Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика влияния простагландинов на моноксигеназную систему печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика влияния простагландинов на моноксигеназную систему печени крыс"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

п 1» в Л П пРавах рукописи

^ УДК 577.152.1 : 577.175.859

о 9 ФЕ8 1998

САДОВНИЧИЙ ВИТАЛИЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЛИЯНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ИЛ МОНООКСИ1ЕНАЗНУЮ СИСТЕМУ ПЕЧЕНИ КРЫС.

03.00.04 - Биохимия

Алзтореф-ерат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 1998

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной

гепатологии Института биохимии АН Беларуси

Научные руководители:

доктор биологических наук В. У. Буко, кандидат биологических наук А.Н. Лрцукевич

Официальные оппонетты:

доктор биологических наук, профессор М.М. Левочёв доктор медицинских наук, профессор И. Н. Морокко

Ведущая организация:

НИИ наркологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «_»_ 1998 г. в «_» час.

на заседании диссертационного Совета Д 001.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук при Институте питания Российской академии медицинских наук (Москва, Устьинский пр. 2/14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан «_» '_ 1997 г.

Ученый секретарь совета, кандидат медицинских наук

В.М. Жминченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации.

Проблема биотрансформации чужеродных веществ в живом организме занимает важное место в биологии и медицине. Система цитохро-ма Р-450 эндоплазматического ретикулума печени участвует в метаболизме как многих эндогенных субстратов, так и большого многообразия лекарств, канцерогенов и различных экзогенных веществ. Превращая гидрофобные соединения в более полярные продукты и, таким образом, способствуй удалению их из организма, эта ферментная система выполняет функцию защиты внутренней среды организма от повреждающего действия ксенобиотиков.

В настоящее время общепринятым в биохимической токсикологии является феномен метаболической активации чужеродных веществ, ко гда токсичность большинства инертных лшгофильных чужеродных соединений обусловлена превращением их в реакционноспособные метаболиты,-вступающие в реакции с макромолекулами и запускающие цепь вторичных патобиохимических процессов. Система ш п охрим а Р-450 также вовлечена в наработку кислородных радикалов в микросомах печени. Индукция этой системы приводит к усилению каскада свободно-радикальных процессов, вызывающих гепатотоксический эффект и ведущих к окислительному поражению печени.

Исследование механизмов регуляции монооксигеназных реакций и поиск препаратов, способных управлять активностью этой системы, открывает широкие перспективы в области предупреждения и лечения токсического и окислительного повреждения печени. В процессе проводимого поиска гепатопротекторов среди естественных метаболитов были обнаружены защитные свойства эйкозаноидов, в частности иростаглан-динов (ПГ) серии Е, обладающих также и антиоксидантными свойствами. Механизмы реализации этих эффектов ПГЕ изучены далеко недостаточно. В связи с этим нам представилось интересным исследовать влияние одного представителя этого семейства ПГЕ), а также ПГРга, не

1 Принятые сокращения в тексте автореферата: БКОД - бензилоксикумарин О-деэтилнроваяие, ДСК - доксилстеариновая кислота, МЭОС - микросомальная этанол-окисляющая система, ОБА — оксилтетраметилпиперидинбромацетамид, ПГ - простагландины, ПОЛ - перекпеное окисление липидов, ПРОД - пентокси-резоруфин О-деэтилирование, ПХМБ - оксилтетраметилшгггерединпарахлормер-курийбензонат, СОД - супероксиддисмутаза, ТЦК - оксилтетраметилпиперидин-циклогексилкарбодиимид, ЭКОД - этоксикумарин О-деэтилирование, ЭМДЕ -этилморфин Ы-деметилирование, ЭРОД - этоксирезоруфин О-деэтилирование.

обладающего гелатопротективными свойствами, на систему микросо-малыгого окисления в печени крыс, а также процессы, связанные с генерацией свободных кислородных радикалов в этой системе. Совокупность приведенных выше положений послужила основанием для выполнения данной работы.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Работа выполнялась по проблеме 2.28.4 "Биохимия животных и человека" в рамках республиканской комплексной программы "Исследование метаболических и регуляторных факторов, общеадаптационных и иммунных реакций, нейрохимических процессов в норме и патологии" по темам "Исследование молекулярных механизмов гепатотоксичности и защиты печени при алкогольном и токсическом поражении", "Механизмы поражения печени альдегидами метаболического происхождения".

Цель и задачи исследования.: Целью настоящей работы явилось исследование влияния простагландинов на функциональные и структурные изменения монооксигеназной системы микросом печени крыс в условиях ее индуцирования или шнибирования.

Для выполнения намеченной цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить влияние ПГЕ] и ШТ2а на биохимические функциональные параметры монооксигеназной системы микросом печени крыс в условиях индукции системы цитохрома Р-450 фенобарбиталом, хронической алкогольной интоксикацией и ацетоном в сочетании с голоданием.

2. Охарактеризовать воздействие ПГЕ! и ПГР2а на свободноради-кальные и антиоксиданшые процессы и микросомах печени крыс при индукции монооксигеназной системы фенобарбиталом, хронической алкогольной интоксикацией и ацетоном.

3. Исследовать взаимодействие Г1Г с микросомальными мембранами печени интактных крыс.

