Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение фракций из AMARANTHUS CSUENTVS L. и определение их биологической активности на модели изолированного сердца крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение фракций из AMARANTHUS CSUENTVS L. и определение их биологической активности на модели изолированного сердца крысы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н.Баха

РГ Б ОД

На правах рукописи

2 УДК 577

ДЭСАЛЕНЬ ТЕМЕСГЕН ЛЕЙЕ

Вьщелет ^ фракций из АМАЯАМТНиБ СШЕНТУБI. и определение их биологической активности на модели изолированного сердца крысы

Специальность 03.00.04-биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1997

Работа выполнена в лаборатории кардиотропных препаратов Института биотехнологии и в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук В. К. Гинс

Научный консультант:

доктор медицинских наук И. Ю. Малышев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор м. Я. Ловкова доктор биологических наук, профессор М. Г. Пшенникова

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет имени М.ВЛомоносова, Биологический факультет

Зашита состоится "_" _ 1997 г. в 10 часов на

заседании специализированною совета (к 002.96.01) по присуждению учёной степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (г. Москва, Ленинский проспект, л. 33, корпус 2).

С дисссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект 33, корпус 1)

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь

специализированною совета, доктор биологических наук

М.И.Молчанов

Актуальность темы. Растение рода Amaranthus L. (амарант) - древняя пищевая культура. К настоящему времени установлено, что это С4-растение отличается высокой фотосинтетической продуктивностью, устойчивостью к высоким температурам и засухам (устойчивее даже хлопчатника [Магомедов И.М., 1995]). По белку, семена амаранта в два раза продуктивнее злаковых культур [Carlsson R, 1977; Ballard M.J. и Jenkins G.I., 1991].

В России из-за одного вида амаранта - щирицы - его считали сорняком. Поэтому в качестве сельскохозяйственного растения род амарант начали изучать лишь в 80-х годах, хотя академик Вавилов Н.И. еще в 1930 г. предлагал внедрить амарант как кормовую культуру. В амаранте обнаружены ценные физиологически активные соединения: большие количества лектина [Гайда A.B., 1989; Carderon de la Barca A.M., 1988], пектина, флавоноидов [Офицеров E.H. и др., 1995], а также витамины и некоторые пептиды, обладающие разнообразной биологической активностью. В амаранте содержатся в значительных количествах оксалаты [Нестерова A.B., 1995; Соколов B.C., 1995], фитаты, таннины [Ajnilian G.H., et al., 1971; Becker R. et al. 1981], сапонины [Wall M.E. et al., 1959; Hegnaur R., 1964], незаменимые аминокислоты - лизин, метионин и цистеин (дефицитные у зерновых* культур [Кононков П.Ф. и др.] и другие вещества, влияющие на питательную ценность данного растения. Имеются данные, что амарант используют в традиционной лечебной практике стран Азии, Африки и Латинской Америки [Daster J.F., 1985; Lily M. Perry, 1980; John E., 1974] .

Однако, пока основные исследования в мире сосредоточены, главным образом, на увеличении кормовой и пищевой ценности и урожайности амаранта. А изучение амаранта как источника биологически активных фракций и соединений (БАФ) ограничено лишь выделением из него некоторых ранее известных веществ. При этом сравнительно мало сведений о биологических экспериментальных испытаниях этих веществ. Почти совсем не изучено действие БАФ амаранта, имеющих природную взаимосвязь между своими компонентами.

Поэтому параллельно с изучением пищевой и кормовой ценности амаранта необходимо проводить исследования влияния БАФ этого растения на биологические системы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение БАФ из растения АтагапИшз сгиепШв Ь. и определение их биологической активности.

Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

- отбор вида растения рода АтагапШиз Ь. и выбор способов получения из него испытуемых материалов;

- выбор соответствующей модели для оценки биологической активности;

- тестирование полученных из амаранта материалов на наличие и характер биологической активности;

- очистка некоторых БАФ до однородного состояния и исследование их физико-химических свойств;

- разработка схемы получения наиболее активных фракций для дальнейшего изучения их влияния на биологические системы.

Исследования рода АтагапШш Ь. как источника БАФ проведены с учётом следующих соображений:

1) Обобщение литературных данных выявило, что из имеющихся видов амаранта, АтагапОшв сгиепШэ Ь. оказался наиболее изученным. В нем были обнаружены практически все виды химических соединений, характерные для растений этого рода. Кроме того, в нетрадиционной лечебной практике в основном используется надземная биомасса растения именно этого вида. Поэтому мы выделяли испытуемые вещества из надземной части вида А. сгиепШБ .

2) Для изучения биологической активности выделяемых промежуточных или конечных фракций была выбрана модель изолированного и перфузированного по методу Лангендорфа-Фаллена сердца крыс (ИСК). Это модель характеризуется быстрой и четкой ответной реакцией при воздействии на неё минимальных концентраций исследуемых веществ.

Научная новизна. Впервые были охарактеризованы БАФ из А. сгиепШз по их действию на ИСК.

