Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование системы Na+/Ca2+ обмена для удаления Са2+ из сердца при реперфузионной контрактуре

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование системы Na+/Ca2+ обмена для удаления Са2+ из сердца при реперфузионной контрактуре"

РГб од

3 ШОН 1995

На правах рукописи

ХАМБУРОВ Владимир Викторович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИСТЕМЫ Ка+/Са2+ ОБМЕНА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ Са2+ ИЗ СЕРДЦА ПРИ РЕПЕРФУЗИОННОЙ КОНТРАКТУРЕ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Смоленск - 1995

Работа выполнена в Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко

Научный руководитель - доктор медицинских наук,

профессор В.В.Алабовский

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Сапрыгин Д.Б., кандидат медицинских наук, доцент Стунжас Н.М.

Ведущее учреждение - Российский медицинский университет им. Н.И.Пирогова

Защита состоится ". -Зо - _1995 г.

в "_" час. на заседании диссертационного совета К 084. 34.01

при Смоленской государственной медицинской академии (214019 г. Смоленск, ул. Крупской, 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Смоленской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан " ЛмЫ- 1995 г.

Ученый секретарь специализированного

совета Н.Ф. Фаращук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из важнейших патогенетических биохимических процессов, протекающих в сердце при ишемии является трансмембранное поступление ионов Са2+ внутрь кардиомиоцитов (Alexander L.C., 1950; Budd G.C.,1979; Duxon J.M.C.,1989).

Особенно интенсивно накопление Са2+ происходит во время восстановления кровообращения (реперфузии) в зоне ишемии или целом сердце.

Подобные явления особенно часто возникают при операциях на сердце с использованием кардиоплегических растворов, когда ишеми-зированную сердечную мышцу неоднократно подвергают реперфузии "кристаллоидным" раствором с целью удаления продуктов обмена и обновления состава внеклеточной среды (Allen D.G.,1987; Tani М.,1990). Реперфузионные осложнения нередко отмечаются клиницистами и во время удаления тромба из сосудов сердца или терапии коронарного спазма. При этом возникает явление "незавершенной диастолы". Существующие методы предупреждения и лечения репер-фузионных осложнений сводятся, в основном, к мерам профилактики подобных нарушений. Медицине пока неизвестны способы удаления "избытка" ионов Са2+ из сердца, способствующие нормализации диастолического напряжения миокарда или расслаблению пересокращенных миофибрилл сердечной мышцы при синдроме "каменного сердца" в кардиохирурги ческой практике.

Методической основой, побудившей нас к разработке нового метода воздействия на поврежденное контрактурой сердце, послужили экспериментальные данные, полученные рядом авторов из нашей лаборатории (Алабовский В.В., 1987; Винокуров A.A., 1992).

Установлено, что высокая внеклеточная концентрация ионов натрия обладает существенными защитными свойствами при ишемии и реперфузии. Ускоряется восстановление электрической и сократительной

активности сердца, устраняются нарушения ритма (Алабовский В.В., 1987). Высокий трансмембранный градиент Ка+ значительно ослабляет првреждения сердца при "кальциевом парадоксе". Эффект гипернатриевой среды особенно четко проявляется в присутствии адени-ловых нуклеотидов и фосфокреатина (Винокуров А А., 1992).

Предполагается, что защитное действие высокой внеклеточной концентрации ионов натрия обусловлено ослаблением процесса Ка+/Са2+ обмена.

Однако прямых экспериментальных доказательств способности гипернатриевой внеклеточной среды ослаблять поток ионов Са2+ в кар-диомиоциты при реперфузии ишемически поврежденного сердца нет. Не доказана и возможность "извлечения" избытка внутриклеточного кальция при развившейся контрактуре миокарда с помощью обмена путем обращения этого процесса искусственно создаваемым высоким трансмембранным градиентом натрия. Учитывая возможность быстрого "рассеивания" градиента ионов Ка+ другими №+-зави-симыми транспортными системами, в частности Ка+/Н+ обменом, необходимо изучение и этого процесса.

Не до конца ясен механизм защитного действия АТФ на миокард, хотя имеются предположения о вовлечении в этот процесс также Ка+/Са2+ обменной системы.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилось изучение возможности ослабления накопления или удаления избытка ионов кальция из сердца при его реперфузии после ишемии путем увеличения трансмембранного градиента ионов натрия и обращения процесса Ыа+/Са2+ обмена. Были поставлены следующие задачи:

1. Дать количественную оценку и изучить динамику процесса накопления Са2+ сердечной мышцей во время реперфузии после ишемии разной длительности.

2. Оценить влияние обмена на процесс аккумуляции сердцем при реперфузии.