4. Провести сравнительное изучение функциональных и структурных особенностей микросомальной системы под влиянием ПГЕ при острой и хронической алкогольной интоксикации.

Научная новизна полученных результатов. Впервые установлено, что ПГЕ ашжает активность монооксигеназной и антиоксидантной системы, ингибирует свободнорадикальные процессы и ПОЛ при микросомальной индукции. В условиях ингибирования ПГЕ! оказывает нормализующее действие на цитохром Р-450-зависимую систему и обладает антирадикальной активностью. В экспериментах с индукцией различных

изоформ цитохрома Р-450 показаны особенности влияния ПГЕ] на эти изоформы и связанные с ними реакции. ПГЕ! и ПГЕ2 изменяют кон-формационное состояние белков поверхностного слоя микросомальной мембраны, а ПГР2а проникает в липидный бислой и вызывает флюиди-зацию полярного его участка и ослабление белок-липидных гидрофобных связей. ПГЕ! стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, уменьшая микровязкость липидного бислоя и внутримолекулярную подвижность гидрофобных областей белковых структур.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные данные расширяют представление о роли ПГ как гепатопротектора и антиоксиданта, регулирующего монооксигеназную и антирадикальную системы. ПГЕ1 проявляет антиоксидантное действие в условиях индукции и ингибировании монооксигеназной системы. Исследован характер взаимодействия ПГ с микросомальными мембранами в норме и в условиях индукции микросомальной системы. ПГЕ проникают в приповерхностный слой микросомальной мембраны, а ПГР2а - в более глубинный липидный бислой, вызывая его разжижение. В условиях хронической алкогольной интоксикации ПГЕ! эффективно стабилизирует микросо-мальную мембрану. Результаты работы носят фундаментальный характер и могут быть использованы а научно-исследовательской практике. Данные о антирадикальном действии ПГ являются принципиально новыми и имеют большое теоретическое и практическое значение. Данное соединение может применяться для предупреждения образования свободных радикалов микросомами печени, а также при поражении печени гепатотоксинами, поражающее действие которых связано с акшвацией свободнорадикальных процессов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. ПГ являются соединениями, снижающими образование свободных радикалов и гидроперекисей липидов при индукции и ингибировании микросомальной системы.

2. Антирадикалыгое действие ПГ серии Е и Е связано с особенностями их взаимодействия с различными изоформами цитохрома Р-450: ПГЕ1 оказывает антиоксидантное действие, ПГРЧа может действовать как в роли антиоксиданта, так и в качестве прооксиданта.

3. ПГЕ1 стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, уменьшая микровязкость гидрофобной области липидного бислоя и внутримолекулярную подвижность гидрофобных областей белковых структур.

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертацш обсуждены на И-ом Гепатологическом симпозиуме (Белосток, Польша 1992), 6-ом симпозиуме по свободным радикалам (Турин, Италия 1992), 27-ом конгрессе Европейской ассоциации по изучению псчеш (Вена, Австрия, 1992), 9-ом конгрессе по изучению болезней печеш (Базель, Швейцария, 1992), международной научной конференции (Гродно, 1993), 14-ом Европейском симпозиуме по метаболизму лекарстг (Париж, Франция, 1994), международном конгрессе по изучению алкоголизма (Сидней, Австралия, 1994), 6-ом симпозиуме по биохимии ли-пидов (Санк!-Петербург, 1994), 1-ом белорусском симпозиуме гепатоло-гов (Гродно, 1994), 1-ом белорусском съезде фотобиологов и биофизикоЕ (Минск, 1994), 15-ом Европейском симпозиуме по метаболизму лекарств (Иена, Германия, 1996), а также на научных семинарах Института биохимии АН Беларуси (1993, 1994),

Опубликованность результатов. По теме диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы; основной части, содержащей обзор литературы, описание материалов и методов, результатов 2-х глав собственных исследований и их обсуждения, заключения; выводов и списка 203 использованных источников, расположенных на 24 страницах. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 16 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследований.

Исследования проведены на 198 половозрелых нелинейных крысах-самцах. Объектом исследования служила ткань печени. В качестве индукторов монооксигеназной системы использовали многократное введение этанола, введение ацетона на фоне голодания, а также индукцию фенобарбиталом. В качестве ингибитора монооксигеназной системы использовалось однократное введение этанола.

Острую алкогольную интоксикацию вызывали однократным введением 25% раствора этанола в дозе 4 г/кг. ПГЕ4 вводили внутрибрюшин-но в дозе 20 мг/кг одновременно с введением этанола. Хроническая алкогольная интоксикация вызывалась внутрижелудочным введением 40% раствора этанола в дозе 5 г/кг массы тела в течение 30 дней. ПГЕ и П1Т2а вводили внутрибрюшинно в течении последних 10 дней в дозе

4 мг/кг. Интоксикация ацетоном вызывалась внутрижелудочным введением 33% раствора ацетона в течении 2 дней в дозе 5 мл/кг веса тела на фоне 48-часового голодания. ПГЕ5 и ПГР2а вводили интраперитоне-ально в течении 3 дней в дозе 10 мг/кг. Фенобарбитал вводили внутрн-брюшинно в дозе 80 мг/кг на протяжении 2 дней. nrEt в этой модели вводили интраперитонеалыю в дозе 4 мг/кг одновременно с фенобарбиталом. Контрольным животным внутрибрюшинно и внутрижелудочно вводился изотонический раствор хлорида натрия. Микросомальная фракция выделялась согласно Карузиной и Арчакову (1977).