Установлено, что две субфракции, выделение из водно-этанольной вытяжки, обладают кардиопротекторным (антиишеми-•ческим) эффектом. При этом рутин и кверцетин, изолированные из этой же вытяжки в чистом виде, не оказывали влияния на работу • ИСК, но в естественном природном сочетании с другими соединениями вызывали положительный инотропный эффект.

Практическая ценность. Разработан способ использования отхода (жома) амаранта (после выделения флавоноидов - рутина и других), д\я получения биологически активной фракции пектина. Разработан метод препаративного получения алкалоида амарантина, который может применяться в качестве красителя.

Показана необходимость тщательного изучения (испытания) амаранта с целью его последующей рекомендации в качестве источника пищевой (кормовой) добавки или как источника БАФ. Это связано с тем, что некоторые фракции амаранта, как показано в этой работе, угнетают функцию биологических систем.

Впервые выявлено наличие защитного противоишемического эффекта у водно-спиртовых фракций амаранта, что делает перспективным их дальнейшее изучение с целью использовании в кардиологической клинике.

Установлено, что состав химических компонентов A. cruentus существенно не зависит от года сбора урожая.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения" Пущино 1995 г, на конгрессе "Пища, экология и человек " Москва 1995 г. и дважды были представлены на научных семинарах в Институте биотехнологии в Москве 1994 и 1995 гг. Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять работ, одна - сдана в печать.

Структура и объем работы. Диссертация содержит введение, 5 глав (обзор литературы, описание методов исследования, и 3 главы с описанием способов выделения и результатов испытания получаемых промежуточных и конечных фракций A. cruentus), обсуждение полученных результатов, выводы и список литературных источников. Диссертационная работа изложена на 126 стр. и включает в себя 14 рис., 13 схем, 18 табл., и 240 литературных источников.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования. Материалы исследования. В качестве объекта исследования использовали два вида сырья - надземную часть и свежий лист красной формы растения A. cruentus. Это связано со следующими обстоятельствами.

1) Биологически активные вещества накапливаются в фазах бутонизации-цветения [Хазиев Р.Ш., 1992]. а также поскольку большинство авторов [Daniee Е. Моегшап, 1977; Albert Y. Lung, 1980]

сообщают, что в народной лечебной практике применяют именно надземную часть амаранта, мы использовали эту часть биомассы растения A. cruentus, собранную в фазе цветения. Исходный материал получали в совхозе "Овощевод" Зеленодольского района Татарстана. Сырьё готовили из урожая 1993, 1994 и 1995 гг., высушивая растения в темноте в потоке теплого воздуха.

2) Известно, что в свежих листьях накапливаются вторичные метаболиты, большинство из которых являются биологически активными соединениями растительного происхождения. В связи с этим собирали свежий лист красной формы A. cruentus (К-23), содержащий по литературным данным [Piatelli M. and Minai L., 1964; Hung and Von Elbe, 1986] пигмент алкалоидной природы - амарантин. Лист срезали в период бутонизации растений, культивируемых на опытном участке БНИИССОК РАСХН (Московская область).

Для исследования активности полученных промежуточных и конечных фракций веществ использовали 334 лабораторных крыс-самцов линии Wistar, массой 220-260г.

Методы получения испытуемых материалов. Для расширения круга изучаемых веществ, входящих в состав амаранта, использовали различные методы выделения. В основу были положены способы, к наиболее часто используемые для получения биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов. Как указано на схемах 1, 2 и 3 работа была направлена на выделение БАФ растительного происхождения (биологически активных фракций из высушенного сырья, выделение пектина и получение фракции амарантина) тремя способами:

1. Получение фракций из высушенного сырья (схема 1). Ввиду того, что в традиционной лечебной практике часто используются смеси веществ из растений в виде настоек (вытяжек), а также учитывая то обстоятельство, что приготовленные вытяжки из надземной части амаранта применяют как жаропонижающее средство [Амирдовлат Амациаци, 1990], для остановки кровотечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний [Махлаюк, 1967], от головной боли и лечения опухолей [Сахобидинов, 1948; Hartwell, 1967], мы начали исследования с трёх основных вытяжек: водной, водно-спиртовой и этилацетатной (см. схему 1).

К сырью, измельченному механическим путем до размера ме- • нее 0.1 мм, добавляли дистиллированную воду, 70%-ный этанол или этилацетат в соотношении 1:10, перемешивая нагревали до 35-40 °С

Получение вытяжек водой, 70%-ным этанолом и этилацетатом

¡1 _I 2 |з

«Г)

водная

Щ

9 (5

70% этанольная 1 ( этилацегатная

Получение экстрактов различными органическими растворителями

^ ¿) 6 (Ь (з>

/15

Г/I / ТТЛ ^ХХ л

Фракционирование экстрактов колоночной хроматографией

^ /\ ТТЛ /У

Повторное разделение активных фракций колоночной хроматографией

(25)

Схема 1.

стадии выделения биологически активных фракций из

высушенного сырья надземной биомассы а.сииемтиэ.

0 ^ @ - биологически активные продукты,

О - дополнительно испытаны на ИСК смесь квертицина и рутина (20) или в отдельности квертицин (28) и рутин (30), - номер не испытанного материала обозначен без круга.