3. Изучить роль Ыа+/Са2+ обмена в механизме поглощения Са2+ миокардом во время реперфузии. С помощью искусственно создаваемого высокого градиента Ка+ ослабить скорость накопления Са2+ сердцем.

4. Определить роль гипертонического фактора гипернатриевого раствора в наблюдаемых результатах влияния высокой внеклеточной концентрации ионов на транспорт Са2+ в сердце при его реперфузии.

5. Изучить действие АТФ как одного из активаторов Ьта'!7Са2+ обмена на аккумуляцию Са2+ сердечной мышцей во время реперфузии.

6. Оценить расслабляющее действие а также проницаемость биомембран кардиомиоцитов для внутриклеточных метаболитов при использовании перфузионных сред, обладающих способностью уменьшать накопление или стимулировать выход ионов Са2+ из сердца во время реперфузии после ишемии.

Научная новизна. Проведенными исследованиями установлено, что после ишемии разной длительности (от 15 до 40 минут) внутриклеточное накопление Са2+ происходит в течение примерно одного периода времени реперфузии: 15-18 минут. Однако этот процесс протекает с разной скоростью: чем длительнее ишемия, тем более интенсивно происходит аккумуляция ионов кальция.

Впервые обнаружено, что Ыа+/Са2+ обмен стимулируется при реперфузии процессом Ыа+/Н+ обмена.

Показано, что высокая внеклеточная концентрация Ыа+ при условии сохранения или повышения его трансмембранного градиента может обращать процесс Ыа+/Са2+ обмена. При этом значительно ослабляется аккумуляция Са2+ сердечной мышцей, предотвращается нарастание реперфузионной контрактуры, а после ишемии средней

продолжительности (25 минут) в сердце появляется электрическая и сократительная активность.

Впервые установлено, что АТФ в концентрации 200 мкМ обладает свойством удалять ионы кальция из сердца во время реперфузии после ишемии разной длительности (от 15 до 40 минут). Показано, что гипернатриевая среда и низкий pH раствора (блокирующий Na+/H+ обмен) существенно усиливают действие АТФ на сердце. При этом еще больше усиливается выход кальция из сердечной мышцы, предупреждается нарастание реперфузионной контрактуры.

Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований позволили получить количественную характеристику и динамику во времени процесса накопления Са2+ сердечной мышцей во время нарастания реперфузионной контрактуры. Это дает возможность более целенаправленно определить оптимальные сроки начала активного воздействия на поврежденное контрактурой сердце. Разработана рецептура перфузионного раствора, способного вызывать интенсивный выход Сд2+ из миокарда на разных этапах развития контрактуры сердца (начиная сразу с момента окончания ишемии и через 15 минут после начала нарастания контрактуры). Новый способ ослабления реперфузионной контрактуры может быть применен в кардиохирургической практике при реперфузии остановленного кардиоплегическим раствором сердца при угрозе развития постишемических осложнений.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Юбилейной конференции физиологов, посвященной памяти Г.И. Косицкого (Москва, 1990); заседаниях Воронежского биохимического общества (Воронеж, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994); школе-семинаре молодых ученых Воронежского государственного медицинского института им. H.H. Бурденко (Воронеж, 1993); конференциях молодых ученых ВГМИ им. H.H. Бурденко (Воронеж, 1991-1995).

По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Экспериментальные материалы нового метода предупреждения реперфузи-онной контрактуры сердца оформлены в виде заявки на патент с приоритетом от 18 июля 1994 г., N 94027258(026666).

Работа выполнена без соавторства. Из научных результатов, опубликованных в соавторстве, в диссертацию включены данные, выполненные лично автором.

Положения, выносимые на защиту.

1. Во время реперфузии сердца после его ишемии процесс накопления Са2+ обусловлен активацией Ка+/Н+ и обменных систем.

2. Ослабление №+/Н+ обмена амилоридом или низким рН пер-фузионного раствора, а также активация выхода Са2+ из сердца адено-зинтрифосфорной кислотой и гипернатриевой внеклеточной средой позволяет осуществить процесс интенсивного выведения ионов Са2+ из сердца при ишемии средней и большой продолжительности.

3. Используя систему На+/Са2+ обмена в качестве объекта, через который осуществляется удаление избытка из сердца после ишемии, удается полностью предупредить возникновение реперфузионной контрактуры миокарда, а в некоторых случаях вернуть ему электрическую и сократительную активность.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Общая характеристика методов исследования", "Результаты исследования и их обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Практические рекомендации", указателя литературы, включающего 342 первоисточника и приложения. Объем диссертации - 206 страниц, включая список использованной литературы, 42 таблицы и 51 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе использовано 396 белых беспородных крыс (самок) массой 180 - 220 г., находившихся на обычной лабораторной диете. В каждой серии экспериментов использовали животных приблизительно одинаковой массы и одной возрастной группы.