Функцию моиооксигеназкой системы печени оценивали по содержанию цитохромов Р-450 и b5 (Omura, Sato, 1964), электронтранспорт-ной активности НАДФН- и НАДН-зависимых флаЕопротеидов (Daliner, 1963), скорости окисления НАДФН и НАДИ (Gillette, 1957), гидроксилирования субстратов: 7-зтокеикумарина и бензилоксикумарина (Aitio, 1976), 7- этилрезоруфина и пентилрезоруфина (Burke, 1978), а также этилморфина (Klinger, Muller, 1976). Функцию антиоксидантной системы оценивали по активности СОД (Nisnikimi, 1976) и наработке перекиси водорода (Hilderbrandt, 1978). Генерация свободных радикалов определялась хемилюминесцектным методом (Mulier-Pcddinghaus,1977), содержание перекисей липидов и стимулируемое пе рекненое окисление липидов - тиобарбитуровым методом (Buege, Aust, 1978). Жирнокислотный и фосфолипидный состав мембран определялся методом газовой и тонкослойной хроматографии. Взаимодейс-чие ТТГ с микросомальпой мембраной изучалось методом ЭПР, используя спиновые зонды: ПХМБ, ТЦК, ОБА, 5- и 16-ДСК.

Результаты псследоватшй проанализированы методом вариационной статистики с использованием критерия Стыодента и методом достоверности разности сравниваемых велетин.

Влияние ПГ на активность компонентов моиооксигеназной и антиоксидантной систем в условиях индукции и ингибирования микросо-мальных систем окисления.

Длительный прием этанола приводил к увеличению содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени (в 1.4 раза), тогда как НАДФН-цитохром Р-450 редуктазная активность оставалась неизменной (табл.1). Прием алкоголя достоверно активировал мнкросомальное окисление НАДФН и этанола, в то время как параметры, относящиеся к цитохро-му 1)5, оставались практически неизменными. Активность СОД была увеличена в 1.3 раза. Длительный прием этанола приводил к достовер-

ному увеличению образования перекисей липидов и НАДФН- зависимой хемилюминесценции, стимулируемой люминолом и люцигенином (Рис.2,3)- Уровень восстановленного глутатиона в печени после приема алкоголя был снижен в 2 раза, тогда как содержание окисленного глутатиона оставалось неизменным (Рис.1). Интоксикация этанолом приводила к достоверному увеличению активности ЭКОД (примерно в 1.5 раза) и несущественному повышению активности БКОД и ЭРОД, тогда как активность ПРОД оставалась, неизменной и более того, активность ЭМДЕ была несколько снижена.

Таблица 1

Влияние ИГЕ! на содержанке и активность компонентов монооксигеназ-ной и антиоксидантной системы печени крыс после хронической алкогольной интоксикации.

Показатели Контроль Этанол Этанол+ПГЕ^

Цитохром Ь5 & 0.49+0.03 0.47+0.02 0.37+0.03 *# j

Цитохром Р-450 & 0.62+0.05 0,83+0.03 * 0.42±0.05 *#

НАДН-цитохром Ь5 5715.4±390.96 4952.2+409.8 4711.9+306.95

р.сдуктаза @

НАДН-цитохром Р-450 234.0±39.3 234.7+34.8 204.0±19.8

редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 2.24+0,24 2,86+0.2 3.38+0.2 *

ПАДФН-оксидаза @ 1.37+0.06 1.91+0.19 * 1.57+0.14

МЭОС @ 238.4+12.7 286.5+14,6 * 134.5+7.9 *#

Продукция перекиси 0.45^0.02 0.4S+0.036 0.46+0.02

водорода @

Супсроксиддисмутаза, 32.8+0.49 40.2+1.25 * 35.7+1.65 U

% блокирования

НАДФН-зависимая 619+80 1526±178 * 521+52 #

хеми люминесценция,

с.р.ш./с на мг.белка

Каждая величина представлена как среднее арифметическое + Б.Е.М для 8 животных.

@ - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в нмоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к этанолу.

Гт/татион мкг/г пячйни Глутатион окисленный, мкг/г печени

* - р<0,05 по сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с этанолом или ацетоном.

К - контроль, Э - этанол, А - ацетон, ПГР2а - простагландины Р2а

Рис.1. Содержание восстановленного (А) и окисленного (В) глутатиоиа в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и их комбинацией с простагландинами Г;« ■

102 имп/мг белка в мин

35 ■ 30 {25 т--

I

20 | - -

1

15 4---

I

10 ■

о -i

0 4-

1

А

¡ГШ '

ГШ I

107 имп/мг белка в мин

Э+ПГ>2а А А+ПГР2а

25 т-

I

20-1---

I

15 | --10-1----

I ]

0 + К

Г±1

В !

+ 1 -Щ

г. Н «"1 1 «Л !

* 1 !

Э+ПГР2а А А+П!Т2сх

* - р<0,05 по сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с этанолом или ацетоном.

