Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение тайтина и белков его семейства в скелетных мышцах в норме, при гибернации и микрогравитации
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Изучение тайтина и белков его семейства в скелетных мышцах в норме, при гибернации и микрогравитации"
На правах рукописи
Вихлянцев Иван Милентьевич
ИЗУЧЕНИЕ ТАЙТИНА И БЕЛКОВ ЕГО СЕМЕЙСТВА В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ В НОРМЕ, ПРИ ГИБЕРНАЦИИ И МИКРОГРАВИТАЦИИ
03.00.02 - биофизика АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино - 2005
Работа выполнена в лаборатории структуры и функции мышечных белков Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Зоя Александровна Подлубная
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Григорий Александрович Наследов
кандидат биологических наук Ольга Васильевна Накипова
Ведущая организация: Уральский Государственный Университет
Защита состоится «6» июля 2005 г. в 12.00
на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область,
г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.
Автореферат диссертации разослан «2» июня 2005 г
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Н.Ф. ^аиина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В настоящее время известна большая группа эластичных белков семейства тайтина (тайтин, С-белок, Х-белок и другие), относящиеся к саркомерным цитоскелетным белкам поперечно-полосатых мышц позвоночных. Тайтин -гигантский эластичный белок скелетных и сердечных мышц млекопитающих с молекулярным весом более 3000 кДа (Labeit & Kolmerer, 1995). Он был открыт независимо двумя группами исследователей, обнаруживших на картинах ДСН-гель-электрофореза поперечно-полосатых мышц в крупнопористых (2-3%) гелях двойные полосы, которые соответствовали белкам с молекулярной массой более 1000 кДа (К. Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981). Белки получили название тайтин 1 (Т1) и тайтин 2 (Т2). Т2 считается протеолитическим фрагментом тайтина 1. Тайтин является третьим (после актина и миозина) по количеству компонентом саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных. Молекулы тайтина длиной около 1 мкм (Tskhovrebova & Trinick, 1997) перекрывают половину саркомера от М-линии до Z-линии, простираясь через I- и А-зоны саркомера, формируя третью филаментную систему в миофибриллах (Fürst et al., 1988). В А-диске тайтин прочно связан с миозин-содержащими (толстыми) нитями. В районе I-диска тайтиновые молекулы проходят свободно, образуя эластичное соединение между концами толстых нитей и Z-мембраной.
С-белок (м.в. 135 кДа) в быстрых волокнах скелетных мышц и его изоформа Х-белок (м.в. 145-152 кДа) в медленных волокнах располагаются на поверхности толстых нитей с периодом 43 нм (Bennett et al., 1986), связываясь одновременно с тайтином и миозином. Предполагается, что тайтин и белки его семейства играют существенную роль в миогенезе при сборке толстых нитей и формировании структуры саркомера, участвуют в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении. Тайтин вносит вклад в пассивное натяжение, развиваемое мышцей, и, возможно, участвует в регуляции генной экспрессии, обновления белков и активности ионных каналов (см. обзор Granzier & Labeit, 2004). Тем не менее, не все свойства этих белков в норме до конца изучены. Недостаточно исследован изоформный состав тайтина в скелетных мышцах животных и человека, хотя, как показано, ген тайтина имеет потенциальную возможность кодирования тайтиновых изоформ разных по длине эластичной части молекулы в I-диске саркомера. Не изучено влияние Х-белка на структуру миозиновых нитей, а также эффекты тайтина и Х-белка на Са2+-чувствительность актомиозиновой системы. Остается не решенным вопрос о связывании тайтина с актином в I-зоне саркомера и не определена функциональная значимость такого взаимодействия. Имеются только предварительные данные о способности белков семейства тайтина фосфорилироваться, однако отсутствуют количественные оценки степени фосфорилирования и неизвестно функциональное значение этой посттрансляционной модификации. Поэтому одна из задач данной работы заключалось в изучении структурно-функрЦ^р^^щ^етюйе«--тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц в норме. I ВмадивтекА^'' I
J I
,».тшшгя Л
эъи
Не изучена роль белков семейства тайтина в мышцах при изменении условий внешней среды. В качестве таковых в работе были рассмотрены зимняя спячка и микрогравитация. Интерес, проявляемый к изучению зимней спячки (гибернации) млекопитающих, определяется, прежде всего, способностью зимоспящих животных адаптироваться к экстремальным условиям среды за счет снижения активности всех физиологических систем организма, включая мышечную, при сохранении контроля за согласованностью их действия (L. Wang, 1987). Поскольку при гибернации животные длительное время пребывают в обездвиженном состоянии, после чего за несколько часов способны перейти к нормальной двигательной активности без патологических последствий, есть основания ожидать, что в скелетных мышцах зимоспящих происходят обратимые адаптационные изменения, которые могут вносить вклад в смену физиологического состояния животных. Полученные ранее в нашей лаборатории данные об изменениях изоформного состава и свойств миозина скелетных мышц сусликов при гибернации (Лукоянова, 1997) подтверждают это предположение. В настоящей работе проведено исследование адаптационных изменений в белках семейства тайтина в скелетных мышцах сусликов при гибернации для изучения вклада этих изменений в ингибирование двигательной активности мышц.
Изучение поведения тайтина и белков его семейства в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации только начинается. Скелетные позно-тонические мышцы млекопитающих испытывают драматические структурно-функциональные изменения в условиях реальной или моделируемой микрогравитации. Комплекс этих изменений можно охарактеризовать как своеобразный «гипогравитационный мышечный синдром», который проявляется в развитии мышечной атрофии, сопровождающейся уменьшением объема мышечных волокон, деструктивными изменениями миофибриллярного аппарата, снижением тонуса, выносливости и общей работоспособности мышц (Гуровский и др., 1975; Fitts et al., 1998). Недавно проведенные исследования выявили уменьшение количества Т1 в m. soleus крыс при моделировании условий гравитационной разгрузки (Toursei et al., 2002). Однако в литературе отсутствуют данные об изменении тайтина в m. soleus человека, а также о поведении Х-белка в этой мышце при микрогравитации.
Цель работы
Изучение вклада изменений тайтина, С-белка и Х-белка в подавление сократительной активности скелетных мышц при гибернации и в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» при моделируемой невесомости.
Задачи исследования
1. Изучение молекулярных параметров тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика, связывания этих белков с миозиновыми нитями и их влияния на ферментативные и регуляторные свойства актомиозина в норме;
2. Изучение связывания тайтина скелетных мышц кролика и суслика с актиновыми нитями в норме;
3. Изучение изоформного состава тайтина в быстрой (m. psoas) и медленной (m.soleus) скелетных мышцах исследуемых животных и человека в норме;
4. Изучение адаптационных изменений изоформного состава и степени фосфорилирования тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц сусликов при зимней спячке и вклада этих изменений в подавление функциональных свойств миозина;
5. Изучение изменений изоформного состава тайтина и Х-белка в ш. soleus человека и крыс при моделировании условий невесомости;
6. Оценка эффективности подходов, направленных на предотвращение или уменьшение негативного влияния моделируемой невесомости на m. soleus.
Научная новизна работы
Обнаружены новые свойства исследуемых in vitro белков в норме: активирующий эффект тайтина и ингибирующий эффект Х-белка на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина; способность тайтина скелетных мышц связываться с актиновыми нитями. Полученные результаты указывают на участие белков семейства тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в скелетных мышцах. С помощью оптимизированной нами методики ДСН-гель-электрофореза в m. soleus животных и человека в норме обнаружены изоварианты N2А изоформы тайтина с м.в. более 3700 кДа. Выявлено избирательное уменьшение количества коротких изовариантов N2A изоформы тайтина при отсутствии изменений количества длинных изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке, что указывает на преимущественную атрофию быстрых мышечных волокон и сохранение медленных волокон скелетных мышц в этот период. Показано, что увеличение степени фосфорилирования тайтина и Х-белка в скелетных мышцах гибернирующих сусликов приводит к снижению активирующего влияния тайтина и увеличению ингибирующего влияния Х-белка на ферментативные и регуляторные свойства актом иозина. Сделано предположение, что увеличение степени фосфорилирования саркомерных цитоскелетных белков при гибернации, наряду с изменениями изоформного состава тайтина, вносит вклад в подавление сократительной активности мышц в этот период. В отличие от гибернации в условиях моделируемой микрогравитации в m. soleus крыс и человека обнаружено неизбирательное уменьшение количества и короткого, и длинных изовариантов N2A изоформы тайтина, что, наряду с другими изменениями в мышечном аппарате, вносит вклад в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома». При исследовании эффективности подходов, направленных на снижение негативного влияния микрогравитации на мышцы, показано, что хроническое растяжение ш. soleus крыс или тенотомия мышц-антагонистов т. soleus крыс на фоне гравитационной разгрузки снижают степень деградации тайтина и предотвращают уменьшение количества Х-белка.
Научная и практическая значимость работы
Полученные результаты расширяют представления о роли тайтина и белков его семейства в регуляции мышечного сокращения в норме и
свидетельствуют о вкладе указанных белков в молекулярные механизмы зимней спячки млекопитающих. Изучение зимней спячки, как природной модели адаптации мышц к экстремальным условиям, помогло понять специфику изменений саркомерных цитоскелетных белков при атрофии мышц у человека и животных в условиях микрогравитации. Эти результаты имеют большое практическое значение, поскольку регистрация поведения тайтина и белков его семейства в мышцах человека при моделируемой и реальной микрогравитации позволяет оценить эффективность подходов, направленных на уменьшение или предотвращение негативного влияния микрогравитации на мышцы.
Апробация работы
Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на многих российских и международных конференциях, в частности, на 29-ой, 31-ой, 32-ой и 33-й Европейских мышечных конференциях (Берлин, Германия 2000; Люнтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004); Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2001, 2004), XVIII физиологическом съезде (Казань, 2001); 2-ой и 3-ей Международных конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005); 24-ом 25-ом Международных гравитационных физиологических съездах (Санта-Моника, 2003;, Москва, 2004); Конференциях молодых ученых, посвященных дню космонавтики (Москва, 2004, 2005); Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2000-2005); на заседании секции Ученого совета ИТЭБ РАН «Биологическая подвижность» от 26 апреля 2005 года.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 49 печатных работ, в том числе 15 статей в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 105 стр., содержит 21 рисунок и 11 таблиц. Список цитируемой литературы включает 238 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальный материал
В работе были использованы зимоспящие суслики Citellus undulatus и кролики породы Шиншилла. Животные содержались в условиях вивария и обеспечивались пищей, водой и гнездовым материалом ad libitum. Суслики были отловлены в Якутии и содержались в индивидуальных клетках при естественном фотопериоде. Использовались гибернирующие (ректальная температура 2-3°С), пробуждающиеся (15-20°С, время пробуждения 1.5-2 часа) и активные (37°С)
животные. Для выделения и очистки белков брались мышцы спины, верхних и нижних конечностей. Для электрофоретического изучения отдельно брались образцы скелетных мышц psoas (быстрая мышца) и soleus (медленная мышца). Также использовались аутопсийные образцы rn. soleus крыс (линия Вистар) и биопсии ш. soleus человека, взятые после проведения экспериментов по моделированию условий микрогравитации в ГНЦ РФ «Институт медико-биологических проблем РАН» (г. Москва). Для создания условий гравитационной разгрузки применялась модель вывешивания задних конечностей крыс в течение 14 суток (Morey-Holton & Globus, 2002) и модель 7-суточной «сухой» иммерсии человека (Шульженко и Виль-Вильямс, 1975).
Выделение и очистка белковых препаратов
Тайтин из скелетных мышц кролика и суслика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993). С-белок и Х-белок скелетных мышц получали по методу (Starr & Offer, 1982). Для изучения влияния тайтина и белков его семейства на структурные и функциональные свойства миозиновых нитей использовали миозин из скелетных мышц кролика, полученный по методу (Offer et al., 1973). Актин из скелетных мышц кролика выделяли из ацетонового порошка, приготовленного согласно (Feuer et al., 1948) по методу, описанному в работе (Pardee & Spudich, 1982). Концентрацию белков определяли спектрофотометрически, используя известные значения коэффициентов экстинции: для тайтина - 1.37 (Trinick et al., 1984), для С-белка и Х-белка - 1.09 (Starr & Offer, 1982), для миозина - 0.52 (Godfrey & Harrington, 1970) и для актина - 1.09 (Rees & Young, 1967).
Гель-электрофорез белков в присутствии ДСН и денситометрия гелей
Для электрофоретического изучения тайтина большинство исследователей применяют градиентные гели с содержанием полиакриламида от 2-3% до 9-12% по методу (Granzier & Wang, 1993), однако анализ таких гелей часто затруднен из-за неравномерного формирования градиента. Альтернативой является использование 2-3% полиакриламидных гелей с добавлением агарозы, придающей им прочность (Tatsumi & Hattori, 1995). Такие гели наиболее приемлемы для выявления изоформ тайтина, но при этом непригодны для изучения белков с низким молекулярным весом, в частности, С-белка и Х-белка (м.в. -150 кДа). Наиболее пригодными для этой цели могли бы быть 15% полиакриламидные гели с пониженным содержанием бис-акриламида (отношение акриламида к бис-акриламиду 200:1) по методу (Fritz et al., 1989). Однако низкая электрофоретическая подвижность тайтина в таких гелях затрудняет его изучение. Поэтому в данной работе применялись все три указанные методики ДСН-гель-электрофореза с нашими модификациями.
Наибольшую модификацию претерпел метод электрофореза по (Fritz et al., 1989), согласно которому разделяющий гель обычно содержал 15% полиакриламида. Мы использовали разделяющий гель с более низким содержанием полиакриламида, (6.5-7%), что приводило к увеличению электрофоретической подвижности тайтина. Кроме этого, вместо
ч
концентрирующего геля с содержанием полиакриламида 5% был применен концентрирующий гель по методу (Laemmli, 1970), содержащий 2.6-2.8% полиакриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1). Это способствовало лучшему фокусированию тайтиновых полос в гелях. Благодаря этим модификациям мы смогли провести электрофоретическое разделение белков с м.в. от 3000 кДа до 100 кДа, что дало возможность исследовать совместное поведение тайтина, С-белка и Х-белка.