Перфузия изолированного сердца крыс. С целью предупреждения тромбозов коронарных сосудов крысам вводился гепарин в дозе 200 ЕД/кг. Через 30 минут под эфирным наркозом производили дека-питацию, сердце извлекали из грудной клетки и погружали в окси-генированный раствор Рингер-Локка. Быстро канюлировали аорту и начинали перфузию сердца по методу Лангендорфа с постоянной скоростью, равной 10 мл/мин на один грамм ткани (под давлением 60-70 мм.рт.ст.) раствором следующего состава (в мМ): NaCl - 140, NaHC03 - 2. NaH2P04 - 0,5, КС 1 - 3,1рис-ОН - 2 (рН 7,4), СаС 12 - 0,6, глюкоза -2. Перед началом перфузии раствор подогревался до 37^ С и окси-генировался. В течение 15 минут проводили проточную перфузию данным распором для стабилизации обменных процессов и сократительной функции сердца.

Физиологические показатели и содержание веществ в оттекающем от сердца перфузате к этому моменту времени были приняты за исходное состояние.

После 15 минут адаптации сердца создавали его глобальную ишемию путем полного прекращения перфузии на сроки 15, 25 или 40 минут. По окончании времени ишемии начинали реперфузию сердца при которой скорость коронарного кровотока составляла 10-12 мл/мин на один грамм сердечной ткани.

Реперфузию осуществляли следующими растворами: 1) раствором, содержащим стандартный набор компонентов (контроль), 2) раствором того же ионного состава, что и контрольный, отличающимся содержанием ионов Иа+ в количестве 240 мМ (в дальнейшем, если не оговорено особо - "тилернатриевый раствор"1), 3) раствором того же состава, что и контрольный, но дополнительно содержащим ионы лигия в концентрации 100 мМ ( в тексте, если не оговорено особо - "гипертонический раствор"). 4)' растворами, помимо ионов, содержащими АТФ в количестве 200 мкМ, или амилорид в концентрации 10 мкМ, гаи имеющими рН, равный 6.8.

Нами использовались три различные схемы опытов (рис.1).

адаптация мнения репер.;: •ЗУ.я исслздуекым раствором

15 минут 15,25,40 иин начало измерения концентрации са

адаптация ишемия рьперфузяя контрольным перехид на исследуемый раствор

15 мину? 15,40 мин раствором Ъ минут начало измерения концентрации Са

адаптация! иаемия реп^рФузия контрольны» перехол на ксслелуемый раствор

15 минут! 15, ¿5, 40 мин раствором 15 минут начала измерения концентрации Ca

Рис. 1. Схемы проведения экспериментов.

Методика измерения содержания ионов Calí в оттекающем от сердца перфузате. Из термостатируемой камеры, в которой находилось сердце насосом забирали оттекающий от сердца перфузат. Его смешивали с раствором Арсеназо III в смесительной камере (Dorogi P.L., 1983). Интенсивность окраски зависила от концентрации Ca-* в перфузате, чувствительность методики составляет 10 -6 М. Далее раствор с помощью перистальтического насоса подавался в проточную кювету спектрофотометра СФ-26. Измерение оптической плотности производилось при длине волны 686 нм. Показания от

спектрофотометра поступали на АЦП и далее обрабатывались на ПЭВМ "Электроника-85" в реальном масштабе времени.

Исследование давления в полости левого желудочка изолированного сердца крысы производили при помощи латексного баллончика, заполненного водой и соединенного с датчиком давления ("Bentley Lab. Europ", Нидерланды). Информация от датчика через АЦП подавалась на ПЭВМ 'Электроника-85".Измерение давления в течение всего опыта проводили в изоволемическом режиме.

Измерение концентрации лактата в оттекающем от сердца перфуза-те производили ферментативным методом, используя 0,1 M трис-гидра-зиновый буфер. Концентрацию лактата в перфузате выражали в мкМ на 1 г массы сердца.

Измерение концентрации миоглобина. пиридин- и пуриновых нуклеотидов в опекающем от сердца перфузате производили спектро-фотометрически при длинах волн 420 нм, 340 нм и 280 нм соответственно. Контролем служил свежеприготовленный перфузионный раствор.

Изучение электрической активности сердца осуществляли с помощью платинового электрода, введенного в толщу левого желудочка на глубину 3 мм (Райскина М.Б., 1980). Сигналы от электрода поступали через АЦП на ПЭВМ IBM PC/AT 386SX, на которой обрабатывались с помощью прикладной программы.

Статистическая обработка результатов экспериментов была проведена методом вариационной статистики с применением критерия Т Стьюдента. Достоверность различий альтернативных признаков бьша изучена с использованием критерия Х2.