К - контроль, Э - этанол, А - ацетон, ПГР2а - простагландины Р2а

Рис.2. НАДФН-зависимая хемилюминесценция, усиленная люминолом (А) и люцигенином (В) в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и их комбинацией с простагландинами р2а.

3 2,5 2 1,5 1 + 0,5

а

нмоль ТБК-реактивных продуктов/мг белка а мин

А ~

1.5 -Д-

— ... Т *

--- ■ я

г--- --.

1И

3 -

К Э Э*ПГЯ2а А А+ПГТ2а нмоль Н202/мг белка в мин

2.5 г

г

1.6 -1

0,5 0

С

3 3+ПГР,а А А+ПГР-л

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 ■ О ■

нмоль ТБК-реактивных продуетов/мг белка

в * * * *

___ . .шш___ ___ гЬ Йй

Я

! • В II" " ш

ин Ш1

Э+ПГР2сс А А+ПГРга

-1

. +

Т|«Г|

К - контроль, Э - этанол, А - ацетон,

ПГР2а - простагландины

* - р<0,05 по сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с этанолом или ацетоном.

Рис.3. НАДФН-стимулируемое перскиснос окисление липидов (А), образование перекисей липидов (В) и продукция перекиси водорода (С) в микросомах печени крыс, обработанных этанолом, ацетоном и их комбинацией с простатландинами Г'2а.

Обработка крыс с хронической алкогольной интоксикацией ИГЕ снижала уровень цитохрома Р-450 и активность МЭОС ниже контрольного уровня (табл.1). ПГЕ1 нормализовал НАДФН-зависимую хеми-люминесценцию микросом и активность СОД. ПГЕ} повышал также НАДФН-оксидазную активность, тогда как уровень цитохрома Ь5 был снижен.

Обработка крыс, получавших этанол, ПГЕга приводила к более выраженному прооксидантному эффекту, чем действие самого алкоголя на печень: наработка Н2О2, образование перекисей липидов и НАДФН-зависимая хемилюминесценция, стимулируемая люминолом и люциге-нином, были достоверно увеличены в 1.2; 1.3; 2 и 2.3 раза, соответственно, в то время как НАДФН-стимулируемое ПОЛ увеличивалось не-

существенно (Рис.2,3). Концентрации окисленного и восстановленного глутатиона снижались в 3.1 и 1.8 раза, соответственно (Рис.1). Этанол вместе с ПГ приводил к недостоверному увеличению активностей ЭРОД, ЭКОД и БКОД, тогда как активности ПРОД и ЭМДЕ снижались достоверно в 1.8 и 1.5 раза, соответственно.

Таблица 2

Влияние ПГЕ} на содержание и активность компонентов монооксигеназ-ной и антиоксидантной системы печетш крыс в условиях интоксикации ацетоном совместно с голоданием.

Показатели Контроль Ацетон Ацетон+ПГЕ}

Цитохром Ь5 & . 0.46+0.03 0.46+0.04 0.39+0.03

Цитохром Р-450 & 0.63+0.04 0.91+0.15 * 0.74+0.11

НАДН-цитохром Ь5 6020.9+662.45 3941.5+432.05 * 2623.9+202.45

редуктяза @

НАДН-цитохром 205.2+11.9 278.9±33.07 * 197.2+22.48

Р-450 редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 1.91+0.27 2.59+0.28 2.49+0.48

НАДФН-оксидаза @ 2.16+0.18 4.98+0.41 * 2.94±0.43 #

МЭОС @ 299.4+17.2 343.3±24.89 294.4+46.13

Продукция перекиси 0.92+0.029 1.36+0.077 * 1.16+0.053 *#

водорода @

Супероксиддисмутаза 21.5+1.87 33.5+1.72 ' 26.8+1.70 а

, % блокирования

НАДФН-зависимая 111+8 154+28 * 106+7 #

хемилюмпнесценция,

с.р.т./с на мг.белка

Каждая величина представлена как среднее арифметическое- ± 5.Е.М для 8 животных.

@ - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в нмоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к ацетону.

Комбинация введения ацетона с голоданием активизировала окисление НАДФН и активность НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы (табл.2). Уровень цитохрома Р-450 в микросомах печени был достоверно увеличен в 1.8 раза. Наблюдалось достоверное увеличение активности СОД. НАДН-цитохром Ь5-редуктазная активность снижалась, тогда

как окисление НАДН и содержание цитохрома Ь5 оставались неизменными в группе, получавшей ацетон. Комбинация ацетона с голоданием приводила к достоверному увеличению наработки перекиси водорода в 1.5, образования гидроперекисей липидов в 1.2 раза, НАДФН стимулированного ПОЛ в 1.52 раза и НАДФН-зависимой хемилюми-несценции, стимулируемой люминолом и люцигенином в 3 и 3.1 раза, соответственно (Рис.2,3). Уровни восстановленного и окисленного глу-татиона в печени резко снижались в 5.2 и 3.3 раза, соответственно (Рис.1-). Интоксикация ацетоном приводила к достоверному увеличению активное гей ЭРОД в 3.4 раза, ЗКОД в ЭРОД, ЭКОД, ВКОД и ЭМДЕ и 3.4, 5.8; 5.9 и 1.8 раз, соответственно, тогда как активность ПРОД была увеличена несущественно.