на водяной бане в течение часа, затем раствор фильтровали и центрифугировали при ЗОООд в течение 20 мин. Надосадочную жидкость упаривали, после чего проверяли биологическое воздействие вытяжек (урожая 1993 и 1994 гг.) на работу ИСК. Далее водную и водно-этанольную вытяжки, обработали хлороформом или н-бутанолом, а этилацетатную вытяжку - петролейным эфиром и гексаном. Полученные экстракты на схеме 1 обозначены под номерами 4-12.

Экстракты, полученные из сырья урожая 1994 г., обладающие выраженной биологической активностью (на схеме 1 обозначены 5, 6, 8 и 9), подвергались разделению методом колоночной хроматографии на силикагеле 100/250р марки I. СЬете ЧССР. Из полученных 10 фракций суммы веществ, к дальнейшему разделению, были выбраны 17-ая, 20-ая, 23-ая и 24-ая фракции, так как эти фракции оказали статистически достоверное влияние на деятельность ИСК. Из сырья урожая 1995 г. по выше описанной схеме получили аналогичные (по ТСХ) четыре активные фракции суммы веществ и вновь приступили к повторному их фракционированию и изучению влияния на работу ИСК полученных субфракций.

Таким образом, при испытании 12 фракций (с 25-ой по 36-ю, схема 1) в концентрациях 0.004 и 0.04 г/л были выбраны три биологически наиболее активные субфракции (26, 34 и 35).

2. Получение фракции пектина. Из цельного сырья (измельченного от 0.1 до 0.8 мм) или жома (остатка сырья после извлечения из него вытяжки водно-этанольным растворителем) гидролизом 25% щавелевой кислотой (в течение 3 часов при температуре 45-50 °С) или ферментативной обработкой (в течение 24 часов), получали гидролизат. Его отфильтровывали, и концентрировали, пропуская через мембранный фильтр с границей фильтрации 50 кДа, на ультрафильтрационной установке АУФ-01. Не прошедший через поры продукт осаждали 96%-ным этанолом в соотношении 1:2. Выпавший в осадок пектин, высушивали лиофильно (схема 2). Степень очистки проверяли методом ИК-спектрометрии (рис. 2)

3. Получение фракции амарантина. Свежий лист красной формы А. сгиепШэ, погружали в 0.005 М трис-буфер рН 6.9 или дистиллированную воду (в соотношении 1:10-15) и измельчали гомогенизатором ЫРШ-324 (ПНР) в течение 20 мин. Гомогенат отжимали через. полотняную ткань, и в течение 30 минут центрифугировали при 6000 об./мин. Полученный раствор лиофильно высушивали.

ЖОМ

водно-этанольной вытяжки или СЫРЬЕ цельной надземной биомассы

ГОМОГЕНИЗАЦИЯ

свежий лист на ИР\М-324

£

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

гомогената 10 мин при бОООд

О

сушка

лиофильная супернатанта

т

гельфильтрация

Iсупернатанта на сефадексе 0-75/

гельфильтрация

повторная на сефздексе С-50

С сушка

лиофильная )

- АМАРАНТИН

Схемы 2 и 3. Стадии выделения фракций пектина и бетацианинов, в том числе амарантина из растения А. сгиепШв.

Полученный порошокообразный продукт красно-фиолетового цвета, после проверки на биологическую активность, разделяли двукратной гельфильтрацией на сефадексе С-75 и С-50 (схема 3). При этом на каждом этапе фракционирования изучали степень очистки фракции амарантина от сопутствующих примесей, её биологическую активность и физико-химические свойства. Процентное соотношение (от сырья) выхода выбранных биологически активных конечных продуктов, выделенных из растения А. сгиепШв, показано в таблице 1.

Следует подчеркнуть, что хотя при получении каждого промежуточного или конечного продукта из сырья разных урожаев (1993-1995 гг.) применяли одну и ту же схему выделения, тем не менее для установления идентичности продуктов разных урожаев

s

дополнительно использовали ТСХ, ВЭЖХ, а также УФ и ИК-спектрометриго (рис. 2, 5 и 6).

Методы биологического испытания получаемых продуктов

При изучении действия выделяемых из A. cruentus промежуточных продуктов (вытяжек, экстрактов и фракций), а также более очищенных субфракций или гомогенных веществ на модели изолированного интактного или ишемизированного сердца крысы, перфузированного по методу Лангендорфа в модификации Фаллена (ИСК), использовали следующую технику [Neely J.R., et al., 1975; Trouve R. and Nohas G., 1985]. После 25 минутной восстановительной перфузии ИСК, в случае интоктной модели в перфузирующий раствор (перфузат) добавляли обычно первоначальные две концентрации продукта в расчете на один литр перфузата: 0.001 г (с 25-ой по 50-60-ую минуты), затем доводили до 0.005 г (с 60-ой минуты) или иногда (при первом испытании материала) концентрацию увеличивали до 0.01 г после 70-80-ой минуты работы ИСК. В случае отсутствия эффекта при исходных концентрациях, начинали с 0.01г/л, или с более низкой концентрации, если первая дала эффект.