Результаты исследований и их обсуждение. При изучении особенностей накопления Са^+ сердечной мышцей была установлена прямая зависимость между длительностью ишемии и количеством поглощенного миокардом кальция. Однако процесс накопления каль-

ция заканчивается примерно в одно и то же время - спустя 15-18 минут от начала реперфузии. Было также отмечено, что максимально сердце крысы может аккумулировать кальций в количестве 1723 нмоль/г. При этом скорость поглощения кальция может достигать 3396 пмоль/с. Следовательно, к 15 минуте реперфузии концентрация кальция в сердце приближается к его внеклеточному уровню. Интересно отметить, что через 15-18 минут от начала реперфузии происходит медленный выход Са2+ из сердечной мышцы, вероятно, вследствие его вытеснения из клеток ионами натрия, проникающими внутрь в результате постепенного рассеивания натриевого градиента.

Как и предполагалось, на процесс аккумуляции Са^+ в значительной степени влиял Ыа+/Н+ обмен (табл. 1).Причем его действие проявлялось двояким образом. С одной стороны, проникновение Ка+ внутрь клеток в обмен на ионы Н+ усиливало процесс ^+/Са2+ обмена и аккумуляцию Са2+ сердечной мышцей (через 25 минут ишемии). Блокирование этого процесса амилоридом снижало накопление Са2+ сердцем. После более продолжительной ишемии (40 минут) во время реперфузии играл роль другой фактор Ыа+/Н+ обмена - его способность удалять избыток протонов из клеток. Остановка этого процесса амилоридом резко усиливала ацидоз, ослабляла тем самым еще больше способность сердечной мышцы противодействовать потоку Са2+ внутрь клеток миокарда. Интенсивность обмена влияет на поглоще-

ние Са2+ после ишемии небольшой длительности (15 минут).

Наибольшая чувствительность к амилориду была отмечена в первые 3 минуты реперфузии, то есть тогда, когда На+/Н+ обмен обеспечивает быстрое восстановление внутриклеточного рН и активность Ыа+,К+-АТФазы после ишемии.

Таблица I

Количество ионов Са^+, поглощенное сердцем (нмоль/г) в зависимости от активности Ыа+/Н+ обмена и продолжительности ишемии при его реперфузии, М+м

Особенности состава перфузион ной среды Время, прошедшее от начала реперфузии, с 100 200 300 400 500

15 минут ишемии

140 мМ 12,8+4,9 16,9+2,5 49,9+0,6 68,8+7,6 86,2+6,3

Ыа+ 140мМ+ амилорид 23,7+2,1 р<0,05 47,6+4,1 . р<0,05 58,9+7,0 Р>0,5 64,8+5,3 р>0,5 67,0+6,5 р>0,5

25 минут ишемии

N3+ 140 мМ 70,1+8,7 226,9+16,6 422,6+26,9 659,7+33,2 879,7+87,3

Ыа+ 140мМ+ амилорид 24,8+3,5 р<0,05 76,1+6,9 р<0,01 138,1 + 17,0 р<0,01 216,2+20,0 р<0,01 290,5+24,5 р<0,01

40 минут ишемии

N3+- • 140 мМ 88,8+3,5 398,9+15,4 700,7+19,3 952,2+36,4 1136,9+55,4

Ыа+ 140мМ+ амилорид 574,5+35,2 р<0,01 1226,7+ 65,6 р<0,001 1463,9+3,6 р<0,001 1528,5+ 21,2 р<0,01 1542,6+29,2 р<0,05

Очень важный результат при попытке ослабить нарастание контрактуры был получен в опытах по измерению диасголического напряжения внутри левого желудочка сердца. Так, в опытах с амилоридом при реперфузии после 15 и 25 минут ишемии, с уменьшением скорости поглощения Са2+ сердечной мышцей одновременно ослаблялось и диастолическое напряжение.

Таким образом, изучение особенностей процесса аккумуляции кальция во время реперфузии после ишемии позволило получить ряд важных наблюдений. Среди них - точная количественная оценка интенсивности и объема поглощенного кальция, специфика динамики

процесса транспорта Са2+ после ишемии разной длительности, а также роль Ка+/Н+ обмена в механизме аккумуляции Са2+ сердцем во время реперфузии.

Данную информацию, сравнивали с результатами изучения влияния повышенной концентрации Ка+*и гиперосмотического компонента на поток Са2+ в сердце при реперфузии.

Прежде всего следует отметить то, что гипернатриевые растворы усиливали поглощение при реперфузии после короткого срока

ишемии (15 минут) и, напротив, ослабляли этот процесс после ишемии большой длительности (25 и 40 минут) (рис. 2,3).