ПГЕ, нормализовал большинство параметров, измененных сочетанием введения ацетона с голоданием. Как видно из таб.2, ПГЕ, достоверно снижал содержание цитохрома Р-450 и образование перекиси водорода, НАДФН зависимую хемилюминесценцию, окисление НАДФН и НАДФН цитохром Р-450-редуктазную активность. Снижение активности СОД после введения ПГЕ; было несущественным. ПГЕ] также способствовал снижению и НАДН-цитохром Ь5-редуктазной активности.

ПГР2а улучшал большинство параметров, измененных комбинацией ацетона с голоданием. ШТ2а достоверно повышал уровень восстановленного и окисленного глутатиона, снижал НАДФН-стимулируемое ПОЛ и НАДФН-зависимую хемилюминесценцию, стимулируемую люминолом и люцигенином, тогда как наработка П2О2 снижалась несущественно, а образование перекисей липидов оставалось неизменным (Р1*е.2,3). П¡Т^а приводил к достоверному снижению активности ЭРОД и недостоверному уменьшению активностей ПРОД, БКОД и ЭМДЕ, тогда как активность ЭКОД оставалась неизменной.

Фенобарбитал вызывал почти двухкратное увеличение НАДФН-оксидазной и НАДФН-цитохром Р-450-редуктазной активностей (табл.3). Активности МЭОС, СОД, НАДН-оксидазы и образование перекиси водорода были также повышены после введения фенобарбитала. Содержание цитохрома Р-450 увеличивалось более, чем в 2 раза. Обработка фенобарбиталом резко повысила НАДФН-зависимую хемилюминесценцию микросом.

ПГЕ( нормализовал НАДФН оксидазу, НАДФН-цитохром Р-450-редуктазу и активность МЭОС у крыс, обработанных фенобарбиталом и достоверно снижал содержание цитохрома Р-450 и активность СОД. В то же время ПГЕ практически не изменял НАДФН-зависимую хемилю-

минесценцию и образование перекиси водорода. Все показатели, относящиеся к системе цитохрома Ь5: содержание цитохрома Ь5, НАДН-оксидазная и НАДН-цитохром Ь5-редуктазная активности были снижены после введения ПП^.

Таблица 3

Влияние ПГЕ1 на содержание и активность компонентов монооксигеназ-ной и антиоксидантной системы печени крыс после индукции микросом

фенобарбиталом.

Показатели Контроль Фенобарбитал Фенобарбитал

+ПГЕ1

Цитохром Ь5 & 0.46+0.02 0.47+0.01 0.32+0.02 *#

Цитохром Р-450 & 0.49+0.01 0.87±0.07 * 0.54+0.05 *#

НАДН-цитохром Ь5 2385.2+145.65 2344.2+262.1 1561.7+99.41 *#

редуктаза @

НАДН-цитохром Р-450 136.8+2.56 256.6+23.17 * 165.2+13.7 #

редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 3.27+0.19 4.82+0.3 * 3.86+0.15 *П

НАДФН-оксидаза @ 2.90+0.09 6.51±0.4б * 2.98+0.25 #

мэос @ 214.4+23.7 ЗЗУ.2+46.5 * 223.3±22.2 4г

Продукция перекиси 0.69+0.049 0.96±0.132 * 0.89+0.065 *

водорода @

Супероксиддисмутаза, 31.2+2.96 55.1+2,65 * 47.4+2.61 *#

% блокирования

НАДФН-зависимая 237+32 343±39* 379+26 *

хемилюминесценция,

с.р.т./с на мг.белка

Каждая величина представлена как среднее арифметическое х 5.Е.М для 8 животных.

@ - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в имоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к фенобарбиталу.

При острой алкогольной: интоксикации содержание цитохромов Ь5 и Р-450 достоверно снижалось в 1.4 и 1.44 раза соответственно (табл.4). Наблюдалось достоверное снижение НАДН-цитохром 1>,-редуктазной активности в 1.4 раза, в то время как НАДФН-цитохром Р-450 редуктазная активность и окисление НАДН и НАДФН остава-

лись практически неизменными, а НАДФН-зависимая хемилюминес-ценция была несущественно увеличена. Активность МЭОС резко снижалась (в 2 раза), а активность СОД и продукция перекиси водорода достоверно повышалась в 1.2 и 1.5 раза соответственно.

Таблица 4

Влияние ПГЕ) на содержание и активность компонентов монооксигеназ-ной и антиоксидантной системы печени крыс при острой алкогольной интоксикации.

Показатели Контроль Этанол Эганол+ПГ

Цитохром Ь5 & 0.42±0.02 0.30+0.01 * 0.42+0.01 #

Цитохром Р-450 & 0.4б±0.01 0.32+0.02 * 0.47±0.02 #

НАДН-цитохром Ь5 4774.3+144.91 3346.5+203.7 * 4003.3+335.9

редуктаза @

НАДП-цитохром Р-450 187.9+8.37 205.8+4.86 260.4+13.54 *#

редуктаза @

НАДН-оксидаза @ 1 Г- Г- . П ! 3.55+0.11 3.98±0.08

НАДФН-оксндаза @ 3.48x0.11 3.58+0.17 3.93+0.07 *

мэос@ - 311.5+36.9 191.75+9.1 " 222.25il5.S6 *

Продукция перекиси 1.16+0.116 1.63±0.094 * 1.55+0.124 *

водорода @

Супероксиддисмутаза, 30.4+0.53 36.1 + 1.65 * 32.9+1.03

% блокирования

НАДФН-зависимая 524+114 649+93 489±83

хемн люминесценция,

с.р.ш./с на мг.белка

каждая величина предст авлена как среднее арифметическое ± Э.Е.М

для 8 животных.