Изучение действия веществ на патологическое состояние биологической системы проводили на модели ишемизированного ИСК. В этих экспериментах за 5 минут до начала ишемии (при изучении защитного эффекта ) или через 5 минут после окончания периода ишемии (при изучении лечебного эффекта) [Моргунов А.А. 1991; Deng K.Y., et. all 1993], испытуемый материал добавляли в расчете 0.05 г на литр перфузионного раствора. В ходе эксперимента регистрировали следующие основные показатели; развиваемое давление в левом желудочке (Рмах) и скорость коронарного протока - количество вытекающей из сердца жидкости в единицу времени (СКП). Регистрацию показателей вели каждые пять минут в течение всего периода (90-110 мин) испытания активности исследуемого материала.

Обработку результатов эксперимента проводили согласно методу математического анализа. При этом вероятность (Р) различия данных (неспарешшх выборок), полученных в экспериментах, оценивали по таблице Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика активных фракций суммы веществ (схема 1)

Первоначальные продукты обработки сырья - водная, водно-этанольная и этилацетатная вытяжки - при анализе с помощью ТСХ отличались между собой. Как показано на рис. 1, их отличие состояло в том, что в водную вытяжку входили вещества полярной природы, а также нейтральные пигменты, хотя и в малых количествах. В водно-этанольной вытяжке обнаружены фенольные соединения, в частности флавоноиды (кверцетин и рутин). Исходя из анализа ТСХ, можно считать, что в отличие от водной, в водно-этанольной вытяжке содержатся почти все полярные и неполярные вещества амаранта примерно в равном соотношении. Этилацетат извлекает из сырья преимущественно неполярные соединения, в основном липиды, зеленые пигменты и относительно немного флавоноидов.

При изучении биологического воздействия этих вытяжек на работу ИСК обнаружено, что водная вытяжка в концентрации 0.1 г/л незначительно уменьшила значения Рмах и СКП, тогда как водно-этанольная вытяжка при 0.05 г/л напротив увеличила значение этих параметров. Этилацетатная вытяжка не влияла на работу ИСК, и лишь при большой концентрации (1г/л) показатель СКП уменьшался по отношению к контролю.

Из девяти продуктов, полученных экстракцией трёх вытяжек органическими растворителями, при анализе на ТСХ в двух системах (хлороформ-этилацетат-н-бутанол 6:3:1 и 2:3:5), хлороформенные экстракты 4 и 7 оказались близкими по составу веществ с гексановым экстрактом (11-ый на схеме 1). Поэтому на биологическую активность исследовали лишь семь (5, 6, 8-12) экстрактов. В результате было обнаружено, что четыре экстракта (5, 6, 8 и 9; см. схему 1) по разному влияли на интактное ИСК. Особенно, экстракт б показал чёткую тенденцию снижения СКП ингактного ИСК, экстракт 8 статистически достоверно повысил показатели СКП и Рмах интактного ИСК, а 9-ый экстракт незначительно увеличивал показатели СКП и Рмах при интактном состоянии сердца и улучшал восстановительную способность ишемизированного ИСК.

Известно, что а-токоферол - антиоксидант, положительно влияющий на работу ИСК [1о-Ус, е1 а1., 1994], в амаранте содержится

Рис. 1. Хроматография на силуфоловой пластинке фракций в системе хлороформ-ацетон-метанол (5:4:1)

Примечание: Арабские цифры обозначают испытанные продукты (см. на схеме!) а буквы Р и Л - два чистых соединения - рутин и лизин, использованные в качестве метчиков.

Римские цифры отражают аналогичность пятен между собой по окраске, появляющейся при опрыскивании нингидрином. Кроме экстракта 8(1993), все продукты получены из сырья 1994 г.

в незначительном количестве. Однако, представлялось интересным проверить влияние фракции неполярных веществ на модель ИСК с точки зрения возможного синергического воздействия этих веществ в том числе а-токоферола, который по данным [Хозиев Р.Ш., 1992] извлекается этилацетагом из надземной части А. сгиепШя. Оказалось,

что при различных концентрациях (от 0.001 до 0.5 г на литр), сами этилацетатные вытяжки (1993 и 1994 г.) или их органические экстракты (на схеме 1 номера 10, 11 и 12) не проявляли статистически достоверного воздействия на функциональную деятельность интактного или ишемического ИСК. Поэтому дальнейшему разделению они не подвергались. Полученные хроматографи-чески на колонке с силикагелем из четырёх выбранных активных экстрактов урожая 1994 г. десять фракций суммы веществ (на схеме 1 номера 13-17 и 19-24) анализировались на ТСХ. На этой стадии получения активных фракций нам удалось идентифицировать два соединения - кверцетин и рутин, содержащиеся в значительном количестве в 20-ой фракции. При сравнении с метчиками -промышленными образцами кверцетина и рутина, подвижности двух основных пятен в двух системах на ТСХ были аналогичными (рис. 2).

О

0

О

Л:

О ОС

тп

р 19 )30 21 20 21 8 зо К

Рис. 2. Хроматография на силуфоловой пластинке 8-го экстракта и компонентов полученных из него в системе хлороформ-ацетон-метанол (5:4:1) Примечание: Арабские цифры обозначают испытанные продукты (см. схему 1), а бухвы Р и К - два чистых соединения - рутян и кверцетин, использованные в качестве метчиков.