—№ 140 мМ —Я—№240иМ —-*-№240*М __ЮОиМ_аидюрвд

Рис. 2. Влияние высокого градиента Иа+ на поглощение

сердцем при его реперфузии после 15 минут ишемии. Реперфузия начата исследуемыми растворами: по оси абсцисс - время от начала реперфузии, с, по оси ординат - количество поглощенного Са2+,нмоль/г. * - достоверность различий (р<0,05)

Причина такого явления кроется, по-видимому, в том, что после кратковременной ишемии (15 минут) реперфузия сердца характеризуется быстрым восстановлением его электрической активности. При этом периодическое открытие -каналов сопровождается поступлением ионов натрия внутрь клеток. В условиях деэнергизации миокарда в первые минуты реперфузии интенсивность накопления Иа+ в клетке существенно зависит от его внеклеточной концентрации. Повышение содержания в перфузионном растворе до 240 мМ вызывает более

интенсивное поступление ионов натрия в клетки, увеличение его концентрации в саркоплазме, стимулирование обмена внутриклеточного Ыа+ на внеклеточный Са2+. Определенное значение имеет и гипертонический фактор гипернатриевого раствора. Литий-содержащий раствор (Ыа+ - 140 мМ) также увеличивал аккумуляцию Са2+, хотя не так значительно, как гипернатриевый. В данном случае оказывала сильное влияние дегидратирующая способность гиперосмолярных растворов. Выход воды из клеток создавал более концентрированную внутриклеточную среду, обусловливал изменения трансмембранного градиента для Иа+ в большей степени, чем для Са2+. В результате равновесное состояние для Са2+ нарушалось быстрее, чем в контроле, вызывая обращение Ыа+/Са2+ обмена и аккумуляцию Са2+ сердечными клетками. Определенный вклад в усиление потока Са2+ внутрь клеток миокарда во время реперфузии гипернатриевым раствором оказывал Ыа+/Н+ обмен. Искусственно создавая более высокий градиент для можно усиливать тем самым процесс Ка+/Н+ обмена. Однако увеличение внутриклеточного уровня Ка+ активизирует его обмен на внеклеточный Са2+ (Ыа+/Са2+ обмен). Блокируя данный процесс амилоридом, нам удавалось несколько снизить накопление Са2+ сердечной мышцей (рис. 2).

Совершенно иные результаты получены при реперфузии сердца после 25 минут ишемии. Электрическая активность сердца в этих условиях отсутствует, поэтому внутриклеточный поток во время реперфузии существенно ослаблен. Здесь может иметь место только пассивная проницаемость сарколеммы, активация Ыа+/Н+ и других натрий-зависимых обменных систем кардиомиоцитов (ОкаЬа Е., 1988; 3\уеап<Дег К.Л., 1988). При этом вклад Ш+/Н+ обмена в суммарный поток Са2+ во время реперфузии нормонатриевой средой составляет около 67% (табл.1). Действие амилорида на фоне более высокой

внеклеточной концентрации Na+ (240 мМ) менее эффективно -ослабление потока.Са2+ составляет около 22% (рис. 3).

300 В00--700 " 600 ■■ 500400 ■ ■ 300 ■• 200 ■ • 100..

о»

0

Na 140 мМ —В—Na 240 нМ —Na 140 кМ, U -*—Na 240 мМ,

100 нМ амилерид

Рис. 3. Влияние высокой внеклеточной концентрации ионов Na+ на поглощение Са2+ сердцем при его реперфузии после 25 минут ишемии сразу начатой исследуемыми растворами: по оси абсцисс - время от начала реперфузии, с, по оси ординат - количество поглощенного Са2+, нмоль/г.

* - достоверность различий (р<0,05)

Приведенные факты свидетельствуют о том, что с повышением внеклеточной концентрации Na+ последствия рассеивания искусственно создаваемого градиента натрия менее значимы. При этом активность Na+/H+ обмена уступает более высокой активности выведения Са2+ из клеток в обмен на натрий.

К пятой минуте реперфузии, когда Na+ZH"1" обмен начинает ослабевать, тормозящее влияние гипернатриевого раствора на поглощение Са2+ сердцем существенно усиливается. К 15 минуте реперфузии раствором с физиологической концентрацией Na+ процесс аккумуляции Са2+ почти останавливается. В такой ситуации появляется возможность "разгрузить" сердце от кальция с помощью гипертонических солевых растворов, причем оба раствора (гипернатриевый и литиевый) действуют практически одинаково. Преимущество высокой внеклеточной концентрации Na+ не сказалось на результатах опытов. Как уже отмечалось выше, этому, по-видимому, мешала резкая интенсификация

100 200 300 400 500

Ыа+/Н + обмена, которая, рассеивая градиент натрия, практически исключает реверсию Ка+/Са2+ обмена в клетках.