@ - активность выражена в нмоль/мин/мг белка. & - содержание выражено в нмоль/мг белка.

* - р<0.05 по отношению к контролю.

# - р<0.05 по отношению к этанолу.

ПГЕ[ оказывал положительный эффект практически на все параметры, измененные при острой алкогольной интоксикации. Он полностью нормализовал содержание цитохромов Ь5 и Р-450, НАДН-цитохром Ь5- и НАДФН-цитохром Р-450-редуктазные активности и активность МЭОС. Кроме того, ПГЕ, снижал активность СОД и досто-

верно не влиял на образованно перекиси водорода и НАДФН-зависимую хемилюминесценцию.

Суммируя приведенные выше результаты, можно сделать следующее заключение: ПГ, в большей степени серии Е, обладают антиокси-дантной и антирадикальной активностью, снижая генерацию свободных радикалов микросомами печени и иигибируя ПОЛ при воздействии различных гепатотоксинов. Этот эффект обусловлен нормализующим действием ПГ на монооксигеназную систему и, в особенности, на цитохром Р-450-зависимую цепь переноса электронов.

Взаимодействие ПГ с мембранами микросом печени крыс.

ПГ уменьшают время вращательной корреляции (т) спиновой метки ПХМБ, которая взаимодействует с аминокислотными остатками цис-теинов, принадлежащим белковым структурам микросомальной мембраны. Уменьшение значения величины т свидетельствует о увеличении частоты вращения спиновой метки, связанной в этом участке микросомальной мембраны, что в свою очередь, означает уменьшение микро-вязкосш липидного бислоя в месте присоединения ПХМБ. Как следует из рис.4 ¡ИТ/«, наиболее выражение влияет на микровязкость окружения спиновой метки ПХМБ. ПГЕ< и, в меньшей степени ПГЕ2 уменьшают микровязкость окружения этой метки, причем наблюдается зависимость воздействия от количества двойных связей в молекуле ПГ. ПГЕз, содержащий две двойные связи, слабее воздействует на микровязкость по сравнению с ПГЕ1; который содержит одну двойную связь.

5ис. 4. Зависимость времени корреляции вращательнрй диффузии (т) липовой метки ПХМБ (А) и ТЦК (Б) в мембранах микросом печени :рыс от концентрации ПГ (1 - ПГЕ2, 2 - ПГЕ}, 3 - ШТ2а).

На рис.4 представлены кривые титрования ПГ суспензии микро-сом, меченных спиновой меткой ТЦК, которая взаимодействует с е-аминогруппами аминокислотных остатков белков, расположенных на поверхности мембраны. Видно, что ПГЕ2а не оказывает влияния на микровязкость окружения этой спиновой метки, связанной с микросо-мальной мембраной. Напротив, ИГЕ! и ПГЕ2 увеличивают значение величины х спиновой метки ТЦК и. следовательно, микровязкость ее окружения. Здесь также наблюдается зависимость степени воздействия от количества двойных связей в молекуле ПГ. ПГЕ2 в данном случае оказывает более сильное влияние на состояние микроокружения спиновой метки ТЦК, по сравнению с ПГЕ}.

Состояние липидной компоненты микросомалыюй мембраны изучали при помощи жирорастворимых парамагнитных зондов: 5- и 16 ДСК, нитроксильные фрагменты которых локализуются на различной глубине липндного бислоя микросомалыюй мембраны. Упорядоченность лииидного бислоя (Б), оцениваемая по поведению спинового зонда 5-ДСК в мембранах, модифицированных ПГ, возрастает, причем для ПГЕ2сс это увеличение значительно более выраженно по сравнению с 11Г серии Е (рис.5).

ЛМ

-ГИМ

Рис. 5. Зависимость параметра упорядоченности (Б) спинового зонда 5-ДСК (А) и 16-ДСК (Б) в мембранах микросом печени крыс от концентрации ПГ (1 - ПГЕ2, 2 - ПГЕЬ 3 - ПГР2а).

ПГЕ2а увеличивает упорядоченность глубинного участка лииидного бислоя, как следует из анализа поведения спинового зонда 16-ДСК.

В то же время ПГЕ} и ПГЕ2 не влияют на упорядоченность этого участка мнкросомалъной мембраны (рис. 5).

Острая и хроническая алкоголизация крыс приводит к структурным изменениям белковой и липидиой компоненты микросомальных мембран печени. Гидрофобное окружение белковых структур мембран микросом одинаковым образом реагирует на способ алкоголизации животных. При остром и хроническом введении этанола наблюдается разжижение гидрофобных областей. Этот эффект составляет до 10% при острой и до 20% при хронической алкогольной интоксикации (рис.6). ПГЕ1 не оказывает стабилизирующего действия в случае однократного введения этанола и полностью стабилизирует мембрану при хронической алкоголизации животных.