Также проводилось предположительное определение природы основных веществ входящих во фракции 17, 23 и 24. При опрыскивании пластинки нингидрином, в 17-ой фракции обнаружены два пятна соединений, у которых имеются ЫНг группы. Наличие 1МН2- групп, было также установлено у 6-ого.

Результаты аналитической ТСХ показали, что в 24-ой фракции тоже были пятна, проявившиеся при опрыскивании нингидрином, но интенсивность окрашивания была слабой. Исходя из способа их получения, а также на основе цветных реакций с соответствующими реагентами (нингидрин и пары иода), можно предполагать, что в данную фракцию входят вещества, в составе которых содержится аминный или амидный азот, в частности аминокислоты. Необходимо отметить, что в 20-ой фракции не обнаружены ни нейтральные липиды, ни окрашенные пигменты.

При изучении влияния выделенных фракций и соединений на ИСК, как показано на рисунке 3, бутанольный экстракт 8 (водно-этанольной вытяжки) и его компонент -20-ая фракция (содержащая в основном рутин и кверцетин) показали положительное воздействие на метаболизм миокарда. Однако, чистые промышленные препараты рутина и кверцетина или их смеси не были активными. Таким образом можно предположить, что спиртовый экстракт 8 проявляет активность за счет суммарного действия нескольких физиологически активных соединений в результате их синергизма.

После обработки водно-этанольного экстракта н-бутанолом водная фаза (на схеме 1 номер 24) и полученные из нее субфракции 34 и 35 (рис. 4), существенно повышали СКП, а 34-ая субфракция кроме того увеличивала Рмах. Напротив 17-ая фракция и субфракция 26 снижали СКП. Однако, биологическая активность 8-ого экстракта исчезала (рис. 3), по мере его разделения на компоненты. Судя по результатом аналитической ТСХ 28-ая и 30-ая субфракции, полученные из 20-ой фракции, были идентичными с высокоочищенными образцами соответственно кверцетина и рутина (рис. 2). 35-ая субфракция имела больше аминных компонентов (при опрыскиваии пластинки ТСХ нингидрином по сравнению с другими субфракциями образовывались пятна с ярким темно-пурпурным оттенком, характерным для аминных групп). У всех субфракций не были обнаружены ни нейтральные вещества, ни пигменты.

100«

0.004 г/л i i i 0.04 г/л i i i i i i

1 15 25 i i i i i i i I I 35 45 55 65 75 85 95 105 115

60

100

15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115

Продолжительность перфузии

— О 0P+K 4-р ge -О- 20

Рис. 3. Сравнительная оценка влияния 8-го экстракта,

выделенного из АтагапШиэ сгие^ия Ь. и его компонента, на скорость коронарного протока (СКП) и сократительную силу левого желудочка (Рмах) изолированного интактного сердца крыс По оси ординат: А - СКП в % и Б - Рмах в %

Примечание: 0 - контроль, Р+К — смесь промышленных препаратов рутина

кверцетина, Р-рутин, 8-8-ой экстракт и 20-20-ая фракция (схема 1) » - достоверность различий между контролем и опытом (Р < 0.05)

25 35 45 55 65 75 85 95

Продолжительность перфузии в минутах

—О +26-©-34 -В-а ^ 17-0-35 24 -^-П

Рис. 4. Сравнительная оценка влияния наиболее биологически активных фракций А. сгиепШя на скорость коронарного протока (СКП) и сократительную силу левого желудочка (Рмах) изолированного интактного сердца крыс

По оси ординат: А - СКП в % и Б - Рмах в %

Примечание: 0 - контроль, 17 и 24 - фракции; 26, 34 и 36 - субфракции (схема 1), П - пектин (схема 2), и а - амарантин (схема 3), * - достоверность различий между контролем и опытом (Р 2 0.05).

Необходимо подчеркнуть, что как видно на рисунке 6А, степень уменьшения СКП возрастала по мере разделения водной вытяжки на экстракты (6), фракцию (17) и затем субфракцию (26). Напротив выделенные из водно-этанолной вытяжки 34-ая и 35-ая субфракции показали достоверный эффект (особенно, как представлено на рисунке 4А, 34-ая субфракция) увеличения показателя СКП интактного ИСК. Значение Рмах при действии этих фракций имело тенденцию к увеличению при концентрации 0.04 г на литр перфузата (рис. 4Б).

На ишемическом ИСК достоверное воздействие наблюдалось лишь у 34-ой субфракции. Так в концентрации 0.05 г/л она увеличивала силу сокращения ишемического сердца (рис. 7). Хотя и не так заметно фракция 35 также вызвала увеличение показателей СКП и Рмах ишемического и реперфузированного ИСК.