Для изучения изоформного состава тайтина мы применили крупнопористые гели с добавлением агарозы по методу (Tatsumi & Hattori, 1995). Мы использовали гелевый буфер с рН 9.0-9.2 вместо 8.6-8.8, что способствовало увеличению электрофоретической подвижности тайтина в геле.
Методика градиентных гелей не претерпела в нашей работе значительных изменений. Отметим только, что концентрация буфера (трис-HCl, рН 8.6), насыщающего гель, в наших экспериментах составляла 0.5 M, а не 0.375 М.
Нами был также изменен процесс приготовления электрофоретических проб. Обычно для лучшей солюбилизации белков электрофоретические пробы перед проведением электрофореза нагревают до 80-100°С в течение нескольких минут. При этом в мышечных пробах увеличивается вероятность протеолиза тайтина эндогенными протеазами. Для предотвращения протеолиза тайтина применяется протеолитический ингибитор леупептин, что, однако, не исключает разрушающего действия на тайтин температур выше 57°С (Granzier & Wang, 1993). Мы инкубировали образцы скелетных мышц в течение 30-40 минут при комнатной температуре в солюбилизирующем растворе, содержащем 10 мМ трис-HCl, 1% ДСН, 10% глицерина, 6 мМ ЭДТА, 80 мМ ДТТ, 8 мкг/мл леупептина, рН 6.8-7.0. Денатурацию белковых препаратов также проводили без дополнительного нагревания, инкубируя пробы в течение 30-40 минут при комнатной температуре в солюбилизирующем растворе, содержащем 12 мМ трис-HCl, 0.5% ДСН, 5% глицерина, 16 мМ ДТТ, рН 6.8-7.0.
Чистоту выделенных препаратов тайтина, С-белка и Х-белка проверяли в 7% полиакриламидном геле по методу (Fritz et.al., 1989) с нашими модификациями. Чистоту препаратов миозина и актина проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970). Электрофоретические гели сканировали на сканере «UMAX Astra 4450». Денситометрия белковых полос в геле проводилась с помощью компьютерной программы Total Lab 1.11.
Изменение степени фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина скелетных мышц суслика при гибернации определяли электрофорезом в 8% полиакриламидном геле в присутствии мочевины согласно методу (Perrie & Perry, 1970).
Фосфорилирование белков in vitro и иммуноблоттинг
Очищенные препараты тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц сусликов фосфорилировали в присутствии радиоактивного изотопа у- [32Р]АТФ с использованием каталитической субъединицы протеинкиназы A (ICN Biochemicals, Cat. number 195812) согласно методикам (Hartzell & Glass, 1984;
Takano-Ohmuro et al., 1992). Для контроля фосфорилирования белковых препаратов применяли метод авторадиографии. Радиоактивность 32Р-меченых препаратов (белковые полосы на гелях) определяли методом счета по Черенкову, описанному в работе (Остерман, 1983), в импульсах в минуту на счетчике «NC-482В» (Венгрия). Ошибка счета не превышала 2%. Анализ содержания связанного фосфата в тайтине и Х-белке скелетных мышц суслика проводили по методу (Somerville & Wang, 1988). Иммуноблоттинг тайтина проводили по методу (Towbin et al. 1970). Использовали моноклональные первичные антитела 9D10 к PEVK-области тайтина в I-диске саркомера.
Определение актин-активируемой АТФазной активности миозина
АТФазная активность реконструированного актомиозина кролика в присутствии (или в отсутствие) тайтина, С-белка или Х-белка скелетных мышц кролика и суслика измерялась по выходу неорганического фосфата (Ф„) с использованием колориметрического метода на основе красящего агента малахитового зеленого (Lanzetta et al., 1979). Соотношение миозина к тайтину по весу составляло 4:1, соотношение миозина к С-белку и Х-белку по весу равнялось 6:1. Расчет Са2+-чувствительности актин-активируемой АТФазы миозина производился по формуле (Lehman & Szent-Gyorgyi, 1975):
Са2+-чувствительность (%) = 100[(АТФазаса) - (АТФазаЕГТД)] / АТФазаЕГГА, где АТФазаЕГтА - АТФазная активность при рСа 7.5; АТФаза^ - АТФазная активность при рСа 4.6.
Электронно-микроскопические исследования
Для приготовления электронно-микроскопических образцов использовали препараты белков с концентрацией 0.05-0.1 мг/мл. Электронно-микроскопические исследования проводили, используя негативно окрашенные образцы. Каплю раствора или суспензии белка наносили на медные сетки, покрытые коллодием и укрепленные углеродом и окрашивали 1-2% водным раствором уранилацетата. Одиночные выпрямленные молекулы тайтина скелетных мышц получали по методу (Tskhovrebova & Trinick, 1997), оттеняя платиной и углеродом. Исследования проводили на микроскопе JEM-100В при ускоряющем напряжении 100 кВ и увеличении 20000-40000х. Увеличение микроскопа было тестировано по паракристаллам парамиозина с периодичностью 14.5 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Изучение структурно-функциональных свойств тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика в норме
Прежде чем приступить к изучению поведения тайтина, С-белка и Х-белка в мышцах при гибернации и микрогравитации, мы провели исследование структурно-функциональных свойств этих белков в норме на примере кролика и активного суслика. Важность проведенных нами экспериментов заключалась в открытии новых свойств белков семейства тайтина, а также в подтверждении уже известных данных о структуре и функциях этих белков.
1.1. Электронно-микроскопическое изучение молекулярных параметров и агрегационных свойств молекул тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика в норме
По данным электронной микроскопии молекула тайтина скелетных мышц кролика и активного суслика имеет вид гибкой нити длиной 0.9-1 мкм и диаметром 3-4 нм с глобулярной головкой на одном конце, что согласуется с литературными данными для тайтина кролика (Tskhovrebova & Trinick, 1997). При низких значениях ионной силы (ц < 0.1) тайтин скелетных мышц изученных животных образует плотные пучки линейных фибрилл.
Молекулы С-белка и его изоформы Х-белка скелетных мышц кролика и суслика представляют собой короткие гибкие ниточки диаметром 2-4 нм. Длина молекул С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика по нашим данным составила 17-26 нм и 29-35 нм соответственно (Фрейдина, 1980; Bennett et al., 1985). Длина молекул С-белка и Х-белка скелетных мышц суслика составила 1426 нм и 27-33 нм соответственно. Более точное определение длины затруднено вследствие большой гибкости молекул. При снижении ионной силы ниже физиологических значений (ц < 0.1) С-белок скелетных мышц кролика и суслика образует аморфные агрегаты (Фрейдина, 1987). Х-белок скелетных мышц кролика в этих условиях кроме аморфных агрегатов формирует спирально скрученные ленточные фибриллы с осевой периодичностью около 66 нм (Bennett et al., 1985), а также пучки линейных фибрилл, которые впервые были обнаружены с помощью электронной микроскопии в наших исследованиях. X-белок скелетных мышц суслика агрегирует с образованием пучков линейных фибрилл, которые не отличались от линейных агрегатов Х-белка скелетных мышц кролика.
Таким образом, не было выявлено отличий в молекулярных параметрах и агрегационных свойствах молекул изученных белков скелетных мышц кролика и активного суслика.
1.2. Взаимодействие тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика с миозином в норме
Миозин скелетных мышц кролика при диализе в условиях, близких к физиологическим, образует биполярные веретенообразные нити с осевым периодом ~14 нм, свойственным толстым нитям in vivo. Добавление тайтина скелетных мышц кролика (или суслика) приводит к пучкованию миозиновых нитей, что указывает на in vitro связывание этих белков, которое имеет место и в мышце. Добавление С-белка скелетных мышц кролика (Фрейдина и др., 1980) или суслика к миозину приводит к образованию длинных и тонких нитей, декорированных агрегатами С-белка. Подобный эффект наблюдался нами впервые и при добавлении Х-белка скелетных мышц кролика или суслика к миозину.
Таким образом, наши электронно-микроскопические наблюдения подтверждают результаты других авторов, полученные не визуальными методами, о связывании тайтина и С-белка с миозиновыми нитями и впервые
демонстрируют связывание Х-белка с нитями миозина in vitro.
1.3. Влияние тайтииа, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика на АТФазную активность и Са2+-чувствительность реконструированного актомиозина в норме
К настоящему времени достаточно изучены эффекты скелетного С-белка на актин-миозиновое взаимодействие. Показано, что при низких ионных силах (ц <0.1) С-белок скелетных мышц кролика ингибирует АТФазу актомиозина (AM) (Offer et al., 1973; Фрейдина и др., 1980). При ц > 0.1 С-белок увеличивает скорость гидролиза АТФ актомиозином, снижая чувствительность системы к Са2+ (Freydina et al., 1986). Влияние тайтина и Х-белка скелетных мышц на АТФазные свойства AM in vitro изучено недостаточно. Показано, что при ц < 0.1 тайтин оказывает активирующий (Kimura et al., 1984), а Х-белок ингибирующий (Yamomoto & Moos, 1983) эффекты на АТФазную активность актомиозина. Однако не исследовано влияние этих белков на Са2+-чувствительность AM системы при условиях, близких к физиологическим (ц = 0.12).
Результаты, проведенных нами исследований, показали, что в присутствии тайтина скелетных мышц кролика и активного суслика наблюдается увеличение АТФазной активности в -1.4 раза (при рСа 7.5) и в -1.55 раза (при рСа 4.6) и увеличение Са2+-чувствительности AM. С-белок оказывает меньший активирующий эффект на АТФазу актомиозина (увеличение в -1.3 ив -1.2 раза) и снижает Са2+-чувствительность системы. В отличие от эффектов тайтина и С-белка, Х-белок ингибирует АТФазу AM (в -1.2 и в -1.3 раза) и подавляет ее Са2+-чувствительность.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о влиянии исследуемых нами белков скелетных мышц на актин-активируемую АТФазную активность и Са2+-чувствительность миозина in vitro. Различия в эффектах тайтина, С-белка и Х-белка на функциональные свойства реконструированного AM можно объяснить разным влиянием этих белков на заряд и (или) структуру миозиновых мостиков, однако наши электронно-микроскопические исследования не позволяют выявить эти локальные изменения. Тем не менее, полученные нами результаты о влиянии белков семейства тайтина на функциональные свойства AM in vitro подтверждают предположение об участии этих белков в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышце.
1.4. Взаимодействие тайтина скелетных мышц кролика и суслика с Ф-актином в норме
Решение вопроса об участии тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышце невозможно без выяснения его способности взаимодействовать с актином in vitro. Ранее было высказано предположение, что тайтин способен слабо связываться с тонкими (актин-содержащими) нитями (Funatsu et al., 1993). Проведенные in vitro исследования по связыванию рекомбинантных фрагментов тайтина с актином (Kulke et al., 2001; Raynaud et al., 2004), а также электронно-микроскопические наблюдения, включающие избирательное удаление тонких нитей из миофибрилл (Trombitas et al., 1997), не
противоречили этому предположению. Однако прямого подтверждения связывания целой молекулы тайтина с актином in vitro до сих пор не показано. Нами было проведено электронно-микроскопическое изучение in vitro взаимодействия тайтина скелетных мышц кролика и суслика с упорядоченными пучками Ф-актина, т.е. паракристаллами (ПК), сформированными в растворе 50 мМ MgCl2, 5 мМ имидазол-HCl, рН 7.0. По данным электронной микроскопии паракристаллы актина имеют ширину 50-200 нм и достигают в длину нескольких микрон. Они образованы бок-о-бок упакованными нитями актина и имеют тупые концы. Наблюдается плотная упорядоченная упаковка субъединиц актина в нитях с периодом 36-38 нм. Связывание тайтина с ПК актина должно было приводить к изменению их структуры. Действительно, добавление тайтина (выделенного из скелетных мышц как кролика, так и суслика) к актину в весовом соотношении 1:2 во время формирования ПК или к уже сформированным ПК приводило к снижению размеров паракристаллов, нарушению упорядоченной упаковки нитей в ПК и образованию рыхлых агрегатов с заостренными концами. Также отмечалось большое количество одиночных нитей. Увеличение количества тайтина в системе (весовое соотношение белков 1:1) приводило к более выраженным его эффектам на структуру ПК.
Наблюдаемое нами in vitro связывание тайтина с актином может быть реализовано в мышце, и быть даже более сильным, чем его связывание с паракристаллами актина в in vitro условиях. Для формирования плотной упаковки актиновых нитей в паракристаллы нами использованы достаточно высокие концентрации ионов Mg2+ (50 мМ). Наши эксперименты показали, что тайтин успешно конкурирует с магнием за связывание с актином и нарушает упорядоченную структуру ПК. Вследствие этого можно предположить, что при низких концентрациях иона магния в клетке (всего несколько мМ) взаимодействие тайтина с актином будет сильнее. Таким образом, результаты наших электронно-микроскопических исследований свидетельствуют о прямом связывании тайтина скелетных мышц с актином in vitro, а также о возможности такого связывания в мышце in vivo, что может вносить вклад в регуляцию актин-миозинового взаимодействия.
1.5. Электрофоретическое изучение тайтина скелетных мышц животных и человека в норме
Поскольку в сердечных мышцах животных и человека экспрессируются изоварианты тайтиновых изоформ (N2B, N2BA) различные по длине эластичной части молекулы в 1-диске саркомера, одна из задач нашего исследования заключалась в детальном электрофоретическом изучении состава тайтина в быстрой (m. psoas) и в медленной (т. soleus) скелетных мышцах животных (кролик, суслик, крыса) и человека в норме.
По результатам электрофоретического тестирования тайтина в 7% и градиентных (2.5-9%) полиакриламидных гелях в изученных скелетных мышцах человека и животных (кролик, суслик, крыса) мы обнаружили присутствие двух тайтиновых полос в геле: верхней (Т1) и нижней (Т2), который считается протеолитическим фрагментом Т1. Между тем, в работе (Neagoe et al., 2003) с
помощью ДСН-электрофореза в крупнопористом полиакриламидном геле с агарозой было показано, что в m. psoas кролика присутствуют две полосы Т1: короткий и длинный изоварианты N2A изоформы тайтина с м.в. 3300 кДа и 3500 кДа соответственно. В ш. soleus животных и человека была выявлена только одна полоса Tl: N2A изоформа тайтина с м.в. 3700 кДа (Freiburg et al., 2000; Trombitas et al., 2001; Neagoe et al., 2003). С помощью модифицированной нами методики ДСН-электрофореза в крупнопористом полиакриламидном геле с агарозой мы подтвердили присутствие двух изовариантов N2A изоформы тайтина в m. psoas кролика (рис. 1а) и впервые обнаружили два изоварианта тайтина (с м.в. 3300-3500 кДа) в m. psoas суслика.
