натрий - кальциевого обмена в изолированном сердце крысы зависит от внеклеточной концентрации ионов калия / О.В.Маслов, В.В. Алабовский, A.A. Винокуров // Организация и регуляция физико- биохимических процессов: межрегион, сб науч. работ. -Воронеж, 2009. - Вып. 11. - С. 130 - 136.

14. Пат. 2400825 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 А61В5/04. Способ одновременной регистрации Na+ - зависимых потоков Са2+ и функционального состояния целого изолированного сердца в эксперименте / В.В. Алабовский, A.A. Винокуров, О.В. Маслов ; заявитель и патентообладатель ВГМА им. H.H. Бурденко Росздрава. - №2009122349/14 ; опубл. 27.092010 // Бюл.- №27,- 3 с.

*- издания Перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ

Подписано в печать 11.11.10. Формат 60>84 '/|6. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 1428.

Отпечатано с готового оригинал-макега в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, д'Л. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маслов, Олег Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иа+-Са2+ обменная система в сердечной мышце в норме и при патологии.

1.1.1. Роль Иа -Са обмена в электромеханическом сопряжении миокарда.

1.1.2. Структура и локализация №+-Са2+ обменника.

1.2. Регуляция активности Ыа+-Са2+ обменника.

1.2.1. Конкуренция между, ионами и Са2+ в сарколемме кардиомиоцитов.

1.2.2. Аллостерическая регуляция № -Са обмена внутриклеточным Са2+.

1.3. Связь электрической активности сердца с процессом Ыа+-Са2+ обмена и его участие в высвобождении Са2+ из саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов.

1.3.1. Электрогенный характер обмена ионов Ыа+ и Са2+ при Ка - Са обмене и его связь с величиной мембранного потенциала клеток.

1.3.2. Участие Ыа -Са обменника в высвобождении

Са2+ из саркоплазматического ретикулума.

4- 241.4. Активность 1Ма -Са обменника при патологических состояниях сердца.

4" 2+

1.4.1. Роль N3 -Са обменной системы в патогенезе повреждений сердца при гипоксии, реоксигенации, ишемии и реперфузии.

1.4.3. Роль митохондрий в удалении избытка Са"

4" 24* при реверсии № -Са обмена.

4- 9.41.4.4. Участие № -Са обменного механизма в нарушении электрической активности сердца.

1.5. Влияние некоторых кардиотропных веществ на процесс № -Са обмена в сердце.

1.6. Методы регистрации № -Са~ обмена в тканях животных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. Объект и методы исследования.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методика перфузии изолированного сердца крысы.

2.3. Методика регистрации поглощения ионов кальция в оттекающем от сердца перфузате.

2.4. Изучение электрической активности сердца.

2.5. Моделирование пероксидного.окисления липидов.

2.6. Модель создания гипоксии, ишемии-реперфузии.

2.7. Регистрация скорости поглощения кислорода изолированным сердцем крысы.

2.8. Методика получения митохондрий из сердца крысы и регистрация скорости поглощения митохондриями кислорода.

2.9. Использованные реактивы.

2.10. Статистическая обработка результатов исследования.

ГЛАВА 3. Характеристика натрий-зависимого противотранспорта ионов кальция в изолированном сердце крысы.

3.1. Динамика поглощения Са2'1' изолированным сердцем крысы при повторных снижениях внеклеточной концентрации ионов натрия.

3.2. Влияние ингибиторов Ыа -Са" обмена на процесс поглощения Са2+, индуцируемого снижением внеклеточной концентрацией ионов натрия.

3.3. Влияние ингибитора Ыа^Н4^ обмена на процесс поглощения ионов Са2+ при снижении трансмембранного градиента ионов натрия.

3.4. Влияние рН на интенсивность реверсного Ыа -Са" обмена.

43.5. Зависимость скорости № -Са" обмена от внеклеточной концентрации ионов натрия в изолированном сердце крысы.

3.6. Влияние внеклеточной концентрации ионов калия на процесс Иа+Са2+ обмена в сердце крыс.

ГЛАВА 4. Участие митохондрий в поддержании физиологического уровня Са в сердце при избыточном поступлении его в кардиомиоциты вызванном реверсией Ыа+-Са2+ обмена.

4.1. Измерение скорости поглощения сердцем кислорода при натрий-зависимой аккумуляции Са2т изолированным сердцем крысы.

4.2. Участие митохондрий в активном поглощении ионов Са2+ при его поступлении в сердце посредством № -Са." обмена.

4.3. Окислительное фосфорилирование в митохондриях сердца крысы при активации реверсного потока ионов Са2+, вызванного снижением внеклеточного уровня натрия.

ГЛАВА 5. Натрий-зависимое поглощение ионов кальция в изолированном сердце крысы при гипоксии и реперфузии после ишемии и связь этого процесса с возникновением аритмии сердца.