Дополнительно были испытаны кверцетин и рутин, выделенные из А. сгиепШБ, сотрудниками Института органической и физической химии г. Казани, и любезно предоставленные нам. Однако, как показано на рисунке 3, чистый рутин, его аналог полученный нами (30-ая субфракция) или смесь кверцетина и рутина (в соотношении 1:4) по аналогии с 20-ой фракцией, не оказывали достоверного влияния на работу ИСК, по сравнению с 8-ым экстрактом из которого их получили.

Принимая во внимание одинаковые полярности (по ТСХ) и идентичный характер влияния на интактное и ишемизированное ИСК субфракций 34 и 35, можно предположить, что содержат общее действующее вещество.

В заключении данного раздела необходимо отметить, что в дальнейшем для возможного выделения из активных субфракций (26-ой, 34-ой и 35-ой), однородных биологически активных соединений, следует продолжить фракционирование этих субфракций и испытание активности получаемых компонентов сначала на данной модели. Необходимо также исследовать влияние 8-ого экстракта на других биологических моделях. Изучение активности пектина растениия А. степсе (схема 2) При выделении пектиновой фракции чистоту пектина контролировали методом ИК-спектроскопии. Как показано на рисунке 5, по сравнению с заводским яблочным- пектином у фракции пектина, полученной гидролизом 0.25% щавелевой кислоты (схема 2), и ферментами (целлюлолитического и мацеририрующего действия при их соотношении 2.5:1 и дозе 0.7 % к весу сырья), интенсивность

поглощения в областях 3500, 1637 и 658-475 была несколько выше, чем у яблочного пектина, а в областях 1443-1332 см'1 - напротив у пектина растения A. cruentus слабее. Полученный пектин (особенно выделений из жома ферментативным способом), судя по его высокой желирующей способности и обменной емкости по СаС12 [Соснина H.A., и др., 1995], а также на основе данных о том, что после двухкратного осаждения пектина данные по ИК-спектру (рис. 5) не меняются. Поэтому его можно считать очищенным.

Фракция пектина испытана только в чистом виде (лишь конечный продукт), на интактном и ишемизированном ИСК.

В результате статистической обработки данных обнаружено, что показатель СКП интактного ИСК достоверно снижался (при добавлении фракции пектина в концентрации 0.04 г/л ), сохраняя развивающееся давление левого желудочка почти на исходном уровне. Следует отметить, что данный эффект воздействия пектина на интактое ИСК аналогичен действию фракции 17-ой и субфракции 26-ой, хотя в отличие от 26-ой, пектин начал резко снижать проток интактного ИСК (рис. 4) только при концентрации 0.04 г/л.

Полученный эффект пектина при интактном состоянии ИСК, для нас был неожиданным, поскольку предполагали, что под его действием Рмах будет снижаться, т.к. свободные карбоксильные группы галактуроновой кислоты (она составляет 67 % от общего количества моносахаров пектина) в растворе могут связываться с ионами Ca¡* [Torre М. et al., 1992], и тем самым в результате уменьшения концентрации Ca" в перфузате, сила сокращения ИСК должна была бы уменьшаться [Чазов Е.И., 1992]. С другой стороны учитывая способность пектина в самом растении образовывать комплекс с ионами Ca2* [Powell D.A., et. all, 1982], а также в виду того, что при увеличении содержания ионов Ca2* в перфузате увеличивается показатель Рмах, перед испытанием диализировали пектин против деионизированной воды, чтобы за счет него не возрастала концентрация Ca2* в перфузате или в самом миокардиоците. Поэтому причина сохранения силы сокращения интактного ИСК при воздействии фракции пектина не связана с ионами кальция. Кроме того при использовании данной модели при уменьшении СКП показатель Рмах также уменьшался. Однако в проведенных исследованиях интактное ИСК сохранило силу сокращения под действием пектина А. cruentus (рис. 4Б) на весь период эксперимента. Поэтому Рмах и СКП не коррелируются.

* [ ____

i "»>. /г'11''1 и \ а №№

*«й\ й р I П|С2Г

\ р А Щ

1,1 о 5«

5*2 • Е =®

й^я _ _, ___,_,

¡¿СО-2?оо ■ %аса-2500 53оЬ 15оо Гооо 50й

Рис. 5. ИК-спектры пектина, выделенного из растения А. сгиепЫв

А - спектр яблочного пектина, полученного в заводских условиях Б -спектр фракции пектина, полученного из целой надземной биомассы В -спектр фракции пектина, полученного ферментативным способом из жома биомассы А. сшеп1и5 (см. схему 2).

is

Изучение влияния фракции пектина на ишемически поврежденном ИСК выявило (рис. 7), что полученный отрицательный показатель СКП при интактном состоянии не только исчезал, но уже в первые минуты реперфузии ишемизированного сердца пектин улучшал скорость восстановительного процесса по сравнению с контролем. В связи с этим можно было предполагать, что пектин, связывая избыток кальция (образовавшийся при реперфузии поврежденного сердца) [Alto L.E., et all., 1981; Ferrary R„ et all., 1991; Антипенко A.E., 1992], будет защищать миокард от негативного влияния Са2\ Однако с этой гипотезой не согласуется полученный нами результат на интактном сердце. Если бы связывание пектина с ионам Са1* было бы существенно, то, как было сказано выше, на недостаток этого иона интактное ИСК отреагировало бы снижением показателя Рмах. Поэтому можно считать, что, несмотря на резкое снижение СКП, пектин сохранил силу сокращения интактного ИСК на уровне первоначального состояния (в период от 20-ой до 25-ой минуты перфузационного периода) за счёт другого пока неизвестного механизма.