Рис. 1. Изоварианты N2A изоформы тайтина m. psoas (а) и т. soleus (б) кролика и иммуноблоттинг с использованием моноклональных антител 9D10 к PEVK фрагменту тайтина (в).
а б в
В т. soleus кролика, суслика и крысы нами впервые было выявлено присутствие двух изовариантов N2А изоформы тайтина (рис. 16), что подтвердилось данными иммуноблоттинга (рис. 1в). При этом молекулярный вес короткого изоварианта тайтина в m. soleus изученных животных составил 3700 кДа. В таком случае, молекулярный вес длинного изоварианта тайтина в ш. soleus изученных животных мог составлять -3800 кДа и более. При изучении изоформного состава тайтина в m. soleus человека нами было обнаружено присутствие трех изовариантов N2A изоформы: короткого (м.в. 3700 кДа) и двух длинных (м.в -3800-3900 кДа). Заметим, что анализ нуклеотидной последовательности тайтинового гена человека предполагает возможность кодирования тайтина с молекулярной массой до 4200 кДа (Bang et al., 2001), однако присутствие в мышце изовариантов тайтина с м.в. более 3700 кДа до сих пор не было зарегистрировано. Полученные нами результаты впервые демонстрируют присутствие в скелетных мышцах изовариантов тайтина с м.в. более 3700 кДа.
Открытие разных изовариантов N2A изоформы тайтина в psoas и soleus мышцах млекопитающих в норме позволило нам перейти к изучению поведения каждого изоварианта тайтина в мышцах сусликов при зимней спячке, а также человека и крыс при моделируемой невесомости. Результаты этих исследований представлены ниже.
Глава 2. Изучение сезонных изменений структурно-функциональных свойств тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц зимоспящих сусликов
Сравнительные исследования структурно-функциональных свойств тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц сусликов в разных состояниях активности (спячка, пробуждение, зимняя и летняя активность) не выявили сезонных различий в форме, размерах и агрегационных свойствах молекул этих белков, а также в эффектах тайтина на структуру паракристаллов актина in vitro. Не было также обнаружено различий в структуре миозиновых нитей, сформированных при добавлении тайтина, С- и Х-белков, выделенных из мышц сусликов в разных состояниях. Однако были обнаружены сезонные различия в эффектах этих белков на актин-активируемую АТФазную активность и Са2+-чувствительность миозина in vitro.
2.1. Сезонные изменения функциональных свойств тайтина, С-белка и X-белка скелетных мышц сусликов: влияние на АТФазную активность и Са2+-чувствительность реконструированного актомиозина
Показано увеличение актин-активируемой АТФазы миозина в -1.35 раза (при рСа 7.5) и в ~1.5 раза (при рСа 4.6) и повышение ее Са2+-чувствительности в присутствии тайтина скелетных мышц активных сусликов. В присутствии тайтина скелетных мышц гибернирующих сусликов наблюдалось уменьшение его активирующего эффекта на АТФазу AM и снижение чувствительности системы к кальцию (табл. 1). Следует отметить, что мы не обнаружили разницы в эффектах тайтина скелетных мышц активных и пробуждающихся сусликов на функциональные свойства AM.
Табл. 1. Влияние тайтина скелетных мышц сусликов на АТФазную активность и Са2+-чувствительность реконструированного АМ кролика (^ = 0.12)
Препарат Активность актин-активируемой АТФазы миозина (в %) Са2+-чувствительность (в%)
рСа 7.5 рСа 4.6
AM 100.0 126.5+4.0 26.5
Тайтин скелетных мышц активных и пробуждающихся сусликов
АМ+тайтин, п=12 135.0±5.0 183.5±6.5 36.0
АМ+ТаИТИН фосфорилированный* п=3 122.0+4.0 139.0±4.0 14.0
Тайтин скелетных мышц гиберни рующих сусликов
АМ+тайтин, п=9 127.0+3.0 145.014.0 14.0
АМ+ТаИТИН фосфоридированный, п=3 120.5+2.5 133.013.5 11.0
Примечание, фосфорилирование тайтина проводилось in vitro (см материалы и методы).
В присутствии С-белка скелетных мышц сусликов в разных состояниях наблюдалось увеличение АТФазы AM в ~1.3 раза (при рСа 7.5) и в ~ 1.2 раза (при
рСа 4.6) при общем снижении Са2+-чувствительности системы. При этом не было выявлено достоверных сезонных различий в эффектах С-белка на функциональные свойства актомиозина.
Х-белок скелетных мышц сусликов в разных состояниях ингибировал (в -1.2 и в -1.3 раза) актин-активируемую АТФазу миозина и подавлял ее Са2+-чувствительность. Однако более значительное снижение Са2+-чувствительности АМ наблюдалось в присутствии Х-белка скелетных мышц гибернирующих животных (табл. 2).
Табл. 2. Влияние Х-белка скелетных мышц сусликов на АТФазную активность и Са2+-чувствительность реконструированного АМ кролика (ц = 0.12)
Препарат Активность актин-активируемой АТФазы миозина (в%) Са2+-чувствительность (в %)
рСа 7.5 рСа 4.6
АМ 100.0 119.0±4.5 19.0
Х-белок скелетных мышц активных и пробуждающихся сусликов
АМ+Х-белок, п=5 86.0±2.0 96.0±2.5 11.5
АМ+Х-беЛОК фосфорилированный П=2 76.0±1.5 77.0±2.0 -
Х-белок скелетных мышц гиберни рующих сусликов
АМ+Х-белок, п=3 81.0±2.5 86.5±2.5 7.0
АМ+Х-беЛОК фосфорилированный п=2 73.0±2.0 73.5±3.0 -
Примечание: фосфорилирование Х-белка проводилось in vitro (см. материалы и методы).
Таким образом, снижение активирующего эффекта тайтина и увеличение ингибирующего эффекта Х-белка скелетных мышц гибернирующих сусликов по сравнению с эффектами этих белков активных животных на АТФазную активность и Са ^чувствительность AM in vitro, может свидетельствовать об изменении функциональных свойств белков и их вкладе в ингибирование сократительной активности скелетных мышц при зимней спячке. Однако причина сезонных изменений функциональных свойств тайтина и Х-белка была не ясна. Поскольку известна способность тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц фосфорилироваться (Lim & Walsh, 1986; Takano-Ohmura et al., 1992), мы предположили, что изменение степени фосфорилирования этих белков у суслика при зимней спячке будет приводить к изменению их функциональных свойств.
2.2. Фосфорилирование тайтина и Х-белка скелетных мышц сусликов: сезонные изменения и их вклад в смену состояния животного
Нами были проведены эксперименты по in vitro фосфорилированию тайтина, С-белка и Х-белка из скелетных мышц сусликов в присутствии радиоактивного изотопа у-[32Р]АТФ с использованием каталитической субъединицы протеинкиназы А. С помощью авторадиографии показана способность тайтина и Х-белка скелетных мышц сусликов к фосфорилированию
in vitro. Степень фосфорилирования тайтина скелетных мышц сусликов в разных состояниях была незначительна, что не позволило нам выявить сезонных отличий в степени фосфорилирования этого белка. Между тем четкие сезонные отличия были обнаружены при фосфорилировании препаратов Х-белка скелетных мышц сусликов (рис. 2).
Рис. 2. In vitro фосфорилирование очищенных препаратов Х-белка скелетных мышц сусликов. На рисунке представлены:
- электрофореграммы очищенных препаратов X-белка скелетных мышц активных (1) и гибернирующих (3) сусликов;
- авторадиограммы Х-белка скелетных мышц активных (2) и гибернирующих (4) сусликов.
Денситометрия белковых полос в гелях и пятен на авторадиограммах показала, что препараты Х-белка из скелетных мышц активных и пробуждающихся сусликов содержат в -2.5 раза больше радиоактивного изотопа у-[32Р]АТФ, чем препараты Х-белка гибернирующих животных (табл. 3). Эти данные подтвердились при определении радиоактивности 32Р-меченных препаратов Х-белка (белковые полосы на геле) методом счета по Черенкову в импульсах в минуту.
Табл. 3. Содержание у-[32Р]АТФ в препаратах Х-белка _скелетных мышц сусликов_
Препарат Содержание у-[ Р]АТФ препаратах Х-белка (Моль/Моль)
Х-белок (активные и пробуждающиеся суслики), п=3 1.80±0.30
Х-белок (гибернирующие суслики), п=3 0.65±0.15
На основе полученных данных, мы сделали предположение об увеличении степени фосфорилирования Х-белка in vivo в мышцах сусликов в период зимней спячки. Вследствие этого Х-белок скелетных мышц гибернирующих сусликов имеет меньше свободных участков связывания для неорганического фосфата и потому в меньшей степени фосфорилируется in vitro, чем Х-белок активных и пробуждающихся животных. Результаты проведенного анализа содержания фосфата, связанного с Х-белком, а также с тайтином скелетных мышц сусликов в разных состояниях, полностью подтвердили это предположение. Обнаружено, что Х-белок и тайтин из мышц гибернирующих сусликов содержат в 1.8-2 раза и 1.4-1.5 раза соответственно больше связанного с ними фосфата, чем белки из мышц активных животных.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об увеличении
уровня фосфорилировання тайтина и Х-белка в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке. Это, в свою очередь, может являться причиной сезонных изменений функциональных свойств этих белков. Для подтверждения этого предположения мы изучили влияние in vitro фосфорилированных тайтина и X-белка на актин-активируемую АТФазную активность и Са2+-чувствительность миозина. Мы ожидали увидеть уменьшение активирующего эффекта тайтина и увеличение ингибирующего эффекта Х-белка на АТФазную активность и Са2+-чувствительность реконструированного AM. Результаты проведенных измерений подтвердили наше предположение (табл. 1, 2).
Таким образом, результаты проведенных нами экспериментов позволяют сделать предположение, что увеличение степени фосфорилировання саркомерных цитоскелетных белков при гибернации будет вносить вклад в подавление двигательной активности мышц в этот период.
Поскольку белки семейства тайтина прочно связаны в саркомере с миозин-содержащими нитями, нам было интересно узнать, происходят ли изменения в степени фосфорилировання регуляторных легких цепей миозина (ЛЦ2) в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке? Известно, что фосфорилирование ЛЦ2 миозина скелетных и сердечной мышц приводит к увеличению его АТФазной активности (Sweeny et al., 1993) и Са2+-чувствительности сократительного аппарата скицированных мышечных волокон (Morano et al., 1985). В таком случае, в период гибернации следует ожидать уменьшение степени фосфорилировання ЛЦ2 миозина скелетных мышц сусликов, что необходимо для ингибирования сократительной активности мышц в этот период. Результаты наших электрофоретических исследований, показывающие двукратное уменьшение уровня фосфорилировання ЛЦ2 в препаратах миозина скелетных мышц гибернирующих сусликов, полностью подтвердили это предположение. Обращает на себя внимание согласованность адаптационных изменений, происходящих в исследованных мышечных белках при зимней спячке. С одной стороны, снижение уровня фосфорилировання легких цепей миозина при гибернации, а с другой - повышение уровня фосфорилировання тайтина и Х-белка в этот период направлены на подавление функциональной активности миозина.
Таким образом, анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о том, что фосфорилирование саркомерных цитоскелетных белков при гибернации включается в адаптационные механизмы подавления сократительной активности скелетных мышц, что необходимо в этот период.
2.3. Электрофоретическое изучение сезонных изменений качественного и количественного состава тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц сусликов
На рис. 3 представлены результаты электрофоретического анализа образцов скелетных мышц сусликов в 7% и градиентном (2.5-9%) полиакриламидных гелях. Денситометрия полос тайтина и тяжелых цепей миозина (ТЦМ) в гелях выявило снижение количества Т1 (в -1.4 раза) относительно количества ТЦМ в m. psoas и m. soleus гибернирующих и
пробуждающихся сусликов в сравнении с количеством тайтина в мышцах активных животных. Содержание С-белка в m. psoas относительно ТЦМ было снижено в мышцах гибернирующих и пробуждающихся сусликов в -1.5 раза. Не было обнаружено сезонных изменений количества Х-белка в m. soleus сусликов.
активность спячка активность спячка активность спячка активность спячка
а б
Рис. 3. Электрофореграммы образцов скелетных мышц psoas и soleus активных и гибернирующих сусликов а) 7% полиакриламидный гель; б) градиентный гель с содержанием полиакриламида 2.5-9%.
Известно, что у животных во время зимней спячки, наблюдается атрофия мышц (Wickler et al., 1991; Steifen et al., 1991; Agostini et al., 1991). Мы впервые показали уменьшение количества саркомерных цитоскелетных белков в мышцах гибернирующих сусликов. Кроме этого, обнаруженное нами значительное уменьшение содержания С-белка, характерного для быстрых мышечных волокон, при отсутствии изменений количества Х-белка в медленных волокнах скелетных мышц сусликов при зимней спячке указывает на преимущественную атрофию быстрых волокон в этот период (Wickler et al., 1991; Steffen et al., 1991). В пользу этого предположения могут свидетельствовать результаты нашего электрофоретического исследования по изменению изоформного состава тайтина в мышцах сусликов при зимней спячке (рис. 4). Денситометрия полос тайтина на гелях выявила почти двукратное уменьшение количества короткого изоварианта N2A изоформы тайтина по отношению к количеству длинного изоварианта в скелетных мышцах гибернирующих и пробуждающихся сусликов.
Уменьшение количества коротких, но не длинных изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке наблюдалось также по отношению к количеству ТЦМ.
3*00 33ÔÔ
Рис. 4. Поведение изовариантов N2A изоформы тайтина в m. psoas (а) и в т. soleus (б) сусликов при гибернации (2% полиакриламидный гель с агарозой).