5.1. Влияние гипоксии и ишемии на Ыа -Са обмен в изолированном сердце крысы.

5.2. Влияние активации пероксидного окисления липидов на активность №+-Са2+ обменной системы.

5.3. Состояние электрической активности сердца крысы при реверсии Кат-Са2+ обмена и в условии его ингибирования.

ГЛАВА 6. Влияние некоторых лекарственных веществ на процесс Иа -Са" обмена в изолированном сердце крысы.

6.1. Особенности № -Са обмена в сердце крысы при воздействии некоторых лекарственных препаратов.

4- 246.2. Параметры селективности № -Са ионообменной системы изолированного сердца к изменению внеклеточной концентрации натрия в различных условиях перфузии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Состояние Na+-Ca2+ обменной системы изолированного сердца крысы при его повреждениях и воздействии некоторых лекарственных веществ"

Актуальность. Для осуществления постоянной и бесперебойной механической активности сердечной мышцы природа наделила ее несколькими дублирующими механизмами, каждый из которых обеспечивает проникновение в миоплазму определенного количества Са2+, вызывающего сокращение сердца. Среди них в последнее десятилетие особое внимание привлекает ученых так называемая система Ыа -Са обмена. Пока она мало известна среди физиологов и кардиологов и до сих пор не созданы лекарственные средства, способные напрямую регулировать этот процесс. Изучение Ыа+-Са2+ обмена в настоящее время пока ограничивается простейшими объектами исследования - фрагментами сарколеммы, изолированными кардиомиоцитами или полосками миокарда. Вышеизложенный научный экспериментальный подход дал большую информацию о строении транспортного переносчика, осуществляющего Иа+-Са2+ обмен, механизме его регуляции, участии в электромеханическом сопряжении сердца.

Сейчас, однако, назрела необходимость в совершении следующего шага исследований для изучения этого важнейшего механизма на более сложных объектах, например на целом сердце в условиях изолирования его из организма, или на целом животном. Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что исследования на данных объектах единичны. И они пока не отражают особенность работы, регуляции Ыа -Са обменного механизма в целостном органе.

Трудности выполнения подобных работ обусловлены крайне незначительными изменениями внутриклеточной и внеклеточной у, концентрации Са , который транспортируется через мембрану сарколеммы в процессе Иа -Са обмена. Поэтому для количественной оценки этого процесса используют косвенные методики - измерение сопротивления мембраны, применение Са2+-селективных биолюминесцентных реагентов, а также микроэлектроды, вводимые внутрь клеток. Однако подобные процедуры невозможно использовать на интактном, целостном органе.

В этой связи возникла необходимость в разработке новой методики, позволяющей изучать натрий - зависимые потоки ионов Са" через мембраны кардиомиоцитов (ТЧа+-Са2+ обмен) в целом сердце. Овладение такой методикой дает широкий простор для изучения состояния Ыа+-Са2+ обмена при различных заболеваниях сердца, а также использования известных и новых лекарственных препаратов с целью регуляции этого транспортного

24* механизма с лечебной целью. Поскольку Ыа -Са обмен сопровождается изменением потенциала на мембране, то было важно определить связь активации этого обмена с возникновением электрической нестабильности сердца, завершающейся его аритмией.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью работы явилось изучение состояния Иа+-Са2+ обменной системы изолированного сердца крысы в норме и при патологиях, определение её роли в возникновении фибрилляции миокарда, а также при воздействии некоторых лекарственных веществ.

Задачи работы предусматривали:

1. Разработать методику для исследования натрий-зависимого транспорта ионов кальция в изолированном сердце крысы.

4- ^4

2. Изучить особенности Ыа -Са" обмена в изолированном сердце крысы. Оценить доли потоков ионов Ыат, обеспечивающих Ыа и Иа -Са^ обмены при снижении внеклеточного уровня

3. Определить роль Ыа -Са" обмена в возникновении фибрилляции желудочков сердца.

4. Выявить участие митохондрий сердца в поглощении ими избыточно поступающего в сердце Са2+ через систему Ыа+-Са2+ обмена. Оценить при этом их способность к окислительному фосфорилированию.

5. Установить влияние различных концентраций калия, рН, гипоксии, реперфузии после ишемии и пероксидного окисления липидов на Са2+ обмен в сердце крысы.

6. Изучить влияние некоторых кардиотропных лекарственных веществ на процесс №+-Са2+ обмена в изолированном сердце крысы.

Научная новизна. Впервые № -Са обмен изучен путем непосредственного измерения динамики изменений концентрации Са2+ во внеклеточной среде в интактном изолированном сердце крысы. Рассчитан ряд параметров в условиях нормы и при повторных инициациях этого процесса. Новизна нового метода подтверждена решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности патентом и товарным знаком о признании представленного изобретения с выдачей патента ((19)1Ш

11)2400825(13)С1).