Вместе с тем, следует признать, что ишемия средней продолжительности (25 минут") не вызывает тяжелых необратимых нарушений обмена веществ из-за внутриклеточного ацидоза. По-видимому, он не столько значителен и система Ма+/Н+ обмена способна довольно эффективно удалять протоны во внеклеточное пространство.

Система На+/Са2+ обмена остается сохранной и через 40 минут ишемии с помощью ее удается довольно активно влиять на процесс накопления кальция сердечными клетками во время реперфузии.

Стимуляция выхода Са^+ из сердца высоким градиентом натрия наблюдается через 15 минут от начала реперфузии (рис. 4).

—»— На НОмМ__—а—На 2*0 мМ_ А На 140 мМ, и 100 мМ

Рис. 4. Влияние высокой внеклеточной концентрации на

поглощение или выведение Са2+ в сердце при его реперфузии после 40 минут ишемии. Смена растворов - через 15 минут от начала реперфузии:

по оси абсцисс - время, прошедшее от начала смены растворов,с,

по оси ординат - количество поглощенного или выведенного Са2+. нмоль/г.

* - достоверность различий (р<0,05) К этому моменту поток Са2+ в клетки практически останавливается. Возможно ослабляется ацидоз. Активируется гликолиз. который обеспечивает более эффективную работу ^*а+.К+-АТФазы. Скорость выведения Са-+ из сердца примерно в 4 раза

меньше, чем при его накоплении в первые секунды реперфузии после 40 минут ишемии. При этом из сердца удаляется 1/15 часть всего накопленного кальция. Это не так много, однако достигнуто главное -обеспечен выход Са2+ из клеток путем обращения Ма+/Са2+ обмена.

Применение АТФ в качестве дополнительного источника энергии, а также как соединения, сохраняющего внутриклеточный запас пуриновых нуклеотидов, дало существенные результаты в решении поставленной проблемы.

В концентрации 200 мкМ АТФ стимулировала выход Са2+ из сердца во время реперфузии после 25- и 40-минутной ишемии. С увеличением длительности ишемии, как известно, возрастает и концентрация внутриклеточного натрия. Поэтому при реперфузии после 40 минут ишемии скорость аккумуляции Са2+ сердечной мышцей в 1,3 раза выше, чем при ишемии длительностью 25 минут и в 9 раз больше по сравнению с ишемией сроком 15 минут. Поэтому противостоять мощному потоку ионов Са2+ в сердце после 40 минут ишемии АТФ-содержащий раствор оказывается в состоянии только спустя 5 минут реперфузии. (рис. 5). По-видимому, внутриклеточный уровень ионов N3+ к началу реперфузии увеличивается настолько значительно, что добавочное поступление N3+ за счет активации Ыа+/Н+ обмена существенно не влияет на процесс обмена На+ на внеклеточный Са2+ (отсутствие эффекта амилорида).

Одним из наиболее вероятных, ключевых механизмов действия АТФ на сердце служит ее способность активировать уабаин-чув-ствительное поглощение К+ сердечной мышцей. Известно, что процесс аккумуляции К+ клетками тесно сопряжен с выведением наружу ионов N3+.

——♦-f—♦-♦

SOO 1000 1100 1200 1300 1400

-Na 140 mM, pH 7,4

-Na 240 uM. АТФ, pH 6,8, сразу

-Na 240 mM, АТФ, pH 6,8, через 5 нин

-Na 240 нЫ, АТФ, pH 6,8, через 15 мин

Рис. 5. Удаление ионов Са2+ из сердца во время реперфузии после ишемии 40 минут раствором, содержащим АТФ (200 мкМ), имеющим высокую концентрацию (240 мМ) и низкий рН (6,8).

Активируя этот процесс во время реперфузии, АТФ способна уменьшать уровень Na+ внутри клеток и обеспечивать тем самым обращение Na+/Ca2+ обмена. Не исключена также возможность активации Са2+-АТФазы сарколеммы миокарда. Однако следует учесть, что суммарный вклад этой ион-транспортной системы в удалении Са2+ из клеток крайне невелик, в связи с низкой активностью фермента (Caroni Р., 1981).