активность спячка а
активность спячка б
Учитывая, что в медленной мышце soleus преобладает N2A изоформа тайтина с М.в. 3700 кДа, а в быстрой мышце psoas - N2A изоформа тайтина с М.в. 3400 кДа (Freiburg et al., 2000), можно предположить, что в мышцах сусликов длинные изоварианты тайтина более характерны для медленных волокон, а короткие изоварианты - для быстрых мышечных волокон. В таком случае, обнаруженное нами уменьшение количества коротких изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке может свидетельствовать о преимущественной деградации быстрых мышечных волокон в этот период, с характерными для них изоформами белков. В пользу этого предположения могут быть приведены и другие данные. Известно, что быстрые волокна скелетных мышц наиболее чувствительны к изменению нейротрофического контроля. При денервации мышцы они более быстро атрофируются (Bacou et al., 1996). Подобным образом быстрые волокна могут атрофироваться во время зимней спячки, когда практически отключена система нервной стимуляции скелетных мышц, а процессы биосинтеза белка заингибированы низкой температурой (Жегунов и др., 1993).
Таким образом, обнаруженное нами уменьшение количества С-белка и коротких изовариантов тайтина при отсутствии изменений количества Х-белка и длинных изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке может свидетельствовать об избирательной атрофии быстрых мышечных волокон при гибернации и сохранении медленных волокон, с характерными для них изоформами белков.
Каково физиологическое значение выявленных нами изменений? Принимая во внимание наши результаты об активирующем эффекте С-белка и ингибирующем эффекте Х-белка на актин-активируемую АТФазную активность миозина, можно предположить, что снижение количества С-белка и сохранение количества Х-белка при гибернации (наряду с увеличением его степени фосфорилирования) вносят вклад в подавление сократительной активности скелетных мышц сусликов в этот период. Учитывая, что тайтин из мышц гибернирующих животных слабее активирует АТФазу актомиозина и снижает ее Са2+-чувствительность по сравнению с эффектами тайтина из мышц активных сусликов, можно предположить, что увеличение доли длинных изовариантов тайтина также будет вносить вклад в подавление двигательной активности мышц при зимней спячке. Различные эффекты изовариантов тайтина на функциональные свойства актомиозина можно объяснить разницей в их первичной структуре и заряде.
В заключение, следует отметить, что уменьшение относительного
количества С-белка и «быстрых» изоформ тайтина в мышцах гибернирующих животных может указывать также на возможную трансформацию быстрых волокон в медленные при зимней спячке. Это предположение подтверждается данными и об уменьшении количества быстрых изоформ тяжелых и легких цепей миозина при гибернации (Лукоянова и др., 1997; Rourke et al., 2004), и результатами о значительном увеличении в мышцах гибернирующих сусликов количества мРНК, кодирующей медленные изоформы легких цепей миозина (Storey & Storey, 2000).
Таким образом, на основании анализа собственных результатов и литературных данных можно предположить, что у зимоспящих сусликов (Citellus undulatus) имеется эволюционно закрепленный адаптационный механизм избирательной атрофии быстрых мышечных волокон скелетных мышц и сохранения (или увеличения) медленных волокон, как наиболее выносливых и энергетически более выгодных, с характерными для них изоформами белков. Такая адаптация направлена на ингибирование сократительной активности скелетных мышц для экономии энергетических ресурсов, что необходимо для выживания животного в экстремальных условиях спячки и выхода из нее без патологических последствий.
Глава 3. Изучение изменений тайтина и Х-белка m. soleus крыс и человека в условиях моделируемой микрогравитации
3.1. Электрофоретическое изучение тайтина и Х-белка m. soleus крыс и человека при моделируемой микрогравитации
Поскольку в условиях микрогравитации, как и при зимней спячке, происходит атрофия мышц, мы сравнили поведение тайтина и Х-белка в т. soleus в условиях микрогравитации и при гибернации.
Результаты электрофоретического изучения влияния гравитационной разгрузки (модель вывешивания задних конечностей) на содержание тайтина и Х-белка в m. soleus крыс показали, что в отличие от уменьшения содержания Т1 в ~1.4 раза в m. soleus гибернирующих сусликов, в т. soleus вывешенных крыс наблюдалось двукратное уменьшение количества Т1 относительно количества ТЦМ. Более того, при отсутствии изменений количества Х-белка в m. soleus сусликов при зимней спячке, в ш. soleus вывешенных крыс наблюдалось уменьшение в -1.5 раза содержания Х-белка по отношению к содержанию ТЦМ. Полученные нами результаты показывают, что в отличие от гибернации, в условиях микрогравитации атрофические изменения в мышцах приводят к более сильной деградации цитоскелетных саркомерных белков, что будет вносить вклад в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома».
Между тем, оставалось не ясным поведение изовариантов N2A изоформы тайтина в m. soleus крыс в условиях микрогравитации. С помощью модифицированной нами методики ДСН-электрофореза в крупнопористом полиакриламидном геле с агарозой, мы обнаружили двукратное уменьшение количества как короткого, так и длинного изовариантов тайтина по отношению к количеству ТЦМ в m. soleus вывешенных крыс. При этом в большинстве случаев наблюдалась полная потеря длинного изоварианта тайтина.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в отличие от гибернации в условиях микрогравитации происходит неизбирательная деградация короткого и длинного изовариантов Ы2Л изоформы тайтина в ш. го1еиз крыс. Эти данные подтверждаются результатами исследований поведения изоформного состава тайтина в гп. Бокив человека при моделировании условий гравитационной разгрузки (модель «сухой» иммерсии). Как было отмечено выше, с помощью ДСН-электрофореза в крупнопористом полиакриламидном геле с агарозой в т. 5о1еш человека нами впервые обнаружено присутствие трех изовариантов №А изоформы тайтина: короткого с м.в. 3700, и двух длинных с м.в. -3800-3900 кДа (рис. 5).
Рис 5 Поведение изовариантов Ы2А
изоформы тайтина в ш 5о1си5 человека в условиях гравитационной разгрузки (2.3% полиакриламидный гель с агарозой)
Подобно неизбирательному уменьшению количества короткого и длинного изовариантов тайтина в т. 8о1еш вывешенных крыс, в т. 8о1еиз человека в условиях моделируемой микрогравитации также наблюдалось значительное уменьшение (в -1.5-2 раза) количества всех трех изовариантов тайтина по отношению к количеству ТЦМ.
Таким образом, атрофические изменения в т. яоЬиэ человека и крыс при микрогравитации приводят к неизбирательной деградации изовариантов тайтина и снижению количества Х-белка. Принимая во внимание мультифункциональность тайтина, связывание его со многими компонентами саркомера и участие его в различных процессах в мышечной клетке (например, в регуляции процесса сокращения, генной экспрессии, обновления белков, активности ионных каналов и др.) можно утверждать, что уменьшение количества этого белка, наряду с другими изменениями в мышечном аппарате, будет вносить вклад в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома».
3.2. Оценка эффективности подходов, направленных на уменьшение или предотвращение негативного влияния моделируемой невесомости на т. $о1еи$ крыс
Показано, что хроническое растяжение гп. вокив крыс на фоне гравитационной разгрузки приводит к подавлению атрофических процессов в мышце (ОЫга & а1., 1997). Мы провели изучение поведения тайтина и Х-белка в т. эо^ив крыс при хроническом ее растяжении на фоне гравитационной разгрузки. Результаты нашего электрофоретического исследования с применением 7% полиакриламидных гелей показали, что хроническое
контроль гравитационная ран рулса
растяжение т. ясПеия крыс на фоне гравитационной разгрузки в -1.4 раза уменьшало степень деградации тайтина 1 (рис. 6) и предотвращало снижение содержания Х-белка. Подобное уменьшение степени деградации Т1 было обнаружено нами в экспериментах с тенотомией (перерезкой сухожилий) мышц-антагонистов (флексоров) т. Бокиэ крыс на фоне гравитационной разгрузки. Кроме того, мы изучили поведение изовариантов ША изоформы тайтина в ш. 5о1еиз тенотомированных животных при вывешивании. Обнаружено, что тенотомия мышц флексоров ш. воЬиБ крыс на фоне вывешивания приводила к уменьшению степени деградации (в -1.5 раза) короткого изоварианта N2А изоформы тайтина и сохранению количества длинного изоварианта в мышце (рис. 7).
тпцм
130-
контро'п, грлвшационпая раыяжсние разгрузка па фане разгрузки
Рис. 6. Влияние растяжения т. м)1еи5 крысы на поведение тайтина 1 при моделировании условий гравитационной разгрузки
изовариаиты ША изоформы гайтина/ТЦМ
í
3700 3800 гравитационная разгрузка
Рис. 7. Влияние тенотомии мышц-антагонистов т. 5о1еиз крыс на поведение изовариантов Ы2А изоформы тайтина при моделировании условий гравитационной разгрузки
3700 3800 юно'юмия на фоне разгрузки
Таким образом, изучение поведения тайтина и Х-белка в ш. 5о1еиБ крыс при моделировании микрогравитации помогает оценить эффективность подходов, направленных на устранение негативного влияния гравитационной разгрузки на мышцы. Полученные результаты являются основой для дальнейшего поиска наилучших подходов к снижению или предотвращению атрофии мышц у человека в условиях реальной невесомости.
ВЫВОДЫ
Проведены исследования структурно-функциональных свойств тайтина, С-белка и Х-белка в скелетных мышцах разных животных (кролик, суслик, крыса) и человека в норме для последующего сравнения их со свойствами этих белков в мышцах суслика при гибернации и в мышцах крыс и человека при моделируемой микрогравитации.
1. Обнаружены новые свойства тайтина и Х-белка в норме: активирующий эффект тайтина и ингибирующий эффект Х-белка на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина; способность тайтина связываться с актиновыми нитями. Полученные результаты указывают на участие белков семейства тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в скелетных мышцах.
2. С помощью оптимизированной нами методики ДСН-гель-электрофореза в ш. вокив животных (кролик, суслик, крыса) и человека впервые обнаружены изоварианты N2 А изоформы тайтина с м.в. более 3700 к Да.
3. Выявлено избирательное уменьшение количества С-белка и коротких изовариантов Ы2А изоформы тайтина при отсутствии изменений количества Х-белка и длинных изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке. Это может являться результатом преимущественного катаболизма быстрых мышечных волокон и сохранения медленных, как наиболее выносливых и энергетически более выгодных, с характерными для них изоформами белков. Такая адаптация направлена на ингибирование сократительной активности скелетных мышц для экономии энергетических ресурсов, что необходимо для выживания животного в экстремальных условиях спячки и выхода из нее без патологических последствий.
4. Обнаружено увеличение степени фосфорилирования тайтина и Х-белка в скелетных мышцах гибернирующих сусликов, что приводит к снижению активирующего влияния тайтина и увеличению ингибирующего влияния X-белка на ферментативные и регуляторные свойства актомиозина. Сделано предположение, что увеличение степени фосфорилирования саркомерных цитоскелетных белков при гибернации, наряду с изменениями их изоформного состава, вносит вклад в подавление сократительной активности мышц в этот период.
5. Показано, что пребывание в условиях моделируемой микрогравитации приводит к неизбирательному уменьшению количества короткого и длинных изовариантов Ы2А изоформы тайтина, а также к уменьшению количества X-белка в т. 5о1еи5 крыс и человека, что, наряду с другими изменениями в
мышечном аппарате, вносит вклад в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома».
6. Показано, что иммобилизация m. soleus крыс в растянутом состоянии и тенотомия мышц-антагонистов m. soleus крыс на фоне гравитационной разгрузки приводят к снижению степени деградации тайтина и к предотвращению уменьшения количества Х-белка. Полученные результаты являются основой для поиска наиболее эффективных подходов к снижению или предотвращению атрофии мышц человека в условиях космического полета.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Vikhlyantsev I.M., Makarenko I.V., Khalina Ya.N., Shpagina M.D., Udaltsov S.N., Malyshev S.L., Vishnevskaya Z.I., Podlubnaya Z.A. Titin cytoskeleton of vertebrate striated muscle: behavior upon hibernation // J. Muscle Res. & Cell Motil., 2000, v.21(8), p. 824.
2. Vikhlyantsev I.M., Makarenko I.V., Khalina Ya.N., Shpagina M.D., Udaltsov S.N., Malyshev S.L., Podlubnaya Z.A. Adaptive changes of titin isoform composition in skeletal and cardiac muscles of hibernating ground squirrels // In: "Basic and Applied Thermophysiology" (Ed. V.N. Gourine), Minsk, 2000, p. 133138.
3. Vikhlyantsev I.M., Makarenko I.V., Khalina Ya.N., Shpagina M.D., Udaltsov S.N., Malyshev S.L., Vishnevskaya Z.I., Podlubnaya Z.A. Myosin-associated protein titin of skeletal and cardiac muscles: behavior upon adaptation and pathology // Abstr. Intern. Symp. "Biological motility: new trends in research", Pushchino, Russia, 2001, p. 167-169.
4. Вихлянцев И.М., Алексеева Ю.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. Изучение свойств С-белка скелетных и сердечных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки // Биофизика, 2002, т. 47, №4, с. 701-705.
5. Vikhlyantsev I.M., Alekseeva Yu.A., Udaltsov S.N., Podlubnaya Z.A. Phosphorylation of sarcomeric cytoskeletal proteins and its role in suppression of the contractile ability of skeletal and cardiac muscles during hibernation // In: "Mediko-Biological Problems of Thermophysiology" (Eds. V.N. Gourine, V.A. Kulchitsky, B. Tzschentke), Minsk, Biznesofcet, 2002, p. 191-194.
6. Vikhlyantsev I., Podlubnaya Z. Phosphorylation of sarcomere cytoskeletal proteins - adaptive factor of inhibiting the contractile activity of muscles upon hibernation // J. Muscle Res. & Cell Motil., 2003, v. 24 (4-6), p. 378.
7. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Фосфорилирование саркомерных цитоскелетных белков - адаптационный фактор ингибирования сократительной активности мышц при зимней спячке // Биофизика, 2003, т. 48, № 3, с. 499-504.