Разработанная нами методика позволила сопоставить кинетику аккумуляции Са2+ сердцем при Ыа+-Са2+ обмене с состоянием электрической активности сердца. Установлено, что фибрилляция желудочков возникает в момент наибольшей скорости поглощения Са сердечной мышцей при функционировании Ыат-Са2+ обменника. Блокирование этого процесса предупреждает ее возникновение.

Выявлена активация поглощения кислорода митохондриями, происходящая в момент аккумуляции ими избыточно поступающего в сердце ионов Са2+ через систему Ыа+-Са2+ обмена. При этом наблюдается необратимое нарушение процесса окислительного фосфорилирования.

Изучена особенность протекания Иа+-Са2+ обмена в целом сердце при гипоксии, реперфузии после ишемии, при активизации пероксидного окисления липидов и изменении рН. Установлена одна из причин побочного негативного влияния некоторых лекарственных средств на сердечную деятельность. Получены данные о механизме действия верапамила и кофеина на обмен Са2+. Предложен новый тест для оценки селективности действия различных факторов и веществ на

I 2 ц. процесс № -Са обмена, протекающего в режиме реверсии.

Практическая значимость. Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко Минздравсоцразвития России и утверждена на заседании Ученого Совета педиатрического факультета ВГМА (протокол №5 от 24.12.2006г.), номер Государственной регистрации 01.200.202014.

В результате выполненнения экспериментальной работы была разработана новая экспериментальная методика для изучения №+-Са2+ обмена непосредственно в изолированном сердце крысы, с помощью которой производилось прямое измерение изменяющегося внеклеточного уровня Са . Новый способ позволил одновременно регистрировать Ыа -зависимые потоки Са2+ и функциональное состояние целого изолированного сердца в эксперименте.

4*

Установлена прямая взаимосвязь между интенсификацией № -Са обмена и возникновением фибрилляции желудочков сердца.

Новые данные об особенностях протекания Ыа -Са обмена в реверсном режиме при изменениях рН, гипоксии, реперфузии после ишемии, активировании пероксидного окисления липидов могут быть использованы клиническими кафедрами для понимания патогенеза развития осложнений в сердце при различных его заболеваниях.

Новая модель исследования влияния ряда кардиотропных лекарственных веществ позволяет уточнить причину их побочных эффектов, наблюдаемых в клинической практике.

Материалы исследования используются во время лекций и практических занятий по биохимии, нормальной физиологии, патофизиологии и фармакологии Воронежской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Результаты исследований, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на II Международной научной конференции молодых учёных-медиков (Курск, 2008); I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине». (Курск, 2008); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009); Российской конференции, посвящённой 80 - летию со дня рождения Р.И. Лифшица (Челябинск, 2009); III Международной научной конференции молодых учёных - медиков (Воронеж, 2009); IV Международной научной конференции молодых учёных - медиков (Курск, 2010)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, и получен один патент на изобретение №2400825.

На защиту выносятся следующие положения:

1. С помощью созданного изобретения, позволяющего регистрировать , 1ч[а+-Са2+ обмен, можно количественно изучать этот процесс на изолированном сердце крысы.

2. Активизация 1Ча -Са обмена в реверсном режиме сопровождается аккумуляцией избытка Са2+ митохондриями, в результате чего происходит нарушение в них процесса окислительного фосфорилирования.

3. При непродолжительной гипоксии, в отличие от ишемических факторов воздействия, наблюдается возрастание скорости накопления ионов Са2+ в сердце крысы через систему 1Ма+-Са2+ обмена.

4. Активизация процесса поступления Са2+ в сердце путем Ыа+-Са2+ обмена (в реверсном режиме) сопровождается резкими нарушениями электрической активности сердца и возникновением фибрилляции его желудочков.

5. Побочные кардиодепрессивные свойства некоторых лекарственных средств (доксорубицин, верапамил, ноотропил, новатрон ) могут быть обусловлены непосредственным влиянием их на Ыа -Са обменник в сердце.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах компьютерного текста и включает 14 таблиц и 23 рисунка. Состоит из "Введения", 6 глав, "Заключения", "Выводов". Список литературы содержит 221 источник, из них 24 отечественных и 197 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Маслов, Олег Владимирович

ВЫВОДЫ ] I

1. Разработана методика регистрации натрий-зависимого поглощения ионов кальция изолированным сердцем крысы. Новизна нового метода подтверждена решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам о признании представленного I! изобретения с выдачей патента. | р' ;