Вг(ис) С16 (не) С5(%) Вг (не) С1в(нс) С,<%)

Щ Контроль О Этанол □Этанол+ПГЕ

* - р<0,05 по сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с этанолом или ацетоном.

Рис.6. Влияние ПГЕг на время корреляции и параметр упорядоченности бромацетамидной метки (Вг) и спиновых зондов С-, и С16 производных доксилстеариновой кислоты при острой (А) и хронической (В) алкогольной интоксикации.

Состояние липидного бислоя на уровне локализации 16-ДСК характеризуется увеличением его микровязкости при хронической алкогольной интоксикации на 45-50% (рис.6). Напротив, в случае острой интоксикации микровязкость уменьшается менее значительно, примерно на 15- 20%. При хронической алкоголизации на фоне введения Г1ГЕ5

наблюдается уменьшение микровязкости гидрофобной области липид-гюго бислоя примерно до уровня, определяемого у контрольных животных. При острой алкогольной интоксикации введение ПГЕ, недостоверно повышает микровязкость гидрофобной области липидного бислоя на уровне локализации парамагнитной метки 16-ДСК (рис.6).

Анализ поведения парамагнитной метки 5-ДСК, локализованной в приповерхностной области микросомальной мембраны, свидетельствует о том, что при однократном введении этанола наблюдается усиление бе-лок-лниидных связей и, наоборот, они ослабевают при хронической ин-тиксикащш животных. Эти эффекты слабо выражены и составляют до 5% по отношению к контрольным животным. Присутствие ПГЕ5 усугубляет этот эффект и в том и в другом случае (рис.6).

В заключении можно сделать вывод, что ПГЕ3 достаточно эффективно стабилизирует структуры микросомальной мембраны яри хронической алкогольной интоксикации, тогда как при острой алкогольной интоксикации подобный эффект отсутствует.

Генерация свободных радикалов в результате аутооксидации фер-рокомялекса цитохрома Р-450 и, как следствие, активация ПОЛ в условиях индукции монооксигеназпой системы играет ключевую роль в поражении печени. Поэтому важнейшей задачей является ингибирование этих процессов путем снижения образования кислородных интермедиа-тов цнтохром Р-450-зависимой системы или обезвреживания радикалов соединениями, имеющими свойства "радикальных ловушек". ПГ отвеча ют всем требованиям, предъявляемым к гепатопротекторам, и обладают следующими протективными действиями: во-первых, они являются стабилизаторами микросомальных мембран и антиоксидантами; во-вторых, взаимодействуя с цитохромом Р-450, они снижают активность моноок-сигеназ и генерацию супероксид-аниона, и в-третьих, эти соединения являются общеизвестными регуляторами внутриклеточного метаболизма. Кроме того, синтетические аналоги ПГЕ способны улавливать свободные радикалы, что может указывать на многофакторность антирадикального и антиоксидантного эффекта ПГ.

Полученные данные позволяют предположить, что стабилизация структурных изменений липидного окружения микросомальных гемо-протеинов ПГ является одним из механизмов антирадикального и антиоксидантного эффекта ПГ, опосредованного через нормализацию активности цитохромов, соответствующих редуктаз и микросомальных ок-сидаз.

ВЫВОДЫ.

1. ИГЕ, в условиях индукции микросомалъной системы многократным введением этанола, фенобарбиталом и ацетоном, а также при ее ин-гибировании однократным введением этанола нормализует активность компонентов монооксигеназнои и антиоксидантной систем.

2.ПГ серии Е проявляют антирадикальное и антиоксидантное действие, снижая образование свободных радикалов и ингибируя процессы ПОЛ, а также повышая активность защитных антирадикальных систем.

3. nrFja действует как прооксидант при хронической алкогольной интоксикации и антиоксндант в условиях индукции микросомалыгой системы ацетоном в сочетании с голоданием. Различия эффектов ПГЕ и ПГЕ связаны с особенностями их влияния на различные изоформы ци-тохрома Р-450.

4.ПГ уменьшают микровязкость гидрофобной области белковой компоненты микросомальной мембраны, что более выражено у nFF2a, чем у ПГЕ. ПГ серии Е изменяют конформационное состояние белков поверхностного слоя мембраны, а ШТ/х вызывают увеличение вязкости гидрофобных участков липидиого бпелоя. Степень изменения микровязкости мембраны зависит от числа двойных связей в молекуле ПГЕ.

5. ПГЕ связываются с функционально активными группами (аминогруппами, SII-группами), расположенными на поверхности микросомальной мембраны. ПГР;>а проникает в глубину липидного бислоя и вызывает разжижение полярного его участка и ослабление белок-лигшдных гидрофобных связей.

6. ПГЕ]' стабилизирует структуру микросомальной мембраны при хронической алкогольной интоксикации, уменьшая микровязкость гидрофобной области липидного бислоя и флюидизацию гидрофобных областей белковых структур.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Buko V., Sadovnichy V. Prostaglandins and cytoprotection of liver cells// The i Ith Hepato.logical Symposium "Bialystok Liver Day".-Bialystok, 1992.- P. 40-42.