8. Зуйкова О.В., Вихлянцев И.М., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. Изменение степени фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина -
адаптационный процесс при зимней спячке // Тезисы III Всеросс. конф. с межд. участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2003 г.), с. 122.
9. Podlubnaya Z.A., Malyshev S.L., Udaltsov S.N., Vikhlyantsev I.M. Myosin, titin and C-protein of skeletal and cardiac muscles during hibernation // News of Biomedical Sciences, 2003, № 3, c. 93-100.
10. Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Vikhlyantsev I.M., Malyshev S.L., Udaltsov S.N., Ziegler C., Beinbrech G. Comparative electron microscopic study on projectin and titin binding to F-actin // Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2003, v. 33, № 8, p. 789-793.
11. Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L., Vikhlyantsev I.M., Udaltsov S.N., Muchina A.M., Podlubnaya Z.A. Myosin phenotype and sarcomeric cytoskeletal proteins behavior in stretched soleus of hindlimb suspended rats // J. Gravit. Physiol.,
2003, v. 10, № 1, p. 53-54.
12. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Адаптационное поведение изоформ тайтина скелетных и сердечной мышц сусликов (Citellus undulatus) при зимней спячке // Биофизика, 2004, т. 49, № 3, с. 430-435.
13. Вихлянцев И.М., Подлубная З.А., Козловская И.Б. Новые изоформы тайтина в скелетных мышцах млекопитающих // Доклады РАН, 2004, т. 395, № 6, с. 828-831.
14. Shenkman B.S., Moukhina A.M., Ardabievskaya, Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A., Nemirovskaya T.I. Effects of flexor tenotomy on soleus fiber characteristics and sarcomeric proteins in unloaded rats // J. Muscle Res. & Cell Motil., 2004, v. 25 (3), p. 268-269.
15. Вихлянцев И.М., С.JI. Малышев, Шенкман Б.С., Подлубная З.А. Поведение тайтина и белков его семейства в скелетных мышц сусликов (Citellus undulatus) при зимней спячке и крыс в условиях моделируемой микрогравитации. // Биофизика, 2004, т. 49, № 6, с. 995-1002.
16. Vikhlyantsev I.M., Shenkman B.S., Podlubnaya Z.A. The changes in titin isoforms composition of human and rat m. soleus under conditions of simulated microgravity // Abstr. Intern. Symp. "Biological motility", Pushchino, Russia,
2004, p. 279-280.
17. Подлубная 3.A., Вихлянцев И.М., Мухина A.M., Немировская Т.Л., Шенкман Б.С. Белки саркомерного цитоскелета и миозиновый фенотип волокон m. soleus при ее хроническом растяжении на фоне вывешивания задних конечностей крысы // Биофизика, 2004, т. 49, № 3, с. 424-429.
18. Vikhlyantsev I.M., Shenkman B.S., Podlubnaya Z.A. The changes in titin isoforms composition of ground squirrel m. soleus upon hibernation as compared with human and rat m soleus under conditions of simulated microgravity // J. Muscle Res. & Cell Motil., 2004, v. 25 (3), p. 264.
19. Шенкман B.C., Немировская Т.Л., Мухина A.M., Подлубная 3.A., Вихлянцев И.М., Ардабьевская А.В., Козловская И.Б., Григорьев А.И. Влияние инактивации мышц-антагонистов на атрофические процессы в m. Soleus крысы в условиях гравитационной разгрузки // Доклады РАН, 2005, т. 400, №6, с. 840-843.
Список сокращений: АМ - актомиозин, ДСН - додецилсульфат натрия, кДа - килодальтон, м.в. - молекулярный вес, ТЦМ - тяжелые цепи миозина, Фн - неорганический фосфат, ц - ионная сила.
Исследование поддержано фантами РФФИ №№ 00-04-48200, 01-04-97007, 02-04-06919, 03-04-06454, 03-04-48487 и РФФИ-ННИО № 99-04-04033, программой Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и Программой ОБН РАН «Интегративные механизмы регуляции функций в организме».
»13927
РЫБ Русский фонд
2006-4 9311
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вихлянцев, Иван Милентьевич
Список использованных сокращений
ВВЕДЕНИЕ .б
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. СТРУКТУРА МОЛЕКУЛЫ ТАЙТИНА И ЕГО ФУНКЦИИ
1.1. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в Z-диcкe саркомера
1.2. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в 1-зоне саркомера
1.2.1. Изоформы тайтина
1.2.2. Взаимодействие тайтина с тонкими нитями в 1-зоне саркомера
1.3. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в А-диске саркомера
1.4. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в М-линии саркомера
Глава 2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ МОЛЕКУЛ С-БЕЛКА И Х-БЕЛКА.
2.1. Структура и локализация молекул С-белка и Х-белка в саркомерах скелетных мышц
2.2. Функции С-белка
Глава 3. ЗИМНЯЯ СПЯЧКА МЛЕКОПИТАЮЩИХ
3.1. Общие представления о зимней спячке млекопитающих
3.2. Сезонные изменения в мышцах зимоспящих животных
3.3. Изменения в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение тайтина и белков его семейства в скелетных мышцах в норме, при гибернации и микрогравитации"
В настоящее время известна большая группа белков семейства тайтина (тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок, М-белок, миомезин и другие), относящихся к саркомерным цитоскелетным белкам поперечно-полосатых мышц позвоночных. Показано, что они связываются с миозин-содержащими (толстыми) нитями и составляют 15% от общего количества белка в саркомере. Хотя предположения о присутствии белков немиозиновой природы в структуре толстых нитей высказывались давно (Рере, 1967; Huxley, 1967; Hanson et al., 1971), до начала 70-х годов прошлого века природа этих белков была неизвестна. Обнаружение с помощью ДСН-гель-электрофореза С-белка и Х-белка в качестве минорных примесей в препаратах миозина (Starr & Offer, 1971), а также открытие тайтина (= коннектина) (Maruyama et al., 1977; Wang К. et al., 1979; Maruyama et al., 1981) стимулировали их выделение и изучение.
С-белок в быстрых волокнах скелетных мышц и его изоформа Х-белок в медленных волокнах (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983) располагаются на поверхности толстых нитей с периодом 43 нм (Bennett et al., 1986), связываясь одновременно с тайтином и миозином. Тайтин является продольным элементом саркомерного цитоскелета поперечно-полосатых мышц позвоночных. До его открытия мышечное сокращение рассматривалось с позиции взаимодействия двух типов нитей: тонких (актин-содержащих) и толстых (миозин-содержащих), скользящих относительно друг друга (Huxley & Hanson, 1954; Huxley & Niedergerke, 1954). Обнаружение тайтина и выяснение его локализации позволило выдвинуть гипотезу о трехнитевой модели саркомера (Wang К., 1984; 1985).
Исследования показали, что тайтин и белки его семейства могут выполнять разные функции в саркомере. Предполагается, что они играют существенную роль в миогенезе при сборке толстых нитей и формировании структуры саркомера, участвуют в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении. Тайтин вносит вклад в пассивное натяжение, развиваемое мышцей, и, возможно, участвует в регуляции генной экспрессии, обновления белков и активности ионных каналов (Granzier & Labeit, 2002; 2004). Тем не менее, не все свойства этих белков в норме до конца изучены. Поэтому одна из задач данной работы - изучение структурно-функциональных свойств тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц в норме.
Не изучена роль белков семейства тайтина в мышцах при изменении условий внешней среды, включая экстремальные, например, зимняя спячка и микрогравитация. Интерес, проявляемый к изучению зимней спячки (гибернации) млекопитающих, определяется, прежде всего, способностью зимоспящих животных адаптироваться к неблагоприятным условиям среды за счет снижения активности всех физиологических систем организма, включая мышечную, при сохранении контроля за согласованностью их действия (Wang L., 1987). Поскольку при гибернации животные длительное время пребывают в обездвиженном состоянии, после чего за несколько часов способны перейти к нормальной двигательной активности без патологических последствий, есть основания ожидать, что в скелетных мышцах зимоспящих происходят обратимые адаптационные изменения, которые могут вносить вклад в смену физиологического состояния животных. Эти изменения могут касаться состава, структуры и функциональных свойств сократительных нитей и составляющих их белков. Полученные ранее в нашей лаборатории данные об изменениях изоформного состава и свойств миозина скелетных мышц сусликов при гибернации (Лукоянова, 1997а, 19976) подтверждают это предположение. В настоящей работе проведено исследование адаптационных изменений тайтина, С-белка и Х-белка в скелетных мышцах сусликов при гибернации.
Изучение поведения тайтина и белков его семейства в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации только начинается. Недавно проведенные исследования выявили уменьшение количества тайтина в m. soleus крыс при моделировании условий гравитационной разгрузки (Kasper & Xun, 2000; Toursei et al., 2002). Однако в литературе отсутствуют данные об изменении тайтина в m. soleus человека, а также о поведении Х-белка в этой мышце при микрогравитации. В настоящей работе изучено поведение изоформного состава тайтина, а также Х-белка в m. soleus человека и крыс в условиях моделируемой микрогравитации.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Вихлянцев, Иван Милентьевич
выводы
Проведены исследования структурно-функциональных свойств тайтина, С-белка и X-белка в скелетных мышцах разных животных (кролик, суслик, крыса) и человека в норме для последующего сравнения их со свойствами этих белков в мышцах суслика при гибернации и в мышцах крыс и человека при моделируемой микрогравитации.
1. Обнаружены новые свойства исследуемых in vitro белков в норме: активирующий эффект тайтина и ингибирующий эффект Х-белка на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина; способность тайтина скелетных мышц связываться с актиновыми нитями. Полученные результаты указывают на участие белков семейства тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в скелетных мышцах;
2. С помощью оптимизированной нами методики ДСН-гель-электрофореза в т. soleus животных (кролик, суслик, крыса) и человека впервые обнаружены изоварианты N2A изоформы тайтина с м.в. более 3700 кДа;
3. Выявлено избирательное уменьшение количества С-белка и коротких изовариантов N2A изоформы тайтина при отсутствии изменений количества X-белка и длинных изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке. Это может являться результатом преимущественного катаболизма быстрых мышечных волокон и сохранения медленных, как наиболее выносливых и энергетически более выгодных с характерными для них изоформами белков. Такая адаптация направлена на ингибирование сократительной активности скелетных мышц для экономии энергетических ресурсов, что необходимо для выживания животного в экстремальных условиях спячки и выхода из нее без патологических последствий;
4. Обнаружено увеличение степени фосфорилирования тайтина и Х-белка в скелетных мышцах гибернирующих сусликов, что приводит к снижению активирующего влияния тайтина и увеличению ингибирующего влияния X-белка на ферментативные и регуляторные свойства миозина. Сделано предположение, что увеличение степени фосфорилирования саркомерных цитоскелетных белков при гибернации, наряду с изменениями их изоформного состава, вносит вклад в подавление сократительной активности мышц в этот период;
5. Показано, что пребывание в условиях моделируемой микрогравитации приводит к неизбирательному уменьшению количества короткого и длинных изовариантов Ы2А изоформы тайтина, а также уменьшению количества X-белка в ш. эокиэ крыс и человека, что, наряду с другими изменениями в мышечном аппарате, будет вносить вклад в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома»;
6. Показано, что иммобилизация ш. бокиэ крыс в растянутом состоянии и тенотомия мышц-антагонистов ш. БокиБ крыс на фоне гравитационной разгрузки приводят к снижению степени деградации тайтина и к предотвращению уменьшения содержания Х-белка. Полученные результаты являются основой для поиска наиболее эффективных подходов к снижению или предотвращению атрофии мышц человека в условиях космического полета.
7.3. Заключение
Проведено изучение изменений изоформного состава тайтина, а также Х-белка в гравитационно-зависимой мышце зо1еш крыс и человека при моделировании условий микрогравитации и проведена оценка эффективности подходов, направленных на снижение негативного влияния микрогравитации на мышцу.
1. Показано, что пребывание в условиях моделируемой микрогравитации приводит к неизбирательному уменьшению количества короткого и длинных изовариантов изоформы тайтина, а также уменьшению количества Х-белка в т. зо1еиз крыс и человека, что, наряду с другими изменениями в мышечном аппарате, будет вносить вклад в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома»;
2. Показано, что иммобилизация т. зо1еш крыс в растянутом состоянии и тенотомия мышц-антагонистов т. зо1еш крыс на фоне гравитационной разгрузки приводят к снижению степени деградации тайтина и к предотвращению уменьшения содержания Х-белка. Полученные результаты являются основой для поиска наиболее эффективных подходов к снижению или предотвращению атрофии мышц человека в условиях космического полета.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вихлянцев, Иван Милентьевич, Пущино
1. Туровский H.H., Еремин A.B., Газенко О.Г., Егоров А.Д., Брянов И.И., Генин A.M. (1975) Медицинские исследования в космических полетах кораблей «Союз-12, 13, 14,» и орбитальной станции «Салют-З» П Космич. Биол. и мед. № 2. с.48-53.
2. Жегунов Г.Ф., Вонг Л., Джордан М. (1993) Транспорт аминокислот и синтез белков у сусликов при гибернации и искусственной гипотермии И Укр. биохим. Журнал. Т. 65 (6). С. 25-29.
3. Какурин Л.И., Черепахин М.А., Первушин В.Н. (1971) Влияние факторов космического полета на мышечный тонус у человека II Косм. Биол. и мед. Т. 5. №2. с. 63-68.
4. Калабухов Н.И. (1969) Периодические изменения в организме грызунов: их причины и последствия // Ленинград. Наука. 279 с.
5. Карманова И.Г. (1977) Эволюция сна (этапы формирования цикла бодрствование-сон в ряду позвоночных) ПЛ.: Наука. 174 с.
6. Карманова И.Г., Оганесян Г.А. (1994) Физиология и патология цикла бодрствование-сон. Эволюционные аспекты II СПб: Наука. 200 с.
7. Клика Э., Зайцова А. (1984) Изменения структурных элементов органов у летучих мышей в периоды активности и гибернации // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. Т. 87 (9). С. 47-52.
8. Лукоянова H.A., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А (1997а) Изучение АТФазных и регуляторных свойств миозина скелетных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки // Биофизика. Т. 42. С. 343-348.