I3

2. Снижение внеклеточного уровня № сопровождается активацией | поглощения кислорода изолированным сердцем крысы. Ослабление скорости поглощения сердцем кислорода ингибитором транспорта Са2+ в митохондриях указывает на их участие в аккумуляции избыточного Са2*, проникающего в миокард во время Ка+-Са2+ обмена. Это приводит к нарушению процесса окислительного фосфорилирования. 1

3. Показано, что внеклеточный уровень ионов калия оказывает существенное влияние на скорость поглощения Са2" изолированным сердцем

4* 24" крысы при № -Са обмене. Результаты отражают электрогенный ха переноса ионов Са2+ и Иа+ через сарколемму кардиомиоцитов, а объясняют причину усиления реверсного пути поступления ионов Ьа2Г <; помощью Ыа+-Са2+ обменника в ишемизированном миокарде. 1 1

41 рактер 1*1 также ' 1 N

I Г 'А !

4. Выявлено значительное влияние на активность №+-Са2+ обменника !в сердце крысы изменений рН (в пределах от 6,5 до 8,5), гипоксии, реперфузии1 ' после 15 минутнои ишемии и активизации пероксидного окисления липидов!

5. Выявленно, что между активизацией поступления Са2+ в сердечные 2+ ' клетки через систему Ыа -Са обменника и возникновением фибрилляции желудочков сердца существует непосредственная взаимосвязь. 1

6. Установлено, что некоторые кардиотропные лекарственные вещества

Г'! доксорубицин, верапамил, ноотропил) существенно изменяют активность

4" 24*

Ыа -Са обменника в интактном миокарде.

7. При использовании более сложного объекта исследования ^

1!! изолированного сердца крысы, появилась возможность рассчитывать параметры селективности №+-Са2^ ионообменной системы к изменению I внеклеточной концентрации натрия в условиях воздействия изучаемых кардиотропных средств. ( ,

8. Установлено, что некоторые лекарственные препараты, обладающие I существенным побочным действием на миокард, обладают свойством изменять взаимодействие натрий-кальциевого обменника с ионами натрия. ;

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маслов, Олег Владимирович, Воронеж

1. A.c. 893205 СССР, МПК А61В10/00 Способ моделирования фибрилляции желудочков сердца у крысы. В.В. Алабовский, М.И. Р' Кужман; Воронеж. Мед. ин-т.; Заявл. 05.05.1980 ; Опубл 30.12.1981 Бюл. № 48 .i {

2. Алабовский В.В. Зависимость контрактуры миокарда при «кальциевомi 11 ' sпарадоксе» от энергетических ресурсов / В.В Алабовский, A.A. Винокуров // Российский физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. 2004. — Т. 90, №12.-С. 1530-1541.

3. Алабовский В.В. Зависимость повреждений сердца от внеклеточной концентрации К+ при «кальциевом парадоксе» /В.В. Алабовский, В.В. Хамбуров, A.A. Винокуров // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. -2003. Т. 89, № 12. - С. 1538-1550.

4. Алабовский В.В. Некоторые механизмы защитного действия1' Üаденозина при «кальциевом парадоксе» / В.В. Алабовский^! В.В.ii ■

5. Хамбуров, A.A. Винокуров // Российский физиол. Журн. им. И.М: Сеченова. 2004. -Т.90, №7. -Р. 889-901. ''

6. Алабовский В.В. Участие митохондрий в регуляции трансмембранного тока Са2+ внутрь клеток миокарда / В.В. Алабовский, В.И. Кобрин//Успехи физиол. наук. 1985.-Т. 16, № 1. - С. 3-20.

7. Аритмии сердца. Механизмы, диагностика, лечение: в 3 т. / под ред. Дж. Мандела. М.: Медицина, 1996, -Т. 2. - С. 373-403.1 ! j

8. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов-/1. N im

9. M.B. Биленко. М.: Медицина, - 1989. - 368с. ¡;| |1|- !>"121 I'1..

10. Болдырев A.A. Биохимические аспекты электромеханического, сопряжения / A.A. Болдырев. М.: Изд-во МГУ, 1977. - 208с. '

11. Булгаков В.Г. Состояние перикисного окисления липидов .ип1ферментной системы транспорта Са2+ в саркоплазматическог^ретикулуме ишемизированного миокарда / В.Г. Булгаков, М.В*

12. Биленко // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1988, - Т. 106;'^9. С. 272-274. '(

13. Влияние диэтиламинового аналога этмозина на функциональное состояние миокарда (клинико-экспериментальное исследование) / Л.В' Розенштраух и др. // Кардиология. 1982. - Т.22, №6. - С.72-78.1 - ''

14. Голиков А.П. Антиоксидант эмоксипин: влияние на формирований1. I'очага некроза и репаративные процессы при инфаркте миокарда / А.П!Ж

15. Голиков, А.Л. Овчинников, В.Ю. Полумисков // Кардиология. 1£90¡к