Другим источником Са2+ может служить гаикокалекс кардио-миоцитов. Предполагается, что АТФ, обладая хепатирующими свойствами, "извлекает" Са2+ с поверхности сарколеммы, обеспечивая тем самым прирост Са2+ в оттекающем от сердца перфузионном растворе. Однако расчеты показывают, что при условии полного извлечения из сарколеммы быстрообмениваемой фракции Са2+ аденозинтрифос-форной кислотой, его количество составит не более 330 нмоль/г сырой

ткани массы сердца. Учитывая также, что в целом сердце, помимо массы миокарда, определенная часть веса ткани приходится на немышечную ткань (клапаны сердца, аорта), то общее количество Са2+, способного связываться и удаляться с поверхности кардиомиоцитов при помощи АТФ, составляет не более 300 нмоль/г сырой ткани. В проведенных нами опытах с использованием АТФ величина суммарного удаления Са2+ за 500 секунд реперфузии колебалась в пределах от 500 до 1270 нмоль/г кальция. Таким образом, возможный "прирост" удаляемого с поверхности клеток Са2+ колебался в пределах от 24% до 60%. Эти показатели существенны и их следует принимать во внимание. Следует, однако, заметить, что именно связанный с сарколеммой кальций непосредственно проникает внутрь клеток, а выведение Са2+ из клеток наружу включает в себя этап его взаимодействия с данной фракцией.

Таким образом, АТФ и гипернатриевый раствор, действуя как синнергисты, увеличивая трансмембранный градиент для Na+, способны обращать процесс Na+/Ca2+ обмена и удалять избыток-кальция из сердечной мышцы. Ослабляя поток Na+ внутрь клеток через систему Na+/H+ обмена с помощью ацидоза удается получить наиболее высокие результаты. Важное значение имеет также повышенное осмотическое давление изучаемых растворов. Удаляя избыток воды из сердечной ткани, гипертонические растворы улучшали микроциркуляцию в жидкости, способствовали удалению кислых продуктов (лактата) из сердца во время реперфузии.

Особый интерес представляют результаты изучения физиологического состояния сердца во время ослабления потока ионов Са2+ внутрь и его удаления из сердца. Хорошо известна зависимость между сократительной активностью сердца (в частности, величиной диасго-лического напряжения) и внутриклеточным содержанием Са2+ (Bridge J.H., 1981; Carafoli Е., 1982; Deitmer J.W., 1978). Непрерывный конт-

роль данного физиологического параметра позволял, в какой-то мере, оценить результаты трансмембранных потоков Са2+, наблюдаемых в наших опытах. Среди них представляются весьма интересными данные, свидетельствующие о снижении роста диастолического давления внутри левого желудочка сердца во время реперфузии растворами, содержащими амилорид, либо высокую концентрацию либо гипертоническими растворами. Однако эта зависимость наблюдается при реперфузии сердечной мышцы после 25 и 40 минут ишемии.

Исключением явились опыты с более коротким периодом прекращения перфузии - 15 минут. Высокая концентрация ионов Ыа+, снижая диастолическое напряжение, вызывала, тем не менее, более активный поток Са2+ внутрь клеток миокарда.

Как уже отмечалось выше, это обусловлено сохранением электрической и сократительной активности сердечной мышцы. Во время систолы сравнительно небольшие количества Са2+ поглощались миокардом и пополняли его внутриклеточные запасы в ретикулуме. В то же время, более высокий градиент ионов Иа+ усиливал отток Са2+ во время диастолы сердца, вызывая, таким образом, расслабляющее действие. Подобный механизм стимулировал стабилизацию электрической активности сердца при его реперфузии.

При более продолжительной ишемии (25 и 40 минут) сокращения сердца отсутствовали. Саркоплазма сердечных клеток наполнялась нонами натрия и кальция. В этих условиях появлялась возможность, снижая внутриклеточный уровень Са2+, уменьшать диастолическое напряжение.

Анализируя результаты данных опытов, приходится признать, что даже при значительном удалении Са2+ из мышцы сердца не удается снизить напряжение сократительных элементов до исходного физиологического уровня. В лучшем случае возможно ослабить контрактуру, вызванную ишемией на 20 - 30%. Хотя это и является существенным

результатом, и удается возвратить сократительную активность сердца после 25 минут ишемии, полноценного эффекта достигнуть пока не удалось. По-видимому, необходимы дополнительные меры, обеспечивающие сохранение внутриклеточных структур и биомембран клеток от множества повреждающих факторов, вызываемых ишемией.

То, что ишемия сопровождается такими серьезными нарушениями, свидетельствуют данные о проницаемости сарколеммы клеток для важнейших внутриклеточных метаболитов - пиридин- и флавиннук-леотидов, пуриновых нуклеозидов и нуклеотидов, а также миошобина - показателя цитолиза клеток. Здесь установлена определенная закономерность: чем больше продолжительность ишемии, тем сильнее проявляются процессы цитолиза в миокарде. Максимум выхода внутриклеточных метаболитов к первой минуте реперфузии свидетельствует о разрушительных явлениях в сердечной мышце преимущественно в период ишемии. Восстановление потока перфузионного раствора сопровождается удалением продуктов распада, накопившихся во внеклеточном пространстве. Более стойкие последствия реперфузии солевым раствором стандартного состава отражаются на гликолизе, который остается высокоактивным в течение всего периода реперфузии, независимо от длительности ишемии.