9. Подлубная З.А. (1981) Формирование сократительных структур в миогенезе И В кн.: Проблемы миогенеза. Л. с.51-74.
10. Подлубная З.А. (1992) Ферменты в толстых нитях поперечно-полосатых мышц позвоночных // Биохимия. Т. 57 (12). С. 1785-1814.
11. Слоним А.Д. (1971) Экологическая физиология животных // М. Высшая школа. 448 с.
12. Фрейдина Н.А., Вишневская З.И., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. (1982) Влияние С-белка, ДТНБ-цепей и ионов кальция на АТФазу актомиозина при разных ионных силах// Тез.докл. I Всесоюзн. Биофизич. Съезда М. Т. II. с. 32.
13. Фрейдина Н.А. (1987) Исследование С- и F- минорных белков толстых нитей скелетных мышц кролика //Диссертационная работа. Пущино. 164 с.
14. Хочачка П., Сомеро Дж. (1988) Биохимическая адаптация ИМ.: Мир. 568 с.
15. Шпагина М.Д., Орлова А.А., Лацабидзе И.Л., Подлубная З.А., Леднев В.В. (1983) Исследование структуры толстых нитей в изолированных А-дисках и продольных срезах скелетных мышц позвоночных методом оптической дифракции // Биофизика. Т. 28. с. 306-310.
16. Шульженко Е.Б., Виль-Вильямс И.Ф. (1975) Имитация детренированности организма методом "сухого" погружения // В кн.: X чтения К.Э. Циолковского. Секц. «Пробл. космич. мед. биол.» с. 39-47.
17. Agostini В., De Martino L., Soltau В., Hasselbach W. (1991) The modulation of the calsium transport by skeletal muscle sarcoplasmic reticulum in the hibernating European hamster // Z. Naturforsch., C. J. Biosci. V. 46. P. 1109-1126.
18. Astier C., Raynaud F., Lebart M.C., Roustan C., Benyamin Y. (1998) Binding of a native titin fragment to actin is regulated by PIP2 // FEBS Lett. V. 429 (1). P. 95-98.
19. Ayoob J.C., Tumacioglu K.K., Mittal В., Sanger J.M., Sanger J.W. (2000) Targeting of cardiac muscle titin fragments to the Z-bands and dense bodies of living muscle and non-muscle cells // Cell. Motil. Cytoskeleton. V. 45. P. 67-82.
20. Bacou F., Rouanet P., Janmot C., Vigneron P., d'AIbis A. (1996) Expression of myosin isoforms in denervated, cross-reinnervated and electriccally stimulated rabbit muscles // Eur. J. Biochem. V. 236 (2). P. 539-547.
21. Bahler M., Moser H., Eppenberger H.M., Wallimann T. (1985) Heart C-protein is transiently expressed during skeletal muscle development in the embryo, but persists in cultured myogenic cells // Develop. Biol. V. 112. P. 345-352.
22. Bennett P., Starr R., Elliott A., Offer G., (1985) The structure of C-protein and X-protein molecules and a polymer of X-protein // J. Mol. Biol. V. 184. P. 297-309.
23. Bennett P., Craig R., Starr R., Offer G. (1986) The ultrastructural location of C-protein, X-protein and H-protein in rabbit muscle // J. Muscle. Res. & Cell Motil. V. 7 (6). P. 550-567.
24. Berry C.A. (1973) Weightlessness // In: Bioastronoutics data book. 2-nd. NASA. Washington. P. 349-416.
25. Brigham R.M., Ianuzzo C.D., Hamilton N., Fenton M.B. (1990) Histochemical and biochemical plasticity of muscle fibers in the little brown bat (Myotis lucifugus) // J. Comp. Physiol. V. 160. P. 183-186.
26. Callaway J.E., Bechtel P.J. (1981) C-protein from rabbit soleus (red) muscle //Biochem. J. V. 195. P. 463-469.
27. Cazorla O., Freiburg A., Helmes M., Centner T., McNabb M., Wu Y., Trombitas K., Labeit S., Granzier H. (2000) Differential expression of cardiac titin isoforms and modulation of cellular stiffness // Circ. Res. V. 86. P. 59-67.
28. Craig R., Offer G. (1976) Localization of C-protein in rabbit skeletal muscle // Proc. Roy. Soc. Lond. B. V.192. P. 451-461.
29. Craig R. (1977) Structure of A-segments from frog and rabbit skeletal muscle // J. Mol. Biol. V. 109. P. 69-81.
30. Dennis J.E., Shimizu T., Reinach F.C., Fischman D.A. (1984) Localization of C-protein isoforms in chicken skeletal muscle: ultrastructural detection using monoclonal antibodies // J. Cel Biol. V. 98. P. 1514-1522.
31. Einheber S., Fischman D.A. (1990) Isolation and characterization of a cDNA clone encoding avian skeletal muscle C-protein: an intracellular member of the immunoglobulin superfamily // Proc Nail Acad Sei U SA. V. 87 (6). 2157-2161.
32. Fährmann M., Erfmann M., Beinbrech G. (2002) Binding of CaMKII to the giant muscle protein projectin: stimulation of CaMKII activity by projectin // Biochim. Biophys. Acta. V. 1569 (1-3). P. 127-134.
33. Feuer G., Molnar F., Pettko E., Straub F.B. (1948) Studies on the composition and polymerization of actin // Hung. Acta Physiol. V. 1 (4-5). P. 150-163.
34. Fitts R.H., Bodine S.C., Romatowski J.G., Widrick J.J. (1998) Velocity, force, power, and Ca2+ sensitivity of fast and slow monkey skeletal muscle fibers // J. Appl. Physiol. V. 84 (5). P. 1776-1787.
35. Flashman E., Redwood C., Moolman-Smook J., Watkins H. (2004) Cardiac myosin binding protein C: its role in physiology and disease // Circ. Res. V. 94 (10). P. 12791289.
36. Freiburg A., Gautel M. (1996) A molecular map of the interactions between titin and myosin binding protein C. Implications for sarcomeric assembly in familial hypertrophic cardiomyopathy // Eur. J. Biochem. V. 235. P. 317—323.
37. Freydina N.A., Vishnevskaya Z.I., Udaltsov S.N. Podlubnaya Z.A. (1986) Effect of C-protein and LC2-light chains on actomyosin ATPase at various ionic strength and calcium-level 11 Acta Biochim. Biophys. Hung. V. 21. P. 247-256.
38. Fritz J.D., Swartz D.R., Greaser M.L. (1989) Factors affecting polyacrilamide gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight myofibrillar proteins // Analyt. Biochem. V. 180. P. 205-210.
39. Fukuda N. & Granzier H. (2004) Role of the giant elastic protein titin in the Frank-Starling mechanism of the heart // Curr. Vase. Pharmacol. V 2 (2). P. 135-139.
40. Funatsu T., Higuchi H., Ishiwata S. (1990) Elastic filaments in skeletal muscle revealed by selective removal of thin filaments with plasma gelsolin II J. Cell Biol. V. 110. P. 53-62.
41. Fürst D.O., Osborn M., Weber K. (1989 a) Myogenesis in the mouse embryo: differential onset of expression of myogenic proteins and the involvement of titin in myofibril assembly // J Cell Biol. V. 109 (2). P. 517-527.
42. Fürst D.O., Vinkemeier U., Weber K. (1992) Mammalian skeletal muscle C-protein: purification from bovine muscle, binding to titin and the characterization of a full-length human cDNA //J Cell Sei. V. 102. P. 769-778.
43. Gautel M., Leonard K., Labeit S. (1993) Phosphoiylation of KSP motifs in the C-terminal region of titin in differentiating myoblasts // EMBOJ. V. 12. P. 3827-3834.
44. Gautel M., Zuffardi O., Freiburg A., Labeit S. (1995) Phosphorylation switches specific for the cardiac isoform of myosin binding protein-C: a modulator of cardiac contraction? // EMBO J. V. 14(9). P. 1952-1960.
45. Gilbert R., Kelly M.G., Mikawa T., Fischman D.A. (1996) The carboxyl terminus of myosin binding protein C (MyBP-C, C-protein) specifies incorporation into the Aband of striated muscle // J Cell Sei. V. 109. (1). P. 101-111.
46. Gilbert R., Cohen J.A., Pardo S., Basu A., Fischman D.A. (1999) Identification of the A-band localization domain of myosin binding proteins C and H (MyBP-C, MyBP-H) in skeletal muscle // J Cell Sci. V. 112 (Pt 1). P. 69-79.
47. Godfrey J.E., Harrington W.F. (1970) Self-association in the myosin system at high ionic strength. II. Evidence for the presence of a monomer-dimer equilibrium // Biochemistry. V. 9 (4). P. 894-908.
48. Goldspink D.F. (1977) The influence of denervation and stretch on the size and protein turnover of rat skeletal muscle II J. Physiol. V. 269 (1). P. 87P-88P.
49. Granzier H.L., Wang K. (1993) Gel electrophoresis of giant proteins: solubilization and silver-staining of titin and nebulin from single fiber segments II Electrophoresis. V. 14. P. 56-64.
50. Granzier H.L. & Irving T.C. (1995) Passive tension in cardiac muscle: contribution of collagen, titin, microtubules, and intermediate filaments // Biophys J. V. 68. P. 10271044.
51. Granzier H., Kellermayer M., Helmes M., Trombitas K. (1997) Titin elasticity and mechanism of passive force development in rat cardiac myocytes probed by thin-filament extraction // Biophys. J. V. 73. P. 2043-2053.
52. Granzier H. & Labeit S. (2002) Cardiac titin: an adjustable multi-functional spring // J. Physiol. V.541. P. 335-342.
53. Granzier H. & Labeit S. (2004) The giant protein titin. A major player in myocardial mechanics, signaling and disease // Circ. Res. V. 94. P. 284-295.
54. Gregorio C.C., Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? // Curr. Opin. Cell Biol. V. 11. P. 18-25.
55. Gutierrez-Cruz G., Van Heerden A.H., Wang K. (2001) Modular motif, structural folds and affinity profiles of the PEVK segment of human fetal skeletal muscle titin // J. Biol. Chem. V. 276. P. 7442-7449.
56. Hanson J., O'Brien E. J., Bennett P. M. (1971) Structure of the myosin-containing filament assembly (A-segment) separated from frog skeletal muscle // J. Mol. Biol. V. 58. P. 865-871.
57. Hartzell H.C., Titus L. (1982) Effect of cholinergic and adrenergic agonists on phosphorylation of a 165000-daIton myofibrillar protein in intact amphibian cardiac muscle II J. Biol. Chem. V. 257. P. 2111-2120.
58. Hartzell H.C., Glass D.B. (1984) Phosphorylation of purified cardiac muscle C-protein by purified cAMF-dependent and endogenous Ca2+-calmodulin-dependent protein kinases II J. Biol. Chem. V. 259. P. 15587-15596.
59. Hartzell H.C.( 1984) Phosphorylation of C-protein in intact amphibian cardiac muscle: correlation between 32P-incorporation and twitch relaxation // J. Gen. Physiol. V. 83. P. 563-588.
60. Hartzell H.C. (1985) Effects of phosphorylated and unphosphorylated C-protein on cardiac actomyosin ATPase IIJ. Mol. Biol. V. 186. P. 185-195.
61. Horowits R., Kempner E.S., Bisher M.E., Podolsky RJ. (1986) A physiological role for titin and nebulin in skeletal muscle // Nature. V. 323. P. 160-164.
62. Horowits R., Podolsky R.J. (1987) The positional stability of thick filaments in activated skeletal muscle depends on sarcomere length: evidence for the role of titin filaments II J. Cell Biol. V. 105. P. 2217-2223.
63. Houmeida A., Holt J., Tskhovrebova L., Trinick J. (1995) Studies of the interaction between titin and myosin // J. Cell Biol. V. 131. P. 1471-1481.
64. Huxley H.E. & Hanson J. (1954) Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation // Nature. V. 173. P. 973976.
65. Huxley A.F. & Niedergerke R. (1954) Structural changes in muscle during contraction. Interference microscopy of living muscle cells // Nature. V. 173. P. 971973.
66. Huxley H. E. (1967) Recent X-ray diffraction and electron microscopic studies of striated muscle// J. Gen. Physiol. V. 50 (Suppl). P. 71-83.
67. Improta S., Politou A.S., Pastore A. (1996) Immunoglobulin-like modules from titin I-band: extensible components of muscle elasticity // Structure V. 4. P. 323-337.
68. Itoh Y., Kimura S., Suzuki T., Ohashi K., Maruyama K. (1986) Native connectin from porcine cardiac muscle // J. Biochem. V. 100. P. 439-447.
69. Jeacocre S.A., England P.J. (1980) Phosphorylation of a myofibrillar protein of Mr 150000 in perfused rat heart, and the tentative identification of this as C-protein // FEBS Letters. V. 122. P. 129-132.
70. Jin J-P. (1995) Cloned rat cardiac titin class I and class II motifs // J. Biol. Chem. V. 270. 6908-6916.
71. Jin J.P. (2000) Titin-thin filament interaction and potential role in muscle function // Adv. Exp. Med. Biol. V.481. P. 319-333. discussion 334-335.
72. Kasman K., Moos C. (1983) Phosphorylation of a 140000 dalton protein of skeletal muscle // Biophys. J. V. 41. P. 99a.
73. Kasper C.E., Xun L. (2000) Expression of titin in skeletal muscle varies with hind-limb unloading // Biol Res. Nurs. V. 2 (2). P. 107-115.
74. Kielley W.W., Harrington W.F. (1960) A model for the myosin molecule ii Biochim. Biophys. Acta. V. 41 (3). P. 401- 421.
75. Kimura S., Maruyama K., Huang Y.P. (1984) Interactions of muscle p-connectin with myosin, actin, and actomyosin at low ionic strengths // Biochem. J. V. 96. P. 499-506.
76. Koebel D.A., Miers P.G., Nelson R.A., Steffen J.M. (1991) Biochemical changes in skeletal muscles of denning bears (Ursus americanus) // Comp. Biochem. Physiol. V. 100B. P. 377-380.