На наш взгляд представляется интересным механизм избирательного суживающего воздействия пектина на коронарные артерии интактного ИСК. Поэтому при дальнейшем испытании пектина и анализе возможного механизма необходимо учитывать результаты других исследователей, показавших, что у детей, получающих пектин в своем рационе, снижалось количество мочи [Pienta К. j. et al., 1995], или сведения, что кондитерский работник, который в течение восьми лет использовал пектин для изготовления кондитерских изделий, заболел астмой [Roth J. A., et al., 1995]. Поэтому причинами воздействия пектина на такие различные части организма (сосуды, бронхи), может быть нечто общее у этих органов. Например, сосуды (уретральные коронарные и бронхи) имеют 1) одинаковую исходную функцию; 2) в основном состоят из гладкой мускулатуры • (эпителиальных клеток) и 3) в стенках сосудов образуются дилататоры (простагландины), функция которых возможно ингибируется пектином, в результате чего сосуды суживаются. Но это все является лишь предположением. Поэтому в необходимо уточнить механизм воздействия пектина на ИСК, а также испытать влияние пектина, полученного из A. cruentus, на других моделях с целью создания лекарственного препарата, содержащего в своём составе это соединение.

Изучение алкалоида амарантина (схема 3)

Поскольку спектр поглощения амарантина, как и у других красно-фиолетовых пигментов представителей бетацианина, имеет максимумы поглощения в ультрафиолетовой области при А. = 270 нм и в видимой области при Х = 535 нм [Кононков П. Ф., и др., 1995], то для оценки чистоты фракции амарантина на каждом этапе очистки, использовали индекс чистоты - соотношение оптических плотностей в видимой и ультрафиолетовой областях (Х535/Х270).

Первоначальный продукт - супернатант (см. схему 3) содержал и другие вещества сравнительно в большом количестве. Однако по мере очистки амарантина величина пиков электронного спектра поглощения этого пигмента при 270 нм и 280 нм снижалась (область, характерная в основном для высокомолекулярных соединений, в том числе белковых), а при 535 нм возрастала ( поглощение характерное для красно-фиолетовых пигментов в том числе и амарантина).

В результате, как показано на рисунке 6, индекс чистоты амарантина возрастал от величины 0.2 (для центрифугата супернатанта) до 2.19 и 2.3 (фракции после гельфильтрации; рис. 6В). Здесь необходимо отметить, что при повторной гельфильтрации на сефадексе G-50, на колонке фракция четко разделилась на три части: первым выходили высокомолекулярные соединения, затем интенсивно окрашенная фракция амарантина и последними выходили желтоватые вещества. Таким образом, именно эта средняя фракция амарантина имела интенсивную красно-фиолетовую окраску и индекс ее чистоты составлял 2.3 (Х535/Х270).

Изучение биологического воздействия центрифугата (после лиофильного высушивания) показало, что при его добавлении в перфузат в концентрации 0.04 г/л статистически достоверно снижался показатель Рмах на 20% от контроля. При этом скорость протока сохранялась на уровне контроля (рис. 4А). Однако по мере очистки амарантина гельфильтрацией от сопутствующих веществ, данный эффект на интакное ИСК исчезал. Очищенная фракция амарантина, как показано на рис. 7, оказывала негативное воздействие на процесс восстановления сократительной способности ишемизированного реперфузируемого ИСК. Особенно сильный отрицательный эффект был получен при добавлении фракции амарантина в концентрации 0.05г/л перфузата за пять минут до начала процесса ишемии. В связи с этим, для предположительного определения механизма воздействия амарантина на интактную и

патологическую модели ИСК, мы изучили некоторые физико-химические свойства амарантина, в частности влияние тех условий, при которых происходит перфузия ИСК. Оказалось, что в условиях перфузии сердца, температура и рН, судя по полученному результату, существенно не влияют на целосность структуры амарантина.

Поэтому на данной стадии изучения амарантина, мы лишь можем предполагать, что такой эффект связан с действием на амарантин ферментов или с влиянием самого амарантина на другие миокардиальные метаболические процессы. Известно, что при ферментативном окислении подобных пигментов алкалоидной природы (схема 4) выделяется перекись водорода (Н202) [Захарова Н.С.,1987] - сильный окислитель липидов мембран миокарда. Поэтому на ряду разных активных форм кислорода Н202 является одной из причин повреждения сердца при ишемическом состоянии [ВПепко, М.У., 1985].

Рис. 6. Спектр поглощения амарантина (см. схему 3) в видимой и УФ области на разных стадиях его очистки

А - спектр супернатанта, полученного из свежего листа

Б - спектр после гельфильтрации супернатанта

В - спектр после повторной хроматографии на сефадексе И- 50

— О О а-5 а П ■©- 34

Рис. 7. Оценка влияния некоторых фракций, выделенных из АтагапНшБ степсе Ь., в процессе восстановления ишемизированного сердца крыс. По оси ординат: А - СКП в % и Б -Рмах в % .