2.Buko V., Sadovnichy V. Effect of prostaglandin Ej on radical generation in rat liver microsomes// Abstracts of the VI Bienniale Meeting "Free Radicals: from Basic Science to Medicine". Free radicals Research Communications.- 1992.- Suppl.l.- Ref 4.11.

3. Sadovnichy V., Nemkevich V., Buko V. Prostaglandin Et and cytochrome P-450 dependent production of free oxygen radicals: Abstracts of the 27th EASL Meetind// Journal of Hepatology.- 1992.- V. 16,-Suppl.l.- P. 82.

4. Sadovnichy V., Buko V. Effect of prostaglandin F.t on ethanol biotransformation, free radical and H2O2 production by iiver microsomes in acute and chronic alcohol intoxication// IX International Congress in Liver Diseases: Extrahepatic Manifestation in Liver.- Basel.- 1992.- P. 21.

б.Арцукевич A. H., Садовничий В. В. Взаимодействие простаг-ландинов Ei, Е2 и F2a с мембранами микросом печени крыс при острой и хронической алкогольной интоксикации./'/ Материалы международной научной конференции.- Гродно, 1993.- Ч.1.- С. 98-99.

6. Садовничий В. В., Мюллер Д., Буко В. У. Эффект простаглан-дннон Е2а на генерацию свободных радикалов, образование гидроперекисей липидов, содержание глутатиона и реакции О-деэтилирования и N-демешлирования в микросомах печени крыс, индуцируемых хронической алкогольной интоксикацией и комбинацией ацетона совместно с голоданием/ Институт биохимии АНБ.- Гродно, 1993.- 20 е.- Ден. в ВИНИТИ 02.12.93, N 2995-В93.

7. Буко В. У., Садовничий В. В. Влияние простагландинов Е, на функции микросомальных цепей переноса электронов и цитохром Р-450 зависимое образование кислородных радикалов/ Институт биохимии АНБ. - Гродно, 1993,- 20 е.- Деи. в ВИНИТИ 02.12.93, N 2996-В93.

8. Buko V.U., Sadovnichy V.V. Cytochrome P-450 mediated inhibition of free radical reactions by prostaglandin Et // 14th European Workshop on Drug Metabolism.- Paris, 1994.- P. 113.

9. Sadovnichy V,V., Muller D., Buko V.U. The effect prostaglandin F2a on free radical generation during chronic alcohol intoxication and combination of acetone wit starvation// 14th European Workshop on Drug Metabolism.- Paris, 1994.- P.. 184.

10.Садовничий В. В., Буко В. У. Влияние простагландинов F2a на генерацию свободных радикалов при хронической алкогольной интоксикации и введении ацетона// Актуальные вопросы гепатологии: Тезисы докладов Первого Белоруского симпозиума гепатологов.- Гродно, 1994.- С. 37-38.

11.Buko V., Artsukevich A., Sadovnichy V., Maltsev A. Interaction of prostaglandin E2 with microsomal membrane in chronic alcohol intoxication// Alcoholism: Clinical and Experimental Research, 1994.-V. 18, N2.- P. 51A, 11.17.

12.Арцукевич A. H., Садовничий В. В., Шарейко С. Ч., Буко В. У. Влияние простагландинов на структуру мембран микросом и функциональные свойства монооксигеназной системы печени крыс/ / Материалы VI симпозиума по биохимии липидов,- Саикт-Петербург, 1994.-С. 18.

13.Sadovnichy V. The effect of prostaglandins E1 and F2a on free radical generation during chronic alcohol intoxication// 38th and 21st International Institutes on the Prevention and Treatment of Alcoholism and Drug Dependence.- Prague, 1994,- P. 290.

14,Арцукевич A. H., Садовничий В. В., Буко В. У. Структура мембран микросом и функциональные свойства монооксигеназной системы печени крыс в присутствии простагландинов//' Материалы Первого съезда белоруского общества фотобиолоюи и биофизиков.-Минск, 1994.-С.8.

15. Buko V., Ailsukevich A., Sadovnichy V. Modification of liver microsomal membranes isolated from ethanol-treated rats by prostaglandin // Alcohol, Alcoholism.- 1995.- V 30, N 4.- P. 504.

16.Sadovnichy V., Buko V. The effect of prostaglandin E,_ on functional and structural changes of monooxygenase system during acute and chronic alcohol intoxication.// Exp. Toxicol. Pathol.-1996.-V.48,N5.-P.386.

17.Buko V.U., Sadovnichy V.V. Cytochrome P-450 and free radical generation in rat liver microsomes under the influence of prostaglandin Ei.// Biochem. and Mol. Biol. Inter.-199fi.-V.39,N6.-P. 1177-1184.

18.Sadovnichy V., Muller D., Buko V. Effect of prostaglandin F2a on free radical generation, glutathione content and microsomal oxidase activities in rat. liver microsomes induced either bv ethanol or acetone.// Pol. J. Pharmacol.- 1997.-V.49, N6. - p. 431-437.

Подписано к печати 27.11.97 г. Бумага офсетная 60x84. 1/16. 1,68 п.л. Тираж 100 экз.

Ротаиринтный участок Гродненского государственного медицинского института, г. Гродно, ул Горького, 80.