77. Kolmerer B., Olivieri N. Witt C.C., Herrmann B.G., Labeit S. (1996) Genomic organization of the M-line titin and its tissue-specific expression in two distinct isoforms // J. Mol. Biol. V. 256. P. 556-563.
78. Koretz J.F. (1979) Effect of C-protein on synthetic myosin filament structure // Biophys. J. V. 27. P. 433-446.
79. Koretz J.F., Coluccio L.M., Bertasso A.M. (1982) The aggregation characteristics of column-purified rabbit skeletal myosin in the presence and absence of C-protein at pH 7.0 // Biophys. J. V. 37. P. 433-440.
80. Koretz J.F., Irving T.C., Wang K. (1993) Filamentous aggregates of native titin and binding of C-protein and AMP-desaminase // Arch. Biochem.Biophys. V. 304 (2). 305-309.
81. Kulikovskaya I., McClellan G., Flavigny J., Carrier L., Winegrad S. (2003) Effect of MyBP-C binding to actin on contractility in heart muscle // J. Gen. Physiol. V. 122 (6). 761-774.
82. Kulke M., Fujita-Becker S., Rostkova E., Neagoe C., Labeit D., Manstein D.J., Gautel M., Linke W.A. (2001). Interaction between PEVK-titin and actin filaments:origin of a viscous force component in cardiac myofibrils // Circ. Res. V. 89. P. 874881.
83. Labeit S., Gautel M., Lakey A., Trinick J. (1992) Towards a molecular understanding of titin // EMBO J. V. 11. P. 1711-1716.
84. Labeit S. & Kolmerer B. (1995) Titins, giant proteins in charge of muscle ultrastructure and elasticity // Science. V. 270. P. 293-296.
85. Labeit S., Kolmerer B., Linke W.A. (1997) The giant protein titin. Emerging roles in physiology and pathophysiology // Circ. Res. V. 80. P. 290-294.
86. Laemmli H. (1970) Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 //Nature. V. 227 (5259). P. 680-685.
87. Lanzetta P.A., Alvarez L.J., Reinach P.S., Candia O.A. (1979) An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate // Analyt. Biochem. V. 100. P. 95-97.
88. Le Guennec J.Y., Cazorla O., Lacampagne A., Vassort G. (2000) Is titin the length sensor in cardiac muscle? Physiological and physiopathological perspectives // Adv. Exp. Med Biol. V. 481. P. 337-348.
89. Lehman W., Szent-Gyorgyi (1975) Regulation of muscular contraction. Distribution of actin control and myosin control in the animal kingdom // J. Gen. Physiol. V. 66. P. 1-30.
90. Leterme D., Cordonnier C., Mounier Y., Falempin M. (1994) Influence of chronic stretching upon rat soleus muscle during non-weight-bearing conditions // PJlugers Arch. V. 429 (2). P. 274-279.
91. Li H., Oberhauser A.F., Redick S.D., Carrion-Vazquez M., Erickson H.P., Fernandez J.M. (2001) Multiple conformations of PEVK proteins detected by single-molecule techniques // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 98. P. 10682-10686.
92. Lim M.S., SutherlandC., Walsh M.P. (1985) Phosphorylation of bovine cardiac C-protein by protein kinase C // Biochem. Biophys. Res. Communs. V. 132. P. 1187-1195.
93. Lim M.S., Walsh M.P. (1986) Phosphorylation of skeletal and cardiac muscle C-protein by the catalyc subunit of cAMF-dependent protein kinase // Biochem. Cell Biol. V. 64 (7). P. 622-630.
94. Linke W.A., Ivemeyer M., Olivieri N., Kolmerer B., Rüegg J.C., Laheit S.1996) Towards a molecular understanding of the elasticity of titin // J. Mol. Biol. V. 261. P. 62-71.
95. Linke W.A., Ivemeyer M., Laheit S., Hinssen H., Rüegg J.C., Gautel M.1997) Actin-titin interaction in cardiac myofibrils: probing a physiological role // Biophys. J. V. 73. P. 905-919.
96. LinkeW.A., Rudy D.E., Centner T., Gautel M.,Witt C., Labeit S., Gregorio C.C. (1999) I-band titin in cardiac muscle is a three-element molecular spring and is critical for maintaining thin filament structure II J. Cell Biol. V. 146. P.631-644.
97. Linke W.A., Kulke M., Li H., Fujita-Becker S., Neagoe C., Manstein D.J., Gautel M., Fernandez J.M. (2002) PEVK domain of titin: an entropic spring with actin-binding properties // J. Struct. Biol. V. 137(1-2). P. 194-205.
98. Liversage A.D., Holmes D., Knight P.J., Tskhovrebova L., Trinick J. (2001) Titin and the sarcomere symmetry paradox // J. Mol. Biol. V. 305. P. 401-409.
99. Lukoyanova N.A., Udaltsov S.N., Podlubnaya Z.A. (1996) Binding of rabbit skeletal muscle phosphofructokinase to the filaments formed by skeletal myosins from ground squirrel at different stages of hibernation // Biophys. J. V. 70 (2). P. A162.
100. Malinchik S.B., Lednev V.V. (1992) Interpretation of the X-ray diffraction pattern from relaxed skeletal muscle and modelling of the thick filament structure // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 13 (4). P. 406-419.
101. Maruyama K., Matsubara R., Natori Y., Nonomura S., Kimura S., Ohashi K., Murakami F., Handa S., Eguchi G. (1977) Connectin, an elastic protein of muscle // J. Biochem. V. 82. P. 317-337.
102. Maruyama K., Kimura S., Ohashi K., Kuwano Y. (1981) Connectin, an elastic protein of muscle. Identification of "titin" with connectin // J. Biochem. V. 89. P. 701-709.
103. Maruyama K., Hu D.H., Suzuki T. and Kimura S. (1987) Binding of Actin Filaments to Connectin // J. Biochem. V. 101. P. 1339-1346.
104. Maruyama K. (1994) Connectin, an elastic protein of striated muscle // Biophys. Chem. V. 50. P. 73-85.
105. Mayans O., van der Ven P.F., Wilm M., Mues A., Young P., Furst D.O., Wilmanns M., Gautel M. (1998) Structural basis for activation of the titin kinase domain during myofibrillogenesis // Nature. V. 395 (6705). P. 863-869.
106. McClellan G., Kulikovskaya I., Winegrad S. (2001) Changes in cardiac contractility related to calcium-mediated changes in phosphorylation of myosin-binding protein C // Biophys. J. V. 81 (2). P. 1083-1092.
107. McClellan G., Kulikovskaya I., Flavigny J., Carrier L., Winegrad S. (2004) Effect of cardiac myosin-binding protein C on stability of the thick filament // J. Mol. Cell Cardiol. V. 37 (4). P. 823-835.
108. McDonald K.S., Fitts R.H. (1995) Effect of hindlimb unloading on rat soleus fiber force, stiffness, and calcium sensitivity II J. Appl. Physiol. V. 79 (5). P. 17961802.
109. Miyahara M., Noda H. (1980) Interaction of C-protein with myosin // J. Biochem. V. 87. P. 1413-1420.
110. Mohamed A.S., Dignam J.D., Schlender K.K. (1998) Cardiac myosin-binding protein C (MyBP-C): identification of protein kinase A and protein kinase C phosphorylation sites II Arch. Biochem. Biophys. V. 358 (2). P. 313-319.
111. Moos C., Offer G., Starr R., Bennett P. (1975) Interaction of C-protein with myosin, myosin rod and light meromyosin II J. Mol. Biol. V. 97. P. 1-9.
112. Moos C., Dubin J., Mason C., Besterman J. (1976) Binding of C-protein to F-actin II Biophys. J. V. 16. P. 47a.
113. Moos C., Mason C.M., Besterman J. M., Feng I-N. M., Dubin J.H. (1978) The binding of skeletal muscle C-protein to F-actin and its relation to the interaction of actin with myosin subfragment-1 // J. Mol. Biol. V. 124. P. 571-586.
114. Moos C., Feng I-N.M. (1979) Modification of actomyosin ATPase by skeletal muscle C-protein // Fed. Proc. V. 38. P. 339.
115. Moos C., Feng I-N.M. (1980) Effect C-prorein on actomyosin ATPase I I Biochim. Biophys. Acta. V. 632. P. 141-149.
116. Moos C. (1981) Fluorescence microscope study of the binding of added C-protein to skeletal muscle myofibrils // J. Cell Biol. V. 90 P. 25-31.
117. Morano I., Hofmann F., Zimmer M., Ruegg J.C. (1985) The influence of Plight chain phosphorylation by myosin light chain kinase on the calcium sensitivity of chemically skinned heart fibres II FEBS Lett. V. 189 (2). P. 221-224.
118. Morey-Holton E.R., Globus R.K. (2002) Hindlimb unloading rodent model: technical aspects// J. Appl. Physiol. V. 92 (4). P. 1367-1377.
119. Morimoto K., Harrington W.F. (1974) Substructure of the thick filament of vertebrate striated muscle II J. Mol. Biol. V. 83. P. 83-97.
120. Mues A., van der Ven P.F., Young P., Fürst D.O., Gautel M. (1998) Two immunoglobulin-like domains of the Z-disc portion of titin interact in a conformation-dependent way with telethonin // FEBS Lett. V. 428. P. 111-114.
121. Muhle-Goll C., Pastore A., Nilges M. (1998) The 3D structure of a type I module from titin: a prototype of intracellular fibronectin type III domains // Structure. V. 6. P. 1291-1302.
122. Murayama T., Nakauchi Y., Kimura S., Maruyama K. (1989) Binding of connectinto myosin filaments///. Biochem. V. 105. P. 323-326.
123. Nave R., Fürst D.O., Weber K. (1989) Visualization of the polarity of isolated titin molecules: a single globular head on a long thin rod as the M band anchoring domain 111 J. Cell Biol. V. 109. P. 2177-2187.
124. Neagoe C., Opitz C., Makarenko I., Linke W. (2003) Gigantic variety: expression patterns of titin isoforms in striated muscles and consequences for myofibrillar passive stiffness II J. Muscle Res. Cell Motil. V. 24 (2-3). P. 175-189.
125. Niederlander N., Raynaud F., Astier C., Chaussepied P. (2004) Regulation of the actin-myosin interaction by titin // Eur. J. Biochem. V. 271 (22). P. 4572-4581.
126. Offer G. (1972) C-protein and the periodicity in the thick filaments of vertebrate skeletal muscle // Cold. Spring Harb. Symp. Quant. Biol. V. 37. P. 87-95.
127. Offer G., Moos C., Starr R., (1973) A new protein of the thick filaments of vertebrate skeletal myofibrils. Extraction, purification and characterization // J. Mol. Biol. V. 74. P. 653-676.
128. Oganov V.S., Skuratova S.A., Murashko L.M., Shirvinskaya M.A., Szilagyi T., Szoor A., Rapcak M., Tacacs O. (1982) Postflight changes in the composition and properties of contractile proteins of muscles // Biophysics. V. 27 (1). P. 26-31.
129. Ohira Y., Yasui W., Roy R.R., Edgerton V.R. (1997) Effects of muscle length on the response to unloading // Acta Ana. (Basel). V. 159 (2-3). 90-98.
130. Ohtsuka H., Yajima H., Maruyama K., Kimura S. (1997) The N-terminal Z repeat 5 of connectin/titin binds to the C-terminal region of alpha-actinin // Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 235. P. 1—3.
131. Okagaki T., Weber F.E., Fischman D.A., Vaughan K.T., Mikawa T., Reinach F.C. (1993) The major myosin-binding domain of skeletal muscle MyBP-C (C protein) resides in the COOH-terminal, immunoglobulin C2 motif// J Cell Biol. V. 123 (3). P. 619-626.
132. Olson N.J., Pearson R.B., Needleman D.S., Hurwitz M.Y., Kemp B.E., Means A.R. (1990) Regulatory and structural motifs of chicken gizzard myosin light chain kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.87 (6). P. 2284-2288.
133. Opitz C.A., Leake M.C., Makarenko I., Benes V., Linke W.A. (2004) Developmentally regulated switching of titin size alters myofibrillar stiffness in the perinatal heart// Circ. Res. V. 94. P. 967-975.
134. Pardee J.D., Spudich J. A. (1982) Purification of muscle actin // In: Methods in Cell Biology. ( Wilson L. eds.) Acad. Press. New York. London. V. 24 (part A). P.271-289.
135. Peckham M., Young P., Gautel M. (1997) Constitutive and variable regions of Z-disk titin/connectin in myofibril formation: a dominant-negative screen // Cell Struct. Fund. V. 22. P. 95-101.
136. Pehowich D.J. (1994) Modification of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum fatty acyl composition during arousal from hibernation // Comp. Biochem. Physiol. V. 109 B (4) P. 571-578.
137. Pengelley E.T., Asmundson S.J. (1974) Circannual rhythmicity in hibernating mammals // In: Circannual Clocks. Annual Biological Rhythms. (Pengelley E.T. eds.) London. Academic Press. 325p.
138. Pepe F. A. (1967) The myosin filament. I. Structural organization from antibody staining observed in electron microscopy // J. Mol. Biol. V. 27. P. 203-225.
139. Pepe F. A., Drucker B. (1975) The myosin filament. III. C-protein // J. Mol. Biol. V. 99. P. 609-616.
140. Pepe F. A., Drucker B. (1979) The myosin filament. IV. Myosin content // J. Mol Biol: V. 130. P. 379-393.
141. Perrie W.T., Perry S.V. (1970) An electrophoretic study of the low-molecular-weight components of myosin // Biochem. J. V. 119 (1). P. 31-38.
142. Person V., Kostin S., Suzuki K., Labeit S., Schaper J. (2000) Antisense oligonucleotide experiments elucidate the essential role of titin in sarcomerogenesis in adult rat cardiomyocytes in long-term culture // J. Cell Sci. V. 113 (21). P. 38513859.
143. Petrovic V.M., Racic O., Janic-Sibalic V. (1985) Accelerated gluconeogenic processes in the ground squirrel (Citellus citellus) during the arousal from hibernation // Comp. Biochem. Physiol. V. 80 A (4) P. 477-480.
144. Pierobon-Bormioli S, Betto R, Salviati G. (1989) The organization of titin (connectin) and nebulin in the sarcomeres: an immunocytolocalization study // J Muscle Res Cell Motil. V. 10 (6). P. 446-456.
145. Podlubnaya Z.A., Freydina N.A., Lednev V.V. (1990) The axial repeats in paracrystals of light meromyosin and its complex with C-protein // Gen. Physiol. Biophts. V. 9. P. 301-310.
146. Podlubnaya Z.A., Orlova A.A., Korchagin V.P., Udaltsov S.N., Shelud'ko N.S. (1992) Modificatory effect of exogenous C-protein on contractile properties of isolated myofibrils // Abstr. 21 Europ. Muscle Conf. Bielefeld. Germany. P. 65.
147. Pollack G.H. (1990) Muscles and molecules: uncovering of the principles of biological motion // Seatle. Ebner & Sons Publishers. 300 p.
148. Raynaud F., Astier C., Benyamin Y. (2004) Evidence for a direct but sequential binding of titin to tropomyosin and actin filaments // Biochim. Biophys. Acta. V. 1700 (2). P. 171-178.
149. Rhee D., Sanger J.M., Sanger J.W. (1994) The premyofibril: evidence for its role in myofibrillogenesis // Cell Motil. Cytoskeleton. V. 28 (1). P. 1-24.
150. Rees M.K., Young M. (1967) Studies on the isolation and molecular properties of homogenous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure // J. Biol. Chem. V. 242 (19). P. 4449-4458.
151. Rome E., Offer G., Pepe F.A. (1973) X-ray diffraction of striated muscle labeled antibody to C-protein // Nature New Biol. V. 244. P. 152-154.
152. Rourke B.C., Yokoyama Y., Milsom W.K., Caiozzo V.J. (2004) Myosin isoform expression and MAFbx mRNA levels in hibernating golden-mantled ground squirrels (Spermophilus lateralis) // Physiol. Biochem. Zool. V. 77 (4). P. 582-593.
153. Salviati G., Betto R., Ceoldo S., Pierobon-Bormioli S. (1990) Morphological and functional characterization of the endosarcomeric elastic filament // Am. J. Physiol. V. 259 (lPt I). P. 144-149.
154. Safer D., Pepe F.A. (1980) Axial packing in light meromyosin paracrystals // J. Mol. Biol. V. 136. P. 343-358.
155. Sebestyen M.G., Wolff J. A. & Greaser M.L. (1995) Characterization of a 5.4 kb cDNA fragment from the Z-line region of rabbit cardiac titin reveals phosphorylation sites for praline-directed kinases // J.Cell Sci. V. 108. P. 3029-3037.
156. Shenkman B.S., Kozlovskaya I.B., Kuznetsov S.L., Nemirovskaya T.L., Desplanches D. (1994) Plasticity of skeletal muscle fibres in space-flown primates // J. Gravit. Physiol. V. 1 (1). P. 64-66.
157. Sjostrom M., Squire J.M. (1977) Fine structure of the A-band in cryo-section. The structure of the A-band of human skeletal muscle fibers from ultrathin cryo-sections negatively stained // J. Mol. Biol. V. 109. P. 49-68.
158. Sommerville L.L. & Wang K. (1983) Phosphorylation of titin and nebulin in vitro and in vivo II Biophysical Journal. V. 41. P. 96a.
159. Sommerville L.L. & Wang K. (1987) In vivo phosphorylation of titin and nebulin in frog skeletal muscle // Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 147 (3). P. 986992.
160. Sommerville L.L. & Wang K. (1988) Sarcomere matrix of striated muscle: in vivo phosphorylation of titin and nebulin in mouse diaphragm muscle // Archiv. Biochem. Biophys. V. 262 (1). P. 118-129.
161. Soteriou A., Gamage M., Trinick J. (1993) A survey of interactions made by the giant protein titin // J. Cell Sci. V. 14. P. 119-123.
162. Soukri A., Valverde F., Hafid N., Elkebbaj M.S., Serrano A. (1995) Characterization of muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoform from euthermic and induced hibernating Jaculus orientalis // Biochim. Biophys. Acta. V. 1243. P. 161-168.
163. South F.E., House W.A. (1967) Energy metabolism in hibernation // In: Mammalian hibernation (Fisher K.C., Dawe A.R., Lyman C.P., Schonbaum E., South F.E., Eds.) NewYork. Elsevier. V. 111. P. 305-324.
164. Squire J.M. (1981) The structural basis of muscular contraction // New York. London. P. 349.
165. Squire J.M., Luther P.K., Knupp C. (2003) Structural evidence for the interaction of C-protein (MyBP-C) with actin and sequence identification of a possible actin-binding domain IIJMol Biol. V. 331 (3). P. 713-724.
166. Starr R. & Offer G. (1971) Polypeptide chains of intermediate molecular weight in myosin preparations // FEBS Lett. V. 15. P. 40-44.
167. Starr R., Offer G. (1978) Interaction of C-protein with heavy meromyosin and subfragment-2 I/Biochem. J. V. 171. P. 813-816.
168. Starr R., Offer G. (1982) Preparation of C-protein, H-protein, X-protein and phosphofructokinase // In: Methods in enzymology. New York. London. V. 85. Part B. P. 130-138.
169. Starr R. & Offer G. (1983) H-protein and X-protein. Two new components of the thick filaments of vertebrate skeletal muscle II J. Mol. Biol. V. 170. P. 675-698.
170. Starr R., Almond R., Offer G. (1985) Location of C-protein, H-protein and X-protein in rabbit skeletal muscle fibre types IIJ. Muscle Res. Cell Mot. V. 6. P 227256.
171. Steffen J.M., Koebel D.A., Mussacchia X.J., Milsom W.K. (1991) Morphometric and metabolic indices of disuse in muscles of hibernating ground squirrels // Сотр. Biochem. Physiol. V. 99B (4). P. 815-819.
172. Storey K.B., Storey J.M. (2000) Gene expression and protein adaptation in mammalian hibernation // In: Life in the cold. (Heldmaier G. & Klingenspor M. eds.). Springer-Verlag. P. 303-313.
173. Suzuki J., Kimura S., Maruyama K. (1994) Electron microscope filament lengths of connectin and its fragments II J. Biochem. V. 116. P. 406-410.
174. Swan H. (1974) Thermoregulation and bioenergetics patterns for vertebrates survival II Am. Elsevier Publishing Co. Inc. New York 430p.
175. Sweeney H.L., Boeman B.F., Stull J.T. (1993) Myosin light chain phosphorylation in vertebrate striated muscle: regulation and function // Am. J. Physiol. V. 264. P. C1085-C1095.
176. Takano-Ohmuro H., Nakauchi Y., Kimura S., Maruyama K. (1992) Autophosphorylation of P-connectin (titin 2) in vitro // Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 183 (1). P. 31-35.
177. Talmadge R.J., Roy R.R., Edgerton V.R. (1996) Distribution of myosin heavy chain isoforms in non-weight-bearing rat soleus muscle fibers II J. Appl. Physiol. V.81 (6). P. 2540-2546.
178. Tashima L.S., Adelstein S.J., Lyman C.P. (1970) Radioglucose utilization by active, hibernating, and arousing ground squirrels // Am. J. Physiol. V. 218 (1). P. 303-309.
179. Tatsumi R., Hattori A. (1995) Detection of giant myofibrillar proteins connectin and nebulin by electrophoresis in 2 % polyacrylamide slab gels strengthened with agarose // Anal Biochem. V. 224. P. 28-31.
180. Tatsumi R., Maeda K., Hattori A., Takahashi K. (2001) Calcium binding to an elastic portion of connectin/titin filaments // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 22 (2). P. 149-162.
181. Thomason D.B., Booth F.W. (1990) Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting// J. Appl. Physiol. V. 68 (1). P. 1-12.
182. Thomson W.E., Rummel M.D. (1974) Muscular deconditioning and its prevention in space flights II Prog. Skylab. Life Sci. Symp. V. 11. P. 403-404.
183. Toursel T., Stevens L., Granzier H., Mounier Y. (2002) Passive tension of rat skeletal soleus muscle fibers: effects of unloading conditions // J. Appl. Physiol. V. 92. P. 1465-1472.
184. Towbin H., Staehlin T., Gordon J. (1970) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 76. P. 4350-4354.
185. Trinick J., Cooper J. (1980) Sequential disassembly of vertebrate muscle thick filaments II J. Mol. Biol. V. 141. P. 315-321.
186. Trinick J.A. (1981) End-filaments: a new structural element of vertebrate skeletal muscle thick filaments II J. Mol. Biol. V. 151. P. 309-314.
187. Trinick J., Knight P., Whiting A. (1984) Purification and properties of native titin // J. Mol. Biol. V. 180. P. 331-356.
188. Trombitas K., Pollack G.H. (1993) Elastic properties of the titin filament in the Z-line region of vertebrate striated muscle IIJ Muscle Res Cell Motil. V. 14(4). P. 416-42.
189. Trombitas K., Greaser M.L., Pollack G.H. (1997). Interaction between titin and thin filaments in intact cardiac muscle // J. Muscle Res. Cell Motil. V. 18. P. 345— 351.
190. Trombitas K., Wu Y., Labeit D., Labeit S., Granzier H. (2001) Cardiac titin isoforms are coexpressed in the half-sarcomere and extend independently // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. V. 281. P. H1793-H1799.
191. Tskhovrebova L., Trinick J. (1997) Direct visualization of extensibility in isolated titin molecules II J. Mol. Biol. V. 265. P. 100-106.
192. Tskhovrebova L., Trinick J. (2003) Titin: properties and family relationships II Nat. Rev. Mol. Cell Biol. V. 4. P. 679-689.
193. Van der Ven PFM, Bartsch J.W., Gautel M., Jockusch H., Furst D.O. (2000) A functional knock-out of titin results in defective myofibril assembly // J. Cell Sci. V. 113. P. 1405-1414.
194. Viskocil F., Gutmann E. (1977) Contractile and histochemical properties of skeletal muscles in hibernating and awake golden hamsters // J. comp. Physiol. V. 122. P. 385-390.
195. Wang K., McClure J., Tu A. (1979) Titin: major myofibrillar components of striated muscle //Proc.Natl Acad. Sci. USA. V. 76 (8). P. 3698-3702.
196. Wang K. (1984) Cytoskeletal matrix in striated muscle: The role of titin, nebulin and intermediate filaments // Advances in experimental medicine and biology. V. 170. Contractile mechanisms in muscle ed. By G. Pollack and H. Sug.P. 285-305.
197. Wang К. (1985) Sarcomere-Associated Cytoskeletal Lattice in Striated Muscle. Review and Hypothesis // Cell and Muscle Motility. V. 6. P. 315-369.
198. Wang К &Wright J. (1988) Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z-line //J Cell Biol. V. 107 (6 Pt 1). P. 2199-212.
199. Wang L.C.H. (1984) Ecological, physiological and biochemical aspects of torpor in mammals and birds. In: Advances in experimental medicine and biology (Eds. Wang L.C.H.) Springer-Verlag Berlin-Heidelderg. V. 4 (Animal adaptation to cold). P. 361-403.
200. Wang L.C.H. (1987) Mammalian hibernation. In: The effects of low temperatures on biological systems (Eds. Grout B. W. IV., Morris G.J.), Edward Arnold Publ. London, p. 349-386.
201. Wang S.M., Greaser M.L., Schultz E., Bulinski J.C., Lin J.J., Lessard J.L. (1988) Studies on cardiac myofibrillogenesis with antibodies to titin, actin, tropomyosin, and myosin // J Cell Biol. V. 107(3). P. 1075-1083.
202. Weisberg A., Winegrad S. (1996) Alteration of myosin cross bridges by phosphorylation of myosin-binding protein С in cardiac muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93 (17). P. 8999-9003.
203. Weisberg A., Winegrad S. (1998) Relation between crossbridge structure and actomyosin ATPase activity in rat heart // Circ Res. V. 83 (1). P. 60-72
204. Whiting A., Wardale J., Trinick J. (1989) Does titin regulate the length of muscle thick filaments? II J. Mol. Biol. V. 205. P. 263-268.
205. Wickler S.J., Horowitz B.A., Kott K.S. (1987) Muscle function in hibernating hamsters: a natural analog to bed rest? // J. therm. Biol. V. 12. P. 163-166.
206. Wickler S.J., Hoyt D.F., Van Breukelen F. (1991) Disuse atrophy in the hibernating golden-mantlend ground squirrel, Spermophilus lateralis I I Am. J. Physiol. V.261. P. R1214-R1217.
207. Wilmann M. Gautel M., Mayans O. (2000) Activation of calcium/calmodulin regulated kinases // Cell Mol. Biol. V. 46 (5). P. 883-894.
208. Yacoe M.E. (1983) Maintenance of the pectoralis muscle during hibernation in the big brown bat, Eptesicus fuscus II J. comp. Physiol. V. 152. P. 137-144.
209. Yamamoto K. & Moos K. (1983) The C-protein of rabbit red, white, and cardiac muscles //J. Biol. Chem. V. 258 (13). P. 8395-8401.
210. Yasuda M., Koshida S., Sato N., Obinata T. (1995) Complete primary structure of chicken cardiac C-protein (MyBP-C) and its expression in developing striated muscles IIJ Mol Cell Cardiol V. 27 (10). P. 2275-2286.
211. Young P., Ferguson C., Banuelos S., Gautel M. (1998) Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin interactions lead to an asymmetrical sorting of alpha-actinin // EMBO J. V. 17. P. 1614-1624.
212. Young P., Ehler E., Gautel M. (2001) Obscurin, a giant sarcomeric Rho guanine nucleotide exchange factor protein involved in sarcomere assembly // J. Cell Biol. V. 154. P. 123-36.
-
Вихлянцев, Иван Милентьевич
-
кандидата биологических наук
-
Пущино, 2005
-
ВАК 03.00.02
- Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии
- Исследование экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов в течение годового цикла и спонтанно-гипертензивных крыс при развитии гипертрофии
- Изучение амилоидных свойств саркомерных белков семейства тайтина
- Сравнительное изучение амилоидных свойств мышечных белков и Aβ(1-42)-пептида мозга
- Роль полиморфизма тайтина в регуляции структурно-функциональных свойств миокарда в норме и при патологии