Введение в состав гипернатриевого перфузионного раствора АТФ и снижение рН значительно уменьшало проницаемость сердечных клеток для миоглобина и нуклеотидов. Очевидно, освобождение кардио-миоцитов от избытка кальция ослабляло десструктивные процессы в цитоплазме и биомембранах клеток миокарда.

ВЫВОДЫ

1. Скорость накопления Са^+ сердечной мышцей во время реперфузии прямо зависит от длительности предшествующей ишемии. Про-

цесс аккумуляции прекращается через 15-18 минут от начала репер-фузии.

2. Интенсивность накопления Са2+ миокардом во время репер-фузии усиливается процессом Ш+/Н+ обмена. Ингибирование его ами-лоридом ослабляет аккумуляцию Са2+ при ишемии средней длительности (25 минут), усиливает поглощение Са2+ после длительной ишемии (40 минут) и оказывает слабое влияние при реперфузин после кратковременной ишемии (15 минут).

3. Свойство высокой внеклеточной концентрации Ка+ ослаблять скорость накопления Са2+ сердцем во время реперфузии, а также обнаруженная зависимость между интенсивностью поглощения Са2+ и активностью Ка+/Н+ обмена указывают на вовлечение Ыа+/Са2+ обменной системы в механизм аккумуляции ионов кальция сердцем во время реперфузии после ишемии.

4. Остановить накопление ионов Са2+ сердечной мышцей или вызвать их высвобождение из миокарда удается только после ишемии средней (25 минут) и большой (40 минут) продолжительности. Осмотический компонент гнпернатриевого раствора также обладает свойством снижать скорость поглощения Са^+ сердечной мышцей, однако значительно меньшим, чем гипернатриевый.

5. Способность гипернатриевой внеклеточной среды ослаблять поступление Са2+ в миокард значительно возрастает при ингибиро-вании Ыа+/Н+ обмена амилоридом или путем уменьшения рН пер-фузионного раствора.

6. АТФ в концентрации 200 мкМ обладает способностью удалять кальций из сердечной мышцы во время реперфузии после ишемии разной длительности (15,25, и 40 минут).

7. Гипернатриевая среда и низкий рН усиливают действие АТФ на сердце во время реперфузии. При этом достигается максимальная скорость удаления Са2+ из сердечной мышцы.

8. Увеличение осмотического давления или концентрации N3+ во внеклеточной среде замедляет нарастание реперфузионной контрактуры сердца.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В целях уменьшения процесса накопления ионов кальция и ослабления величины контрактуры сердца во время реперфузии после ишемии длительностью от 25 до 40 минут необходимо повышать концентрацию ионов натрия и уменьшать рН перфузионного раствора.

2. При использовании гипернатриевого раствора в качестве средства, ослабляющего аккумуляцию кальция сердцем во время реперфузии после 25-минутной ишемии, его применение эффективнее всего начинать в момент возобновления перфузии.

3. Реперфузию после длительной ишемии (40 минут) следует осуществлять с использованием гипернатриевых растворов, содержащих АТФ и имеющих низкий рН.

Список публикаций, отражающих содержание диссертации

1. Алабовский В.В., Винокуров АЛ., Хамбуров В.В., Якимов А.П. Значение обменной системы и возможности ее использования для регуляции уровня Са2+ при патологических состояниях сердца // Тезисы докладов IV научно-практической конференции "День науки". -1992. - С.15.

2. Алабовский В.В., Хамбуров В.В., Золотухина В.Н. Использование системы

обмена в сердце как средства защиты сердца от перегрузки его кальцием // Сб. науч. тр. Воронежского гос. мед. ин-та им Н.Н.Бурденко. - Воронеж. - 1993. -С.6-9.

3. Алабовский В.В., Якимов А.П., Хамбуров В.В. Снижение постишемической реперфузионной контрактуры путем воздействия на

Ыа+/Са2+ обмен в сердце // Сб. науч. тр. Воронежского гос. мед. ин-та им Н.Н.Бурденко. - Воронеж. - 1993. - С.10-11.

4. Алабовский В.В., Винокуров АЛ., Хамбуров В.В., ВасиленкоД.В. Некоторые аспекты защиты сердца при нарушении внеклеточного электролитного гомеостаза // Тезисы докладов научно-практической конференции "Здоровье человека и действие факторов внешней среды". - Губкин. - 1995. - С.43-44.

Заказ 193 от 25.5.95 г. Тир. 100 экз. Формат 60 X 90 1Дб. Объем I п.,л» Офсетная лаборатория В1У.