Примечание: 0 - контроль, 34 -34-ая субфракция, П -пектин, а -амарантин и а-5 - амарантин, добавленный в перфузаг за пять минут до начала ишемии; с 30-ой по 60-ой минуты остановлена перфузация (шла ишемия). • - достоверность различий между контролем и опытом (Р< 0.05).

Схема 4. Ферментативное превращение бетацианиновых пигментов II = остаток Сахаров

В пользу этого предположения может служить результат, полученный при добавлении амарантина в перфузат до начала ишемии (Р < 0.001), в сравнении с эффектом уже после начала рсперфузии. Именно при таком способе его добавления в перфузат образующиеся продукты метаболизма амарантина, в частности перекись водорода (если происходит расщепление амарантина согласно схеме 4), усиливают образование липидных радикалов, повреждая тем самым мембраны кардиомиоцитов.

На данном этапе исследования трудно предложить точный механизм воздействия рстальных двух основных продуктов или самих алкалоидов на метаболизм миокарда. Однако можно считать, что негативное влияние амарантина на силу сокращения стенки левого желудка по-видимому связано с повреждающим воздействием на органеллы, в частности, прямым или косвенным путём на миофибриллы миокардиоцитов.

Таблица 1

Выход БАФ от сырья

Название фракции Источник Выход, %

26-я субфракция Высушенная биомасса от 0.03 до 0.05

субфракции -34-я и 35-я Высушенная биомасса от 0.02 до 0.025

Пектиновая фракция Жом после 70%-ной этанольной вытяжки 8 для кислотного и 10 д ля ферментативного гидролиза

Фракция амарантина Свежий лист от 0.2 до 0.3

ВЫВОДЫ

1. Из водной вытяжки надземной высушенной биомассы растения Атагап^в сгиепШв Ь. выделена субфракция веществ (26), а также пектин в концентрации 0.04 г/л избирательно (без изменения показателя Рмах) понижающие скорость коронарного протока (СКП) соответственно на 35 и 50 %.

2. 70%-ный этанол позволяет извлекать субфракцию веществ (34), которая увеличивает сократительную функцию интактного сердца и улучшает восстановительную способность ишемизированного изолированного сердца крыс соответственно на 30 и 40 %.

3. Бутанольный экстракт, полученный из 70% водноэтанольной вытяжки, содержащий в основном кверцетин и рутин, вызывает положительное (30%) инотропное действие на изолированное сердце крысы. Однако в очищенном виде ни кверцетин, ни рутин или их смеси не оказывали влияние на функцию данной модели.

4. Вещества, извлекаемые из надземной биомассы А. сгиепШв этилацетатом, практически не влияют на функционирование изолированного сердца крысы.

5. Супернатант водного экстракта амарантина снижает величину Рмах интактного изолированного сердца крыс на 20 % (не влияя на показатель СКП). Однако этот эффект исчезает по мере удаления соопутствующих компонентов амарантина. Очищенная фракция амарантина на 30% ингибирует процесс восстановления сердца после ишемии.

6. Исследование водной и спиртовой вытяжек, а также фракций веществ после ферментативного или кислотного гидролиза с последующим хроматографическим фракционированием или спиртовым осаждением полученных из растения АтатапШиБ сгиепШв 1«, позволило установить, что АшагапШв сгиепШБ Ь. является ценным перспективным источником биологически активных соединений, в том числе для создания лекарственных препаратов, в частности для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1). Дэсалень Т.Д., Гинс В.К., Коненков П.Ф. Изучение влияния амарантина на работу изолированного сердца крыс. // "Пища, экология и человек" РФ.- Москва, 1995- с. 17

2). Gins V. К., Dessalegn Т. L. Characterization of amaranthine, which is derived from different species of Amaranthus L. // Physical-chemical basis of plant physiology -annual symposium РФ,- Пенза, 1996- p.131.

3). Дэсалень Т.Д., Моргунов А.А. и Офицеров Е.Н. Изучение химических соединений, полученных из растений рода Amaranthus, на кардиотропную активность. // Сб. тез. докл. III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" РФ,- Москва, 1995-с.234

4). Дэсалень Т.Д., Цепаева О.В., Соснина Н.А., Офицеров Е.Н., Гинс В.К. и Кононков П.Ф. Исследования активности действия фракций Amarantus cruentus L. на модели изолированного сердца крыс. // Сб. тез. докл. III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" РФ,- Москва, 1996- с.19

5). Дэсалень Т.Л., Цепаева О.В., Соснина Н.А., Елькина Г.И., Левандовский И.В., Бравова Г.Б., Офицеров Е.Н. и Лапин А.А. Выделение и изучение биологической активности пектина А. cruentus. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (1997) N. 1 с.31-95

1). Гинс М.С., Кононков П.Ф., Лысенко Г.Г., Дэсалень Т.Л. и др. Физико-химические свойства и биологическая активность амарантина из растений А. сгиепШв. // Прикладная биохимия и микробиология (1997) N. 6

Сдано в печать: